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微生物催化转化制备龙脑的初步研究 摘要 龙脑是香料和医药行业的重要原料。化学合成龙脑中异龙脑的含量较 高，从而影响了药效，而天然龙脑资源稀缺，价格昂贵。因此，制备与天 然龙脑成分更相似的龙脑产品值得关注。本文即是探索利用生物催化的选 择性制备龙脑的可行性。 本文首先尝试以蒎烯为原料制备龙脑。以0 t 蒎烯为底物，建立高效的筛 选模型，从土壤中筛选得至i j 4 0 株能以0 【蒎烯为唯一碳源生长的微生物菌株， 发现部分菌株转化q 。蒎烯的主要产物为马鞭草烯醇、桃金娘烯醇和乙酸龙脑 酯，其中有三株菌株能够直接转化0 【蒎烯生成龙脑或异龙脑，但含量较低， 需做进一步研究。其次，又以乙酸龙脑酯为底物，通过直接稀释涂布分离 和富集培养从采集的土样中共筛选得n 11 5 株微生物菌株。转化产物经t l c 、 i r 、g c m s 矛i g c 定性和定量检测，发现共有4 5 株菌株具有催化乙酸龙脑酯 水解生成龙脑的能力，部分菌株催化水解所产龙脑的正龙脑含量高于7 5 ， 比采用化学法水解提高10 以上，更接近于天然龙脑。这表明生物催化剂对 龙脑酯的水解过程具有立体选择性。 选取活性及传代稳定性较高的菌株s m 0 8 0 1l 、z j 0 8 0 2 a 1 和e 0 8 0 2 a 作为 目标菌株并进行菌种鉴定。菌株s m 0 8 0 11 、z j 0 8 0 2 a 1 和e 0 8 0 2 a 均为革兰氏 阴性菌；根据生理生化特性分析和1 6 sr d n a 序列同源性分析，进一步鉴定 s m 0 8 0 1 1 和z j 0 8 0 2 a 1 均为特氏克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a p l a n t i c o l a ) 。 对菌株s m 0 8 0 1 1 、z j 0 8 0 2 a l 和e 0 8 0 2 a 催化乙酸龙脑酯水解反应工艺条 件进行优化。发现初始p h 值，反应温度，摇床转速对菌株催化水解反应活 性影响较大，菌株s m 0 8 0 11 、z j 0 8 0 2 a l 与e 0 8 0 2 a 在3 0 。c ，1 2 5r r a i n ，p h 7 0 7 5 时进行水解反应可获较高转化率和产率，最高可分别达至1 j 5 4 5 和 4 0 5 ，正龙脑含量均可保持在7 8 。 关键词：伐蒎烯乙酸龙脑酯龙脑生物催化筛选 i i i n i t i a ls t u d yo np r e p a r a t i o nb o r n e o lb y m i c r o o r g a n i s mc a t a l y s i s t r a n s f o r m a t i o n a bs t r a c t b o r n e o li sa ni m p o r t a n tm a t e r i a li nf l a v o ra n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y i t c a nb eo b t a i n e df r o mc h e m i c a ls y n t h e s i s ，h o w e v e r , w h i c hc o n t a i n sm o r e i s o b o m e o la n dt h u sh a sa no p p s i t i e so nt h ed r u ge f f i c a c y t h er e s o u r c eo fn a t u r a l b o m e o li sv e r ys c a r c e ，s on a t u r a lb o r n e o li sh i g hi np r i c e t h e r e f o r e ，i ti sw e l l w o r t ha t t e n t i o nt op r e p a r eap r o d u c tt h a ti ss i m i l a rt ot h en a t u r a lb o r n e o li n c o m p o n e n t i nt h i sp a p e r , af e a s i b i l i t i e si n v e s t i g a t i o no nu s i n gs e l e c t i v ec a t a l y t i c b yb i o c a t a l y s tt op r o d u c eb o m e o lw a sr e s e a r c h e d f i r s t l y , p r e p a r a t i o nb o r n e o lu s i n gp i n e n ea sm a t e r i a lw a st r i e d a ne f f i c i e n t s c r e e n i n gm o d e lw a sb u i l t a n d4 0s t r a i n sc a p a b l eo fm e t a b o l i z i n go 【一p i n e n ea s s o l ec a r b o na n de n e r g ys o u r c ew e r ei s o l a t e df r o ms o i l i tw a sf o u n dt h a ts o m eo f t h es t r a i n sc o u l db et r a n s f o r m a t e0 c p i n e n et ov e r b e n o l ，m y r t e n o la n db o m y l a c e t a t ea sm a jo rp r o d u c t s ；o fw h i c ht h r e es t r a i n sa l s ob i o t r a n s f o r m a t e d 仅一p i n e n e t ob o m e o la n di s o b o m e o ld i r e c t l y , b u tt h eb o r n e o lw a sl o wi nc o n t e n t ，a n di t n e e d st ob ef u r t h e rs t u d i e d b e s i d e s ，b o r n y la c e t a t ei n s t e a do fa - p i n e n ea s s u b s t r a t e ，115s t r a i n si nn u m b e rw e r eo b t a i n e db yd i r e c t l ys p r e a do re n r i c h m e n t c u l t u r e ，o f w h i c h4 5s t r a i n sh y d r o l y s e db o r n y la c e t a t et ob o r n e o la n di s o b o m e o l a sd o m i n a t i o np r o d u c t sd e t e c t e dq u a l i t a t i v e l yb a s e do nt l c ，i r ，g c m sa n d g c m o r et h a n7 5 b o m e o lw a sg a i n e db ys o m es t r a i n s ，b e i n gh i g h e r10 t h a n i i i t h a tp r o d u c e db yc h e m i c i a lh y d r o l y s i s ，a n ds i m i l a rt ot h a to fn a t u r a lb o m e 0 1 i t w a si n d i c a t e dt h a tb i o c a t a l y s th a dc e r t a i ns e l e c t i v e l yf o rt h ep r o c e s so fb o m y l a c e t a t e h y d r o l y s i s t h es t r a i n ss m 0 8 011 ，z j 0 8 0 2 a1a n de 0 8 0 2 aw e r ec h o s e na sa i ms t r a i n s b e c a u s eo ft h e i rh i g h e r a c t i v i t ya n dh e r e d i t a r ys t a b i l i t y , a l lo ft h e mw e r e i d e n t i f i e da sg r a mn e g a t i v eb a c i l l i o nt h eb a s i so fp h y s i o l o g i c a l - b i o c h e m i c a l a n d16 sr d n as e q u e n c eh o m o l o g o u sa n a l y s i s ，b o t hs m 0 8 011a n dz j 0 8 0 2 a 1 w e r ef u r t h e ri d e n t i f i e dt ob ek l e b s i e l l ap l a n t i c o l a t h er e a c t i o nc o n d i t i o n so fh y d r o l y s i s c a t a l y s e db ys m 0 8 0 11 ，z j 0 8 0 2 a1 a n de 0 8 0 2 aw e r eo p t i m i z e d v a r i o u sr e a c t i o np a r a m e t e r ss u c ha si n i t i a lp h ， t e m p e r a t u r ea n ds h a k i n gr a t ew e r ef o u n dt og r e a t l yi n f l u e n tt h ec o n v e r s i o na n d y i e l d u n d e rt h ec o n d i t i o no fp h7 - 7 5 ，t h et e m p e r a t u r eo f3 0o c ，a n dt h e s h a k i n gr a t eo f12 5r m i n ，t h ec o n v e r s i o no f5 4 5 a sw e l la st h ey i e l do f 4 0 5 w a so b t a i n e d w h i l eb o r n e o lc o n t e n tc o u l dm a i n t a i na t7 8 k e y w o r d s ：0 【一p i n e n e ；b o m y la c e t a t e ；b o m e o l ；b i o c a t a l y s i s ；s c r e e n i n g i v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：飞罗蔼韵 学位论文使用授权说明 月细 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 文口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 敝作者始吼苇1 导师虢痢? 广西大学硕士掌位论文微生物催化转化制畚龙脑的初步研究 1 1 生物催化与生物转化概述 第一章绪论 生物转化( b i o t r a n s f o r m a t i o n ) 是指通过植物、动物或微生物细胞或纯化的酶作为催化 剂，通常用于进行复杂底物的专门转化【l 】。生物转化在生成新产物或更有效地生产已知 产物等方面具有非常大的潜力。世界经合组织( o e c d ) 曾指出：生物催化技术是工业可 持续发展最有希望的技术【2 1 。近年来，随着基因组学、蛋白质组学等生物技术的飞速发 展，极大地推动了生物转化与生物催化的基础研究和应用研究。 1 1 1 生物转化的特点与应用 生物转化包括酶法转化和微生物转化，微生物转化的本质实际上也是通过微生物体 内的酶系进行的酶催化转化。相比于传统的化学催化方法，生物转化具有一些不同的特 占 具有高度的立体选择性。生物转化反应是一种酶催化的反应，酶对底物作用时，具 有高度的选择性【3 ，4 】，在对结构的化学选择性( c h e m o s e l e c t i v i t y ) 和非对映异构体选择性 ( d i a s t e r e o t o p e s e l e e t i v i t y ) ，以及严格的区域选择性( r e g i o s e l e c t i v i t y ) ，面选择性 ( f a c e s e l e c t i v i t y ) 及对映异构体选择性( e n a n t i o p e s e l e c t i v i t y ) 等方面都有较高的选择性。 生物转化反应条件温和，设备简单，公害少，而且反应速率快。生物转化反应一般 都在常温和p h7 o 左右进行，无需苛刻的高压、强热等条件。因此，反应所需设备简单、 条件温和、生产安全。反应原料除底物和普通培养基外无需其他化学品，故一般无公害。 并且酶催化反应速度快，在最适条件下，酶可在一秒钟内使1 0 2 1 0 6 个底物分子转化成 产物i 5 。 微生物转化收率高，成本低。微生物转化反应是在全细胞内进行，保持原有整体的 酶系统，较符合生物催化所需的环境与条件，即在催化反应时不需添加辅酶，因为微生 物细胞本身具有辅酶再生能力；这克服了酶催化时需要外加辅酶的困难，而辅酶非常不 稳定，难以分离制取，且价格昂贵，是酶催化反应的主要难题之一；同时，微生物转化 反应能持续进行，反应量大，收率高，可大规模工业生产，加之设备和原料简单、易得 等优点，其生产成本不仅低于酶法合成，并且也低于化学合成【6 】。 微生物转化可以减少反应步骤。通过酶合成基因构建所得的基因工程菌，可将需几 广西大掌硕士掌位论文微生物催化转化制畚龙脑的初步研究 步催化的中间体在一步反应中转化完成。若能通过基因重组技术将合成各步中间体转化 酶的合成基因构建于同一个工程菌中，则可在转化时实现需几步催化合成的中间体一步 转化成功。 由于生物催化过程具有以上所列的高效、高选择性、条件温和、环境友好等优点， 因此其将成为可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。由此，生物 催化转化在手性药物中间体合成，香精香料的制备以及通过组合生物催化开发新药等方 面的应用将越来越广泛【7 1 。 1 1 2 生物转化反应的类型及催化剂 选择生物催化剂的类型和底物用于进行区域、立体和对映选择性和底物特异性反 应，反应的类型和立体化学结构取决于底物上的功能基团及其临近的部分结构。生物转 化反应的反应类型主要包括以下几个【1 , 8 , 9 】： 羟基化：一些植物细胞常用于通过导入氧官能团在分子的不同部位区域和立体选择 性地羟基化外源底物。 糖基化：糖基化反应可产生新的糖苷，能使水不溶性物质变成水溶性的物质。 醇和酮间的氧化还原：在一些生物催化剂的作用下，醇可转化为相应的酮，而酮 或醛也可被还原成相应的醇。 c = c 双键的还原：碳碳双键可加氢还原成饱和的碳碳单键。 环氧化：碳碳双键可经氧化反应形成环氧化的物质。 水解：生物催化对选择性水解消旋混合物的光学和动力学拆分非常有效。 在进行各种生物催化转化反应时，采用的催化剂有三种形式【1 0 】，分别为植物细胞、 微生物细胞和酶。 植物组织细胞培养液是一类新的生物转化系统，能对映选择性地将外来底物转化。 在该转化系统中，可直接用植物悬浮细胞作为催化剂；也可将植物细胞固定化后进行催 化；还可以毛状根培养物作为催化系统进行转化。 用微生物细胞作为催化剂主要是通过微生物代谢过程中产生的酶催化底物发生的 反应。微生物细胞的增殖比植物细胞更快，基因转化表达、基因重组、原生质体融合也 比动植物细胞容易成功，所以整个过程可实现自动化、连续化，转化效率更高。 催化同一反应时，利用从生物体系中提取得到的酶制剂进行的生物转化比直接利用 微生物全细胞催化具有更高的活性。 2 广西大掌硕士掌位论文微生物催化转化制畚龙脑的初步研究 1 2 龙脑概述 1 2 1 龙脑的结构及性质 龙脑( b o m e 0 1 ) 3 l 名冰片，由羟基所在空间位置不同形成了相应的立体异构体。龙脑 为无色半透明的六方片状结晶体，其分子式c l o h l 8 0 ，分子量为1 5 4 2 5 ，化学名1 ，7 ，7 三甲基双环 2 ，2 ，1 庚2 醇【l l ，12 1 。龙脑的化学结构如图1 1 所示。 6 5 o h 4 图1 1 龙脑的结构 f i g 1 - 1b o m e o l ss t r u c t u r e 从图1 1 可看出，龙脑在化学结构上系莰2 醇，其分子结构中有c 1 ，c 2 ，c 4 三个 不对称碳原子，但c 1 与c 4 被c 7 基团所固定，整个环就像一个不对称碳原子，因此它有 四个异构体即d 龙脑，1 龙脑，d 异龙脑和1 异龙脑，如图1 2 所示。正龙脑和异龙脑的 结构非常相似，正龙脑具有内向构型( e n d o - c o n f i g u r a t i o n ) ，而异龙脑则具有外向构型 ( e x o c o n f i g u r a t i o n ) 。 h h o h i 正龙脑 h o h d 一正龙脑 d 异龙脑 o h h i 异龙脑 图1 2 龙脑的构型 f i g 1 2b o m e o l sc o n f i g u r a t i o n 龙脑易溶于乙醇、乙醚、汽油和氯仿等溶剂，但不溶或微溶于水。纯天然右旋龙脑 的b 】苫+ 3 4 - 3 7 7 ( c 2 h s o h ) ，左旋龙脑的k b 一3 和3 7 7 ( c 2 h s o h ) ，右旋龙脑熔点2 0 8 o c ，沸点2 1 2o c ，左旋龙脑熔点2 0 4o c ，沸点2 1 0o c 。 1 2 2 龙脑的性能及作用 龙脑最重要的用途是药物，在本草纲目和中国药典( 1 9 9 5 年版) 中均有使用记载。 3 广西大掌硕士掌位论文微生物催化转化制备龙脑的初步研究 中医认为其味辛、苦，微寒，归心、脾、肺经，具有开窍醒神，清热止痛之功效，是世 界上最早应用的天然有机成分药物之一1 1 引。龙脑的来源有天然龙脑和合成龙脑。天然龙 脑中正龙脑的含量较高，具有有强烈的清凉感，具有开窍、醒神、散郁火、清热止痛、 去嗡明目等功效，常用于中风口噪，喉痹齿痛、口疮痈疡、目赤等的治疗。而合成龙脑 中含有较多的异龙脑。研究工作者对龙脑的药理作用进行了研究，发现龙脑对中枢神经 兴奋性有较强的双向调节作用，既有镇静安神作用，又有醒脑作用”1 6 】；可以通过改善 缺血脑组织的血氧供应，进而改善该区域的能量代谢，起到对脑缺血的保护作用；能减 少微血管内皮上细胞间黏附因子( i c a m 一1 ) 表达，对内皮细胞有保护作用【17 1 ；具有抗炎 及止痛【l8 j 和抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、草绿色链球菌、肺炎球 菌和大肠杆菌等在试管内均有明显抗菌作用；对粉小孢子菌、裴氏着色真菌、孢子丝菌 的抑菌作用较强【1 9 】；l 8l d 5 0 计量的龙脑乳液对晚期妊娠有明显引产作用【2 0 】；同时，龙 脑还能促进其他药物的透皮吸收1 2 1 】；对神经胶质细胞的分裂和生长有促进作用2 2 1 。此外 龙脑还有去腐防腐，驱避虫类的效力。他们还发现在药用效果方面，正龙脑和异龙脑的 作用是相似的：正龙脑和异龙脑在抗菌、止痛、抗生育等方面效果一致，而在抗炎作用 上异龙脑比正龙脑效果更显著【2 0 2 3 。但是，在医药上一般认为异龙脑的副作用比正龙脑 大。因此，正龙脑的制备具有良好的前景。 龙脑的应用除医药处方外，还广泛应用于化妆品、日用品和饮料如浴用剂、室内清 香剂、牙膏、墨汁、薰香剂、口腔清洁剂、消毒杀菌剂等。由于正龙脑的香味优于异龙 脑，故在香料和化妆品工业上正龙脑的用途比异龙脑大。市场上正龙脑价格比异龙脑贵， 根据s i v a 公司发布价格【2 4 1 ，纯度为9 8 的天然龙脑价格为8 0 0 0 0 0 元吨，而医药级的合 成龙脑售价仅为5 8 0 0 0 元吨，正龙脑含量约8 5 的龙脑1 0 0g 售价为3 9 美元。龙脑也是 名贵的定香剂和配制高级香水的重要原料，以及合成香料制造龙脑酯类的香原料，并且 还用于坚果和调味等实用香精【2 5 1 ，在饮料工业上还能作为清凉添加剂。随着龙脑的研究 不断深入，研究成果的不断普及，人们对龙脑的认识将逐渐深入，龙脑在各个领域的作 用也将不断拓宽。 1 3 龙脑的制备 龙脑可以从天然植物中提取得到，也可以通过催化合成法制备。 4 广西大掌硕士掌位论文微生物催化转化制备龙脑的初步研究 1 3 1 从植物中提取龙脑 从植物中提取得到的龙脑被认为是天然龙脑。天然龙脑为龙脑香科植物龙脑香树脂 的加工品或树干及树枝经水蒸馏升华，冷却后所得的结晶( 龙脑冰片) ，该植物主产于印 度尼西亚的苏门答腊等地【2 6 1 。利用及其它植物的枝叶采用水蒸气蒸馏的方法提取天然龙 脑时，提取的精油得率只有o 3 4 2 0 6 ，精油中天然龙脑含量为7 0 左右【1 1 ，2 7 1 。近来， 我国科研人员发现了三种樟科植物江西的已趋濒危而经济价值高的一个种内新类 型樟树龙脑樟、湖南新晃县油樟的一种化学型龙脑型植物、阴香的一种化学型 梅片树，并成功利用其叶子提取天然右旋龙脑【2 6 1 。当然，其它植物的叶子和花也可 能含有龙脑，但龙脑的含量很低，不易得到。虽然这些芳香植物树叶生长周期短，在人 工培植的作用下在一定程度上能提高天然龙脑的得率，但是能提取天然龙脑的植物资源 稀缺，天然龙脑的含量低，一般只有百分之几左右，再加上生产成本高，远远不能满足 其人们对龙脑的市场需求【2 8 】。 1 3 2 化学法合成龙脑 由于从植物中提取的天然龙脑不能满足人们的需要，人们研究和开发了合成龙脑。 合成龙脑原料易得，价格低廉，很大程度上代替天然龙脑，以满足市场上的需求。一个 多世纪以来，人们广泛开展了龙脑合成方法的研究，归纳起来主要有以下几种2 9 。3 1 。 1 3 2 1 无水草酸酯化一皂化二步法 以松节油为原料，无水草酸酯化一皂化二步法是目前国内外制备龙脑的主要方法。 该法是利用从松节油中分馏得到的a 蒎烯与无水草酸在硼酐和醋酐的催化下发生酯化 反应生成草酸龙脑酯、双戊烯、二聚萜烯等轻油分。蒸去轻油后加苛性碱液皂化，获得 游离龙脑。经蒸汽蒸馏龙脑与聚合物分离，再经升华结晶等方法精制得商品龙脑。该工 艺存在的主要问题是酯化反应剧烈放热，难以控制，于5 0o c 投料，无水草酸需分六批 加入并不断采取冷却措施，操作极不便，且生产过程有爆炸危险，原料消耗大，产品质 量差，生成的龙脑产品中异龙脑含量常高达3 0 4 0 。 1 3 2 1 氯乙酸法合成龙脑 该法主要是把传统的酯化剂换为氯乙酸。酯化反应稳定，易于控制，生产安全，所 得龙脑产品中正龙脑含量较高，但选择催化剂时要尽可能避免生成异龙脑酯副反应的发 生，且反应时间长，原料循环周期过长。 5 微生物催化转化制备龙脑的初步研究 1 3 2 3 苯氧乙酸酯化一水解法 松节油中的q 蒎烯与苯氧乙酸反应生成苯氧乙酸龙脑酯，然后在碱性条件下水解 即得到龙脑。此法存在酯化反应较困难、原料转化率低、工业应用难度大等缺点。 1 3 2 4 旺蒎烯直接水合法 主要是将原来酯化和皂化这两步反应合二为一，即利用蒎烯在催化剂作用下直接发 生水合反应，大大简化了生产工艺。但在a 蒎烯的直接水合反应中，龙脑一般只是一种 副产物，含量只有百分之几。 1 3 2 5 樟脑还原法 该法是以天然樟脑为原料，在还原剂作用下将樟脑还原为两个差向异构的仲醇一异 龙脑和龙脑，还原剂是金属钠、铜、钴、c u c r 合金、液氨+ 金属钠、氢化锂铝、烷基 氢化铝等，或采用电还原法。有人研究用硅烷由樟脑制得龙脑，在r h c i ( p p h 3 ) 3 催化下， 樟脑与硅烷作用生成硅醚，继之水解即得到龙脑。此法制得的龙脑中，异龙脑的含量高 达7 3 9 0 。若在同样条件下，使用硅烷( c h 3 c h 2 ) 3 s i l l ，则异龙脑的含量将下降为3 5 ， 但此法生产成本较高，产品中的异龙脑含量仍较甜3 4 。7 1 。 另外还有有机镁化合物分解法、固体酸催化法【3 引、纳米催化法【3 9 j 、异龙脑异构化转 正龙脑【4 0 j 等。 化学合成龙脑中正龙脑的含量约为6 0 6 5 ，异龙脑含量约为3 5 , - - 4 0 ，故产品的光 学活性差，药效较差，毒性较大，某些急救、儿科用的中成药仍采用天然龙脑入药，化 学合成龙脑不能满足人们对正龙脑的需求。 1 3 3 生物法制备龙脑 利用生物方法，通过微生物的转化或酶的催化作用，也可以制备得到龙脑。与化学 法相比，由于生物技术发展较晚，在某些领域还没有成熟，生物法制备龙脑还是在实验 室研究阶段，报道也不多。生物法制备龙脑，所用的原料主要是蒎烯、龙脑酯及其它单 萜类化合物。 1 3 。3 1 由蒎烯生物转化制备龙脑 生物转化0 【蒎烯和p 蒎烯可得到龙脑，由于该转化需要经历一个扩环过程【4 1 1 ，蒎烯 的结构发生改变而不容易进行，所以通常蒎烯有多种转化途径，而龙脑不是主产物，且 其含量很低。 对蒎烯的微生物转化研究始于上世纪6 0 年代初。1 9 6 0 年，b h a t t a c h a r ) ，) ，a 等m 报道了 6 广西大掌硕士掌位论文微生物催化转化制备龙脑的初步研究 微生物对c y , 蒎烯的生物转化。1 9 6 2 年，p r e m a 等【4 3 】报道了用黑曲霉n c i m 6 1 2 等6 株霉菌 分别对q 蒎烯进行转化；随后，b h a t t a c h a r y y a 4 4 】和s h u k l a 等【4 5 】又相继报道用黑曲霉、假 单胞菌等微生物对a 和p 蒎烯的生物转化，所得产物中均有龙脑生成。 1 9 7 4 年，d h a v l i k a r 掣4 6 】发现培养基是影响单萜生物转化的一个重要因素，转化产 物取决于培养基的成分，当利用假单胞菌p s e u d o m o n a ss p 转化p 蒎烯时，在s e u b e r t s 培养 基中得到的主要产物是龙脑，而在c z a p e k d o x 培养基中得到的主要产物为反松香芹醇。 1 9 8 2 年，日本学者n a r u s h i m a 掣4 1 】通过富集分离的方法，从土壤中分离出一株能以q 蒎烯为唯一碳源生长的假单胞菌，其对0 【蒎烯进行转化，得到柠檬烯、龙脑、樟脑、紫 苏酸、2 ( 4 一甲基3 环己烯) 丙酸等，并通过比较该菌株对0 【蒎烯、p 蒎烯、龙脑、樟脑、 和孟烷衍生物的氧化转化，初步确定0 【蒎烯的代谢途径之一为0 【蒎烯龙脑樟脑途径。 1 9 8 8 年，瑞典学者l e u 向e n 等m 通过将从甲虫五粥卯卿厅螂分离得到一株酵母菌置 于在韧皮组织培养基中培养进行生物转化氧化蒎烯，得到的主要氧化产物为0 【松油醇和 龙脑，韧皮培养基中龙脑的含量高达9 5 肛g ( 5 0m e ) 一，仅次于0 【松油醇，远高于萜品烯4 醇、桃金娘烯醇等。 1 9 9 4 年，南京林业大学王飞等【4 8 1 采用一株自行分离筛选得到的桔青霉n f u 9 0 1 及其 诱变株u v ( 0 1 ) 对伐蒎烯进行生物转化，发现a 蒎烯的转化产物主要是马鞭草烯醇( 7 5 ) ， 而龙脑的含量只有2 4 和4 。 。 1 9 9 8 年，k n g s 等【4 9 】也报道了生物转化0 【蒎烯获得龙脑。 2 0 0 1 年，美国学者y 0 0 等例从土壤中分离出能够以0 【一或p 蒎烯为唯一碳源生长的一 株假单孢菌，对0 【蒎烯和p 蒎烯进行生物转化时都得到柠檬烯、尸伞花烃、a 萜品油烯、 萜品烯4 醇、0 【松油醇、内龙脑和尸伞花烃8 醇等产物，但龙脑的含量远低于含量最 高的p 伞花烃；他们【5 1 】在研究蒎烯的转化产物对菌株的影响时，发现a 一萜品醇和龙脑的 加入会抑制该菌的生长，因此推断转化反应中蒎烯的主要代谢途径为开环反应，所得龙 脑并非主要产物，因此产量很低。 2 0 0 4 年，瑞典学者l i n d m a r k h e n r i k s s o n 掣5 2 1 研究发现，不管是纯对映体或消旋体的 p 蒎烯，当用p i c e aa b i e s 悬浮细胞培养时，都主要转化为反松香芹醇，还有微量产物桃 金娘烯醇，q 松油醇，松香芹酮，桃金娘烯醛和龙脑，这与一些文献【4 5 4 6 1 报道的结果有 相同的产物。 蒎烯是化学法合成龙脑时应用最广泛的原料。而以蒎烯为原料进行生物转化可以制 备龙脑，说明自然界的微生物中存在能催化蒎烯转化生成龙脑的酶；但是从文献报道的 7 广西大掌硕士学位论文微生物催化转化制畚龙脑的初步研究 结果中可以发现，龙脑往往只是作为转化产物中的一个副产物，因此产量都较低。若能 寻找到能够专一性或选择性转化蒎烯生成龙脑的微生物，则以丰富的蒎烯为原料，通过 生物转化的方法制备龙脑的产率将会大大地提高。 i 3 3 2 由龙脑酯生物催化水解制备龙脑 利用微生物催化龙脑酯水解获也可以得到龙脑，水解过程往往伴随着氧化反应的发 生，在得到龙脑的同时，还会得到羟基化的乙酸龙脑酯。 2 0 0 0 年，z h u 等【5 3 】利用植物p 9 彩门“聊h a r m a l a 细胞培养液生物转化萜类和非萜类化 合物时，催化乙酸龙脑酯水解得到龙脑，并发现转化率与细胞浓度、底物浓度及结构有 关。 2 0 0 1 年，日本学者m i y a z a 、v a 和m i y a s a t o 【5 4 】利用植物寄生真菌g ，d 朋p r p 刀白c i n g u l a t a 爿e 物转化( + ) - 和( ) 一乙酸龙脑酯，分别在c 5 位置导入羟基，氧化得到构型不变的( + ) 和( ) 5 外羟基乙酸龙脑酯，并进一步氧化为( + ) 和( ) 5 羰基乙酸龙脑酯，同时也分别水解得到 ( + ) 和( ) 龙脑，菌株对底物转化有较高的专一性。 2 0 0 5 年，伊朗学者s h a m s a r d a k a n i 等 5 5 1 利用g 批沙砌切咖6 ml 悬浮培养生物转化 萜烃及其相关化合物时，由( ) 乙酸龙脑酯水解得到内龙脑和异龙脑，其中内龙脑含量 很高，并发现该水解反应会发生一定的异构化，但没有其他的副产物；转化速率与底物 浓度、p h 值、温度等因素有关。 同年，意大利学者n a n o 等【5 6 】利用三株担子菌生物转化( ) 乙酸龙脑酯，发现其代谢 途径主要为水解和氧化，具有高的效率、高的区域选择性和立体选择性，5 夕卜- 羟基乙酸 龙脑酯为主要的转化产物；水解得到( ) 龙脑，并进一步氧化为樟脑和5 或6 - 夕卜羟基龙 脑；氧化反应除了得到5 - 夕卜羟基乙酸龙脑酯外，还有其进一步氧化的产物和6 - 夕f 、羟基 乙酸龙脑酯等；同时发现菌株c o l l y b i av e l u t i p e s 和t r a m e t e sh i r s u t a 的活性很高，4 天后乙 酸龙脑酯的转化率达9 0 ，并对c 5 位置具有高度的优先选择性，5 _ 夕 - 羟基乙酸龙脑酯 的含量一直保持最高；而g a n o d e r m aa p p l a n a t u m 转化较慢，但开始3 天内水解产物 龙脑的含量却远高于羟基化产物5 - 夕 羟基乙酸龙脑酯。 1 3 3 3 由其它单萜类化合物生物转化制备龙脑 生物转化其它单萜类化合物也可得到龙脑。报道较多的单萜就是香叶醇，其衍生物 香叶基焦磷酸酯在多种酶的催化下环合可以得到龙脑。该法制备龙脑的报道不多，龙脑 会在其脱氢酶作用下氧化为樟脑，或酯化为乙酸龙脑酯。 1 9 8 1 年，美国学者c r o t e a u 等【5 7 1 利用从未成熟鼠尾草( 勋知扬q 历c 删西) 的叶子中提取 8 广西大学硕士掌位论文微生物催化转化制各龙脑的初步研究 的酶催化香叶基焦磷酸酯环化生物合成樟脑的过程中，发现该过程经历了龙脑焦磷酸酯 和龙脑中间体，并由龙脑脱氢酶催化得到樟脑。若能使龙脑脱氢酶失活，得到的产物应 该是龙脑。随后，他们【5 8 石o 】由酶催化香叶基焦磷酸酯生物合成莰烯时，发现酶环化香叶 基焦磷酸酯过程中经历了龙脑正离子。 1 9 9 8 年，美国学者a d a m 等【6 l 】利用不同产地的蛇苔cc o n i c u m 菌株单细胞催化环合 香叶基二磷酸酯时，提取得到可溶性单萜环合酶，并发现来自欧洲蛇苔的菌株含有桧烯 合成酶，催化产物主要是( ) 桧烯；而北美蛇苔的菌株因其龙脑二磷酸酶的高活性，得 到的产物主要是( + ) 乙酸龙脑酯，认为香叶基二磷酸酯先环合为龙脑二磷酸酯，水解得 到龙脑，再乙酰化得到( + ) 一乙酸龙脑酯，并证明了产物中( + ) 龙脑的存在。 2 0 0 2 年，s c h w a b 等【6 2 j 报道了( ) 柠檬烯合成酶，( + ) 龙脑二磷酸酯合成酶和( ) 蒎烯 合成酶的催化环化机理，( + ) 一龙脑二磷酸酯由香叶基二磷酸酯异构为中间体3 r 芳樟基二 磷酸酯，在( + ) 一龙脑二磷酸酯合成酶催化下环合得到，为香叶基二磷酸酯合成龙脑提供 了依据。2 0 0 7 年，k a r p - 等1 6 3 】通过合成香叶基二磷酸酯的类似化合物研究单萜环化酶的抑 制情况，使香叶基二磷酸酯生物合成蒎烯和龙脑的萜类化合物的机理更明确。 萜类化合物对微生物具有抑制作用，且水溶性不好，使生物法合成龙脑的研究得不 到推广。由于天然龙脑存在资源稀缺，目前合成龙脑的生产和消费量很大，但与天然龙 脑相比，合成龙脑中正龙脑的含量较低，因此合成龙脑远不能满足市场对正龙脑的需求； 所以制备出与天然龙脑成分更相似的龙脑产品显得非常之重要。天然龙脑来源于生物， 因此通过生物法制备龙脑将是很有前途的方法，所得的产品也将更接近天然龙脑。 1 4 课题的研究意义及目标 1 4 1 选题意义 龙脑是香料和医药工业重要的原料，我国是生产和出口龙脑的大国。但目前化学合 成的龙脑中，异龙脑的含量较高，药效较差，毒性较大，因此无法满足人们对正龙脑的 需求。随着人们环保意识的增强和生活质量的提高，回归自然已是人心所向，而天然龙 脑的资源稀缺，因此，制备出天然龙脑成分更相似的产品更显得重要。采用生物转化或 催化的方法具有较高的选择性，且反应条件温和，无毒，环境污染小，符合绿色化学发 展的要求。而通过生物法制得的产品，往往被认为更接近天然产物。因此，若能够通过 生物转化或生物合成的方法制备出正龙脑含量更高的龙脑产品，将会对龙脑的应用提供 9 广西大学硕士学位论文微生物催化转化制备龙脑的初步研究 更广阔的空间。 广西是我国松节油原料和产品生产的主要省份之一，若能通过生物催化或生物转 化，发挥当地的松节油及其下游产品的资源优势，以蒎烯或者其它单萜为原料，制备出 品质更高更接近天然龙脑的产品，将为龙脑的制备、开发提供一条新的途径，同时也将 促进当地的经济的发展。 1 4 2 研究内容 本文拟通过建立适当的筛选模型，从采集的土壤中筛选到能利用蒎烯或乙酸龙脑酯 为唯一碳源生长、生物转化底物生成龙脑、且有较高选择性的微生物菌株；并对选定的 菌株进行鉴定及初步优化菌株催化的反应条件。本文研究的主要内容拟安排如下： 土壤中原始菌种的筛选及鉴定。在不同的地方，从萜类化合物含量较丰富的环境中 采集土壤和树叶及树枝样品，经适当处理后，通过两条路线即选用蒎烯或乙酸龙脑酯为 唯一碳源，通过建立合适的筛选模型和方法进行实验原始菌株的筛选。并通过对筛选所 得的菌株进行催化转化实验以检测菌株的催化活性及稳定性，选取活性和稳定性较高的 菌株作为目的菌株，并进行菌种鉴定。 产物的鉴定。借助各种检测手段，如薄层色谱( t l c ) 、红外光谱( i r ) 、气相色谱( g c ) 及气相色谱质谱联用技术( g c m s ) 等，对菌株催化底物转化反应的结果进行定性和定量 的分析，鉴定所得产物可能的结构。 菌株催化乙酸龙脑酯水解制备龙脑工艺条件的优化。初步探究不同初始p h ，反应 温度及摇床转速条件下，对菌株催化乙酸龙脑酯水解生成龙脑的底物转化率，产物龙脑 的产率以及正龙脑含量的影响，找出菌株催化底物水解反应生成目的产物的较优条件。 l o 广西大掌硕士掌位论文微生物催化转化制备龙脑的初步研究 第二章龙脑的分析方法 实验中的分析方法包括定性分析和定量分析。根据不同的实验要求，本文分别选取 了薄层色谱法、红外光谱法、气相色谱法对实验结果做定性和定量的分析。 薄层色谱法是萜类化合物研究中常用的一种分离和分析方法。其原理是将吸附剂或 者支持剂均匀地铺在一块玻璃上或铝箔上制成薄层，把欲分离样品点在薄层上，展开剂 借助毛细管作用流经固定相，使组分分离并保留在固定相上，然后定位、显色。根据斑 点的位置，计算r f 值可进行定性分析；根据斑点的峰面积可进行定量分析。该法是一 种微量、快速的分离方法。在菌种筛选过程中，可通过样品斑点的的变化来判断反应进 行的程度及初步判断是否生成龙脑产物。 红外光谱( i r ) 是根据有机化合物分子中的价键产生伸缩或弯曲需要吸收能量的不 同，利用波长位于红外区域的连续光扫描测定记录下来的吸收图谱晔】。化合物红外吸收 带的位置、强度及峰的数目与组合等特征都与样品分子的内在结构特点呈很有规律的对 应关系，分子结构中微小的结构差异都会引起红外光谱的不同，且红外光谱分析操作简 便、快速，所需样品量较少( 数毫克) 且易回收。因此红外光谱在有机分子的定性、定量 和结构分析等方面有广泛的用途1 6 5 】。本文主要利用此法在筛选菌种时快速检测反应样品 中的产物。 气相色谱法( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 是一种以气体为流动相，以固体吸附剂或 图渍有固定液的固体为固定相的柱色谱分离技术。它具有分离效能高、灵敏度高和分析 速度快等特点，已成为广泛应用的定性和定量分析手段之一。本文采用气相色谱内标法 对乙酸龙脑酯和龙脑进行定量分析。 2 1 材料与设备 2 1 1 实验试剂 乙酸龙脑酯( 9 8 ，上海诺泰化工有限公司) ；龙脑冰片( 9 8 ，西安罗森伯科技有限 公司) ，萘( 9 9 5 ，上海国药集团) 。 乙酸乙酯；石油醚；无水乙醇；碘；磷酸二氢钾；磷酸氢二钠；硫酸镁；氯化铵( 以 上均为a r 级) 。 广西大掌硕士掌位论文 微生物催化转化制畚龙脑的初步研究 2 1 2 培养基 无机盐培养基：k h 2 p 0 41 5g l 一，n a 2 h p 0 413 5g - l ，m g s 0 4 o 1g l 一，n h 4 c 12 0 g l ，p h7 2 。 2 1 3 实验设备及型号 表2 - 1 实验设备及型号 t a b l e2 1e q u i p m e n t sf o re x p e r i m e n ta n dt h e i rt y p e s 仪器、设备备注 柜式恒温摇床h q l 3 0 0 精密p h 计 电子分析天平 气相色谱仪( 6 8 9 0 ) 中国科学院武汉科学仪器厂 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 美国a g i l e n t 公司 2 2 实验方法 2 2 1 薄层色谱法( t l c ) 取适量样品，用乙酸乙酯溶解，毛细管点样，乙酸龙脑酯和龙脑作为对照，晾干后 于展开剂为石油醚一乙酸乙酯( 1 ：5 ) 混合液的展开缸中展开，通过碘蒸汽显色，与对照样 的比移值( r f ) 对比，进行定性分析。 2 2 2 红外光谱法( i r ) 采用k b r 压片法，将实验中经t l c 初步检测的样品进行红外光谱分析，并与龙脑 的标准谱图对照。 2 2 3 气相色谱法( g c ) 目前定量测定乙酸龙脑酯、龙脑的主要方法为气相色谱内标法【6 6 7 0 1 。本文主要采用 气相色谱内标法定量分析反应中的底物转化率和产物产率等。 g c 定量分析条件为：f i d 检测器，h p 1 玻璃毛细管柱( 3 0m x 0 5 3m i n x 0 8