（化学工程专业论文）超临界流体色谱法分离手性物质的基础研究.pdf

超i 临界流体色谱分离手性物质的基础鲤塞( 斯- 2 r - 叁堂堡主堂堡堕查! ! ! ! ! 旦! 摘要 本文综述了近三十年来有关物质在超临界流体中的溶解度、超临界流体 色谱仪和超临界流体色谱分离手性物质的应用与进展。基于分子缔合假设， 推导出一个适合于固体溶质的、包含相平衡的四参数溶解度分子缔合模型。 用此模型关联了七种固体溶质在四种超临界流体中的溶解度，平均相对误差 、 为2 3 2 0 6 ，其关联精度比c h r a s t i l 模型有很大改进。 一， 建立了一套流动法测定超临界流体中固体溶解度和超临界流体色谱装 置。用萘作典型溶质检验了该装置，证明具有较好的重复性和准确性。测定 了t r 6 9 e r s 碱外消旋体在超临界c o ：中以及含夹带剂乙醇中的溶解度。伽。定 结果表明该物质在纯c o ：中的溶解度较小，在压力8 0m p a 和温度3 2 8k 时 溶解度最小，为3 1 1 0 t o o l m o l ；当压力1 9 0m p a ，温度3 2 8k 时最大 为8 0 1 0 t o o l m o l 。加入乙醇作夹带剂后的溶解度明显增加，为1 0 4 数量 级。用所得模型对纯c o ：中的溶解度数据进行了关联，平均相对误差1 49 1 本文还初步研究了超临界流体色谱( s f c ) 法分离外消旋体。证明了火焰 离子化检测器适合于s f c 装置。f 当微晶纤维素三乙酸酯( m c t a ) 为手性固 定相、纯的超临界c o ：为流动相时，外消旋的t r i s g e r s 碱难以被分离。其原 因在于该物质在纯c o ：中的溶解度较低，洗脱力不强。而改用乙醇为央带剂 、 的流动相时，可望得到分离。 关键词：超i i 缶界流体t 溶解度，缔合模型，t r 6 9 e r s 碱 塑堕墨堕堡鱼堂坌塞至生塑堕笪茎型婴窒! 堑江垄主塑圭堂堡丝查： ! ! ! ! 至三旦三一 a b s t r a c t ar e v i e wh a sb e e na c c o m p l i s h e d f o rt h ea d v a n c e si ns o m e s u p e r c r i t i c a l t e c h n i q u e s ，i n c l u d i n gs t u d i e s o ns o l u b i l i t yi ns u p e r c r i t i c a lf l u i d ，i n s t r u m e n to f s u p e r c r i t i c a l f l u i dc h r o m a t o g r a p h y ( s f c ) a n dc h i r a ls e p a r a t i o n sb ys f ci n t h e r e c e n t3 0 y e a r s a c c o r d i n g t ot h em o l e c u l a ra s s o c i a t i o n a s s u m p t i o n ，a f o u r p a r a m e t e r sm o l e c u l a ra s s o c i a t i o nm o d e l f o rs o l i d sh a sb e e ni n f e r r e d ，i nw h i c ht h e p h a s ee q u i l i b r i u mw a sc o n s i d e r e d s o l u b i l i t i e so fs e v e ns o l i ds o l u t e si nf o u rk i n d s o fs u p e r c r i t i c a lf l u i d sw e r er e l a t e du s i n gt h i sm o d e l t h ea v e r a g er e l a t i v ee r r o r s a r ew i t h i n2 3 a n d2 0 6 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h i sm o d e li sm o r e a c c u r a c yt h a nc h r a s t i l sm o d e l a na p p a r a t u sh a sb e e nb u i l tf o rm e a s u r i n gs o l u b i l i t yo fs o l i di ns u p e r c r i t i c a l f l u i d ，a n di t c a nb eu s e da ss f c i tw a sp r o v e dt h a tt h i s a p p a r a t u si s f e a s i b l e s o l u b i l i t i e so ft r 6 9 e r sb a s ei n s u p e r c r i t i c a l c a r b o nd i o x i d ea n d s u p e r c r i t i c a l c a r b o nd i o x i d ea d d e de t h a n o la sm o d i f i e rw e r em e a s u r e d t h er a n g eo fs o l u b i l t i e s o ft r 6 9 e r sb a s ei nc 0 2i s3 1 1 0 5t o8 0 1 0 一m o l m 0 1 t h em a g n i t u d e so f s o l u b i l i t y i s10 3w h e ne t h a n o l ( 5t o2 0m o l m 0 1 ) i sa d d e da s m o d i f i e r s o l u b i l i t i e so f t r 6 9 e r sb a s ei np u r ec 0 2a r er e l a t e db yt h ec h e m i c a la s s o c i a t i o n m o d e l t h ea v e r a g er e l a t i v ee r r o ri s1 4 9 i n a d d i t i o n ，s e p a r a t i n gr a c e m i ct r 6 9 e r sb a s eb ys f ch a sb e e ns t u d i e d i t w a sp r o v e dt h a tf i di ss u i t a b l et o s f c u s i n gm c t a a sc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e a n d s u p e r c r i t i c a l c a r b o nd i o x i d ea sm o b i l ep h a s e ，i tw a sd i f f i c u l tt o s e p a r a t e t r 6 9 e r sb a s eb e c a u s et h es o l u b i t yi sl o w e ri np u r ec 0 2 i ti sp o s s i b l et os e p a r a t e r a c m i ct r b g e r sb a s ew h e ne t h a n o li sa d d e da sm o d i f i e r k e y w o r d s ：s u p e r c r i t i c a lf l u i d ，s o l u b i l i t y ，c h e m i c a la s s o c i a t i o n m o d e l ， t r 6 9 e r sb a s e 2 塑堕墨鎏堡鱼道坌塞至堡塑堕塑薹型婴壅! 堑、江垄兰塑主兰垡垒圭l 二竺旦三旦三一 绪论 对映体的存在是自然界的一种普遍现象，在药物中尤为突出，约有 3 0 。4 0 的药物具有手性。随着生命科学以及生物学、药物学等学科的发展， 对光学纯物质的需求将越来越大。因此，对映体分离已受到人们的普遍关注。 在医药工业方面，由于手性药物各对映体的药效和药理作用可能完全不同。 因此，在手性药物的药效、药理研究方面以及新药开发方面都不同程度地涉 及到手性对映体的分离问题。 据统计，世界上使用的1 8 5 0 种药物中，天然的及半合成的有5 2 3 种，全 合成的有1 3 2 7 种。在天然和半合成的5 2 3 种药物中，非手性的只有6 种，手 性药物有5 17 种。在手性药物中，单一对映体有5 0 9 种，外消旋药物有8 种。 在全合成的1 3 2 7 种药物中，非手性药有7 9 9 种，手性药有5 2 8 种。在手性药 物中，单一的对映体只有6 1 种，其余的4 6 7 种为外消旋药物。可见合成药物 中，有相当多的药物有手性中心，批准使用的并非单一的异构体，而是外消 旋混合物。从药物管理部门来说，现在越来越需要了解现用药物中每一个异 构体的药理及毒理学性能，最后导致生产和使用手性纯的化合物。1 9 9 2 年美 国食品医药管理局( f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n ，f d a ) 提出，制药公司必 须测定每个药物的立体异构体的组成，对每个异构体的药理学活性都要有比 较，特别是新药的报批都要有这些材料。1 9 9 2 年6 月，美国f d a 正式公布 了关于手性药物研究开发市场销售的准则性文件，将进一步激励手性药物的 开发t ”。 因为对映体在物理化学性质上极其相似，所以分离的难度很大。分离对 映体的办法可分为两大类，色谱法和非色谱法。无论用哪一种方法分离， 其基本原理都是基于对映体在化学或物理化学性质上的差异。常用的非色谱 分离法主要是结晶，也包括微生物或酸的消化。但非色谱分离法耗时较长， 过程繁复，产品收率低，也不易制各纯度较高的对映体。因此规模化工业生 产难以普遍接受，目前大多倾向于采用色谱法。包括气相色谱、液相色谱、 薄层色谱、超临界流体色谱和电泳在内的几乎所有色谱和准色谱手段都已涉 足到对映体分离这一领域。 所谓超临界流体色谱( s u p e r c r i t i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h y ，s f c ) 是指以 超临界或亚临界状态的流体为流动相的色谱技术，后者也常称为亚临界流体 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文， 2 ) 0 0 年2 月) 色谱( s u b c r i t i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h y ，s u b f c ) ”1 。 超临界流体既具有较大的扩散系数和较小的粘度，又具有较高的密度， 与液体相比具有更高的传质速率，与气体相比具有较大的溶解能力h ”。因此 用这种技术分离手性药物与常规的高效液相色谱和气相色谱相比具有许多优 点。s f c 必将在手性药物的分离、分析和制各方面发挥重要作用。 溶质在流动相中的溶解和在两相之间的扩散传质是研究超临界流体色谱 分离过程的重要内容。溶解度值更是开发应用s f c 技术不可或缺的基础物化 数据。为了配合超临界流体色谱法分离固体物质，特别是分离手性物质的研 究，首先需要解决固体物质在超fj 螽界流体中的溶解度问题。 本文配合超临界流体色谱分离手性物质课题研究，着重就固体物质在超 临界流体中的溶解度的测定方法和理论进行了较为深入的研究。建立了一套 流动法测定固体物质在超临界流体中的溶解度的装置。测定了若干条件下 t r 6 9 e r s 碱在超临界c o ：或含有夹带剂乙醇中的溶解度。并比较选择了一种 合适的溶解度理论模型关联实验所得结果，预测不同温度和压力条件下 t r 6 9 e r s 碱在超临界流体中的溶解度数据。为选定一种合适的流体作为超临 界流体色谱分离t r 6 9 e r s 碱的流动相及其相应的分离条件提供依据。 本文还进一步将溶解度测定装置扩展成为简易的超临界流体色谱仪，并 对仪器的性能和超临界流体色谱法分离t r 6 9 e r s 碱外消旋体进行了初步的实 验研究。 2 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文， 20 0 0 年2 月) 第一章文献综述 1 1 超临界流体的性质 当流体的温度和压力在它的临界温度和临界压力之上时，称该流体处于 超临界状态。图1 1 是纯流体的典型压力温度图。图中曲线a t 表示气固平 衡的升华线，曲线b t 表示液- 固平衡的熔融曲线，曲线c t 表示气一液平衡的 饱和蒸气压曲线，点t 是气液固三相共 存的三相点。将纯物质沿气液饱和线升 温，当达到图中点c 时，气一液的分界面消 失，体系的性质变得均，不再分为气体。 和液体，称c 点为临界点。与该点对应的 。 温度和压力分别称为临界温度t ，和临界压 力p 。图中高于l 临界温度和临界压力的阴 影区域内的流体即超临界流体 温度 ( s u p e r c r i t i c a lf l u i d ，s c f ) 【6 】。 圉1 - l 纯流体的压力一温度圈 理论上，可用作s f c 流动相的溶剂很多。如二氧化碳、乙烯、氨、氧化 亚氮等。表1 一l 列出了一些可用作s f c 流动相的物质的临界性质。 表1 1 一些可用作s f c 流动相的物质的临晃性质m 9 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究! 堑江垄鲎塑堂堡堡塞，! ! ! ! ! 旦! 由表中数据看出，二氧化碳的i i 备界温度和临界压力都不太高，可以在室 温附近比较容易地实现s f c 操作。并且二氧化碳还具有不可燃、无毒、化学 稳定性好、价廉易得等优点。因此二氧化碳是应用最广的s f c 流动相。 超临界流体的物理性质介于气体和液体之间，如表1 2 所示。它既具有较 大的扩散系数，较小的粘度，又具有较高的密度，从而比液体的扩散传质速 率大，比气体具有较大的溶解能力。这些特点决定了超临界流体应用上的优 越性。 表1 2 气体、液体和超临界流体的性质【4 ” 1 2 固体在超临界流体中的溶解度 1 2 1 溶解度的测定方法 由于各种超临界流体在临界状态附近往往与高压或同时与高温和高压条 件相联系，造成研究工作对实验装置的技术要求高，价格昂贵，操作费用大， 且难以获得准确的实验数据。因此限制了这一领域的研究工作。 目前测定超临界流体中溶解度的实验方法主要有静态法和动态法两种。 静态法在封闭的高压容器内操作，而动态法则在填充床式流动系统中进行 ，”】。典型的动态法和静态法装置流程示意图见图1 2 。 虽然很多研究者采用静态法测定溶解度，但此法的采样分析系统往往较 为复杂和昂贵、且达到相平衡的时间较长。相反，流动法中溶质与溶剂的接 触面积大，平衡时间短，实验省时”】。流动法还有一个优点，即可采用多种 采样分析方法，既可以通过先降压分离，用冷阱收集或溶剂吸收后再定量分 析”1 , 1 3 1 5 ，又可以将高压检测器与此系统耦合，不需降压直接进行检测1 5 - 1 7 1 。 无论哪种分析方法，其技术要求都比较简单，所获数据也有足够的准确性。 4 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文，2 0 0 0 年2 月) a b s o l v e n t 6 。 h e l se g 二u g e l 一j t h e r m o s t a t 9 ：i i 紫5 9 ：i i 暨 图卜2 测定液体或固体溶质在超临界流体中溶解度的装置示意图 ( a ) 流动法，( b ) 静态法 1 2 2 溶解度模型 超临界流体中的溶解度模型主要有三大类。应用最多的一类是将超临界 流体看作稠密气体，并用状态方程计算溶质在流体相中的逸度系数；另一类 模型是将超临界流体看作膨胀液体，以高压态作为参考态并计算流体的活度 系数；第三种模型是将溶解过程看作为气相中的缔合反应，反应平衡等效j 二 溶解平衡，以此建立溶解度模型。 12 2 1 状态方程 5 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文，2 0 0 0 年! 旦j 当固体溶质在超临界流体中达到溶解平衡时，固体组分在气固两相中的 逸度必须相等： z 3 = z 式中上标s 表示固体相，f 表示超临界流体相；下标1 表示固体溶质组分。 根据p r a u s n i t z i ”1 提出固体逸度计算公式，并假设固体体积不随压力和温 度而变化，固体组分在饱和条件下的逸度系数铲是1 ，则组分1 的固相逸度 、可表示为： 元。= p ? “e x p e p p i t “) ( r t ) 1 0 - 2 ) 又因 = m 群p( 1 3 ) 所以 y 。= p 7 ( p + 乒j ) e x p 【k ( p p ) ( r t ) ( 1 。4 ) 式中y ，为固体溶质在超临界流体中的溶解度：p ? 。和k 6 分别为溶质的饱和 蒸气压和摩尔体积，可以用溶质的性质估算：群为溶质在超临界流体中的逸 度系数，可以用不同的状态方程和各种混合规则求得。 状态方程法溶解度模型的研究十分活跃，其中应用最多的是立方型状态 方程，其表达式比较简单且应用方便，有时可以达到较高的精度。 ( 1 ) p r 方程 p r 方程是超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 计算中常 用的一种状态方程。p r 状态方程9 1 结合经典的v d w 混合规则，可以导出逸 度系数计算式： - n 妒鲁( z 川山( z 圳一而a 卜a l 铷z - 2 4 1 4 b ( 1 s ) 6 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文，2 0 0 0 年2 月) 式中a = a p ( r t ) 2 ，b = b p ( r t ) ，z = p v ( r t ) ，a lt = 2 z y a 。 ( 2 ) s r k 方程 s r k 方程结合经典的v d w 混合规则【2 0 1 ，可以得出如下逸度系数计算式： ，n 驴，= 鲁( z - 1 ，一- n c z b ，一暑f z 莩口，a “2 一等 ，n ( ，+ 耋) c s ， ( 3 ) p t 方程 p a t c l 和t e j a 在1 9 8 2 年提出了一种新的立方型状态方程l ”i ： r r a p v - b 万币i j 而 ( 1 7 ) p t 方程与经典的v d w 混合规则结合可以得到较高的关联精度。 ( 4 ) 局部组成模型 在s f e 过程中，流体的高压可压缩性导致了溶剂分子在溶质分子周围的 高度聚集”，因此有必要运用局部组成概念，建立与流体密度有关的混合规 则。m o l l e r a p 2 2 1 首次用局部组成概念将溶液模型与状态方程联系起来，并导 出局部组成概念形式的p r ，s r k 及c s v d w 方程。k i r k w o o d b u f f 局部组成 模型”3 】是基于k i r k w o o d b u f f 溶液理论【2 4 】。对处于平衡的，单一的，纯的不 可压缩固体和超临界流体组成的系统，若假设溶液是稀薄的，则固体的摩尔 分数可被表示为： n y ，2 i n ( p l “p ) + l n ( z ) 一d r ：l q 正( 月，) 1 ( 1 - 8 ) + 【k 3 + k ：e x l x6 0 + b , r ) 一k ：】( p p ? “) ( r t ) 式中正是纯溶剂的逸度，v 。b 。、b 是可调参数。 12 2 2 活度系数法模型 如果把超临界流体看成是膨胀的液体，则在给定温度下难挥发固体组分 在超临界流体色谱中的溶解度可以写) 戎1 2 5 2 6 1 ： 胪l o s e x 啤产揪y , f ； e x p 胎- - l 咖) 如果假定 ( 1 - 9 ) 7 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学住论文，2 盟! ! 只) 1 ) 忽略难挥发组分在液固两相的热容差，即c 。一c p , s = o ； 2 1 难挥发组分在液圊两相的摩尔体积之差v i l - - v ，8 - 5 玉, 力无关。 则纯组分在固相和液相中的标准态逸度之比可表示为： - n “川_ ( 竿怯手 华 m 式中y 是固体溶质的活度系数，是固体的正常熔点温度，删是熔点 温度下的溶解热。 周庆荣等口7 l 用活度系数法准液体模型关联了固体溶质在含夹带剂超临界 流体中的溶解度数据，理论计算值与文献数据吻合很好。活度系数法计算相 平衡的优点是仅采用一个可调参数，且迭代容易收敛。缺点是不易推广到三 元体系的相平衡计算，且计算活度系数所需的溶质和夹带剂的某些物性参数 不易得到。 1 2 2 3 分子缔合模型 以上关于固体物质在s c f 中溶解度的研究多数基于热力学理论，仅考虑 了物质间的物理作用。1 9 8 2 年c h r a s t i l l 2 乱单纯基于溶剂缔合化的观点，提出 了计算溶质在s c f 中平衡溶解度的计算式： c = p s “e x p ( a t + b )( 1 - 11 ) 但是因近临界区压力不高，流体密度不大，分子间相互作用不很强，所 以在近临界区出现最大误差，这时物理作用与化学作用相比不可忽视。为了 弥补这一缺陷，近年来不少研究者用缔合模型结合状态方程描述了超临界流 体中的相平衡问题。龙军 2 9 1 、谭飞1 3 0 i 、j i a n g i ”等分别提出了各自的溶解度缔 合模型，由于同时考虑了溶质与溶剂之间的物理作用和分子缔合作用，使溶 解度关联精度得到很大提高。 1 2 2 4 其它模型 除了上述溶解度模型以外，还有其它一些关联方法。k i n g 等 ”】建立了一 种用分子结构预测溶解度的方法：b a r t l e 等m 】利用溶质在超临界流体色谱中 的保留值来获取溶解度数据；b u c h w a l d 等i3 4 1 基于拓扑学的方法建立了一种预 测溶解度的经验模型，亦有很高的应用价值。 8 塑竖墨鎏堡鱼遭坌塑至丝塑堕塑茎型堡壅1 1 堑- 江查芏婴主堂堡笙查：一! ! ! 生! 三旦上一 1 3 超临界流体色谱法分离手性化合物 1 3 1 超临界流体色谱装置 s f c 是k l e s p e r 等【3 5 于1 9 6 1 年首次提出的，八十年代以来得到迅速发展。 典型的s f c 流程见图1 - 3 【3 6 】，主要包括三个部分： a b 恒溢箱 t h e r m o s t a t 恒温箱 t h e r m o s ta t 图1 3s f c 装置示意图1 4 】 ( a ) 使用气相检测器( b ) 使用带高压池的检测器 1 ) 高压流动相输送系统主要由贮槽、压力控制器和泵组成。作用是将高 压气体( 有时含少量夹带剂) 经压缩和热交换转变为超临界流体，并以一定 的压力连续输送到色谱分离系统。 2 ) 色谱分离系统包括进样器、色谱柱和恒温箱三部分。s f c 采用高压进 样器。色谱柱分为填充柱和毛细管柱两种。填充柱可使用不锈钢液相色谱柱， 毛细管柱内径一般为5 0 1 0 0 um ，长约2 5 2 0r n 。 3 ) 检测系统s f c 检测器分为两类：g c 型和h p l c 型。g c 型检测器适用 于毛细管柱s f c ，包括火焰离子化检测器、热离子检测器、火焰光度检测器 等；h p l c 型检测器适用于填充柱s f c ，包括荧光检测器、紫外检测器等。s f c 还可以与m s 、f t i r 等联用，使其在定性、定量检测中极为方便”。 9 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文， 20 0 0 年! 旦! “瞎芹拦二一l c ! 筻霉if 兰1 l 可飘鲻4 一 q 剑l f i l 】匕型j “”“”9 lc 鲥o l u m 柱i | 燃 | b 恒温印元倥器后面板 图1 4惠普公司s f c 设备简图【”1 ( a ) 柱前调压式( u p s t r e a mm o d e )( b ) 柱后调压式( d o w n s t r e a mm o d e ) 早期的理论或应用研究中，s f c 设备多由实验室改装气相色谱仪或液相 色谱仪而成。目前已有多种商品化s f c 仪器问世，较成功的有l e es c i e n t i f i c 公司的d s f c ( 毛细管超临界流体色谱仪) 6 0 0 0 系列，c a r l o r b a 公司的 s f c 3 0 0 0 系列，i s c 0 公司的s f c l o o 11 0 0 、s f c l 0 0 4 1 0 0 、s f c l 0 0 5 1 0 0 系 列【3 ”，g i l s o n 公司的s f 3 系列及h e w l e t t p a c k a r d 公司的h ps f c 系列等。在 商品化s f c 设备中一般采用计算机对泵和恒温箱进行控制，以实现压力、温 度和密度的梯度洗脱。另外，某些超临界色谱仪还可以在同一套装置中提供 柱前调压式( u p s t r e a m ) 和柱后调压式( d o w n s t r e a m ) 两种操作模式，见图 1 4 。柱前调压式s f c 在柱前进行压力控制，使用填充式色谱柱；杜后调压 式s f c 在柱后进行压力控制，既可使用毛细管柱，又可使用小内径的填充柱。 两种操作模式之间可以方便地进行转换。 1 0 超i 临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文， 20 0 0 年2 月) 虽然已经有许多商品化s f c 装置，但其价格相对较高。对广大实验者来 说，根据各自的不同需要，用现成的色谱仪进行改装，无疑是一种既经济又 简便的选择。例如用h p l c 进行改装时，只要在原有设备的基础上添加高压 进样器和压力控制系统，并根据需要选择合适的高压检测器，即可将h p l c 改装成简易的填充式s f c 装置。因为s f c 在高压状态下操作，因此改装时必 须解决好压力控制问题，既要使流体在系统中保持超i 艋界状态，又要防止管 线堵塞和泄漏。 13 2 色谱柱类型 超 艋界流体色谱中使用的色谱柱有填充式和非填充式之分m 。非填充式 s f c 色谱柱内径通常为5 0 一1 0 0p m ，长2 5 2 0 m ，固定相厚度通常在0 15 一o 2 5 “m 之间。也有报道认为在不明显降低柱效的前提下可以把膜厚度增加到10 m 。一般选用环糊精作为手性选择基团( c h i r a ls e l e c t o r ) 的载体，超临界c o ， 为流动相。洗脱强度可以通过调节温度和压力，从而改变密度来控制。1 9 9 2 年p e t e r s s o n 等【4 0 l 报导了一种用最陡上升法优化非填充式s f c 操作参数的方 法，可以在不降低分离效果的前提下减小保留值。非填充式s f c 的优点在于 能提高效率，操作条件温和以及使用多种检测器，但是它的样品负荷很低， 一般限于样品分析。 虽然许多外消旋体在非填充式色谱柱上得到分离，但填充式手性分离变 得越来越普遍。大多数用于h p l c 的商品化手性固定相( c h i r a ls t a t i o n a r y p h a s e s ，c s p s ) 可以直接转换到s f c 上，且流动相和正已烷的极性相似，所 以很容易从普通的h p l c 直接过渡到s f c 。大多数c s p s 的骨架是硅基的， 通常需要加入夹带剂来减小极性溶质与c s p s 中残余硅烷醇的相互作用。由 于夹带剂的加入使混合流动相的临界压力较纯流体有所升高，而手性分离又 通常在室温下进行，所以流动相一般处于亚临界状态】。填充式s f c 具有选 择性高，洗脱速度快的优点，并且可以分析高极性的溶质。 1 3 3 手性固定相法直接分离手性化合物 自从1 9 8 5 年，m o u r i e r 4 2 1 等首次使用超临界流体色谱进行手性分离以柬， s f c 技术在手性分离技术领域发展迅速。特别是近几年来，发表了许多的关 - j 二s f c 的综述性文章1 37 , 3 8 , 4 3 - 4 9 】。 s f c 分离手性化合物可分为直接法和间接法两利，。直接法包括使用手性 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文， 2 0 0 0 年2 月) 固定相和手性流动相：而间接法则基于手性衍生作用，先把对映物转化为非 对映物，然后用非手性固定相分离1 。目前，手性固定相直接分离法是发展 最快的领域，而间接法则相对使用较少。 超临界流体色谱的手性固定相是在h p l c 和g c 手性固定相的基础上发 展起来的。目前已有大量的商品化c s p s 问世】。除冠醚类和蛋白质类外， 绝大多数c s p s 都可直接用于s f c ，而不需任何改进处理，如聚酰胺类、环 糊精类和聚糖类等。 1 3 3 1p ir k ie 型手性固定相 p i r k l e 型c s p s 是根据三点作用原理设计合成的，母体结构为3 ，5 一二硝基 苯甲酰，然后接上苯基甘氨酸或亮氨酸等基团 5 2 1 。 p i r k l e 型c s p s 在s f c 上可直接分离氨基酸、抗疟药和目b l o c k e r s ( 一类 含仲胺基团的化合物) 等对映物以及亚砜、内酰胺等含有芳基的对映物；极 性更强的物质般在进样前先转化为弱极性的衍生物，然后再进行分离i “l 。 1 9 9 3 年n i s h i k a w a l 5 3 1 用装填有p i r k l e 型c s p s 的s f c 和s u b f c 分离了拟除虫 菊酯，其分离效果在温度较低时比h p l c 好得多。 1 3 3 2 环糊精手性固定相 环糊精( c y c l o d e x t r i n ，c d ) 是一种包含六至十二个葡萄糖单元的手性环 状低聚糖，包括q ，0 ，y 等类型，其中以0 型应用最广 5 4 , 5 5 l 。 环糊精主要用于非填充式s f c 。含有不同官能团( 单醇、二醇、内酯、 酮、胺、羧酸和甾体) 的手性对映物有的可在b 环糊精上得到有效分离。 s u s a n n e 等【5 哪用非填充式s f c 在b - 环糊精上基线分离了五种拟除虫菊酯。 a r m s t r o n g 等1 5 7 】于艮道了一种以短链聚硅氧烷聚合物为取代基的甲基化b 环糊 精c s p s ，并用它在非填充式s f c 上分离了l 一氨基二氢化茚和全氢化吲哚。 c h i r a s i l d e x ( 固着在聚硅氧烷上的二甲基化b 一环糊精) 是一种新型的c s p s ， 据报道m “2 1 用c h i r a s i l d e x 可分离多种芳香醇、氨基醇、氨基酸、羧酸、二 醇、胺和酰亚胺等对映物；许多药用化合物( 如巴比妥药物、甾族药物等) 也可在c h i r a s i l d e x 上分离，且与g c 相比，分离效果好、操作温度低。 133 3 聚糖类手性固定相 聚糖类c s p s 包括纤维素衍生物和直链淀粉衍生物两种，过去只用于填充 式色谱杜，1 9 9 2 年，j u v a n c z 及合作者1 6 3 1 把它推广到了非填充式s f c 。 1 2 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文，_ 2 0 0 0 午l 业 纤维素三苯甲酸酯( c h i r a l c e lo b ) 和纤维素三3 ，5 二甲基氨基酸甲酯 ( c h i r a l c e lo d ) 是两种应用广泛的纤维素c s p s 。使用超临界流体色谱，o b 可分离a 亚甲基y 一内酯与内酰胺、芳基酰胺、1 ，2 一氨基醇( b b l o c k e r s ) 等 对映物1 6 4 , 6 5 ；o d 可以分离b b l o c k e r s 对映物、苯并二氮杂草和反一均二苯代 乙烯等手性物质 6 6 , 6 7 1 。o b 和o d 都可用于分离苯丙醇及恬尔心( 抗心绞痛药) 的氢氯化物( 一种抗癌药物) 1 6 8 , 6 9 。 直链淀粉衍生物c s p s 虽不如纤维素类应用广泛，但许多非甾族抗炎药的 对映物都可以在直链淀粉三3 ，5 一二甲基氨基酸甲酯( c h i r a l p a ka d ) 柱上直 接分离。k a i d a 与合作者l 0 1 用苯基甲酸酯直链淀粉作c s p s ，c o ，醇作流动相， 分离了t r 6 9 e r s 碱等多种外消旋体。b a r g m a n n 等】贝0 比较了在纤维素和直链 淀粉衍生物c s p s 上的s f c 和h p l c 手性分离情况，通过研究p b l o c k e r s 在 o d 和a d 上的手性识别机理，发现初级或二级羟基和胺等极性基团的存在 是导致h p l c 、s f c 之间存在明显选择性差异的原因。 1 33 4 其它手性国定相 除上述用于s f c 手性分离的固定相外，还有许多其它类型，如基于螺旋 聚甲基丙烯酸酯的c s p s 、大环抗菌素类c s p s 和基于金属配合物的c s p s 等 等，它们都在s f c 分离技术中得到应用。m a c a u d i 6 r e i “i 等曾对c h i r a lo t ( 涂 覆在硅胶上的螺旋聚甲基丙烯酸酯) c s p s 进行了研究，在填充式s f c 中成 功分离了二- 1 3 一联萘酚和o - 亚甲基y 内酯。此外，他们还用c h i r a l p a k o t ( + ) ( 涂覆在硅胶上的聚三苯甲基异丁酸酯) c s p s 在填充式s f c 上分离了联萘 酚。1 9 9 7 年，m e d v e d o v i c l t 7 2 l 等用大环抗菌素类手性固定相c h i r o b i o t i cv 和 c h i r o b i o t i c t 在填充式s f c 上分离了多种不同类型的外消旋化合物( b b l o c k e r s 、1 3 兴奋剂、b e n z o d i a z i p i n e s 、非甾族抗炎药、巴比妥酸盐、氨基酸 及其衍生物等) 。但与o d 和a d 等c s p s 相比，其应用范围相对较小。 c h i r a s i l n i c k e l 是一种基于镍配合物的c s p s ，s c h l e i m e r 等1 7 3 , 9 4 1 曾以苯基乙醇 和樟脑为典型手性溶质，用非填充式s f c 研究了温度、压力和流动相密度对 保留值和分离因子的影响。 1 3 4 手性衍生与手性流动相法分离手性化合物 使用手性固定相进行手性分离，无疑是目前应用最广的一种s f c 手性分 离方法，但有时也要用到其它替代方法。如先将对映体进行手性衍生或与手 性流动相形成非对映体，然后在非手性柱上分离。这两种方法是应用最早的 1 3 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文， 2 0 0 0 年2 月) 色谱手性拆分法。 13 41 手性衍生法 手性衍生作用取决于目标分子的手性衍生能力。目前，已经研究了氨基、 羟基、羰基、环氧化物、链烯和硫羟等大量的官能团和衍生物，有二十多种 商品化手性衍生试剂，它们中的大多数都曾用外消旋化合物作过测试。 1 9 9 4 年，s u s a n n e 等以( s ) 一t r o l o x 醚为手性衍生剂，以含二醇基团的熔 凝硅石为固定相，在填充式毛细管s f c 上分离了外消旋拟除虫菊酯，包括 o x a z e p a m ，l o r a z e p a m ，t e m z e p a m 和e t h y ll o f l a z e p a t e 等，分离度都大于1 0 。 还以联苯甲基聚硅氧烷为固定相，用非填充式s f c 基线分离了t e m z e p a m 外 消旋体。 一方面，因为衍生法是一种间接法，所以要求衍生剂纯度必须很高，反 应必须严格定量，反应过程中要严格阻止溶质的外消旋化；另一方面，间接 法可以通过改变( r ) 一或( s ) 一手性衍生剂的方法来改变洗脱顺序，并有许多商品 化的s f c 非手性柱。 1 3 42 手性流动相法 手性流动相分离的根据是非手性络合物稳定性差异和它们在流动相中溶 解能力不同。在手性流动相中形成的非手性络合物主要有三种：过渡金属元 素离子络合物( 配位体交换) ，离子对和包络物| 5 0 】。每种方法生成的络合物 都是可逆的非手性络合物，分离时使用非手性色谱柱。 1 9 8 8 年，s t e u e r 等【7 6 1 用电子对法 法扩大了非填充式s f c 的应用范围， 的伯胺等物质。 1 3 5 实验参数选择 在s f c 上分离了1 ，2 一氨基醇。这种方 使它能够分离在c o ：流动相中不能分离 在超临界流体色谱操作中，流动相的温度、压力( 或密度) 、流速和组 成等参数对s f c 的选择性、分离度和分离效率都有很大影响。因此正确选择 实验参数显得至关重要。 分离度与柱效和选择性有关，提高分离度必须从这两方面着手。 分离度与柱效的平方根成正比。例如将理论塔板数提高三倍，分离度将 从o9 增大到1 5 ，达到基线分离。一般来说，要在s f c 或s u b f c 中达到这 1 4 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文，2 0 0 0 年2 月) 种分离效果，比在h p l c 中容易的多。增大柱效一般不会使选择性降低。 图卜5 温度对s f c 洗脱顺序的影响。 s f c 条件：压力3 0m p a ，c 0 2 流速1 5m l m i n ，乙醇含量1 0 。 增大选择性的方法目前还不系统。 但这种方法费时费钱，且不定成功。 开始主要是通过改换手性柱来实现， 更常用的方法是使用不同的夹带剂。 几乎所有关于s f c 手性分离的报道都提到了夹带剂或添加剂对选择性的影 响。醇类是种常用的夹带剂，如加入甲醇一般可以提高选择性。a n t o n l 9 0 1 ， p e y t a i n ”1 等还注意到夹带剂的浓度对选择性也有一定影响，通常浓度较低时 选择性最大。添加剂通常采用水、有机酸等强极性物质，只要在流动相中加 入极少量添加剂就可以显著改善峰形，提高色谱峰的分离度l 。 许多研究者发现，温度对手性选择性有很大影响 4 1 , 4 2 , 5 3 , 7 3 , 7 6 - 7 9 。研究表明 ( 7 7 1 ，当密度不变时，保留值( 用k 表示) 随温度升高而降低，即i n k ，。c l i t 。 同时，手性选择性也随温度升高而降低，即i no 。c 1 t 。因此在较低温度下( 低 于临界温度) 进行手性分离一般可以得到满意的结果。但保留值与温度的关 超临界流体色谱分离手性物质的基础研究( 浙江大学硕士学位论文， 20 0 0 年2 月) 系并不总是成立【8 0 】，当温度升高到一定程度，对映体将同时洗脱，温度更高 时，洗脱顺序颠倒，这时手性选择性将随温度升高而升高，这时称为“熵推 动”的手性分离( 见图1 5 ) 。由于高温时柱效和选择性都比较高，可以预 测这种方法有很好的应用前景。 1 3 6 制备色谱分离手性化合物 制备色谱手性分离可以替代不对称合成法或重结晶法制备纯对映体化合 物。虽然目前主要使用h p l c 制备色谱，但由于在相同的洗脱时间内s f c 的 分离度通常比l c 高，且产量大，节约溶剂，易于分离，所以应用越来越广。 w h a t l e y l 8 ”在c h i r a l c e lo d 和c h i r a l p a k a d 超临界制备色谱柱( 2 5 0 1 0 r a m i d ) 上分离了外消旋g l i b e n c l a m i d e 同系物，进样量可达8m g h 。m u n e o 等m 1 用c h i r a l c e lo d 超临界流体手性制备色谱分离了甜一黄烷酮。使用的是1 0m m i d 的手性制备柱。进样1 2m g ，可以回收4 0m g 纯度9 8 4 的小黄烷酮和4 1 3 m g 纯度9 3 7 的，- 黄烷酮。f u c h s 等1 8 3 用色谱柱内径为6 0m m 的填充式亚i l 缶 界流体色谱中试装置，在p i r k l e 型c s p s 上分离了三种氧化膦对映体，选择 性在1 3 之间。所得每种单一对映体的光学纯度都在9 5 以上，最大产量为 5 1 0m g h ，收率达8 0 。普通的超临界流体制各色谱一般产量较低，费用相 对较高，如果将模拟移动床技术用于s f c ，有可能解决以上问题 s 4 , 8 5 l 。 1 3 7 超临界流体色谱与普通色谱技术的比较 超临界流体具有粘度小、扩散系数大、密度高等特性，因此，s f c 手性 分离技术与h p l c 或g c 相比有很多明显的优点 8 1 8 6 - 9 0 】： 1 ) 由于s f c 流动相的扩散速率、传质速率及最佳线速度都比h p l c 高， 所以一般来说，s f c 在单位时间内能达到更高的分离度，且有机溶剂的消耗 减少： 2 ) s f c 的分离温度通常比g c 低得多。由于手性选择性随温度的升高而 减小，所以s f c 的选择性也就比g