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硕士学位论文 可体内降解的交联聚乙烯砸胺的合成及其应用 摘要 本文主要是合成高效低毒的阳离子聚合物基因转染载体。在各种阳离子聚合物 中，2 5 k d a 分枝状p e i 是迄今为止转染效率最高的阳离子聚合物之一，现已经被做 为新开发的基因转染载体的评价标准，但其细胞毒性较大；而小分子量的p e i 通常 没有细胞毒性，转染效率却较低。为了提高转染效率和降低细胞毒性。我们寻找或 设计合成了一些生理条件下可降解的交联剂与无细胞毒性的小分子量p e i 进行交 联，从而合成出1 0 2 种可体内降解的p e i 衍生物。首先对这些聚合物进行了水溶性 评价。然后以h e k 2 9 3 细胞为受体细胞，增强绿色荧光蛋白质粒( e g f p ) 为报告 基因对其中能溶于的水的聚合物进行了细胞转染实验，筛选出一些比2 5 k d a p e l 转 染效率高的新型聚合物。其中有一种聚合物转染效率高达8 8 ，对其进行分子量测 定，测得其分子量约为1 9 0 0 0 。用其它细胞系对这种聚合物进行评价，发现其对几 种细胞系转染效率都超过了5 0 。对n i h3 t 3 细胞系，与其它商业化的转染试剂进 行比较，发现在各自最佳转染条件下，这种聚合物的转染效率是s u p e f f e c t 的1 5 倍， 是2 5 k d ap e i 的5 倍。用3 t 3 、2 9 3 t 细胞进行细胞毒性实验，数据显示其细胞毒性 明显低于2 5 k d ap e ! 。迸一步地研究发现。该聚合物的转染效率不受血清影响，对 c 5 7 小鼠肌肉转染实验表明其体内转染效率较高。以上结果表明，这种聚合物可以 作为安全有效的转染试剂在体外转染实验中使用，而且具有潜在地应用于体内的可 能。 关键词：基因传递，非病毒载体，聚乙烯皿胺，可降解，细胞毒性 硕士学位论文 里堡堕堕坚的交联聚互舅垩堕的台成壁蔓堕星 a b s t r a c t t h ec a t i o n i cp o l y m e r sw i t hh i g hg e n et m n s f e c t i o ne f f i c i e n c i e sa n dl i t t l ec y t o t o x i c i t y w a ss y n t h e s i z e d d u et oi t sh i g hg e n et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya n de a s ya v a i l a b i l i t y , b r a n c h e d2 5 k d ap e ih a sb e c o m eab e n c h m a r kt ow h i c ho t h e rp o l y m e r s ，e s p e c i a l l yn e w l y d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e am a t e r i a l s w e r eo f t e nc o m p a r e d h o w e v e ri ti se y t o t o x i ei n m a n yc e l l l i n e s s m a l l e rp e ii su s u a l l yn o n - c y t o t o x i eb u tl e s se f f i e i e n t i no r d e rt o e n h a n c et h eg e n ed e l i v e r ye f f i c i e n c ya n dm i n i m i z ec y t o t o x i e i t yo fp e i ，o n eh u n d r e da n d t w oo fp o l y m e r sw g l l ：p r e p a r e db yn o n - e y t o t o x i cs m a l l e rp e i ( b r a n c h e d8 0 0 d ao r 2 0 0 0 d a ) r e a c t i n gw i t hd i f f e r e n tp o t e n t i a l l y b i o d e g r a d a b l el i n k a g e st h a tw g r ef o u n do r s y n t h e s i z e d h o w e v e r , s o m eo ft h e s ep o l y m e r sw e r en o ts o l u b l ei nw a t e ra n dt h u st h e y c o u l dn o tb eu s e di ng e n ed e l i v e r y ，t h ep o l y m e r st h a ti ss o l u b l ei nw a t e rw e l - ea s s e s s e d w h e nh e k 2 9 3c e l l sw a su s e d 船r e c e p t o rc e l la n de n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) w a s u s e da sg e n er e p o r t e r i nt h e s ep o l y m e r s ，w eg o to n ep o l y m e r 、v i 廿1 “曲 t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y ( g f pp o s i t i v er a t i o 8 8 嗡t h e nt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h i s p o l y m e rw a sm e a s u r e da n di ti sa p p r o x i m a t e l y1 9 0 0 0 a n dt h et r a r t s f e c t i o ne f f i c i e n c yo f t h i sp o l y m e rw a sa l s oi n v e s t i g a t e di no t h e rc e l ll i n e s r e s u l t ss h o w e dt h a ti t st r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c ye x c e e d s5 0 f o rt h e s ec e l l s f o rn i h 3 t 3c e l l s ，i t st r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yi s l 。5t i m e sm o r ee f f i c i e n tt h a nt h a to fs u p e f f e c ta n di s5t i m e sm o r ee f f i c i e n tt h a nt h a to f 2 5 k d ap e ir e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n , c y t o t o x i c i t yo ft h i sp o l y m e rw a sm e a s u r e di n2 9 3 t , 3 1 3c e l ll i n e s t h i sp o l y m e re x h i b i t sl o w e rc ”o t o ) 【i c i t ) rt h a n2 5 k d ap e i m o r e o v e r , i t s t r a n s f e e t i o ne f f i c i e n c yi sn o ta f f e c t z db ys e i u n la n di sh i g hi nc 5 7m o u m u s c l e a l l t h e s er e s u l t ss h o wt h a tt h i sp o l y m e ri ss a f ea n de f f i c i e n tg e n ed e l i v e r yv e c t o ri nv i t r oa n d i ti sp r o r a i s i n gt ob eu s e di nv i v o k e y w o r d s ：g e n ed e l i v e r y ,n o n - v i r a l ，p o l y e t h y l e n i m i n e ( p e l ) ，d e g r a d a b l e , c y t o t o x i c i t y n 硕t 学位论文可体内降解的交联聚乙烯亚胺的合成及其应用 注释表 e g s乙二醇二( 琥珀酰亚胺丁二酸酯) s a蔗糖丙烯酸酯 g m a甲基丙烯酸缩水甘油酯 b d 1 ，4 丁二醇二丙烯酸酯 d m s o二甲亚砜 d c cn ，n 二环己基碳二亚胺 d 呼n ，n 二甲基甲酰胺 b p e i8 0 0分枝状聚乙烯亚胺( 分子量8 0 0 ) b p e i 2 0 0 0分枝状聚乙烯亚胺( 分子皇2 0 0 0 ) 2 5 k d ap e l分枝状聚乙烯亚胺( 分子量2 5 0 0 0 ) 瓶k 2 9 3鼠源的h e k 2 9 3 细j i 包 b 1 6 f l o鼠源的b 1 6 f 1 0 细胞 3 t 3 鼠源的n i h3 t 3 细胞 2 9 3 t 鼠源的2 ，t 细胞 a 5 4 9人肺癌细胞 p e g f p c i 增强绿色荧光蛋白质粒 l i p o f e e t a m i n e 2 0 0 0i n v i t r o g e nc r o p 的一种转染试剂 p r i m e f e c t i m i n ep r i m g e nc r o p 的一种转染试剂 唧 四唑盐 v 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：年月 日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：年月 日 硕士学位论文 可体内降解的交联聚乙烯亚胺的合成及其应用 1 前言 基因治疗是指将外源基因转入细胞内部通过恢复或增添基因表达以纠正人自身 基因结构或功能上的错乱，阻止病变的发展，杀灭病变的细胞，或抑制外源病原体遗 传物质的复制，从而达到治病的目的。目前基因治疗被认为是一个非常有前景的治疗 方法，它不仅能够治疗遗传缺陷性疾病，而且可以发展出治疗或防止馒性病，例如癌 症，心血管病和类风湿性关节炎等的方法。基因治疗包括三个重要的环节，即治疗性 基因，转基因载体和靶细胞。安全高效地将核酸转移到特定的细胞中是基因治疗的技 术核心，也是基因表达调控，突变分析，蛋白质结构与功能分析等研究中的重要技术 环节，因此是现代生物技术中最有价值和最经常使用的技术之一。如何成功地使足够 量的外源核酸( d n a ，r n a 等) 转移到要治疗研究的宿主细胞中是当今生命科学研 究中急待解决的问题。以往的方法是将核酸整合到病毒载体中，尤其是逆转录病毒、 腺病毒或腺相关病毒中。这些系统利用了病毒迸入细胞的机制和它们对抗降解的保护 作用。由于病毒载体转染效率高，所以目前的文献报道中，许多的基因传递实验是由 病毒载体实施的，且已经批准的基因治疗临床实验方案0 0 6 9 是采用病毒载体【”。但 是，这些方法有一些严重的缺陷，例如，病毒载体的开发与制备需要使用缺陷病毒和 互补细胞系的复杂技术，因此制备复杂且价格较高。易产生能够在宿主机体中传播的 感染性病毒颗粒的风险，而且，对于逆转录载体，还有插入突变的风险，因此有潜在 的安全风险。此外，将治疗性的或疫苗性的基因插入到病毒基因组中的能力仍然有限， 因此病毒载体的包装容量有限。所以人工合成的非病毒载体受到了极大的关注【2 l ，合 成载体具有安全性高，免疫原性低，易于操作等优点，所以近来人们越来越重视人工 合成的非病毒载体的研究，而且合成载体的转染效率不断提高，最近的研究表明非 病毒的合成载体用于基因治疗前景光明【4 j 。合成载体主要是指聚合物载体( 包括聚合 多肽) 和脂质体。在非病毒载体研究的早期，人们的主要兴趣放在脂质体上，并且使 得阳离子脂质体广泛地用在体内和体外的基因转染实验中。但是直到现在为止脂质体 基因表达效率低，体内不稳定一直是困扰医学界的难题。目前已经合成的多种非病毒 载体中，聚合物基因载体占有重要的地位。研究较多的聚合物基因治疗体系主要有阳 离子多聚物型载体、非缩聚型聚合物体系、可生物降解的聚合物体系、多复合脂质体 体系、热，p h 敏感聚合物体系及聚合型胶束体系等。本课题研究是希望在总结以前的 关于基因传递的机理和相关聚合物结构研究基础上，设计出新型可生物降解的聚合物 基因载体。因此在提出我们的设计思想前先系统地总结一下近些年来的研究进展，因 为象病毒那样进行转染，一直是人们追求的目标，所以在总结基因转染机理时。我们 力求与病毒的作用过程比较。 颅士学位论文 可体内降解的交联聚乙烯亚胺的合成及其应用 1 1 基因传递过程中所遇到的障碍 为了将基因物质传递到细胞核发挥其功能，基因载体必须能保护基因跨越一系列 的细胞内外的障碍。病毒载体已经进化出了应对这些挑战的功能，与之相比，不同的 合成载体由于缺少一个或几个这样必需的功能，使其基因转染效率通常不令人满意。 为了能设计且合成出新一代的高性能的聚合物载体，首先应该理解目前阳离子聚合物 结构上的缺陷及基因传递中的各个环节。 1 1 1 细胞外障碍 聚合物基因载体是以静电结合的方式与基因物质作用且将d n a 压缩包装成纳米 颗粒的，这种纳米颗粒被称为聚合物，基因复合物( p o l y p l c x e s ) ，一般粒径为几十至 几百纳米，柱形或球形 6 1 。每个p o l y p l e x 颗粒通常是多个聚合物分子包裹几个d n a 分子，它们的结构和形态可能是动力学控制的1 7 j ，且受溶液中的d n a 与聚合物混合的 比影响很大。尽管已经有许多关于这个复合物的形成过程研究报道1 7 j ，但至今还没有 理解该过程的全部，进一步的研究仍然是被期待的。阳离子聚合物本身的结构影响它 对d n a 分子的静电结合与包裹作用，其正电荷密度对二者的结合有较大的影响。聚 合物的正电荷密度高，往往与负电性的d n a 更易于形成静电包裹，且包裹后所形成 的复合物上有多余正电性会使之易于与负电性细胞膜结合，但如果包裹过于紧密，跨 膜后，基因物质不易于释放出来，反而会降低转染效率，因此必须平衡阳离子聚合物 与d n a ，胞浆蛋白和负电性细胞膜问的作用嗍。 l 。1 2 血清中的稳定性与细胞的靶向性 p o l y p l e x 的稳定性取决于聚合物的结构和它与d n a 的正负电荷的比。电中性的 复合物在生理盐水条件下容易发生聚集形成大的颗粒，从而导致它们失去转染活性。 而正电性的复合物能分散在溶液中且发挥其转染活性，但最近的研究表明它们随时间 增加也发生聚集 7 1 ，血清白蛋白和其他负电性的蛋白能引起它进一步地聚集，其结果 是容易被巨噬细胞和网状内皮细胞系统迅速清除i ”。当将亲水性的聚乙二醇【i 田，n - ( 2 羟丙基) 甲基丙烯酰胺【埘，寡糖【1 0 1 ，糖j 和蛋白【1 2 】等偶联到聚合物载体上时能使其 抵抗由盐、蛋白或它们共同引起的p o l y p l e x 聚集，从而保护p o l y p l e x 的转染活性。 这些亲水性的聚合物稳定p o l y p l e x 的效果与它们的分子量。接枝度及偶联的方式有 关。基于高分子材料的非病毒基因载体不仅安全，而且具有大量的活性官能基团易于 被修饰，可以通过特定的修饰反应，赋予聚合物基因载体细胞间靶向传递的能力。已 经被偶联到聚合物基因载体上的靶向分子包括各种糖，叶酸，表皮生长因子( e g f ) ， 蛋白，多肽，抗体或抗体片段等，可以直接的或经适当的连接臂与靶向配体偶联，这 些连接分子是聚乙二醇( p e g ) 链、聚琥玻酸、聚癸二酸( p s a ) 、寡糖、氨基酸链、或 2 硕学位论文可体内降解的交联象乙烯亚胺的合成及其应用 其他任何适合的连接物。成功的靶分子偶联需要优化各种影响与细胞表面作用的参 数，它们包括连接臂的长度和结构，靶分子的接枝密度等。 1 1 3 溶酶体中逃离 p o l y p l e x 通过循环系统到达组织细胞表面后，细胞将以吞噬或吞饮的方式将其摄 人胞内，并通过克服一系列障碍而发挥作用。首先p o l y p l e x 、胞膜等形成内涵体，内 涵体迅速被内涵体小泡膜上质子泵的a t p a s e 酶酸化至p h5 6 ，然后内涵体被溶酶 体迅速吞噬且进一步酸化至p h4 5 ，在溶酶体内基因如果不能被保护，并及时有效 地被释放，则会被溶酶体酶降解l i ”，研究表明许多d n a 在此被降解。大多数研究者 认为基因能否有效地从溶酶体内迅速逃离是影响基因转移效率的关键步骤。病毒显然 已经进化出了相应的结构( 转导肽序列) 帮助基因从溶酶体内逃离，聚合物载体可以偶 联一些这样的的肽序列例如h wt a t 或h a 一2( i n f l u e n z av i r u sh e m a g g l u t m i n s u b u n i t ) 1 1 4 i ”，从而改善其性能。据说，在转染过程中添加氯奎可帮助调节内涵体小 泡的p h 值从而提高一些聚合物的转染效率i l ”。尽管这种方法经常用于体外转染实验， 但却不能用于体内的基因传递。但一些被称之为质子海绵的聚合物由于有较大的p h 缓冲能力，所以不需要氯奎的帮助也能表现出较高的转染效率，例如树枝状聚合物和 聚乙烯亚胺1 1 7 1 ，它们有其自己的独特的作用机理【堪l 。 基因逃离溶酶体至细胞质内，能否在胞质内不被降解，并顺利进入到核内也同样 影响着基因的表达和功能。因为胞质中有各种蛋白，微管和其他细胞器，这些都会阻 碍p o l y p l e x 的运动。正电性的p o l y p l e x 能够通过非特异性地与负电性的微管或运 动的蛋白作用而沿着微管运动，也可以被内溶酶体沿着微管运送。当然在有丝分裂期 间，p o l y p l e x 也可以通过混合而重新在细胞内分配，这样一些复合物才能达到细胞核 附近。正确地理解胞质中p o l y p l e x 的运送机理对设计和改善聚合物基因载体的性能 有巨大的帮助。有研究者认为胞质内质粒d n a 不被降解可能比基因从溶酶体逃脱更 能决定基因的转移效率【1 9 1 。研究表明目前许多的基因载体可以把基因带入细胞，但有 的复合物不能及时地打开释黼a ，而有的复合物容易在胞质中被降解洌。 1 1 4 核定位 基因物质必须跨越核膜进入细胞核才能发挥其作用，细胞核上的核孔复合物 ( n u c l e a r p o r ec o m p l e x ，n p c ) 只允许一些特殊生物小分子进出细胞核，超过1 0 - 2 0 k d a 的蛋白等物质必须由特殊的核输送蛋白运送。病毒已经进化出了相应的结构来完成这 个过程，但聚合物载体显然没有这样的能力，它们运送的基因进入核内可能主要通过 两种途径，一是细胞分裂时核膜的破裂，另一个便是经核孔进入不过具体的机制目 前仍不太清楚1 2 1 1 0 在细胞分裂前不久进行的转染效率比细胞生长初期的转染效率高3 0 3 硕士学位论文 可体内降解的交联聚乙烯亚胺的台成及其应用 或5 0 0 倍1 2 2 1 。对非病毒基因载体，在细胞非分裂期间使运送的基因物质跨越核膜似乎 是一个较大的障碍。可以通过偶联一些核定位信号小肽帮助跨越核膜，但这种方法似 乎效果不明显i 矧。所传递的基因物质上的一些核苷酸序列有时能提供核定位或核靶向 功能1 2 3 l 。 1 2 阳离子聚合物基因载体 阳离子聚合物具有安全性高，免疫原性低，易于对d n a 进行操作，价格低，特 别是其结构易于改造等优点。因此人们对阳离子聚合物作为基因载体的兴趣越来越 高。阳离子聚合物包括商业上易锝到的聚合物材料和专门为基因传递设计的合成聚合 物。其结构特点为：这些聚合物的主链或侧基上均包含有各种伯、仲、叔胺基或正电 性的脒基等正电性基团，可以是线性、分枝或树枝状结构。由于这些聚合物结构上改 造容易，所以它们可以提供有效基因传递所要求功能。结果是尽管目前它们的体内转 染效率并没有完全满足需要，但日益增加的研究报道表明它们具有极大的临床应用潜 力。为了改善其性能，它们本身和其结构修饰后的衍生物得到了广泛的研究，这些研 究是目前非病毒载体研究的主要部分也是文献报道的绝大多数内容。 1 2 1 商业上易得到的聚合物用作基因载体 聚赖氨酸( p l l ) 是最早用于现代基因传递的阳离子聚合物之一。它的转染效率低 且需要氯喹帮助，为了提高其转染效率，科学家对其进行了各种修饰和改造，这些研 究包括将其与其他聚合物接枝、嵌段或共聚，偶联各种靶向分子例如糖、叶酸、r g d 等多肽和抗体。由于其与d n a 形成的转染复合物在被胞吞后，d n a 较难从中逃逸至 细胞浆中，因此近来的研究表明聚赖氨酸类的聚合物进行临床应用取得成功的前景并 不乐观。 树枝状聚合物具有高度支化和规整的结构。它的分子大小和表面电荷可以通过控 制合成它的代数得到准确的控制。1 9 9 3 年h a e n s l e r 和s z o k a 2 4 首先报道了聚酰胺胺树 枝状高分子( p a m a m ) 用作基因转染剂。5 代以上的p a m a m 树状大分子能将d n a 高 效转染到不同的哺乳动物细胞中，转染效率高于脂质体。转染效率主要取决于树状大 分子与d n a 比例及树状大分子的大小。目前己被合成的商品化的s t a r b u r s t t m ( p a m m ) 分子有o l o 代。这些分子的特定结构和表面大量的氨基基团有利于它 们与核酸通过静电作用形成稳定的复合物，因此被广泛地应用于基因转染领域。研究 实验表明，第五至第十代的树状高分子可携带d n a 跨越细胞膜而获得高效的基因表 达，且对宽范围的哺乳动物细胞系仅呈现较低的毒性。有些树枝状聚合物甚至可以在 第二至第三代就取得较高的基因转染效率磷】。树枝状聚合物偶联精氨酸和环糊精等可 以进一步地提高其转染效率【2 6 2 7 1 。可降解的树枝状聚合物也比其本身有更高的转染效 4 硕士学位论文 可体内降解的交联聚乙烯哑胺的合成及其应用 率i 邛l 。由于它们有较高的转染效率和好的生物相容性，所以近来树枝状聚合物已经被 用于些体内的基因传递实验1 2 9 , ”1 。 聚乙烯亚胺( p o l y e t h y l e n i m i n e 简称p e i ，其结构式如图1 2 1 所示) 是迄今为止 转染效率最高的聚合物载体之一，自1 9 9 5 年被发现以来得到了广泛的应用与研究f 1 7 川。它不需要任何外界的内涵体离解剂就能取得较高的转染效率，它的转染效率是基 于溶酶体保护，使d n a 免于核酸酶降解，随后溶酶体溶胀与破裂提供了p e i ，d n a 粒 子逃脱机制。它容易与各种靶向分子例如半乳糖，甘露糖，转铁蛋白和抗体等偶联从 而使其具有靶向性。目前聚乙烯亚胺已经成功地用于体内各种组织例如中枢神经系 统、肾、肺和肿瘤等的基因传递。但聚乙烯亚胺往往有较高的细胞毒性，它的高转染 活性主要是得益于它的质子海绵结构所导致的p e i 基因复合物易于从内涵体和溶酶 体中逃离7 j 。p e i 聚合物链中每相隔三个原子，即每“第三个原子”都是质子化的氨基 氮原子，使得聚合物网络在任何p h 下都能充当有效的“质子海绵”体。由于p e i 有非常 高密度的胺基，所以在生理p h 值下它也只有1 5 - 2 0 被质子化【让1 。p e i 是非常有希望 的基因治疗载体，但由于它不是专门为基因传递而生产的聚合物，所以它的基因传递 性能并没有处于最佳状态。但在设计更复杂的基因载体时，p e i 经常做为核心组成成 分。f o r r e s t 等将p e i 中的胺基与乙酸酐反应，把p e i 中的部分伯胺和仲胺转化为酰胺 基l ”j ，这种转化由于减少了聚合物中的可质子化的n 原子数，从而降低了质子海绵的 电性。结果发现p e i 的乙酰化作用增加了它的转染活性，其中4 3 叱的胺基被乙酰化的 p e i 其转染效率比母体提高了2 6 倍。类似地，t h o m a sa n d k l i b a n o v 将2 5 k d a p e i 中的 胺基完全地被各种基团例如甲基、乙基，胆碱、氨基酸和长链烷基修饰i m i ，结果发现 只有采用丙氨酸修饰的p e i 转染效率提高，其他的修饰均使得转染活性下降。而低分 子量的2 0 0 0d a 的p e i 经十二烷基化和十六烷基化后，其在血清存在下的转染效率比 2 5 一k d ap e i 高5 6 倍。这些结果表明阳离子聚合物的胺基密度不是越高越好，胺基 太多则对d n a 的结合就越紧密，当p o l y p l e x 进入细胞后解离释放d n a 就困难，所以 阳离子聚合物的缓冲能力也需要与其他性质平衡和优化。 r h， h ，一、，| “一一“b i 矗z 图1 2 1 分枝型和线型p e i 硕士学位论文 可体内降解的交联聚乙烯哑胺的合成及其应用 1 2 2 专门设计合成的聚合物基因载体 有许多种类型的聚合物是专门为基因传递而设计与合成的，在大多数情况下是针 对基因传递过程中的某个胞内障碍的，例如稳定性，生物相容性和溶酶体逃离等。结 果是有些聚合物的性能得到了改善。但还达不到病毒的性能。如下的结构和合成方法 对未来的研究有重要启迪且是非常有希望应用的。 1 2 2 1 含咪唑基的聚合物基因载体 有质子海绵性质的聚合物是目前商业上可得到的非病毒载体中转染效率最高的， 但它们的细胞毒性较大，因此限制了它们使用。模拟这些结构且增加其生物相容性的 聚合物是非常有希望的非病毒基因载体。咪唑基有基因传递所需要的质子化性质( p k a - - 6 ) ，并且也是一些生物分子的成分( 例如组氨酸) ，因此在聚合物中引入昧唑基可 能会增加其生物相容性，同时也可能促进其p o l y p l e x 的溶酶体释放【3 5 1 。聚赖氨酸 ( p l l ) 的一胺基被组胺酸修饰后其转染活性增加，但细胞毒性降低口6 】。乙烯类聚 合物侧基被组胺酸化后其转染效率高于p e i 口”。组氨酸均聚物( p h i s ) 经葡萄糖酸修饰 后( g _ p h i s ) 其水溶性增强p ”。而且d n a ，g p h i s 和转铁蛋白聚赖氨酸( t f - p l l ) 三重 复合物在没有添加内涵体解离剂( 氯奎) 情况下，其转染c o s - 7 细胞的效率类似于 t f - p l l 在氯奎存在下的效率。 1 2 2 2 有破膜功能的多肽和聚合物基因载体 从内涵体逃离是基因传递过程中的一个至关重要的环节。许多病毒已经在其壳蛋 白上进化出了特殊的酸性肽序列，这个酸性肽在酸性环境下可以被质子化，然后与内 涵体膜融合，使内涵体破裂，从而将d n a 或r n a 直接运送到细胞质中【3 9 j 。有类似p h 响应的，膜去稳定功能的合成肽已经被用作易于使p o l y p l e x 的内涵体释放的转染剂 1 4 0 1 ，但这些外源的肽做为基因载体有引起不被希望的免疫应答的危险。因此人们希望 模拟病毒壳蛋白上酸性肽序列合成有与内涵体融合功能的内涵体释放剂，例如对酸性 有响应的合成聚合物1 4 1 1 能增加p o l y p l e x 的传递效率。这种聚合物的特性是当它在内 涵体的酸性条件下它们被质子化且从亲水性变为疏水性，且引起内涵体分裂。这些聚 合物包括聚烷基丙烯酸类【4 z j ，聚羧酸类阳j ，其中聚丙基丙烯酸( p p a a ) 有较强的内 涵体裂分能力且在内涵体的酸性条件p h _ - l i p o f e c t i m i n e 2 0 0 0 f u g c n e6 2 5 k d a p e i n a k e d d n a ( 图3 2 6 ) 。从图中可以看到，p 6 4 转染效率是s u p e f f e e t 的1 5 倍，是2 5 k d a p e i 的5 倍。通过以上的实验结果，我们可以得出p 6 4 是我们所需要的具有较高转染效 率的基因转染试剂。 畲 一卯 茎钟 最加 茎：。 g - 。 o 图3 2 6 各种不同的转染试剂x f f n i h3 1 3 细胞的转染效率 另外，我们还把p 6 4 用在t c 5 7 d , 鼠肌肉转染实验中，结果如图3 2 7 所示。其中， 硕士学位论文 可体内降解的交联聚乙烯亚胺的合成及其应用 白光与荧光叠加表明转染效率达到9 0 。 荧光分析转染情况白光分析细胞形态 荧光自光叠加分析转染效率 p 6 4 d n a ( 质量比) = 1 5 ：1 图3 2 3 在优化的转染条件下，p 6 4 介导的g f p 在细胞a 5 4 9 中的转染效果 p 6 4 d n a ( 质量比) = 2 ：l 图3 2 4 在优化的转染条件下。p 6 4 介导的g f p 在2 9 3 t 细胞中的转染效果 图3 2 5 在优化的转染条件下，p 6 4 介导的g f p 在b 1 6 f 1 0 细胞中的转染效果 荧光分析转染情况白光分析细胞形态荧光白光叠加分析转染效率 图3 2 7p 6 4 介导g f p 在c 5 7 小鼠肌肉部位转染的荧光照片 预t 学位论文可体内降解的交联聚乙烯亚胺的合成及其应用 3 2 3 细胞毒性实验 尽管高分子量的p e i 转染效果较好，但往往是以牺牲细胞毒性为代价的。为了 进一步的评价p 6 4 的性能，我们还用m t t 法进行了细胞毒性实验【胡l 。结果显示： 对于3 t 3 细胞，p 6 4 在其最优条件下( p o l y m e r d n a 为i 5 ：l ，聚合物浓度为l o r t g m l ) 的细胞存活率达到了9 5 ( 图3 2 8 ) ，然而对照组的2 5 k d a p e i ( p o l y m e r d n a 为4 ： 1 ，聚合物浓度为2 5 p g m l ) 仅有6 3 ：对2 9 3 t 细胞，p 6 4 在其最优条件下 ( p o l y m e r d n a 为2 ：l ，聚合物浓度为1 3 i _ t g m l ) 的细胞存活率仍为9 3 ，而2 5 k d a p e i 为6 2 ( p o l y m e r d n a 为3 ：l ，聚合物浓度为2 0 1 _ l g m l ) ( 图3 2 9 ) ；对于h e k 2 9 3 细胞，各种转染试剂在其最优条件下进行基因转染后细胞存活百分率均在8 5 以 上，其大小顺序为：p 6 4 s u p e r f e e t f u g e n e l i p o f e e t i m i n e 2 0 0 0 ( 图3 2 1 0 ) ，说明 p 6 4 对眦k 2 9 3 细胞毒性最小。从上述结果可以看出我们所筛选出的聚合物p 6 4 比 2 5 k d ap e i 有较低的毒性。这种低毒性的原因可以归结为它具有可生物降解的性质。 由于它的低毒性，以及在有血清存在的条件还能保持较好的转染效果的性质( 数据 没有给出) ，同时c 5 7 小鼠体内肌肉转染实验表明其体内肌肉转染效率较高，且毒 性很小，这使p 6 4 具有了应用于体内的可能。 毋 u * 蜒 性 霉 疆 图3 2 8p 6 4 与2 5 k d ap e i 对3 t 3 细胞的毒性对比 硕士学位论文可体内降解的交联聚乙烯亚胺的台成及其应用 毋 v 铬 蜂 件 霉 最 图3 2 9p 6 4 与2 5 k d ap e i 对2 9 3 t 细t 胞的毒性对比 蠢 v 鼍 楚 幛 露 最 s u p e r f e c !f u g e n e6l i p o f c c t a m i a e2 0 0 0 图3 2 1 0 用各种转染试剂进行基因转染后i - i e k 2 9 3 细胞存活百分率 3 2 4 复合物的粒径分析 复合物的粒径用光散射法在2 5 。c 下测定，所用的仪器为b r o o k h a v e n9 0p l u s p a r t i c l es i z ea n a l y z e r ( b r o o l d 3 a v e n e n t sc o r p o r a t i o n , h o l t s v i l l e ，n y ，u s a ) 。波长 帅 砷 柏 加 。 硕t 学位论文 可体内降解的交联聚乙烯亚胺【合成及其应用 6 6 0 啪，恒定角9 0 0 ，在基于重量分析的基础上，假设p 6 4 d n a 复合物是对数正态 分布时，其尺寸表示为有效直径。复合物的制备方法同3 1 2 3 ，只是复合物的总体 积可以等比例地增加至lm l 。具体为：1 0p gd n a 溶于5 0 0 1 l 1 的p b s 中，适当量 ( 依据p o l y m e r d n a 质量比要求) 的p 6 4 溶入5 0 0mp b s 中，然后将二者混合， 室温下振荡l o 秒钟，静置4 s 分钟后，进行光散射实验。结果表示为平均粒径4 - s d 。 n = 3 。为了研究血清对复合物稳定性的影响其对比实验为：l 质粒d n a 的溶液 ( 1 m g m 1 ) 溶于5 0 山p b s 中，再取适当量( 依据p o l y m e r d n a 质量比要求) 的p 6 4 溶入5 0 山p b s 中，然后将二者混合，振荡1 0 秒钟，室温静置l o 1 5 分钟后，加 入0 9m l 的含l o 新生牛血清的d m e m 培养液，3 0 分钟后进行光散射实验。结果 表示为平均粒径士s d ，n = 3 。如图3 2 1 0 所示，没有加入含有血清的完全培养基的 p 6 4 与d n a 的复合物4 5 分钟后已经发生了聚集，粒径达到4 0 0 衄左右，而加入 完全培养基后能明显地抑制p 6 4 与d n a 所形成的复合物的聚集，同样条件下其粒 径仅为1 5 0l i r a 以下，且能维持数小时。因此，当p 6 4 与d n a 在p b s 中形成的复 合物用含血清的完全培养基稀释后，能够稳定该复合物对抗盐诱导的聚集。 图3 2 1 0p 6 4 d n a 复合物的动力学光散射分析其粒径的大小 3 2 5 筛选出的聚合物的结构性能分析 根据上述试验结果可以看出在我们所合成的1 0 2 种聚合物中。p 6 4 具有较高的 转染效率以及较低的毒性。这种聚合物的合成原料由b p e l 2 0 0 0 、e g s 、s a 组成： b p e l 2 0 0 0 ：e g s ：s a 的摩尔比为2 ：l ：l 。分析其具有较高转染效率和较低细胞毒 性的原因，可归结为以下几点： 1 产物p 6 4 比其它没有s a 参与反应的聚合物的溶解性要好，在没有加入s a 而 单纯用e g s 合成的聚合物难溶于水。当加入s a 量太多时，溶解性太好，转染 3 硕士学位论文可体内降解的交联聚乙烯亚胺的合成及其应用 效率反而变差，这与文献的理论基本一致，即太好的溶解性对转染效率有负面 影响，可能的原因是水溶性太好会影响聚合物和细胞的接触1 6 9 1 。另外，从试验 结果看出没有s a 参与的产物难溶于水，无法进行细胞转染实验。 2 我们对产物p 6 4 进行了分子量的测定，其分子量约为1 9 0 0 0 ，所得的聚合物的 分子量可能较好的满足了细胞转染的条件。因此，b p e i ：e g s ：s a 为2 ：l ：1 在目前来说是一个较为理想的摩尔比。 3 通过查阅大量文献可以发现在合成可生物降解的基因传递载体中，有较好转染 效率所使用的交联剂主链长度都在6 1 3 之间【6 0 , 6 h 。而我们筛选出来的产物p 6 4 所用的交联剂e g s 恰好也在这个范围之内。原因可能是通过适当的交联剂所德 的产物符合在生理p h 下都能充当有效的“质子海绵”( p r o t o ns p o n g e ) 障1 7 0 i 。 4 从实验结果可以看出产物p 6 4 的细胞毒性比2 5 k d ap e i 低。主要原因可能是它 在生理条件下，形成的聚合物中的酯键能够降解，所以细胞毒性较低1 7 i j 。 5 聚合物上连有糖基不但改善了聚合物的水溶性而且还能够有效增加 p o l y m e r d n a 复合物与细胞表面的接触，这也可能是提高细胞转染效率的原因 之一。 6 从复合物的粒径分析结果可知，当p 6 4 与d n a 在p b s 牛形成的复合物用含血 清的完全培养基稀释后，能够稳定该复