（化学工程与技术专业论文）细菌中乙偶姻代谢相关研究.pdf

中图分类号：q 8 1 2 单位代码：1 0 4 2 5 学号：s 0 7 0 3 0 4 5 2 寸阂石油六学 硕士学位论文 c h i n au n i v e r s i t yo fp e t r o l e u mm a s t e rd e g r e et h e s i s 细菌中乙偶姻代谢相关研究 t h e s t u d yo fa c e t o i nm e t a b o l i s mi nb a c t e r i a 学科专业： 研究方向： 作者姓名： 指导教师： 辅导教师： 化学工程与技术 生物材料与工程 乔树苓 徐海教授 肖梓军副教授 二。一。年五月 t h e s t u d y o fa c e t o i nm e t a b o l i s mi nb a c t e r i a at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：s h u l i n gq i a o s u p e r v i s o r ：p r o f h a ix u a s s i s t a n t ：a s s o c p r o f z i j u nx i a o c o l l e g eo fc h e m i s t r y & c h e m i c a le n g i n e e r i n g c h i n au n i v e r s i t yo fp e t r o l e u m 关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的 成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均已在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名： 岙拉j 蕉 日期：跏l 。年b 月 日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印刷版 和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、借阅和 复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、缩印或其他 复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名：丕盘查整 指导教师签名：刍缉圣逛1 日期：弘l o 年b 月日 日期：矽o 年衫月y 日 摘要 本论文对乙偶姻在细菌体内的分解代谢相关的未知蛋白a c o x 进行了n c b i 序列比 对，对其性质及功能进行了预测，并以p s e u d o m o n a sp u t i d ak t 2 4 4 0 的基因组为模板， 克隆表达了a c o x 基因，并对纯化后的a c o x 进行了圆二色谱分析。 n c b i 中将a c o x 注释为n a d k ，n a d k 家族的氨基酸序列上有两段高度保守的序 列：g g d g 模序和g l y r i c h 模序。但通过对九个物种的典型的a c o x 氨基酸序列比对发 现，它仅有保守的g g d g 模序以及自己独特的保守序列，而没有g l y r i c h 模序。因此认 为a c o x 不是n a d k ，并进一步用实验进行了证明。 以pp u t i d ak t 2 4 4 0 的基因组为模板，根据其a c o x 序列设计引物，克隆表达a c o x 基因，并用镍螫合亲和层析法对a c o x 进行了纯化，得到的纯化蛋白用圆二色谱对其二 级结构进行分析，分析结果表明，a c o x 为c 【螺旋和b 折叠混合型。 本论文还以b a c i l l u ss u b t i l i s1 6 8 的基因组为模板，根据其a c o a 序列设计引物，进行 p c r 扩增，克隆表达了a c o a 基因，并对其进行纯化，用纯化后的蛋白进行了e l 的酶 活验证，实验没有检测到酶活，暗示了e 1 是由e 1a 亚基和e 11 3 亚基共同编码的，1 3 亚 基对e 1 的正确折叠起到不可替代的作用。 另外，本论文还以葡萄糖为底物，用气相色谱检测产物，实验表明，在葡萄糖发酵 过程中，首先产生乙偶姻，然后会有少量的2 ，3 丁二醇产生，但在较短的时间内，2 ，3 丁二醇产生后又首先被耗尽，实验研究了发酵产物的产生与底物的消耗及菌体生长的关 系。 关键词：a c o x ，序列比对，表达纯化，功能分析 t h e s t u d yo f a c e t o i nm e t a b o l i s mi nb a c t e r i a s h u l i n gq i a o ( c h e m i c a le n g e n e e r i n ga n dt e c h n o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f h a lx ua n da s s o c p r o f z i j u nx i a o a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h es e q u e n c e so ft h eu n k n o w np r o t e i na c o xa s s o c i a t e dw i t ha c e t o i n m e t a b o l i s mw e r ea l i g n e du s i n gt h en c b id a t a b a s e t h ec h a r a c t e r sa n df u n c t i o no fa c o xw e r e p r e d i c t e d t h ea c o xg e n ew a sc l o n e da n de x p r e s s e du s i n gt h eg e n o m eo fpp u t i d ak t 2 4 4 0 a s t h et e m p l a t e a c o xw a st h e np u r i f i e da n da n a l y z e du s i n gc i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r o s c o p y a c o xw a sn o t e da sn a d ki nt h en c b id a t a b a s e t h e r ea l et w oh i g h l yc o n s e r v e d s e q u e n c e s ：t h eg g d g m o t i fa n dt h eg l y r i c hm o t i fi nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so ft h en a d k f a m i l y b u tt h e r ew e r eo n l yt h eg g d gm o t i fa n do t h e ru n i q u ec o n s e r v e dm o t i f si na c o x ，b u t n og l y r i c hm o t i f s ow ep r e d i c t e dt h a ta c o xw a sn o tn a d k t h ep r e d i c t i o nw a sp r o v e dt o b et r u eb yf u r t h e re x p e r i m e n t s t h ea c o xg e n ew a sc l o n e da n de x p r e s s e du s i n gt h epp u t i d ak t 2 4 4 0g e n o m ea st h e t e m p l a t e t h e na c o xw a sp u r i f i e dw i t l lt h en i c k e lc o l u m n c i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r o s c o p y w a su s e dt od e t e r m i n et h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fa c o x t h er e s u l ts h o w e dt h a ti t ss e c o n d a r y s t r u c t u r ew a sam i x t u r eo fah e l i x sa n dds h e e t s t h ea c o ag e n ew a sc l o n e da n de x p r e s s e du s i n gt h eg e n o m eo fb a c i l l u ss u b t i l i s16 8a st h e t e m p l a t e a c o aw a sp u r i f i e dw i t ht h en i c k e lc o l u m na n dt h e nt e s t e di t se 1a c t i v i t y b u tn o a c t i v i t yw a sd e t e c t e d ，i n d i c a t i n gt h a te 1i sc o d e db yb o t ht h ee10 【s u b u n i ta n de11 3s u b u n i t a n de 1bs u b u n i ti si n d i s p e n s a b l ei nt h ec o r r e c tf u n c t i o no fe1 g a sc h r o m a t o g r a p h yw a su s e dt od e t e c tt h ev o l a t i l ep r o d u c t si nt h eg l u c o s ef e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t a c e t o i n ，a n dt h e nal i t t l e2 , 3 b u t a n e d i o l ，w e r ed e t e c t e d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h eg r o w t ho fb a c t e r i u ma n dp r o d u c t sa c c u m u l a t i o nw a ss t u d i e d k e yw o r d s ：a c o x ，s e q u e n c ea l i g n m e n t ，e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n ，f u n c t i o n a la n a l y s i s 目录 第一章前言1 1 1 乙偶姻的基本性质及其应用1 1 1 1 乙偶姻的性质l 1 1 2 乙偶姻的应用l 1 2 乙偶姻的生产1 1 2 1 丁二酮部分加氢还原生产乙偶姻。1 1 2 22 ，3 丁二醇选择性氧化法生产乙偶姻2 1 2 3 生物法生产乙偶姻2 1 3 乙偶姻新陈代谢的生理意义3 1 3 1 维持p h 稳定，贮存碳源3 1 3 2 维持n a d n a d h 比值的稳定4 1 4 乙偶姻分解代谢g2 ，3 丁二醇循环还是a o d he s 途径4 1 4 12 ，3 丁二醇循环。4 1 4 2a o d he s 途径4 1 5a o d he s 系统中的酶5 1 5 1a o d he s 酶1 、a c o a 和a c o b 5 1 5 2 a o d he s 酶2 与a c o c 5 1 5 3a o d he s 酶3 与a c o l 。6 1 5 4a o d he s 系统中的其他酶6 1 6 未知蛋白a c o x 7 1 7 研究的背景与意义9 1 8 本课题的研究内容9 第二章a c o x 蛋白功能预测比对分析1 0 2 1 前言1 0 2 2 数据库10 2 3 功能预测分析1 l 2 3 1 用生物信息学方法对a c o x 功能进行预测分析1 l 2 3 2a c o x 不可能是n a d 激酶1 1 2 3 3 二级结构预测1 3 2 4 实验结果1 3 2 4 1 对a c o x 的b l a s t 比对分析1 3 2 4 2 模序数据库比对16 2 4 3a c o x 与未知蛋白y 0 3 6s y n y 3 的比对结果1 8 2 4 4a c o x 的基本性质预测分析19 2 4 5a c o x 疏水性预测l9 2 4 6 跨膜区结构预测2 0 2 4 7a c o x 二级结构预测分析2 2 2 5 小结2 2 第三章a c o x 基因的克隆表达及蛋白a c o x 的纯化2 3 3 1 前言2 3 3 2 实验所需的材料及方法一2 3 3 2 1 主要仪器和试剂2 3 3 2 2 菌株和质粒2 5 3 2 3 培养基菌种保藏2 5 3 2 4p s e u d o m o n a s p u t i d ak t 2 4 4 0 基因组d n a 的提取2 6 3 2 5p c r 体系及方法2 7 3 2 6p c r 扩增产物的回收2 7 3 2 7p c r 扩增产物与载体的连接2 8 3 2 8 感受态细胞的制备( 采用传统的c a c l 2 法) 2 8 3 2 9 转化2 8 3 2 1 0e c o l id h 5 a 中转化质粒的提取2 9 3 2 1 1 限制性内切酶酶切2 9 3 2 1 2 表达载体的构建2 9 3 2 1 3b l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 a ( + ) 一a c o x 的诱导表达3 0 3 2 1 4s d s p a g e 电泳。31 3 2 15 蛋白纯化3 2 3 3a c o x 圆二光谱分析3 3 3 4 验证a c o x 不是n a d k 的实验3 4 i v 3 4 1n a d k 酶活测定原理3 4 3 4 2a t p 测定试剂盒3 5 3 4 3 蛋白浓度测定3 6 3 5 实验结果3 6 3 5 1 提取p s e u d o m o n a sp u t i d ak t 2 4 4 0 基因组3 6 3 5 2a c o x 基因的p c r 结果3 7 3 5 3a c o x 基因与载体的连接3 7 3 5 4a c o x 基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化3 9 3 5 5 蛋白浓度标准曲线3 9 3 5 6a c o x 圆二色谱图4 0 3 5 7a t p 标准曲线4 l 3 5 8a c o x 的n a d k 活性检测4 1 3 6 小结4 l 第四章a c o a 的表达纯化及发酵生产乙偶姻的实验4 3 4 1a c o a 基因的克隆表达及蛋白a c o a 的纯化4 3 4 1 1a c o a 的表达及纯化4 3 4 1 2e1 酶活测定方法4 4 4 2a c o a 基因克隆表达及纯化的结果4 4 4 2 1b a c i l l u ss u b t i l i s1 6 8 基因组提取4 4 4 2 2 梯度p c r 结果4 5 4 2 3 连接好的质粒进行酶切验证4 5 4 2 4 连接产物测序结果4 6 4 2 5 表达载体的构建4 7 4 2 6 蛋白表达条件确定4 7 4 2 7 蛋白纯化结果4 7 4 2 8a c o a 酶活测定标准曲线4 8 4 3 以葡萄糖为底物，发酵产物测定实验。4 9 4 3 1 主要的实验仪器4 9 4 3 2 培养基及培养条件4 9 4 3 3 菌体干重测定方法4 9 v 4 3 4 葡萄糖浓度测定方法5 0 4 3 5 乙偶姻浓度测定方法5 0 4 3 6 乙偶姻及2 ，3 丁二醇标准曲线绘制5 0 4 4 以葡萄糖为底物发酵产物测定实验结果5 0 4 4 1 葡萄糖标准曲线4 9 4 4 2 乙偶姻及2 ，3 丁二醇浓度标准曲线51 4 4 3 实验测定乙偶姻2 ，3 丁二醇的产生量与葡萄糖减少量的关系5 2 4 5 小结5 3 第五章结论5 4 参考文献5 5 攻硕期间取得的学术成果6 0 致 射6 6 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第一章前言 1 1 乙偶姻的基本性质及其应用 1 1 1 乙偶姻的性质 乙偶姻( a c e t o i n ) 即3 羟基丁酮，分子量8 8 1 2 ，有两种手性异构体。乙偶姻单体为 无色或淡黄色液体，有奶油香气，两分子乙偶姻易聚合成二聚体，二聚体为白色结晶粉 末，熔点1 5 0 c ，沸点1 4 8 0 c ，能自燃，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇，微溶于乙醚，在 植物油中几乎不溶。自然地存在于玉米、葡萄酒、蜂蜜、可可、黄油、咖啡、草莓和醋 栗等物质中，由于其具有特有的奶油香味，因此多用于奶油、干酪、咖啡、坚果的香味 增强剂，同时也可用于配制奶油、乳品、酸乳和草莓型香精等，啤酒风味、奶酪香味均 与乙偶姻有关。由于其具有特有的奶油香味，乙偶姻在食品、香料以及化妆品等行业都 有着非常重要的用途。 1 1 2 乙偶姻的应用 ( 1 ) 在食品中的应用：乙偶姻是国际上常用的香料品种。主要用作奶油、乳品、酸乳 和草莓型等香料的生产，8 0 含量的乙偶姻俗称“醋嗡 ，是酒类调香中一个极 其重要的品种； ( 2 ) 在制药行业的应用：可用来生产医药中间体，较大程度地提高药效，减轻药物的 副作用； ( 3 ) 在烟草行业的应用：乙偶姻、1 一戊烯3 醇、1 戊醇等成分具有典型的香气特征， 对烟叶香气具有良好的影响，是特香型烤烟品种中特殊香气风格的主要物质基 础： ( 4 ) 在化工行业的应用：乙偶姻可以用做含氯聚合物的稳定剂，石油行业的起泡剂， 而乙偶姻与脂肪二元羧酸形成的酯可以用做防冻剂和增塑剂。 乙偶姻还可以作为一种新兴的平台化合物，广泛应用于其他行业，2 0 0 4 年美国能源 部将其列为3 0 种优先开发利用的平台化合物之一【1 1 。 1 2 乙偶姻的生产 1 2 1 丁二酮部分加氢还原生产乙偶姻 目前国内外研究及应用较多的乙偶姻生产方法是2 ，3 丁二酮部分加氢还原的方法【2 】， 反应原理见下图： 第一章前言 00o 珏0 |；iz n 物 l | c i i 一c c c h 一c h 一c i i c c h 。 。s o l 0 0 该方法主要是以2 ，3 丁二酮为原料通过添加不同的催化剂、还原剂来加氢还原得到 乙偶姻。张小舟【3 j 等人对以2 ，3 丁二酮为原料的乙偶姻化学合成工艺进行了研究，以锌 为还原剂，探索了该还原反应的规律。而m a r t i ns t u d e r 等则应用改性的铂作为催化剂对 2 ，3 丁二酮进行选择性的加氢还原，得到具有一定旋光度的乙偶姻。 1 2 22 ，3 丁二醇选择性氧化法生产乙偶姻 人们对于2 ，3 丁二醇选择性氧化法生产乙偶姻的探索主要集中在空气氧化法和电化 学氧化法。空气氧化法即在装填铜刨花的反应器中，将2 ，3 丁二醇与空气加热至3 1 5 0 c 后 通过管式反应器，通过被空气氧化得到乙偶姻。电化学氧化法即通过电解，使2 ，3 丁二 醇失去h 质子后变成负离子，向正极迁移从而发生氧化反应。电化学氧化法只需使反应 温度维持在4 0 0 c ，电池电压为0 8 v 臣l j 可实现反应。 上述两种化学法都存在产品收率低，较难实现产业化，环境污染严重等缺点，最严 重的是上述两种方法的原料来源( 2 ，3 丁二醇和丁二酮) 均来自石油，随着石油资源的 日益枯竭，这两种原料的成本将越来越高，必将增加乙偶姻的生产成本，更加不能满足 人们对乙偶姻的消费需求，因此迫切需要一条可持续的乙偶姻生产工艺。 1 2 3 生物法生产乙偶姻 基于上述两种化学法合成乙偶姻工艺路线的缺点以及人们对产品质量的担忧，人们 开始将目光集中在用生物合成法来替代化学合成法，以期减轻环境资源压力，提高产品 质量。 1 2 3 1 酶转化法生产乙偶姻 h u m m e l 4 】等通过分离纯化乳酸菌或酵母菌中的丁二酮还原酶，以n a d p h 为辅酶， 在p h 5 0 ，7 0 0 c 下用该还原酶催化丁二酮的还原，得到乙偶姻。该方法产率最高可达到 1 0 0 ，且没有其他副产物。 d ef a v e f i 5 】等开发了一种附有醇脱氢酶活力的膜反应器，采用汉氏醋杆菌 仰c e t o b a c t e rh a n s e n i i ) m i m 2 0 0 0 5 全细胞催化2 ，3 丁二醇合成乙偶姻，考虑各种因素，在 最适条件下2 ，3 丁二醇转化为乙偶姻的晟大摩尔转化率达7 1 6 。 酶转化法与化学合成法相比，酶法产物得率高，没有其他副产物，但要获得大量特 异性的酶比较困难，并且原料与化学法相同，都为丁二酮或2 ，3 丁二醇，存在同样的原 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 料限制，因此酶法并没有从根本上改变乙偶姻的生产现状。 1 2 3 2 发酵法生产乙偶姻 自然界中某些细菌具有产乙偶姻的能力，能以糖质为原料进行发酵生产，但通常乙 偶姻是作为丁二酮和2 ，3 丁二醇的副产物，产量较少。因此从自然界中筛选分离到能够 高产乙偶姻的菌株是提高发酵法生产乙偶姻转化率的一个重要环节。赵祥颖等【6 ，7 1 选育 获得了一株高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌s f a h 3 1 ( c g m c c1 8 6 9 ) ，可有效地转化葡萄糖 生成乙偶姻，转化率高达4 8 2 6 ，接近理论转化率( 4 8 9 ) 【8 】，且该菌不产丁二酮和 2 ，3 丁二醇，是一株极具研究价值的乙偶姻生产菌株。此；, b x u t 9 】等也分离纯化出一株短 小芽孢杆菌x h l 9 5 ( d s m1 6 1 8 7 ) ，该菌株发酵生产乙偶姻的发酵单位达8 0g ，l ，是目 前报道的乙偶姻发酵单位最高的菌株，它能在含氯化钠质量浓度为1 0 0g l 的培养基上生 长，并能以葡萄糖或蔗糖为碳源，3 7 0 c 下发酵6 0h 后，乙偶姻的产量分别达6 3 0g l 或5 8 1 g m 。 此外由于以葡萄糖或其他能够转化生成丙酮酸的化合物为底物发酵生产乙偶姻的代 谢途径已经研究得比较清楚【l o ，1 1 1 ，因此可以通过这一点，通过基因工程手段得到能够高 产乙偶姻的菌株。在微生物体内，有两条主要的乙偶姻合成途径：两分子丙酮酸在洳乙 酰乳酸合成酶的作用下合成一分子0 【乙酰乳酸，a 乙酰乳酸在酸性条件下非酶自然氧化 脱羧生成丁二酮，丁二酮又可在丁二酮还原酶或2 ，3 丁二醇脱氢酶的作用下还原为乙偶 姻，该氧化途径已得到大量生化、分子生物学的数据支矧1 1 ，1 2 】；另一条途径是在仅乙酰 乳酸合成后，经a 乙酰乳酸脱羧酶生成乙偶姻。通过这两条途径生成的乙偶姻还可进一 步被2 ，3 丁二醇脱氢酶还原成2 ，3 丁二醇。因此可以通过基因工程手段敲除编码这两个酶 的基因以使这两个酶失活，阻止乙偶姻向2 ，3 丁二醇和丁二酮的转化，从而达到积累乙 偶姻的目的。 1 3 乙偶姻新陈代谢的生理意义 1 3 1 维持p h 稳定，贮存碳源 细菌由于将丙酮酸代谢为乙偶姻或2 ，3 丁二醇而避免了酸性产物在胞内的积累【1 3 1 4 】，维持了p h 稳定，避免了菌体的过早衰亡；同时由于在葡萄糖等能源利用完之后， 乙偶姻能被作为替代的能源或碳源【1 5 】，因此在细菌体内乙偶姻和2 ，3 丁二醇的合成也是 一种能源贮备策略【1 6 ，1 7 1 。 3 第一章前言 1 3 2 维持n a d n a d h 比值的稳定 乙偶姻和2 ，3 丁二醇之间的可逆转化是和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，n a d ) 与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n i c o t i n a m i d ea d e n i n e d i n u c l e o t i d eh y d r o g e n a t e d ，n a d h ) 之间的转化相偶联的，因此乙偶姻2 ，3 丁二醇代谢 途径也被认为参与了细菌中维持n a d n a d h 比率的稳定和平衡【1 7 ，1 8 1 。 1 4 乙偶姻分解代谢：2 ，3 丁二醇循环还是a o d he s 途径 1 4 12 ，3 丁二醇循环 1 9 5 6 年，j u n i 和h e y m 1 9 】提出了一条循环途径，用来解释在a c i n e t o b a c t e r c a l c o a c e t i c u s 中，2 ，3 一丁二醇( 2 ，3 b u t a n e d i 0 1 ) 、乙偶姻和双乙酰( d i a c e t y l ) 如何分解为乙酸的，被称 为2 ，3 丁二醇循环。 这个循环的特征性的中间代谢产物a 乙酰乳酸，乙酰乙偶姻等已经在彳 c a l c o a c e t i c u s ，c o r y n e b a c t e r i u m s p 1 9 1 等中被检测到，但是丑s u b t i l i s 2 川和a l c a l i g e n s e u t r o p h u s l 2 1 】在敲除2 , 3 t - - - 醇脱氢酶( 是b d 循环中的关键酶) 后仍然可以利用乙偶姻， 则说明了用b d 循环来解释乙偶姻等在细菌体内的代谢具有很大的局限性。 1 4 2 a o d he s 途径 l a c t a t e c o ， e t h a n o l a c e t a t e a c e t y l c o a + 图1 - 1 在可以利用乙偶姻的细菌中与丙酮酸代谢相关联的途径。实线箭头表示反应步骤，虚线箭 头表示碳源代谢物抑制( c a r b o nc a t a b o l i t er e p r e s s i o n ，c c r ) 途径。由a c o 操纵子编码的a o d he s 受到依赖于c c p a 的葡萄糖直接和间接的转录抑制作用。n o d ，非酶催化的氧化脱羧作用 ( n o n e n z y m a t i co x i d a t i v ed e c a r b o x y l a t i o n ) f i g l - 1 i n t e r c o n n e c t i o no fp y r u v a t em e t a b o l i cp a t h w a y si na c e t o i n - u t i l i z i n gb a c t e r i a b l a c ka r r o w s i n d i c a t et h er e a c t i o n s d o t t e do n e si n d i c a t et h ec a r b o nc a t a b o l i t er e p r e s s i o n ( c c r ) p a t h w a y t h ea c o o p e r o ne n c o d i n ga o d he si ss n b j e c t e dt od i r e c ta n di n d i r e c tc c p a d e p e n d e n tg l u c o s e t r a n s c r i p t i o n a ir e p r e s s i o n s n o d ，n o n e n z y m a t i co x i d a t i v ed e c a r b o x y l a t i o n 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 在p e l o b a c t e rc a r b i n o l i c l l s 中，乙偶姻的分解是由乙偶姻脱氢酶酶系统( a c e t o i n d e h y d r o g e n a s ee n z y m es y s t e m ，a o d he s ) 催化的，这个酶系统由乙偶姻：2 ，6 一二氯酚靛酚 氧化还原酶( a c e t o i n ：2 ，6 d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o lo x i d o r e d u c t a s e ，a o ：d c p i po r 或a o d h e se l ，由a c o a 和a c o b 编码) 、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶( d i h y d r o l i p o a m i d e a c e t y l t r a n s f e r a s e ，d h l t a 或a o d he se 2 ，由a c o c 编码) 和二氢硫辛酰胺脱氢酶 ( d i h y d r o l i p o a m i d ed e h y d r o g e n a s e ，d h l d h 或a o d he se 3 ，由a c o l 编码) 组成【2 2 ，2 引。 因此，o p p e r m a n n 等人提出了乙偶姻分解代谢的一种新机制，命名为a o d he s 途径。 1 5a o d he s 系统中的酶 1 5 1a o d he s 酶l 、a c o a 和a c o b 对pc a r b i n o l i c u s 的e 1 进行s d s p a g e 电泳，得到两条不同的条带，表明e 1 有 两个不同的亚基组成，分别为仅亚基和p 亚基，这两个亚基组成一个四聚体( ( 1 2 8 2 ) 。 其中a 和p 亚基分别为a c o a 和a c o b 的翻译产物。和其它t p p 依赖的酶一样，在a c o a 的翻译产物中可以找到推测的t p p 结合区域。这与d c p i p 依赖的乙偶姻氧化断裂是t p p 依赖的结果相一致【2 4 2 5 1 。a o d he se 1 两个亚基与a o d hs ( a c e t o i n c l e a v e i n gs y s t e m ) 的e 1 的两个亚基有高度的相似性，而通过对a o he se 1 的序列与其它的2 酮酸脱氢酶 复合体( 2 o x oa c i dd e h y d r o g e n a s ec o m p l e x e ，o a d h c ) 2 6 】的酶序列比对，其结果呈现 出很高的相似度，因此推测a o d he se 1 可能和o a d h ce 1a 亚基推测的催化功能类似 2 7 , 2 8 ，即可能催化最初依赖t p p 的对乙偶姻的亲核攻击。 而通过对a o d he s 和o a d h c 的两个e 1 的b 亚基之间的序列比对，发现有更高的 同源性，覆盖了整个区域。这个发现与d 亚基是起到结合酶l 和酶2 、稳定酶1 的各个 a 亚基、并且( 或者) 正确组装酶1 四聚体的作用的观点相一致2 6 , 2 9 , 3 0 。 1 5 2a o d he s 酶2 与a c o c 在pc a r b i n o l i c u s 中a o d he s 酶系统的e 2 是由a c o c 编码的，a c o c 的氨基酸序列 与二氢硫辛酰胺酰基转移酶的独特的多畴结构有惊人的相似性。在n 端有两个高度同源 的区域，通过对硫辛酰胺结合位点的同源序列比对发现，每个区域都包含一个硫辛酸赖 氨酸残基，与2 一酮酸脱氢酶复合体( 2 - o x oa c i dd e h y d r o g e n a s ec o m p l e x e ，o a d h c ) 的 e 2 的脂化有关。而两个同源序列与a e u t r o p h u s 的a o d hs ( a c e t o i n c l e a v e i n gs y s t e m ) e 2 的推测的脂化位点也有惊人的相似性。在两个推测的硫辛酸结构域之间是对蛋白酶 敏感的连接硫辛酸结构域的铰链区和催化域，在非变性的限制性蛋白酶水解作用下，铰 5 第一章前言 链区会被切开，生成相近分子量大小的结构域和催化域。而在c 端与其它的d h l t a 很 相似，包含保守的推测的组氨酸一天冬氨酸活性位点，它们被认为是与酶2 催化的乙基 转移作用相关f 3 l j 。p c a r b i n o l i c u s 的e 2 的c 端区域与像s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 的丙酮酸 脱氢酶复合体的e 2 催化区域有显著的同源性【3 2 】。 1 5 3a o d he s 酶3 与a c o l pc a r b i n o l i c u s 的e 3 是a c o l 的翻译产物，它有两个相同的亚基，且每一个亚基都 包含一个非共价的黄素腺嘌呤二核苷酸( f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，f a d ) 结合位点。 a c o l 编码4 7 0 个氨基酸，它的氨基酸序列与其它的来自原核或真核d h l d h 的初级结构 相比有很高的同源性，在氮端区域有非共价的黄素腺嘌呤二核苷酸( f l a v i na d e n i n e d i n u c l e o t i d e ，f a d ) 结合位点，在中间是n a d h 结合和碳末端相互作用区【2 7 ，3 3 1 ，并且 有保守的二硫键结合位点。 1 5 4a o d he s 系统中的其他基因 a c o r 是调控基因，o c o 操纵子需要a c o r 的正调节，在a c o r 敲除的突变株中，o c o 操纵子不能转录【3 4 1 。在丑s u b t i l i s 和c l o s t r i d i u mm a g n u m 中a c o r 的氨基酸序列与各种各 样的2 4 一1 2 启动子激活蛋白共同的保守碳末端有很高的同源性，这些激活蛋白与0 5 4 依赖的r n a 聚合酶有相互作用1 3 5 1 。 在c u p r i a v i d u sn e c a t o r 中，a c o d 编码乙醛脱氢酶i i ，p r i e f e r t 曾指出它对乙偶姻的分 解代谢至关重要【3 6 1 ，尽管它不与a c o x a b c 操纵子在同一个簇中。a c o d 有自己的启动子， 它的启动子序列与细菌中0 5 4 依赖的启动子序列有很高的同源性。由a c o d 编码的乙醛 脱氢酶氨基酸序列与其它的乙醛脱氢酶初级结构序列有高度的同源性。 a c o e 与乙偶姻在a e u t r o p h u s 内的利用有关，它编码乙酰辅酶a 合成酶，通过氨基 酸序列比对发现，a c o e 的氨基酸序列与其他来源的乙酰辅酶a 合成酶的结构有高度相 似性( 达到5 0 5 ) 。a c o e 在大肠杆菌中表达后使大肠杆菌更倾向于以醋酸盐( 相对酶 活1 0 0 ) 作为底物，也可以以丙酸( 相对酶活4 6 ) 及羟基丙酸( 相对酶活8 7 ) 作 为底物，但是却不能分解四个或更多个碳的脂肪酸3 7 1 。 在p c a r b i n o l i c u s 中，a c o s 编码3 1 0 个氨基酸，它与ec o l i 的例基因有较高的同 源性( 在2 7 8 个氨基酸中有6 4 7 的相似性) ，而l p a 基因是与硫辛酸的合成有关 3 8 , 3 9 1 的。a c o s 位于a c o c 的下游，与a c o l 共用一个新的启动子( a c o a ，a c o b ，a c o c 共用一个 启动子) 。 6 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 在不同的生物体中，还有另外一些基因，口c o 尉4 0 , 4 1 、a c 0 1 k 4 2 1 等并不总是出现，但却 与乙偶姻的分解代谢相关。 1 6 未知蛋白a c o x 通过对某些以乙偶姻为底物的细菌的深入研究发现了未知功能的蛋白a c o x ，a c o x 存在于某些以乙偶姻为底物的细菌中，但并不是所有能利用乙偶姻的细菌中都有a c o x 。 通过n c b i 序列比对发现，它和现有的已知功能蛋白的同源性都很低，它有自己独特的 保守区域如n p x s g a k r d i l v r r 、s x g t n n 、【a t l f i d g e r k 等模序，下图在对 2 1 个典型a c o x