（动物学专业论文）基于18srdna片段数据对含贝类诸阶元的动物系统关系的研究.pdf

摘要 摘要 本文研究了包括8 属巴蜗牛、软体动物门各纲代表及腹足纲各总科代表、2 2 个动物 门的部分1 8 s f d n a 序列的特点。结果表明，软体动物为多系发生，但头足纲和多板纲 互为姐妹群。蜗牛总科内的巴蜗牛科、潮蜗牛科、大蜗牛科不能通过1 8 s r d n a 序列m l 分析得到符合传统分类系统的系统发育关系推测。m l 树和b i 合意分析表明，在有适当 的赋根条件下，不对称动物和除棘皮动物外的辐射对称动物成为一个单系；包括线虫动 物、颚胃动物在内的无体腔三胚层动物为多系起源的。m l 无根树不支持依照假体腔存 在与否为特征的分类系统。m l 和b i 树表明裂体腔动物组合的多系性。此外，包括腕足 动物和帚虫动物在内的触手冠动物为单系发生；扁盘动物与栉水母动物构成单系，这一 方面说明将旧系统的腔肠动物门分裂为刺胞动物门和栉水母动物门具有合理性，另一方 面也暗示扁盘动物与海绵动物所组成的侧生动物是否为一单系、真后生动物是否为一单 系的问题值得深入研究。 关键词软体动物分子系统学贝叶斯推断 18 s r d n a a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep r e s e n tw o r ks t u d i e dp a r t i a l18 s r d n ao fe i g h tb r a d y b a e n i dg e n e r aa n dm o s to f o t h e rm o l l u s kr e p r e s e n t a t i v e s ，a n dt h er e p r e s e n t a t i v e sd i s t r i b u t e di nt w e n t y o n ea n i m a lp h y l a t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h em o l l u s k sw a sp o l y p h y l o g e n e t i c a l ，a l t h o u g hc e p h a l o p o da n d p o l y p l a c o p h o r a nk e p ts i s t e rr e l a t i o n s h i p t h er e s u l tf r o mm la n a l y s e ss h o w e dp h y l o g e n yo f i n v o l v e dh e l i c o i d sf a m i l i e sw a sq u i t ei n c o n s i s t e n tt ot h et r a d i t i o n a lh y p o t h e s i s m la n db i r e s u l t ss h o w e dt h a t , w i t l lr o o tu n d e t e r m i n e d ，a s y m m e t r i ca n i m a l sa n da c t i n os y m m e t r y a n i m a l se x c l u d i n ge c h i n o d e r m a t aw a sm o n o p h y l e t i c a c o e l o m a t et r i p l o b l a s t i c a , i n c l u d i n g n e m a t o d aa n dg n a t h o s t o m u l i d a , w a sp o l y p h y l e t i c p s e u d o c o e l o m a t a ，i n c l u d i n gg a s t r o t r i c h a , r o t i f e r , n e m a t o m o r p h a , e n t o p r o c t a , a c a n t h o c e p h a l a a n dk i n o r h y n c h a , m lm o o t e d p h y l o g r a m sd i dn o ts u p p o r tt h ec l a s s i f i c a t i o ns c h e m ed e p e n d e do nt h e o c c u r a n c eo f p s e u d o c o e l e m la n d b it r e e ss h o w e dt h a ts c h i z o c o e l aw a sp o l y p h y l e t i cg r o u p p l a c o z o aa n d c t e n o p h o r aw e r er e v e a l e da sam o n o p h y l e t i cb r a n c h t h er e s u l ti sc o n s i s t e n tw i t ht h es p l i t t i n g o fc o e l e n t e r a t ai n t oc n i d a r i aa n dc t e n o p h o r a c o n s e q u e n t l y ，i tr a i s e dt h eq u e s t i o n so ft h e m o n o p h y l yo fp a r a z o ai n c l u d i n gp l a c o z o aa n ds p o n g i a , a n dt h em o n o p h y l yo fe u m e t a z o aa s w e l l k e yw o r d s ：m o l l u s c a ；m o l e c u l a rp h y l o g e n y ；b a y e s i a ni n f e r e n c e ；18 s r d n a 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：趟垫鱼日期：盘三旦年上月盟日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密妙。 ( 请在以上相应方格内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 刎疋氏 日期：垄! 1 2 年上月卫e t e l 期：纠年益月上日 第1 章前言 第1 章前言 1 118 s r d n a 在无脊椎动物系统发育中的意义 尽管现有动物各分类阶元因系统发育研究水平不一致，就阶元等级绝对意义而言，在 各所谓等级别阶元之间并没有太多的可比意义( 如昆虫的一个科和脊椎动物的一个科之 间) 。但为叙述便利计，仍不得不假设这些涉及的阶元具有等同的系统发育等级。 包含1 8 s r d n a 的序列常在研究动物界中门以上系统发育关系方面得到运用，并能支 持一些基于形态学依据的门之间关系的结论，但目前基于这类序列的某些相关分析也不乏 矛盾之处。如，由1 8 s r d n a 、肌球蛋白重链l i 、组蛋白h 3 和延长因子1 - a l p h a 的序列数 据得到的分析能支持蜕皮动物( e c d y s o z o a ) 的单系性( 形态学研究不能十分明确地推断 该单系性) ；但是，这套分子数据却不能用于支持有关节类( 腕足动物1 ) i 1 】。在三胚层 动物系统发育研究中，由1 8 s r d n a 序列和形态学构成的混合数据得到一致的分支有( 1 ) d e u t e r o s t o m i a 【( ( e c h i n o d e r m a t a - i - e n t e r o p n 穗s 哟q 卑衄配c h o r da t a ( u r o c h o r d a t a + v e r t e b r a t a ) ) ) ；( 2 ) e c d y s o z o a 【( ( ( p d a p u l i d a + k i n o r h y n e h a ) ( n e m a t o d a + n e m a t o m o r p h a ) ) ( ( o n y c h o p h o m + t a r d i g r a d a ) a r t h r o p o d a ) ) ；( 3 ) t r o c h o z o a ( ( p h o r o n i d a + b r a c h i o p o d a ) ( e n t o p r o c t a ( n e m e r t e a ( s i p u n c u l a ( m o l l u s c a ( p o g o n o p h o r a ( e e h i u r a + a n n e l i d a ) ) ) ) ) ) ) 】；a n d ( 4 ) p l a t y z o a ( ( g n a t h o s t o m l x l i d a ( c y e l i o p h o r a + s y n d e r m a t a ) ) ( g 嬲仃o t r i c h a + p l a t h e l m i n t h e s ) ) ， 而毛腭类、n e m e r t o d e r m a t i d a 和苔藓动物与这4 个分支没有明显的关系【2 j 。在两侧对称 动物( b i l a t e r i a ) 的早期进化分支分布格局中，扁形动物和线虫动物之间系统发育扮演着 相当重要的作用，基于1 8 s r d n a 序列分析得到了矛盾的结论，而使用几个核基因连接氨 基酸片段的分析却得到较接近形态学分类系统的分析结果：棒形次亚门( r h a b d i t o p h o r a n ) 的扁形动物与真两侧对称动物( e u b i l a t e r i a ) 可能构成姐妹群；而后者又分为线虫类和有 体腔动物( c o e l o m a t a ) 。这些核基因连接氨基酸片段数据的分析结果显示主要的两侧对称 动物的门不起源于寒武纪生命大爆发，而可能起源于前寒武纪的数亿年时段中【3 】。 1 8 s r d n a 多变区v 2 和v 7 的分析表明两侧对称动物和刺胞动物为单系群，栉水母和海绵 动物从后生动物中很早分开，扁盘动物与刺胞动物接近【4 j 。1 8 s r d n a 、线粒体基因和核 编码d n a 共同用于b a y e m a n 分析，其结果强烈支持半索动物和棘皮动物的分支。此外， 这三组基因的同源性也支持圆口类( c y c l o s t o m e s ) 的单系性【5 1 。1 8 s r d n a + 2 8 s r d n a 的 1 河北大学理学硕士学位论文 部分序列的分子系统发育关系表明，后生动物为多系起源的，即两胚层动物( d i p l o b l a s t s ： p o r i f c r a + c n i d a r i a + c t e n o p h o r a + p l a c o z o a ) 和三胚层动物( t r i p l o b l a s t s ) 分别为单系，栉水母 和海绵动物体现出相似性嘲。近全长的1 8 s r d n a 序列的b a y e s i a n 分析表明，蜕皮动物各 门具有单系性( 除曳鳃动物，其假体腔的一类与真体腔的一类各成单系) ；假体腔的曳鳃 动物类与动吻动物近缘；线虫与缓步动物近缘，所组成的单系与节肢动物呈姐妹群关系 【刀 o 单独使用1 8 s r d n a 或线粒体的1 2 s r d i n a + 1 6 s r c i n a 用于系统发育重建海星亚纲 ( a s t e r o i d e a ) 下部分阶元系统发育关系，得到一致的结论。当使用三个基因的联合数据 分析时，这种系统关系得到更好的支持【8 】。虫类扁形动物中，1 8 s r d n a 的全长序列可用 于重建各个目之间的系统发育关系网；而使用完整的1 8 s r d n a 中部约7 5 0 b p 的序列用于 推测涡虫类扁形动物起源时，证实了无肠目( a c o e l a ) 的原始性 1 0 l 。当参考1 8 s r d n a 二级结构，手i b m , 对1 8 s r d n a 序列，使用b a y e s i a n 方法( g h i + g 模型) ，得到了与传 统形态学系统发育主张没有矛盾的系统发育方案：六足纲( h e x a p o d a ) 和弹尾纲 ( c o l l e m b o l a ) 成为一个单系；单系性的全变态类( h o l o m e t a b o l a ) 与准新翅目 ( p a r a n e o p t e r a ，或称“类新翅目”) 成为具弱支持的姐妹群；蜉蝣目( e p h e m e r o p t e r a ) 与 新翅类( n e o p t e r a ) 为姐妹群，该结果可用直接精子转移进化和飞翔进化来解释；此外， 其他许多( 但不是全部一如直翅类各目的关系未得到有效的支持) 类群的关系大都得到很 好的支持【l l 】。钙质海绵纲( c a l e i s p o n g i a ) 中，基于细胞学、胚胎学特征的新分类系统在 支持上弱于基于水管系统特征的老分类系统。而1 8 s r d n a 的分析表明，钙质海绵具单系 性，但其与其他海绵之间的关系未能解决。然而，受到细胞学、胚胎学特征支持的新系统 分类阶元各自的单系性得到确认，与此对比，上述旧分类系统中诸阶元的单系性假设被拒 绝。结果暗示骨骼系统和水管系统的构造系呈平行演化的结果【1 2 】。对不同类群的类似研 究都多少对其系统发育关系有所揭示【1 3 h 4 】等。 针对科以下的无脊椎动物分类阶元，也有许多使用1 8 s r d n a 作为部分或全部数据来 源的研究。使用1 8 s r d n a + 部分m a s p l 对蜘蛛( t e t r a g n a t h i d a e ) 科以下系统发育的推测 结果，与形态学推测一致【1 5 1 。核来源的1 8 s r d n a 、i t s l 、5 8 s 和i t s 2 来源的序列联合 使用时，4 种蜻蜒( d a v i d i u ss p p ) 的系统发育地理关系得到解释。而线粒体的c o l 基因 不能很好地区分所有的种类p 6 。而在对澳洲袋鼠i s o o d o no b e s u l u s ( m a r s u p i a l i a ： p e r a m e l i d a e ) 的寄生虫阻p e r a m e l i s ，h e p a t o z o o n ) 研究中，分析表明这种寄生虫在 2 第1 章前言 1 8 s r d n a 序列上的差异及其与形态学上的矛盾，提出该寄生虫本身可能具有的复合种性 质l i t 。在寄生性扁形动物( g y r o d a c t y l u s ) 及其虾虎鱼宿主的协同进化研究中，使用寄生 虫1 8 s r d n a 的v 4 区序列、完全的i t s r d n a 序列，宿主的1 2 s 和1 6 sm t d n a 片断进行 分析，通过宿主和寄生虫两者物种形成绝对时间的推测，排除了鳃寄生虫的同时物种形成 事件的可能性，同时得到某些地史、生物学资料验证的结果【1 引。 使用1 8 s r d n a 进行系统学研究，也产生了一些可能存疑的问题。当使用全长1 8 s r d n a 进行同门不同属以下的系统关系，尤其研究所使用的外群很少时，可能在结论的确凿性方 面存在问题。如对海绵的研究 1 9 1 d p 所采用的方法。而有研究表明，尽管五e 1 动物和节肢 动物甲壳类在1 8 s r d n a 和精子超微结构上具有一致性，但由于用于系统关系推测的数据 量小和精子超微结构上平行演化的原因，这很可能不能反映两者间实际的系统发育关系 2 0 1 o 1 2 有关分子系统学方面的研究进展 综合现有的在各阶元层次动物的系统发育研究，可见由于各类基因演化速率差异的复 杂性，很难事先确定某一类基因可用于何种阶元层次的系统发育研究。因此，对单基因单 独分析( 考虑功能区) 、多基因联合分析( 考虑功能区) ，及这两者与形态学等非基因来源 的数据联合分析，在系统发育研究中就显得十分重要。目前，有关方面研究越来越活跃。 如表1 所示，分别截止至u 2 0 0 5 年和2 0 0 7 年，各类基因序列在肺螺类中的研究案例数： 表1 截止2 0 0 5 年3 月9 日和2 0 0 7 年4 月1 6 日，g e n b a n k 中登记的肺螺类物种序列类型及数量 t a b l eln u m b e ro fv a r i o u sg e n e s ，s e q u e n c e df r o mp u l m o n a t es n a i l s ，r e g i s t e r e di ng e n b a n kr e s p e c t i v e l y b e f o r em a r c h9 ，2 0 0 5a n da p r i l16 ，2 0 0 7 核基因组d n a线粒体d n a其他 要 喜 警 吣b 搴 搴 q q室 镑窃 卜叻 枣专 、 萤 殳 喾 霎 窃 器 镑 心 要 安 - 一 - - _ n - - - 一a厶小u 苫 o o j厶认、jo - _ ou u- 一 au a厶a 。 o oa认 _ l _ 口 - _ 油 h- 一 - - - 一_u u o j - - u o 厶uvl v o o u o- _ 上- _ - _ u u o j - _ - 一 - _ 盒 认u u o 文乱 l 、j - _ o j o 昏 u io o厶 a _o- _ q、】 厶 o _ _ 河北大学理学硕士学位论文 通过比较文献中出现的各种数据集对类群的分析能力，可知：核d n a 中，2 8 s r d n a 、 18 s r d n a 和1 t s - 2 数据可用于分析科以上阶元的系统学关系，但有时也会得到与传统系统 学推论不一致的结果，即仅证明部分传统分类的单系性；而口娶2 在科以下阶元的研究中 也有所运用；1 t s - 1 数据可用于种群分化的研究中。在线粒体d n a 中，c 甜用于科以下阶元 系列的分类研究，而l r d n a 在科以上的阶元系统学研究中有应用。本研究尝试选择编码 r n a 的核d n a 序列，虽p l s s 的序列作为数据集对软体动物各阶元和其他2 1 个门【1 8 】( 表2 ) 的动物进行系统学探讨。 表2 用于本研究分析的门类及其缩写、代表种及其所属科、n c b i 编号( 本研究中自测) t a b l e2p h y l aa n dt h e i ra b b r e v i a t i o n s ，r e p r e s e n t a t i v es p e c i e sw i 吐lt h eg r o u p e df a m i l ya n dn c b ia c c e s s i b l e n u m b e r s a s t e r i s k sr e f e r r i n gt ot h o s es e q u e n c e di nt h i ss t u d y 门纲类群缩写代表科代表种n c b i 编号 软体动物门 m o l l u s c a 腹足纲潮蜗牛科 g a s t r o p o d a c a r a c o l h y g r o m i i d a 旧 c a r a c o l l n al e n t i c u l a心5 4 6 3 8 5 c a n d i d u h y g r o m i i d a e c a n d i d u l ao l i s i p p e n s i sa y 5 4 6 3 8 6 c a n d i d u h y g r o m i i d a e c a n d i d u l ar u g o s i u s c u l aa y 5 4 6 3 8 7 c e r n u e l h y g r o m i i d a e c e r n u e l l ac e s p i t u ma y 5 4 6 3 91 c e r n u e l h y g r o m i i d a e c e r n u e l l av i r g a t aa y 5 4 6 3 9 3 h e l i c o ph y g r o m i i d a eh e l i c o p s i ss t r i a t a a y 5 4 6 4 0 2 h y g r o m ih y g r o m i i d a eh y g r o m i al i m b a t a a y 5 4 6 4 0 4 m o n a c h a h y g r o m i i d a e m o n a c h ac a n t i a n aa y 5 4 6 4 0 7 m o n a c h a h y g r o m i i d a e m o n a c h am a r t e n s i a n aa y 5 4 6 4 0 8 s p h i n c t e r o c h i l a s p h i n c th y g r o m i i d a e c a n d i d i s s i m aa y 5 4 6 4 13 t r i c h i a h y g r o m i i d a e t r i c h i as e r i c e aa y 5 4 6 4 1 4 大蜗牛科 c e p a e a h e l i c i d a e c e p a e an e m o r a l i s a j 2 2 4 9 2 1 c 办i l o s th e l i e i d a ec h i l o s t o m ac i n g u l a t u ma y 5 4 6 3 9 4 e o b a n i ah e l i c i d a ee o b a n i av p ，7 行i c u l a t aa y 5 4 6 3 9 7 胁l i c e lh e l i c i d a eh e l i c e l l ai t a l aa y 5 4 6 3 9 8 第1 章前言 h e l i c e lh e l i c i d a eh e t c e ao b v i aa y 5 4 6 3 9 9 h e l i c i g h e l i c i d a e h e l 耙i g o n al a p i c i d a a y 5 4 6 4 0 0 h e c o d h e l i c i d a e h e l i c o d o n t ao b v o l u t aa y 5 4 6 4 01 l s o g n o m o s t o m a l s o g n o m h e l i c i d a e i s o g n o m o s t o m o s k x5 4 6 4 0 6 p s e u d o th e l i c i d a ep s e u d o t a c h e as p l e n d i d aa y 5 4 6 4 1 2 h e i xah e l i c i d a eh e l i xa s p e r s aa y 5 4 6 4 0 3 巴蜗牛科 b r a d y b a e n i d a e l a e o c a t h a i c a f i l i p p i n a b r a d y b a e n i d a e l a e o c a t h a i c as u b s i m i l i s b r a d y b a e n i d a e a c u s t ad e s p e c t a b r a d y b a e n i d a e p s e u d i b e r u si n n o m i n a t a b r a d y b a e n i d a e p s e u d i b e r u sm a r i e l l u s p s e u d o b u l i m i n u s p s e u d o b u b r a d y b a e n i d a en a n e h o n g e n s 豇 b r a d y b a e n i d a e p s e u d o b u l i m i n u sp i l i g e r u s p s e u d o b b r a d y b a e n i d a e p s e u d o b u l i m i n 淞b u l i m i n u s b r a b a e n ab r e v i s p i r a b r a d y b a e n i d a e s p e a l b r a d y b a e n ab r e v i s p i r a s b r a d y b a e n i d a e p e c 2 b r a d y b a e n i d a eb r a d y b a e n am a a c k i i b r a d y b ab r a d y b a e n i d a eb r a d y b a e n as 眦t o t a c n i a b r a d y b a e n i d a e m e t o d o n t i ah u a i e n s i s b r a d y b a e n i d a ec a t h a i c a f a s c i o l a c a t h 口f c b r a d y b a e n i d a e c a t h a i c ag a n s u i c a b r a d y b a e n i d a e c a t h a i c ao c h t e p h i l o i d e s s t n o b r a d y b a e n i d a e s t n o d i s c u ss c a s s i a n u s 环口螺科 a p e r o s t c y e l o p h o r i d a e a p e r o s t o m ap a l m e r i d q 0 9 3 4 3 5 三i t t o r i l i t t o r i n i d a el i t t o r i n al i t t o r e a a j 4 8 8 7 1 3 t r u n c a tt r u n c a t e l l i d a e t r u n c a 跎l l ag u e r i n i i a f 0 5 5 6 5 3 p u g i l i nm e l o n g e n i d a ep u g i l i n am o r i o a y 6 7 9 7 8 3 s a l i n a tm a c u i d a es a l i n a t o rs o l i d al 1 1 2 6 6 琥珀螺科 5 河北大学理学硕士学位论文 詈皇量! 詈詈詈詈曼量曼皇鲁墨巴曼曼曼詈詈皇鲁量鲁兽喜皇鲁鼍皇曼曼詈! ! ! 曼曼舅! ! 曼置曼鼍皇皇葛! ! 曼量曼曼曼! 皇! 詈詈詈薯富詈鼻詈皇量詈! 曼暑鼍皇! 量置詈量皇昔詈量薯| 曾1 1 量舅一 o x y t o m a s u c c i n e i d a e o x y l o m as p e c x 9 4 2 7 6 烟管螺科 b a l e a b ic l a u s i l i i d a e b a l e ab i p l i c a t a x 9 4 2 7 8 无板纲 a p l a c o p h o r a a p l a c o p c h a e t o d e r m a t i d a ec h a e m d e r m an i t i d u l u ma y 3 4 0 4 2 5 头足纲 c e p h a l o p o d a c e p h a l oo n y e h o t e u t h i d a e m o r o t e u t h i sk n i p o v i t c h ia y 5 5 7 5 1 2 多板纲 a p l a c o p h o m p o l y p l a a r e h i t e u t h i d a ea r c h i t e u t h i sd u xa y 3 7 7 6 6 1 掘足纲 s c a p h o p o d a s c a p h o p d e n t a l i i d a ea n t a l i si n a e q u i c o s t a t aa j 38 9 6 6 0 双壳纲 b i v a l v i a b i v a l v ip e c t i n i d a e a r g o p e c t e ng 的b u s a f 0 7 4 38 9 腕足动物门 b r a c h i o p o d a b r a c h i oc r a n i i d a e n e o c r a n 妇a n o m a l a d q 2 7 9 9 3 4 毛颚动物门 c h a e t o g n a t h a c h a e t o gs p a d e l l i d a e p a r a s p a d e l l ag o w i o t 0 1 8 s f 刺胞动物门 c n i d a r i a c n i d a d h y d r i d a e h y d r al i t t o r a l i s h l u 3 2 3 9 2 栉水母动物门 c t e n o p h o r a c t e n o p h m l m a r i d a e a u r e l i aa u r i t a a y 0 3 9 2 0 8 棘皮动物门 e c h i n o d e r m a t a e e h i n o do d i n e u i d a e o d i n e l l an u t r i x娥9 3 5 5 5 0 内肛动物门 e n t o p r o c t a e n t o p r o b a r e n t s i i d a e b a r e n t s i ag r a c i l i s a y 2 1 0 4 4 2 腹毛动物fj g a s t r o t r i c h a g a s t r o t l e p i d o d a s y i d a e m e s o d a s y sa d e n o t u b l 比l a t u s a m 2 3 1 7 8 0 颚咽动物门 o n y c h o g n a t h i a g n a t h o s t o m u l i d a g n a t h o s o n y c h o g n a t h i i d a e r h o m b o c e p h a l a d q 0 7 9 9 3 3 半索动物门 h e m i c h o r d a t a h e m i c h oh a r r i m a n i i d a e h a r r i m a n i ap l a n k t o p h i l u s a f 2 3 6 7 9 9 中生动物门 m e s o z o a m e s o z o ao r t h o n e c t i d a r h o p a l u r ao p h i o c o m a e r o u 5 8 3 6 9 线虫动物门 6 第1 章前言 n e m a t o d a n e m a t o d d i p h t h e r o p h o r i d a et y l o l a i m o p h o r u sm i n o r a j 9 6 6 51 2 线形动物门 n e m a t o m o r p h a n e m a t o mc h o r d o d i d a e s p i n o c h o r d o d e st e l l i n f f a f 4 2 1 7 7 3 有爪动物门 o n y c h o p h o r a o n y c h o pp e r i p a t o p s i d a ep e r i p a t o p s i sc a p e n s i s a f l1 9 0 8 7 帚虫动物门 p h o r o n i d a p h o r o n ip h o r o n i f o r m e a p h o r o n i sa u s t r a l i s a f l l 9 0 7 9 扁盘动物门 p l a c o z o a p l a c o z o t r i c h o p l a x t r i c h o p l a x s p e c a y 6 5 2 5 7 9 多孔动物门 p o r i f e r a p o d f e rl u b o m i r s k i i d a e b a i k a l o s p o n g i a f u n g i f o r m i s e f 0 9 5 1 9 0 曳鳃动物门 p r i a p u l i d a p r i a p u lp r i a p u l i d a e p r i a p u l u sc a u d a t u s 心0 2 5 9 2 7 轮形动物门 r o t i f e r r o t i f e rs e i s o n i d e as e i s o ns p e c晦0 5 3 6 1 2 星虫动物门 s i p u n c u l a s i p u n c ug o l f m g j i i d a eg o l f i n g i ae l o n g a t a a y 3 4 0 4 31 环节动物门 a n n e l i d a a n n e l i d n e r e i d i d a e p l a t y n e r e i sd u m e r i l i i e f l1 7 8 9 7 虫益虫纲 e e h i u r a e c h i u me c h i u r i d a e a r h i n c h i t ep u g e t t e n s i s a y 2 1 0 4 4 l 须腕纲 p o g o n o p h o r a p o g o n o p s i b o g l l i n i d a e o s e d a xm u n o f l o r i s娥9 4 1 2 6 3 节肢动物门 a r t h r o p o d a a r t h r o p b a l a r 6 d a e m e g a b a l a n u s s t u l t u s a m 4 9 7 9 2 4 五口纲 p e n t a s t o m i d a p e n t a s t p o r o c e p h a l i d a ep o r o c e p h a l u sc r o t a l i p o r e a a 7 河北大学理学硕士学位论文 2 1 材料 第2 章材料和方法 2 1 1d n a 测序标本 见附录i 。 2 1 2 实验试剂 2 1 2 1 一般药品 十六烷基三甲基溴化铵( c w 国) ：上海生物工程有限公司；三羟甲基氨基甲烷 ( t r i s ) ：上海生工生物工程技术服务有限公司；浓盐酸( h c l ) - 中国医药公司北京采 购站；7 , - - 胺四乙酸( e d t a ) - 国产分析纯；蔗糖：天津市华东试剂厂；氯仿( c h c l 3 ) ： 天津市四通化工厂；氯化钠( n a c l ) 天津市华东试剂厂；乙酸：北京市华新试剂厂； 琼脂糖：上海生物工程有限公司；矿物油( m i n e r a lo i l ) ：上海生物工程有限公司；苯酚： 天津灏洋生物制品科技有限责任公司；巯基乙醇：上海试剂四厂；溴化乙锭( e b ) ： 北京北方伟业发展有限公司；无水乙醇：国产分析纯；无菌水( 自制) ；双蒸水( 自 制) ；冰醋酸：国产分析纯；蛋白酶k ( p r o t e i n a s e k ) - 北京天为时代科技有限公司。 2 1 2 2 溶液 抽提缓冲液：1 0 0 m mt r i s - h c l ，1 4 mn a c l ，2 0 m me d t a ，2 ( m v ) c t a b ，o 2 巯 基乙醇，蛋白酶k ；t a e 电泳液( 5 0 x 贮存液) ：2 4 2 9t r i s 碱，5 7 1 m l 冰醋酸，3 7 2 9 n a 2 e d t a 2 h 2 0 ，加h 2 0 至1 l ，p h 约8 5 ；溴酚蓝样品液：o 2 溴酚蓝，5 0 蔗糖溶 液。 2 1 2 3 试剂盒 宝生物工程( 大连) 有限公司：t a k a r at a qd n a 聚合酶( 5 u i t l ) ，1 0 x p c rb u f f e r m g + f r e e ) ，d n t pm i x t u r e ( 各2 5 r a m ) ，m g c l 2 ( 2 5 m m ) ，d n a 凝胶回收试剂盒。北京 天为时代有限公司：1 0 0 b pd n a l a d d e r 。 第2 章材料和方法 2 1 2 4 标准分子量 m ：l a m b d ad n a e c o ri + h i n d l i id i g e s t 北京原平生物技术有限公司。m ：d n a m a r k e rd l2 ，0 0 0 宝生物工程( 大连) 有限公司。 2 1 2 5 仪器及耗材 h h - 2 型数显恒温水浴锅( 金坛市华峰仪器厂) ；t g l 1 6 b 型台式离心机( 上海安厅 科学仪器厂) ；m g 2 5 + 型基因扩增仪( 杭州郎基科学仪器有限公司) ；d h x 9 0 5 3 1 3 型电 热恒温鼓风干燥箱( 上海福玛实验设备有限公司) ；b s l l 0 s 型分析天平( 北京赛多利斯 仪器系统有限公司) ；d y y - 5 型稳压稳流电泳仪( 北京市六一仪器厂) 。3 1 a 型电泳槽 ( 北京市六一仪器厂) ；u v - 1 0 0 0 国产型凝胶成像紫外分析仪( 北京宾达英创科技有限公 司) ；y x q s g 4 1 2 8 0 型手提式压力蒸汽灭菌器( 上海华线医用核子有限公司) ；7 8 1 a 型磁力加热搅拌器( 杭州仪表电机厂) ；k j 2 5 b c 型机器烧烤微波炉：b d b c 2 5 8 h 型 电冰柜( 星星集团有限公司) ；尼康5 7 0 0 型数码相机；方正计算机；1 0 9 l 、2 0 9 l 、4 0 9 l 、 2 0 0 9 l 、1 0 0 0 9 l 取液器( 国产) ；2 0 9 l 、1 0 0 9 l 、1 0 0 0 9 l 取液器枪头若干，1 5 m l 、0 5 m l 、 0 2 m le p p e n d o r f 管若干。 2 1 3 系统发育分析所选物种 见上表2 。 2 1 4 分析软件 c l u s t a l w l 8 3 2 1 】、m e g a 3 11 2 2 1 ，用于d n a 数据集的对位排列；m r b a y e s v e r s i o n 3 1 2 瞄】，用于系统发育推断的贝叶斯分析，构建b i 树；d a m b ev e r s i o n 4 2 1 3 2 4 2 5 1 ，用于d n a 数据集的基本构成信息分析，系统发育推断的最大似然分析，构建m l 树。 2 2 实验方法 2 2 1d n a 提取 陆生贝类组织中含有大量的黏多糖成分。在制备供p c r 使用的d n a 模板时；使用 十六烷基三甲基溴化铵( c 1 ：a b ) 的抽提缓冲液，以避免黏多糖抑制p c r 反应。 以下d n a 提取步骤在原有实验方法【2 6 】有所变化，以期得到较高的d n a 得率。 取2 5 删n 3 腹足部肌肉，研细。在1 5 m l 离心管中加入含0 o l