第3代BiFC载体.doc

1 第三代第三代 BiFC （目的基因可以连接到（目的基因可以连接到YFPN/C上游或下游）上游或下游） 在 YFPN和 YFPC的 5和 3 端都有多克隆位点 MCS（1， 2， 3）, 可根据需要把目的基因装在适 合的位置。如果目的基因的结合域在靠近 N 端，可优先考虑接在 YFP 的 5端；如果目的基因的结 合域在靠近 C 端，可优先考虑接在 YFP 的 3端。 使用两组不可逆重组 LoxP 突变位点（LoxP1L/1R、Lox2L/2R）把 2 个表达盒整合在一个质粒 （LoxP1L 只能与 LoxP1R 不可逆重组；LoxP2L 只能与 LoxP2R 不可逆重组） ，可以大大提高 2 个表达盒的共转化效率。 在 NOS 终止子末端 EcoRI 位点旁增加 I-SceI 位点。 NE1L2L-nsI: MCS TCT AGA GTT AAC CGG GCT CAG GCC TGG CGC GCC ACT AGT GGA TCC ATC GAT AGT Xba I Hpa I Stu I Asc I Spe I BamH I Cla I ACT GTC GAC CTC GAG GGT ACC GCT CCC GGG ATG GAG CAA AAG TTG ATT TCT GAG Sal I Xho I KpnI /Acc65 I Xma I/ Sma I GAG GAT CTT ATG-YFPN-GCC GCG GAT GCT AGC GGC CGC AAG ATC TGG CCG GCC TGG SacII NheI NotI BglII FseI ApaI GCC CAC CGG TAA AgeI CE1RL2R-nsI: MCS TCT AGA GTT AAC CGG GCT CAG GCC TGG CGC GCC ACT AGT GGA TCC ATC GAT AGT Xba I Hpa I Stu I Asc I Spe I BamH I Cla I ACT GTC GAC CTC GAG GGT ACC GCT CCC GGG ATG-YFPC-AAG GCT AGC AAG ATC TGG Sal I Xho I Kpn I /Acc65 I Xma I/ Sma I NheI BglII CCG GCC TGG GCC CAC CGG TAA FseI ApaI AgeI MCS1 MCS2 MCS1 MCS3 2 操作流程操作流程 NE1L2L-nsI CE1R2R- nsI 将 2 种质粒等量混合，稀释成约 10ng/ul，取 1ul 转化 E. coli NS3529 （表达 Cre 酶）, Amp（50ug/ml） /Kam（25ug/ml）双抗平板筛选，37培养20h。或在平板培养12h 后（下午/晚上至第二天上午）混 收少量菌接种到 Amp（50ug/ml）/Kam（25ug/ml）-LB 液体培养基成 OD 约 0.5，再培养 68h（到傍 晚） 。 从平板混收菌，提取质粒，稀释成0.1ng/ul（过高浓度容易出现不同质粒的共转化，因此要避免高 浓度质粒转化） ，取 1ul 转化 E. coli DH10B (或 NS3529 以外的其它菌株)，Amp/Kam 双抗筛选。取单菌 落培养，提取和纯化质粒 在在(洋葱洋葱) 细胞瞬间表达细胞瞬间表达 用用 EcoRI 或或 I-Sce I 切出整个表达盒，连接到切出整个表达盒，连接到 pCAMBIA1300 或或 pCAMBIA1300(I-SceI) 农杆菌转化植物，恒定表达农杆菌转化植物，恒定表达 Rep LoxP1 LoxP2 3 注：I-SceI 位点是 17-base 非回文序列，切割产生的粘性末端也是非回文；在 pCAMBIA1300 的 MCS 中加入了 2 个 方向相反的 I-SceI 位点，酶切后载体的 2 个末端不能自连，因此不需要脱磷反应 NE-1L2Lns: 加加 I-SceI 位点位点 TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTC AGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGC ACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCC EcoRI AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAATTCATTACCCATTACCC TGTTATCCCTTGTTATCCCTA ACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGTATAAT TGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATC ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTATTA CE-1R2Rns: 加加 I-SceI 位点位点 TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTC AGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGC ACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCC EcoRI AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAATTCATTACCCATTACCC TGTTATCCCTTGTTATCCCTA ACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGTATAAT TGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCT