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东北大学硕士学住论文摘要 树状体包被的纳米金的制备、表征及生物分子修饰 摘要 纳米金粒子具有良好的稳定性、表面效应、光学效应以及特殊的生物亲和性，可与 生物活性分子结合形成探针，用于生物体系检测。由于纳米金随其直径大小不同可以呈 现红色至蓝色的不同颜色变化，这种信号稳定，肉眼可见，大大降低了对信号检测的要 求，可以简化整个测定过程，这种优越性使纳米金标记法作为一种生物标记手段，已广 泛地应用于d n a 澳4 序和蛋白免疫检测中。 本研究采用树状体( d c n d r i m c r ) p p i h a ( 聚苯丙烯亚胺，十六烷基氨) 在加热的条 件下还原h a u c h ，反应过程中p p i h a 同时作为保护剂和还原剂，制备出表面修饰了氨 基基团的纳米金，可以直接应用于生物标记，且避免了在修饰过程中可能造成的团聚。 研究了制备过程中比率r 、温度t 、浓度c 、时间t 、搅拌速度v 、p h 值等参数的影响 规律，优化了制备纳米金的反应条件，制备了分散性、均匀性良好的稳定纳米金。另外 还采用n a b h 4 和p p i h a 共同制备纳米金，并通过两种方法的比较，进一步讨论了p p i h a 在制备反应中的作用。用紫外可见分光光度计、透射电子显微镜、纳米粒度分析仪作为 检测手段，对制得的纳米金进行了表征。三种表征方法基本得到了一致的规律。 研究中已初步将制得的纳米金用于标记d n a 和牛血清白蛋白，结果表明，采用 p p i h a 制得的纳米金由于表面修饰了多氨基基团，可以与3 或57 端修饰了磷酸基团的 单链寡核苷酸连接，当分别修饰了靶序列寡核苷酸和其互补序列寡核苷酸的纳米金溶胶 混合后，反应体系颜色由红色变为紫色。在b s a 浓度低于l m g m l 的范围内，纳米金 一b s a 复合物的吸光度随b s a 浓度增大呈近似线性的增加，因此该方法具有对蛋白做 简单定量分析的可能性。 关键词：纳米金，树状体p p i h a ，d n a ，牛血清白蛋白 1 i 东北大学硕士学位论文 h b s t r a c t p r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n d m o d i f i c a t i o no fd e n d r i m e rc a p p e dg o l d n a n o p a r t i c l e s a b s t r a c t g o l dn a n o p a r t i c l e sh a v eg o o ds t a b i l i t y , e x c e l l e n ts u r f a c ee f f e c t ，u n i q u eo p t i c a ls p e c i a l i t y a n ds p e c i a lb i o l o g i c a la f f i n i t y g o l dn a n o p a r t i c l e sc a nc o u n j u c t ew i t hb i o m o l e c u l e sa n dc a n b eu s e da sb i o l o g i c a lp r o b e s t h ec o l o u ro fg o l dn a n o p a r t i c l e sc h a n g e sf r o mr e dt ob l u ew i t h t h ei n c r e a s eo ft h ed i a m e t e ro fn a n o p a r t i c l e s t h ec h a n g ec a nb eu s e da sas i g n a lr e a d o u tt o d e t e c tb i o m o l e c u l e sb e c a u s eo fi t sc o n s i s t e n c ya n dv i s i b i l i t y t h e s ec h a r a c t e r i s t i c so fg o l d n a n o p a r t i c l e sh e l ps i m p l i f ya n ds p e e du pd e t e c t i o np r o c e s s e s ，t h e r e f o r e ，t h e yh a v eb e e n w i d e l yu s e df o rd n a a n dp r o t e i nd e t e c t i o ni nb i o l o g i c a la s s a y s i nt h i ss t u d y , p p i h a ( d a b a m 1 6 , p o l y p r o p y l e n i m i n eh e x a d e c a a m i n ed e n d r i m e r , g e n e r a t i o n3 d e n d r i m e rw a su s e da sb o t hr e d u c i n ga g e n ta n dp r o p e c t i n ga g e n tt op r e p a r e g o l dn a n o p a r t i c l e sb yh e a t i n ga na q u e o u ss o l u t i o nc o n t a i n i n gp p i h a a n dh a u c h i nt h e p r o c e s so fs y n t h e s i s ，g o l dn a n o p a r t i c l e sw e r em o d i f i e d w i t hm u l t i a m i n og r o u p s ，w h i c hm a d e t h e mc a p a b l eo fc o n j u g a t i n gw i t hb i o m o l e c a l e sd i r e c t l y t h i sw a y , t h ea g g r e g a t i o no fg o l d n a n o p a r t i c l e s w a sa v o i d e d c o n d i t i o n s0 1 1t h e p r e p a r a t i o n o fg o l dn a n o p a r t i c l e sw e r e o p t i m i z e d ，a n d t h eb e s tc o n d i t i o nt o p r e p a r em o n o d i s p e r s e d ，u n i f o r m a n d s t e a d y n a n o p a r t i c l e sw a si d e n t i f i e d i na d d i t i o n ，n a n o - g o l dp r e p a r a t i o nu s i n gb o t hn a b h 4a n d p p i h a w e r e c o n d u c t e d t os m d y t h e r o l e o f p p i h a b y c o m p a r i n g o f t h e t w o m e t h o d s u v - v i s s p e c t r o p h o t o m e t e r , t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dg r a n u l a r i t ya n a l y z e rw e r eu s e dt o c h a r a c t e r i z et h eg o l dn a n o p a r t i c l e s t h er e s u l t so b t a i n e df r o mt h et h r e ed e t e c t i o nm e t h o d s s h o w e dt h es a m et r e n d s g o l dn a n o p a r t i c l e sp r e p a r e db yp p i h aw e r ea l s ou s e da sp r o b e st od e t e c td n aa n dt o d os i m p l eq u a n t i m t i v ea n a l y s i so fb s a t h eg o l dn a n o p a r t i c l e sl a b e l e dw i t ha m i n og r o u p s w e r ec o n n e c t e dw i t h3 7 o r5 l a b e l i n gp h o s p h a t eo l i g o n u c l e o t i d e s t h ec o l o u rc h a n g e df r o m r e dt o p u r p l ea f t e rg o l dn a n o p a r t i c l e sl a b e l e dt a r g e to l i g o n u c l e o t i d e s w e r em i x e dw i t h c o m p l e m e n t a r yo l i g o n u c l e o t i d e sl a b e l e dw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s t h ea b s o r b a n c eo fa u b s a m 东北大学硕士学位论文 i n c r e a s e dl i n e a r l yw i t ht h ei n e r e a s eo ft h eb s ac o n c e n t r a t i o nb d o wl m g m lo fb s a t h i s s u g g e s t st h a tg o l dn a n o p a r t i c l e sc a i lb e u s e di ns i m p l eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s k e y w o r d s ：g o l dn a n o p a r t i e l e s ，p p i h ad e n d r i m e r , o l i g o n u c l e o t i d e ，b s a 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：霭朱 日期：阳，j b 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 东北大学硕士学位论文 第一章引言 第一章引言 现代分析化学作为一种分析检测手段，已经被广泛地应用于其他相关领域，目前最 受关注的应属生物分析。人类对生命的渴望促使生命科学得到飞速发展，生命遗传物质 d n a ，一些生物大分子如多肽、蛋白质等的分秽亍，对生物化学提出了大量新的课题。 而生物药物分析，超痕量、超微量生物活性物质分析，酶分析，甚至微生物分析，这些 在生物体内发生的动态的反应产物的分析检测，既需要检测手段的精细快速，又要不影 响生物体系的活性，对现代分析化学提出很高要求，因此生物化学分析已经成为现代分 析化学发展的最重要前沿领域之一【1 1 。 生物大分予( 核酸、蛋白质等) 检测的最主要方法之一是标记分析法。许多生物分 子由于本身可供分析的性质较弱，要获得高灵敏度的检测，常常借助外来的标记物获得 可测量的信号来分析。常用的标记物可分为发光标记物、酶标记物、电化学标记物等等。 其中以发光标记物为基础的发光标记法是最主要的一大类方法，如各种荧光标记、化学 发光标记等。发光标记检测的灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度，发展高灵敏 的发光体系直是研究的主要内容。目前这些标记物虽然已发展得比较成熟，但各自存 在着无法克服的缺陷，无法为生物检测提供最优结果。 近年来，纳米材料作为标记物已经成为研究的热点并取得了可喜的成果，用纳米粒 子作标记物是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用。纳米粒子由于其 尺寸在纳米量级( 1 l o o n m ) ，呈现出许多与同质单个分子或大块物体不同的性质，如 小尺寸效应、表面效应和量子效应等【2 1 。报道的研究结果表明，用这些具有特殊性质的 材料作为生物分析的标记物质，可大大改善标记物的性能，显著提高现有分析方法的灵 敏度。目前科学家已将纳米晶体生物材料的应用扩展到生物传感器、药物开发、蛋白质 组成和环境检测等领域，成为生命科学发展的前沿领域。 金纳米粒子良好的稳定性、光学效应、电学效应以及特殊的生物亲和效应，在许多 领域表现出潜在的应用价值，引起了人们浓厚的研究兴趣，在分子生物学领域的研究和 应用已成为目前科学家研究的热点。 1 1 纳米金 纳米金( g o l dn a n o p a r t i c l e s ) 是指金微小颗粒，其直径为l l o o n m 。化学中常说的 纳米金，是指金纳米粒子在水中形成的分散系，俗称胶体金。纳米金随其直径大小不同 而呈现红色至紫色的不同颜色变化。由于可与氨基发生非共价静电吸附而牢固结合，与 1 东北大学硕士学位论文 第一章引言 巯基之间形成很强的共价键，使得纳米金可与生物活性分子结合，形成的探针可用于生 物体系检测。纳米金作为标记物引入免疫学实验，已形成了四大免疫标记技术之一的纳 米金标记技术，并得到广泛应用。 从纳米金首次发现到作为免疫标记物而得到大规模研究经历了四百多年。大约在 1 6 0 0 年，中世纪杰出医生p a r c e l s u s 用一种植物的醇提取物还原氯金酸制备“饮用金”， 这就是纳米金。1 8 5 7 年，法拉第对纳米金作了系统的科学研究，发现加入少量电解质可 使纳米金由红色变成蓝色，最终凝集为无色，而加明胶等大分子物质后便可阻止这种变 化。他的重大发现奠定了纳米金应用的科学基础。1 9 3 9 年，k a u s c h e 和r u s k a 把烟草花叶 病毒吸附在金颗粒上，在电子显微镜下观察到金粒子呈高电子密度，这一发现为纳米金 在免疫电镜中的应用奠定了基础。1 9 7 1 年，f a u l k 等将纳米金颗粒与兔抗沙门氏菌血清结 合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原，开创了纳米金标记技术【3 1 。但 当时纳米科学体系还没有形成，纳米金还没有得到广泛的重视。在纳米科技开始发展的 8 0 年代末9 0 年代初，金纳米粒子的制各已有不少科技工作者在探索。如t u r k e v i c h 和f r e n s 等做了早期的工作，经典的f r e n s 法到今天还是制备金纳米粒子的主要方法之。 纳米金必须在体系中稳定、均匀地分散，并且有一定的粒径范围，这样才能更好地 应用于生物体系检测中。如何能制各出最优的适用于生物标记和检测的纳米金，国内外 多方学者经过研究，不断发现新的制备方法，并对原有方法不断改进，都收到了良好的 效果。 1 2 纳米金的常规制备方法 到目前为止，已经发展了许多制各金纳米粒子的方法，总体上可划分为物理法及化 学法。单纯就化学法而言，纳米金的制备方法也很多，化学实验中常用的纳米金一般用 氯金酸( h a u c l 4 ) 通过化学还原来制各。在还原剂的作用下，氯金酸水溶液中的金离子 被还原成金原子，并聚集成微小的金核，即粒径在纳米数量级的纳米金。化学法制备纳 米金的反应过程中主要需要控制的是金颗粒的大小及分散程度。 自从纳米金制备形成一项体系之后，方法不断更新，已经形成几类。从粒子生成及 长大的不同过程来分，主要分为以下几类： 1 2 1 溶胶法 比较常用的方法是溶胶法，即采用白磷、抗坏血酸或柠檬酸钠这类水溶性很好的物 质作为还原剂，直接进行还原。采用柠檬酸钠还原法制得的金颗粒直径较为均一，因此 2 东北大学硕士学位论文 第一章引言 目前常用。还原剂的选择与拟制各的纳米金颗粒的大小有关。一般来说，如果要制备金 颗粒直径在5 1 2 n n 3 的纳米金，可用白磷或抗坏血酸还原氯金酸，若欲制备直径大于 1 2 n m 的纳米金颗粒则用柠檬酸三钠还原氯金酸。在用同一种还原剂时，制备的金颗粒直 径的大小还可通过还原剂的用量来控制，还原剂用量的多少与制备的金颗粒直径大小成 反比【4 j 。经典的f r e n s 法就属于这种方法。将h a n c l 4 水溶液加热至沸腾，在剧烈搅拌下 迅速加入柠檬酸钠水溶液，保持沸腾状态反应1 5 m i n 后关闭热源，继续搅拌至室温，透 射电镜( t e m ) 结果显示，粒子的平均粒径为1 5 7 2 0 r t m l 5 1 。这样形成的纳米金表面吸附 负离子( a u c l 2 一) 和部分正离子( r ) 形成的吸附层，依靠静电作用形成稳定的胶体溶液。 但这样形成的纳米金一般不是非常稳定，表面活性使它们很容易团聚。可以通过加入反 絮凝剂或表面活性剂比如鞣酸、聚乙烯吡咯烷酮( p v p ：p o l y v i n y l - p y r r o l i d o n e ) 来避免这 种团聚。西安交大的兰新哲等采用草酸还原较高浓度h a u c h 溶液的方法，在p v p 作保护 剂的水溶液中，成功制备出了粒度平均为2 0 3 0 n m 且高度分散的金溶胶，同时讨论了 口h 值、还原剂浓度、保护剂用量及加入方式等对纳米金粒度分布的影响1 6 】。p v p 不仅可 以用作保护剂，本身也具有还原性，只是还原能力有限，所还原出的纳米金粒子随还原 剂用量变化不大。d y k m a n 等报道了用大分子量的还原剂，如聚环乙亚胺、聚乙二醇及 p v p 等还原h a u c h 制备金溶胶 7 1 。g a r d e a j 搴用紫花苜蓿生物质制各金纳米粒子。紫花苜 蓿生物质与a u ( h i ) 弱键合，能把a l u ( ) 还原出来，从而形成金纳米粒子。高倍显微镜 显示，当a u ( ) 被还原后与紫花苜蓿生物质形成5 种不同类型的金纳米粒子，包括正四 面体型、六角小盘型、二十面体复合孪生型、十面体复合孪生型及不规则形状的金纳米 粒子 8 1 。w a n g 等在5 一苯硫基咔唑存在的条件下，用n a b h 4 水溶液还原n a u c h 制得了金纳 米微粒吼 1 2 2 液相法 液相法，一般指在含有可溶性的或悬浮盐的均相溶液中，利用各种途径( 如添加还 原剂、射线辐照、加热分解等) 引发化学反应，通过均相或异相成核及随后的扩散生长， 生成一定形状和大小的，不仅具有窄的尺寸分布而且表面功能化的纳米粒子。液一液两 相法和反相胶束法等都属于液相合成方法。液相法制各金属微粒的历史已有近一个世 纪，但液相法制各粒径可控且单分散的金属纳米粒子直到2 0 世纪8 0 年代才开始得到广泛 的研究。由于可以在原子分子水平上进行物质组装与控制，可以更好地控制纳米粒子的 形状、粒径、粒径分布和组分，还具有通用性、可操作性和相对简单等优点，特别适合 单分散金属及其合金纳米粒子的制备。 3 东北大学硕士学位论文第一章引言 1 2 2 1 液一液两相法 液一液两相法通常是将h a u c l 4 与含有长链烷基胺( 表面活性剂) 的甲苯有机溶液混 合，从而形成一个两相体系。然后剧烈搅拌若干小时，使水相中的金属盐转移到有机相 中，随后分离，保留有机相。将一定量的包覆剂( 典型的是长链硫醇和磷酸盐类) 在剧 烈搅拌的同时加到溶液中，然后再快速加入还原剂( 如硼氢化物、胼) 以成核形成纳米 金粒子，利用a u p 和a u s 键防止金颗粒聚集。b m s t 等首先用液一液两相的方法制备出硫 醇包裹的稳定的金纳米粒子，类似于在气相中合成后再用含有卜十二烷硫醇的有机溶剂 气雾钝化的纳米金粒子，可以制备出不同粒径的纳米金粒子【1 0 1 。( ；h e n 等用巯基琥珀酸作 为保护剂，以n a b h 4 还原法合成了粒径在1 0 3 0n m 范围内的纳米金。琥珀酸对h a u c h 的摩尔比率在0 5 2 5 之间变化，制成的纳米金可以重新分散到水相中i n j 。采用柠檬酸 钠还原时，p ( c c , i - h s o 小i a ) 3 作保护剂，可以制得稳定的1 5 2 0 n m 的纳米金，纳米金沉积 后可以重新溶解到去离子水里，呈现出紫红色【捌。 1 2 。2 2 反胶束法 反胶束法亦称微乳液法，反胶团是指表面活性剂溶解在有机溶剂中，当浓度超过临 界胶束浓度( c m c ) 后形成亲水极性头向内、疏水有机链向外的液体颗粒结构，其内核 可增溶水分子或亲水物质。微乳液一般由4 种组分组成，即表面活性剂、助表面活性剂 ( 一般为脂肪醇) 、有机溶剂( 一般为烷烃或环烷烃) 和水。该体系是一种分散相分布 均匀、透明、各向同性的热力学稳定体系。反胶束的液滴( d r o p l e t ) 或称“水池”( w a t e r p 0 0 1 ) 是一种特殊的纳米空间，以此为反应场历可以制备纳米微粒。反胶束微反应器中 “水池”的大小可控制在几到几十纳米之间，尺度小且彼此分离，是理想的反应场所。 微乳液的组成确定以后，液滴的粒径保持定值。用反胶束法制备纳米金通常采用的还原 剂主要是肼或n a b i - h 。反胶束中纳米微粒的形成过程一般包括化学反应阶段、成核阶段 和晶核生长阶段三部分。当含有两种不同反应物a 和b 的反胶束溶液混合后，由于胶束 之间的碰撞、融合、分离、重组等过程，使反应物在。水池”内互相交换、传递及混合， 在一个胶束中同时含有j 谛b 这两种反应物而发生化学反应，生成产物。含有产物分子 的胶束经无数次碰撞后，在“水池”中形成产物的过饱和溶液，达到一定过饱和程度就 会产生晶核粒子。由于生成的晶核粒子大小不均匀，小粒子的溶解度大，大粒子的溶解 度小，因而发生o s t w a l d 熟化( 即小粒子溶解，大粒子长大) 而使晶核逐渐长大，贮存 于反胶束“水池”中，形成纳米微粒【1 3 1 。 c h i a n g 等报道了在异新烷中表面活性荆气溶胶和非离子表面活性剂脱水山梨( 糖) 醇一油酸酯形成的微乳液中，用肼还原h a u c h 形成稳定的、各向异性的金纳米粒子【1 4 l 。 东北大学硕士学位论文 第一章引言 e s u m j 报道了在2 一乙烯基吡啶调聚物的存在下，在水中用n a b l - h 还原h a u c h 制得金纳米 粒子f 1 5 l 。u n 等报道了在c t a b ( c e t y l t d m e t h ya m m o n i u mb r o m i d e ) p 辛烷+ 卜丁醇反向胶 束中用n a b 阻还原h a u c l 4 制得金纳米粒子1 1 6 t 。s e l v a n 等也报道了用微乳液法制备金一聚 毗咯复合材料。金粒在聚合物中分散性良好，粒径在7 9n m 之间。m o r i 等在w o 型微乳 状溶液中以聚氧乙烯、十二烷基醚或双十二碳烯基二甲基溴化物乳剂为表面活性裁，还 原h a u c h n 得金纳米粒子i 埘。当采用不同的表面活性剂时，微乳液滴的大小主要由碳 链的长短来决定，从而控制纳米金的大小，其他控制步骤和反应条件就不需要再考虑了。 周学华等采用反胶束法制备了c l o n h 2 、c 1 2 n h 2 、c 1 6 n h 2 、c 1 s n h 2 不同链长脂肪胺修饰 的金纳米颗粒，通过分离后重新溶解并测量紫外可见吸收光谱，表明长链脂肪胺形成金 纳米溶胶的稳定性随着链的增长而增大，且链越长，制得的纳米颗粒粒径越小，粒径分 布越窄【1 8 l 。 液相法制得的纳米金颗粒粒径均一，分散性好，非常稳定，是很好的纳米材料，但 若要将其应用到生物标记检测方面，必须在水溶液条件下进行，所以必须将纳米金转移 回水相，需要反复用不同的有机溶剂和水溶液洗涤，所需工艺较多，回收率有限，浪费 试剂。液相法还有副产物多、制备过程存在污染等问题。 1 2 3 晶种生长法 随着对纳米金粒径范围要求的不断扩大，大粒径的纳米金制备受到了关注。由溶胶 法制备的纳米金粒径受到限制，人们在此基础上提出了晶种生长法。这斡方法是以小的 纳米颗粒为晶种，合成大纳米颗粒的方法。 n a t a n 首先探讨了这种方法【1 9 1 。先用柠檬酸钠还原h a u c h 制得粒径为5 0 + _ 5 r i m ，长短 轴之比为1 1 之间的水相金溶胶。以此金溶胶为晶种，加入适量的h a u c h 及羟胺，利用 金纳米粒子表面的自催化反应使晶种逐渐长大。通过控制适当的条件，可以制出粒径在 5 0 1 1 0 n m 之间的各种金纳米粒子。纳米金粒子的大小可以通过h a u c l 4 的量来控制。由 于大粒径的金溶胶易聚沉，反应完毕后需加入适量的聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 作为胶体 稳定剂。朱梓华等在n a t a n 反应的基础上，进一步扩大了粒径范围，制得了粒径为6 0 1 6 0i l r n 的一系列单分散金纳米粒子水溶胶例。h o s t e t l e r 等在烷基硫醇溶液中，用n a b i 丑 还原h a t t c l 4 制得了l 3 n m 的纳米金，离子的大小可以通过改变硫醇的浓度来获得1 2 1 j 。 将这样制得的金颗粒作为晶种加入到盐溶液中，通过调节晶种盐的比例，可以控制纳 米金的大小阎。 用液一液两相法、反相胶束法等也可以制备出小粒径的“晶种”，将这些“晶种” 5 东北大学硕士学位论文第一章引言 作为晶核，采用不同的液相制备方法可制备出单分散的同相或多相的纳米金粒子。 m a l l i c k 等用紫外光激发金盐和还原剂的方法制备出1 5 2 0 姗的金纳米粒子作为“晶 种”，进而制备出粒径为2 0 8 0n m 的金纳米粒子【2 3 1 。j a n a 等用晶种生长法制备出粒径 范围为5 4 0 n m 的单分散金纳米粒子，随后研究了晶种生长法得到的金纳米尺度的扁球 体在氰化钾溶液中的溶解前后形状的变化，以及在过硫酸铵水溶液中的热稳定性，认为 纳米粒子的稳定性和反应活性依赖于粒子的纵横l e t 2 4 1 。 制备金纳米粒子的方法除了上面介绍的几种之外，还有如电解法、多相反应法、水热 法、喷雾热解法、溶剂热法等【矧。由于应用不多，就不一一论述了。 1 。3 树状体( d e n d ri m e r ) 制备纳米金 随着纳米金的应用越来越广泛，对不同形态的纳米金需求越来越多，制各纳米金的 方法也越来越多，很多新型材料的应用也被开发出来。树状体是一种三维球状结构，通 常是聚合物，不同的树状体端基基团不同，有的是氨基，有的是羧基，但构型都比较相 似，基本成树枝状，多个树枝状结构由中心向外延伸，形成球状，因而我们常将其译为 树状体。 树状体( d e n d r i m e r ) 作为一种大分子，可以吸附在纳米金表面，由于它们带有相同 的电荷互相排斥，可以避免纳米金粒子团聚，目前已经开始作为保护剂应用到纳米金的 制备当中。用此种方法制得的纳米金，相对于用传统方法如柠檬酸钠还原法制得的纳米 金粒径较小。 图1 1 两种比较常见的树状体结构示意图 f i g 1 1 s c h e m e o f s t i i c t i l r e s o f t w o k i n d s o f c o l l l l n o n d e n d r i m e r s 同一类树状体是由相同的端基基团构成的，比如，p a m a m 的端基都是氨基，p p i 的端基都是亚胺基。具体含有多少端基是用“代”( g e n e r a t i o n ) 来区分的，也就是树状 6 东北大学硕士学位论文第一章引言 体的层有多少。代数越高，层数就越多，因此端基分为初级端基、次级基团等，以此类 推。 g 3 og4o(话0 图1 2 不同“代”的以氨基为端基的树状体结构示意图 f i g 1 2s c h e m eo fd i f f e r e n tg e n e r a t i o n so fa m i n og r o u pt e r m i n a ld e n d f i m e r g a r e i a 等采用树状体聚氨基胺( p a m a m ) 作为保护剂，用n a b h 4 还原出了稳定包 覆的2 3n l t l 纳米金颗粒，树状体包覆在纳米金表面，由于静电的吸附作用，纳米金粒 子可以稳定地存在。研究发现，低“代”的p a m a m 可以得到较大粒径的纳米金，这主 要是由a u 与树状体表面氨基端基基团的数量比率决定的。这个比率基本固定，p a m a m 的代越高，所需加入的p a m a m 就越少，制得的纳米金比较稳定。但太高级别的p a m a m 可能导致纳米金由于树状体之间的相互交联而聚集，通常使用第三、四代的树状体l 冽， 可以制得2 3 n n l 的纳米金。e s u m i 等也作了这方面的研究，发现纳米金的粒径与树状体 的浓度和代的大小有关，浓度越高，代数越大，制得的纳米金越小，当表面基团个数对 金盐摩尔数的比率大于1 时，可以制得稳定的纳米金粒子1 2 7 1 。另外，他们还对树状体表 面不同的甲基酯基团对制备纳米金的影响做了研究。在甲酰胺溶液中，树状体可以还原 出一定粒径范围的纳米金，再加入n a b h 4 可以使纳米金的粒径发生变化，粒径大小与树 状体的浓度和代数有关。在n ，n - - - 甲基甲酰胺溶液中，还原出的纳米金分散性更好瞄】。 w a n g 等人发现了一种带有4 - p y f i d o n c 功能基团的n 址l a m 作捕获剂。这样制得的纳米金 粒径随树状体“代”的增大而增大f 2 9 l 。 p a m a m 被用于制备纳米金已经有较长的时间了，g r o l m 等以它为模板，通过t e m 、 s a n s 和s a x s 研究了树状体制备纳米金的形态。纳米金粒子形成在树状体中心偏一点的 位置，被树状体包覆在里面。低代的树状体是几个树状体分子聚集在纳米金周围的，而 东北大学硕士学位论文第一章引言 高代的树状体( 第6 代到第9 代) 则是每个树状体分子内部含有一个金粒子，粒径的大小 取决于每个树状体分子中的金原予数，到第1 0 代时，一个树状体分子里就开始有几个小 的金纳米粒子了。这个模板反应初步证实了纳米金的反应机理。 s u n 等人用树状体p p i - g 3 【t h i r d - g e n e r a t i o np o l y ( p r o p y l e n e i m i n e ) d e n d r i m e r 时作为 保护剂和还原剂，通过加热它和h a u c l 4 的混合溶液直接制备出纳米金。p p i 在常温下就 可以将h a u c l 4 还原，这个反应过程需要几天甚至十几天，但如果加热的话，这个过程只 需要几分钟就可以完成，大大缩短了反应时间。该法制得的纳米金比较稳定，粒径范围 大约在3 3 0 n m 之间，可以放置几个月而不会发生沉聚。这个发现为纳米金的制备提供 了更广阔的前景i ”i 。 常用的树状体端基基团都是氨基或胺基基团的，d a l d o 等人发现了用巯基端基基团 的树状体也可以制备纳米金。树状体的代以及表面原子在树状体的位置，都会影响纳米 金的形成、大小以及稳定性，这样制得的纳米金比烷基硫醇制备的粒子周围所包覆的壳 厚度小得多【3 “。 k a z u t a k a 等人采用激光激发的方法，用p o l y ( a m i d o a m i n e ) ( p a m a m ) d e n d r i m e r s 和 p o l y ( p r o p y l e n e i m i n e ) ( p p 0d e n d r i m e r s 来制备纳米金，起还原作用的分别是树状体表面的 氨基和亚胺基基团。通过4 - 硝基酚的发泡作用，随着激光照射时间的增加，a u ( h i ) 不断 被还原，而且随着树状体浓度增加，生成的纳米金粒径减小。研究表明，树状体以单层 的形式吸附在纳米金表面，p p i f 时状体还原的反应速率要比p a m a m 树状体快，而且相同 “代”的p p i 树状体制各出的纳米金的粒径要比p a m a m 树状体制各的粒径小【3 3 】。 目前，树状体制备的纳米金已经得到应用，开始应用于电化学方法。e s u m i 研究组 已经开始将树状体制得的纳米金涂覆在玻碳电极上，用次氯酸钠循环伏安法做了电化学 研究。纳米金沉积在电极表面后，阳极峰和阴极峰电流都增加，为电化学检测提高灵敏 度提供了有效的途径【3 4 1 。k r a s t e v a 等人也利用纳米金p p i 组成的膜研究了第一代至第五 代的p p i 对纳米金制各的影响，通过原子力显微镜和f e - s e m 观测了膜厚度及纳米金粒径 大小，循环伏安法测定表明膜的电阻系数与树状体大小紧密相连，并随“代”的增加里 指数增大【3 5 】。 1 4 纳米金的应用 纳米金应用于生物领域弥补了现有标记物无力为生物检测提供最优的检测结果等各 方面的缺憾。纳米金粒子作标记物测定生物大分子的突出优点是利用自身的颜色作为检 测信号，这种信号具有长久稳定性，甚至是肉眼可见的，这就大大降低对信号检测的要 - 8 东北大学硕士学位论文 第一章引 言 求，进而简化整个测定过程。在生物分析中，金纳米粒子目前已开始应用于生物传感器、 药物开发、d n a 测序、免疫检测等领域。 1 4 1 纳米金的修饰 金纳米粒子作为标记物具有制备简单，化学性质稳定，可和多种生物分子( 抗体、 激素、蛋白质) 结合，易于标记的特点。不同粒度的金属纳米粒子还可实现多重标记。 把生物组分耦合或者修饰到纳米粒子表面主要有两种方法，第一是利用生物分子本 身的官能团或者衍生的官能团在纳米粒子表面进行连接；第二是把纳米粒子表面改性， 衍生出能够方便连接生物分子的官能团。 通常湿化学法合成的纳米金粒子在粒子表面都吸附有稳定剂( 柠檬酸根，膦或者巯 醇) 3 6 l ，这些稳定剂能够控制纳米粒子的增长以及抑制粒子之间的聚集，起到稳定作用。 柠檬酸根做保护剂时，生物分子可通过较强的键合配体直接与金纳米粒子连接。例如免 疫球蛋白( i g g ) 和血清白蛋白通过半胱氨酸残基上的巯基与纳米金连接i ”j 。 如果生物分子上没有这些基团，就需要对生物分子或是纳米金进行修饰。将纳米金 应用于生物检测通常要经过基团修饰，用于修饰的基团称为功能基团，常用的功能基团 有氨基、羧基、巯基以及醇等。这些基团或以共价键与纳米金连接，或通过静电吸附的 方式与纳米金结合，形成比较牢固的键合力，使生物大分子能够稳定地与纳米金粒子连 接，从而通过金纳米粒子的特性进行检测，以达到生物检测的目的。胡瑞省等通过控制 p h 值研究了不同基团与金纳米粒子的连接方式，证明了金纳米粒子通过静电吸附的方式 与氨基结合，以共价键的形式与巯基结合，比较来看，与巯基结合更稳定，当两种基团 同时存在时，巯基可以替代氨基从而改变金粒子的排列方式【5 , 3 8 1 。天然蛋白可以用化学 方法衍生巯基基团【3 9 】。同样也可在d n a 的3 或者5 端衍生巯基基团，把d 1 蛆固定到纳 米金粒子上。还可以用连有巯基磷腺苷的d n a 与金属纳米粒子直接反应 4 0 j 。 1 4 2 纳米金应用于d n a 检测 寡核苷酸特定顺序的测定对于基因和疾病的诊断非常重要。美国西北大学m i r k i n 教 授领导的研究小组在纳米金与d n a 片段之间相互作用方面作了大量深入细致的工作。 1 9 9 6 年他们首先发表论文，指出将d i q a 修饰的1 3n m 纳米金颗粒组装为宏观光谱材料， 通过巯基链接，与d n a 寡核苷酸结合在一起，自组装成为各种有用韵集合体。这种组装 过程在热交性条件下可逆，从而可以通过d n a 反应的特异性去控制不同粒径及组成的粒 子间的反应，应用于光学、电子学和与胶体链接的结构和性质等研究领域1 4 ”。 0 东北大学硕士学i - e 文第一章引言 次年，他们发表了以纳米金颗粒光学性质与粒子间距离的依赖关系为基础的测定多 核苷酸的比色方法。纳米金在可见区有特征等离子体共振吸收【4 2 l ，且其吸收峰的等离子 共振常随着尺寸的变化而发生频移，其溶液的颜色从橘红色到紫红色发生相应变化，有 利于肉眼观察。利用巯基修饰的寡核苷酸在一定尺寸的金纳米粒子上自组装，形成寡核 苷酸包裹的金粒子探针，见图1 。3 ( 。当金标记的探针与互补的靶寡核苷酸分子杂交时， 就形成了以d n a 杂交体为纽带的多个金纳米粒子构成的网状聚集物，见图1 3 ( b ) 。寡核 苷酸探针不仅按特定顺序与目标寡核苷酸结合，而且形成一个聚合网络，每一个受体单 元都连接着多个较短的双螺旋片断。随着杂交的进行，体系的颜色将随纳米粒子光学性 质的改变而改变，因为纳米金的光学性质部分依赖于它们在聚合网络中的距离，此距离 远大于粒子的平均直径时显红色，大致相等时，显蓝色i 张。这种变化是由金的表面等离 子体子共振引起的。杂交能使金粒子间距离缩短，产生相应的颜色变化，并形成纳米金 粒子的聚集体。因此，可由颜色的变化来判断是否发生了杂交。这种由纳米金寡核苷 酸探针目的多核苷酸片段组成的复合物点滴至固相支持物上时，由体系组装诱导的聚 集过程伴有红色到蓝色的颜色变化，由此衍生出快速检测特定多核苷酸序列的比色法。 这是一种无需分离杂交后来杂交探针的均相溶液测定法，具有很高的灵敏度，文献报道 可达至l j f m o l 的检测限m 。在高浓度靶分子存在下甚至用肉眼就可直接观察到结果。测定 不同大小的金纳米粒子的散射光，还可进行寡核苷酸阵列的多色标记和检测1 4 5 j 。 图1 3 纳米金修饰的寡核苷酸的比色法测序原理图 f i g 1 3 s c h e m e o f c o l o r i m e t r i c d e t e c t i o n b a s e d o i l t h e o l i g o n u c l o o t i d e - m o d i f i e d g o l d n a n o p a r t i c l e s 纳米金经过巯基修饰后，与修饰了氨基的d n a 寡核苷酸连接，具有相当的稳定性， 是纳米粒子标记d n a 寡核苷酸应用最广泛的。s t o r h o f f 等人用“尾对尾”链接模式的1 2 个碱基对系统，通过检测由于两个探针相遇处碱基堆积的程度不同而产生t m 的变化检 测出存在单碱基插入的序列m 。该小组在将其推广到瑚悄芯片中提高了检测的灵敏度 后，相继又将各种检测手段引入到标记了纳米金的生物检测中，如平台扫描仪、银显影 液信号放大技术，电检测技术等1 4 7 - 4 9 1 。他们还论述了影响q a 修饰的纳米金聚集体光学 1 0 东北大学硕士学位论文 第一章引 言 特性的各种因素，指出由于埘w l 双链结构的熔解温度由碱基序列、链长等因素控制，纳 米金体相材料与胶体溶液之间的可逆转换反映了d n a 分子的可逆变性行为。研究表明 d n a 修饰的纳米金颗粒组装体的光学特性决定于聚集体的大小，而与寡核苷酸的链长无 关【4 ”。这对于建立基于纳米颗粒的比色方法有重要的指导意义。周剑章等在金基底上用 阳离子聚电解质一一聚二烯丙基二甲基胺氯化物【p o l y ( d i a l l y l d i m c t h y l a r n m o n i u m c h l o r i d e ) ，p d d a l 自组装膜固定长链d n a 的方法，根据一些电活性分子与单链 d n a ( s s d n a ) 和双链d n a ( d s d n a ) 相互作用以及引起的电化学反应存在明显的差异， 利用这种差异发展了d n a 杂交的电化学标记方法t 5 们。利用自组装的d n a 模板可以实现 纳米粒子的一维排序，这样就可以对d n a 编码形成长链f 5 “。p o m p i 等人发现，纳米金在 与d n 越奎接后发生团聚，当加入带一个与靶序列互补的寡核苷酸链时发生可逆反应，这 条互补链上连了一个支链短序列，通过这种可逆反应，可以将纳米金重新释放出来1 5 引。 另外，k e a t i n 2 研究组的h e 等以及c s a i ( i 等都对金标记的d n a 检测进行了报道，提出新 的见解【5 3 5 4 1 ，并开始将其应用于实际检测，比如传染病的快速诊断及单核苷酸多态性( 基 因突变) 的检测。这种检测可以区别抗抗生素细菌( 如葡萄球菌) 和非抗抗生素细菌。 而且方法比较灵敏，以致不经p c r 扩增也可以检测到1 5 5 1 ，充分证实了d n a 检测所受到的 重视。 随着纳米金检测d n a 寡核苷酸的应用越来越广泛，不断有新的检测方式出现。有研 究表明，d n a 有静电吸附作用，在此基础上建立了一些新的d m 蝴4 序方法，u 等做了一 系列研究。他们先是利用单链d n a 可以吸附在带负电荷的纳米金表面面双链d n a 贝i 不 能吸附这个特性，将荧光染料与纳米金联用，建立了一种新的荧光标记法来检测d