（工业催化专业论文）茶多酚制备工艺优化及化学氧化生产茶色素工艺研究.pdf

摘要 本文主要以降低茶多酚提取过程和树脂吸附层折过程中氧化为目的，最终建 立了在提取阶段和层析阶段添加抗坏血酸的工艺条件。并初步建立了茶多酚的酸 性氧化生产茶黄素的工艺条件。 本文首先对实验用酶进行了筛选，并建立了酶解提取优惠工艺条件，其次确 定了在沸水提取茶多酚中抗坏血酸加量。通过对比水提，酶解提取和加抗坏血酸 提取三种提取工艺，综合考虑确定在提取阶段加入抗坏血酸具有较好效果和实际 意义。 本研究采用a n d e u f - 0 1 超滤中试机对茶叶提取液进行精制。实验表明： 3 x 1 0 0 d 的超滤膜可有效地将蛋白质、茶多糖分离，从面可以防止树脂污染、提 高产品纯度；而且可以利用膜浓缩液来生产茶多糖。 通过对离子交换撼脂及大孔吸附树脂进行筛选，最终选定h 6 0 0 树脂作为吸 附层析树脂纯化茶多酚。层析工艺中，用溶液a 作为第一阶段洗脱剂来洗脱咖 啡碱，第二阶段用8 5 乙醇洗脱茶多酚，实现了茶多酚、咖啡碱的高效分离。该 阶段洗脱层析工艺解决了传统方法中使用有毒溶剂脱除咖啡碱的难题，所得产品 无有毒溶剂残留、安全无污染、纯度高，符合“绿色技术”的时代主题。水洗阶段 加入抗坏血酸能有效的还原在第一阶段洗脱时氧化的茶多酚。 本文初步研究了茶多酚化学氧化生产茶黄素的工艺方案。 关键词：茶多酚；茶黄素；抗坏血酸；吸附层析； o p t i m i z i n gp r e p a r a t i o np r o c e s so ft pa n dc h e m i c a lo x i d i z i n g m e t h o do fp r o d u c i n gt f s a b s t r a c t t h i sp a p e rw a sf o c u s i n go nr e d u c i n go x i d a t i o no ft p , f i n a l l yd e v e l o p e dap r o c e s s w h i c hv cw a sa d d e di nb o t he x t r a c t i o ns t e pa n dc h r o m a t o g r a p h y 1 nt h ep r o c e s so fe x t r a c t i o n ，a u t h o rm a i n l yc o m p a r e dt w om e t h o d s t h ef i r s to n ew a sa d d i n gc e l l u l o s ei n t oe x t r a c t i o nu q n i d , t h eo t h e ro n ew a sa d d i n gv ci nt h eb o i l i n g e x t r a c t i o nl i q u i d u n d c rc o m p r e h e n s i v ec o n s i d e r a t i o n ，a u t h o re s t a b l i s h e dt h ep r o c e s s o f v ce x t r a c t i o n t h ee x t r a c t i o nl i q u o rw a sr e f i n e db ya n d e u f m iu l t r a f i l t r a t i o np i l o tu n i t t h e e x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e3 0 ，0 0 0 du l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n ec o u l ds e p a r a t e p r o t e i na n d t e aa m y l o s ee f f e c t i v e l yw h i c h c a l lc a u s et h ec o n t a m i n a t i o nt or e s i n t h e u l t r a f i l t r a t i o nc a ni n e a s et h ep u r i t yo fp r o d u c t o nt h eo t h e rh a n d ，i ti se a s yt o p r o d u c ea m y l o s ev i a c o n d e n s e dl i q u o r t h r o u g hc o m p a r i n gs e v e r a li r o ne x c h a n g er e s i na n dm a c r o - p o r o u sr e s i n , u l t i m a t e l y h 6 0 0w a sa p p l i e da st h ef i r s ts t a g ea d s o r p t i o nr e s i nf o ra d s o r bt h ee x t r a c t i o nl i q u i d 1 nt h ef i r s ts t e pa u t h o ra d o p t e ds o l u t i o naa st h ed e s o r b i n gl i q u o rf o re l u t i n g c a f f e i n ea n dt h es e c o n ds t e pc h o s e8 5 e t h a n o la st h ed e s o r b i n gl i q u o rf o re l u t i n gt p t h ep r o c e s sc a nh i g h l ys e p a r a t et pa n dc a f f e i n ea n ds o l v e dt h ec o n v e n t i o n a lp r o b l e m f o re l u t i n gc a f f e i n eb yu s i n gt h et o x i cs o l u t i o n t h ef i n a lp r o d u c tc o n t a i n sn ot o x i c r e a g e n t , w h i c hi s s a f e ，n 0p o l l u t i o n ，a n da c c o r d i n gw i t ht h et h e m eo f “g r e e n t e c h n i q u e ”。a d d e dv ci n t ow a t e re l u t i o np r o c e s sw h i c hc a np r o f i c i e n t l yr e d u c et h e o x i d a t i o nc a u s e di nt h ee l u t i o ns t e pl t h i sp a p e rs e t 叩am e t h o do fo x i d i z i n gt pt op r o d u c et h e a f l a v i n k e y w o r d s ：t e ap o l y p h e n o l s ；c a f f e i n e ；r e s i n ；a d s o r p t i o nc h r o m a t o g r a p h y ；r e c y c l e 第一章引言 1 1 概述 茶，起源于中国，传播于世界，与咖啡、可可并称为世界三大饮料。茶之所 以能够成为世界性饮料，是因为它不仅有解渴提神之功效，更有着多种保健的功 能。 在茶叶利用的四千多年的历史中，有三千多年主要作为药用。古书神晨本 草上记载：“茶味苦，饮之使人益思，少卧，轻身，明目。”并有“神农尝百草， 一日遇七十二毒，得茶而解之。，1 1 】唐代本草拾遗指出：“诸药为各病之药， 茶为万病之药。”，明朝李时珍在本草纲目中也记载说：“茶苦而寒，最能降 火，火为百病之因，火降则百病清也”1 2 1 。茶由古代的药到后来的饮料，现在又 回归到药，是现代生物技术和现代医学科技的成果。现代科学研究表明，茶叶之 所以对人体有保健作用，是因为它含有茶多酚、咖啡碱、茶多糖、茶氨酸、茶色 素等生物活性物质，其中对人体健康最有益的物质是茶多酚【3 1 。 茶多酚是3 0 余种多酚类物质组成的复合体，具有很强的生理活性，现代医 学研究表明，茶多酚可有效清除人体自由基，激活机体内过氧化物歧化酸活性1 4 】。 因此，它具有诸多功效，有抗癌n 抗诱变【6 l ，抑制肿瘤阴、抗病毒【8 1 ，杀菌抑菌 【”o l 、防辐射【1 1 j 、降脂助消化【1 2 , 1 3 1 ，防龋护齿1 1 4 1 、减肥去斑【1 5 1 、解烟毒【1 6 】等多种 功效。此外，由于其具有超强的抗氧化性和安全无毒性，所以被广泛应用于各种 动、植物制品加工行业的产品保质防腐，如饮品、肉制品、植物油等【切。 咖啡碱是茶叶、咖啡、可可以及其它植物中的生物碱，是茶叶的主要成味物 质和生理活性成分。咖啡碱有多种生理作用，能作为药品使用，具有兴奋神经枢、 强心、利尿、松弛平滑肌等作用【“。但是，过量的咖啡碱会对人体产生副作用， 如会引起心悸、胃肠痛、焦虑、失眠、呼吸频率增加、血压升高、心率失常，并 可能诱导心肌梗塞和冠心病的发生【”刎，特别是2 0 世纪6 0 年代以来，国内外都 出现了咖啡碱致癌致突变等的报道，这些报道使得消费者“望茶生畏”。正是由 于以上这些不利的负面作用，所以在国内及国际市场上，都希望有脱( 低) 咖啡碱 的茶叶和茶饮料的产品，因此脱咖啡碱技术只益受到人们的重视。 我国是产茶大国，茶叶资源十分丰富，在当前国际市场茶叶供给过剩，国内 产量持续增长，而出口形势又十分严峻的情况下，我国茶叶生产跌入深谷，出现 全国范围内的“卖茶难”。每年数以万吨的茶末、修剪叶、滞销积压茶叶，得不到 进一步的加工而是全部当作废料处理，造成巨大的资源浪费和环境污染。这些被 视作“废料”的茶，从保健、防病治病的功能来说著不比高档茶叶差，而且价格又 比高档茶叶低廉，来源又极其丰富。因此，开展茶叶的综合利用研究，无论是从 经济效益方面还是从社会效益方面来说都具有重要的意义。 1 2 茶叶的化学组成 茶叶的化学组成十分复杂，粗略估计，经过分离和鉴别的化合物约有4 5 0 种 以上，无机矿物元素不少于4 2 种f 2 l l 。茶叶的化学成分随品种、产地、采摘季节 的不同有较大差别，但归纳起来有如下几类： 1 ) 多酚类：是一种以儿茶素为主体的酚性化合物，含量约占茶叶干基的 1 5 一2 5 ，是决定茶汤滋味、颜色的主体成分，是形成毛茶品质的关键性物质【捌。 2 ) 氨基酸和蛋白质：茶叶中的氨基酸共有3 0 种以上。其中以谷氨酰己胺， 即茶氨酸( t e a n i n e ) 含量最高，其含量约为0 。5 一1 。2 ，对茶叶的滋味、品质具有 重要作用阎； 3 ) 芳香类物质：是一类含量少而种类多的挥发性混合体。按化合物的结构 分为醇、酚、醛、酮、酸、酯、内酯、含氮类物质、碳氢化合物、氧化物及酚酸 类化合物等约3 0 0 种左右。茶叶的香气主要由芳香物质的组成和浓度所决定。芳 香物质大多数不溶于水而易溶于有机溶剂，其成分非常复杂，虽然其含量少，但 对茶叶品质有着重要的影响【刎。 4 ) 生物碱：茶叶中含有多种嘌呤碱，其中以咖啡碱为主。 5 ) 糖类化合物：茶叶中含有多种单糖、多糖及果胶类物质。糖类在茶叶中 含量的高低是茶叶老嫩的标志，鲜茶含糖约1 左右。茶多糖的药理作用主要表 现在抗血凝、抗血栓、防辐射、降血糖、增强机体免疫功能等方面瞄i 。 6 ) 色素：茶叶中的色素有脂溶性和水溶性两大类，脂溶性色素主要为叶绿 素和类胡萝卜素。叶绿素约占茶叶干重的0 6 ，由于其分子中存在共轭双键的 闭合系统，故具有颜色。叶绿素难溶于水，通过过滤便可除去；水溶性色素主要 为花黄素和花色素，它们均属于酚类衍生物中类黄酮化合物，约占茶叶干重的 4 5 1 - 7 6 1 。 7 ) 其他化学成分：茶叶中还含有少量的游离有机酸、维生素、酶及无机元 素等多种物质。其中酶对茶叶的代谢与储存过程中茶多酚的含量有很大影响【2 7 1 。 1 3 茶多酚的化学组成与结构、性质及应用 1 3 1 茶多酚的化学组成与结构 茶多酚( t e ap o l y p h e n o l s ，简称t p ) 是茶叶呈味的主要成分，又称茶单宁、 茶鞣酸、茶鞣质，是茶叶中多酚类物质的总称【捌。一般来说，绿茶中茶多酚含量 较高，约占其于重的1 5 - 2 5 ，而红茶因发酵过程中部分茶多酚被氧化，故含 量较低，约为干重的6 。不同季节采摘及不同品种的茶叶，茶多酚的含量也有 差异，一般夏秋茶高于春烈冽。 茶多酚类物质大致可分为一下几种p q ： 1 ) 儿茶素( c a t e c h i n s ) ：属黄烷醇类，是茶多酚的主体成分，约占茶多酚 总量的6 0 8 0 ，在茶叶中的含量为千重的1 2 - 2 4 。主要包括l 表儿茶素( 简 称l - e c o 、l - 表没食子儿茶素( 简称b e g c ) 、l - 表儿茶素没食子酸酯( 简称l - e c g ) 和l ，表没食子儿茶素没食子酸酯( 简称l - e 6 c g ) 等。 2 ) 黄酮及黄酮醇类( f l a v a n o l s ) ：主要是黄酮醇及其苷类。含量占茶叶干 重的3 - - 4 。 3 ) 无色花青素( l e u c o a n t h o c y a n i n s ) ：即羟基【4 】_ 黄烷醇及其盐，包括花白 素及花青素，茶叶中花白素占干物质的2 - 3 ，花青素占0 0 1 左右。 4 ) 酚酸类和缩酚酸类( p h e n o l i ca c j d sa n dd e p s i d e s ) ：总量占茶叶干重5 左右。 其中儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，其结构式可表示为： o h o = c h f rhoh 一广 r 叩 q j 诞肭麟一孙一酯 耻乒埋髭臌臁一一叫； 1 3 2 茶多酚的性质 茶多酚为淡黄色至棕黄色的粉末或晶体，味苦涩、无毒，易溶于温水、乙醇、 甲醇、丙酮、冰醋酸和乙酸乙酯，微溶于油脂，不溶于氯仿、石油醚及苯等有机 溶剂，具有吸湿性，耐热性好的特点。在1 6 0 食用油中添加茶多酚，3 0 r a i n 后 茶多酚仅降减2 5 ，食用油的过氧化值( p v 值) 几乎不变，而未添加茶多酚的 食用油p v 值则增大一倍。茶多酚有较好的耐酸性，光照或p h 值大于8 时易氧 化聚合，遇光照及过渡金属易变质，能和铁离子生成绿黑色化合物【3 l j 。 1 3 3 茶多酚的应用 1 3 3 1 茶多酚在医药、保健品中的应用 1 ) 降血脂，降血压，抗血栓，改善血流变，防治心脑血管疾病1 3 2 , 3 3 1 茶多酚，尤其是茶多酚中的儿茶素e c g 和e g c 及其氧化产物茶黄素等，有 防治心脑血管疾病发生的功效。茶多酚调节血脂的作用在于它能与脂类结合，并 通过粪便将其排出体外，抑制脂质斑块的形成；同时它能促进血管内膜斑块中的 胆固醇较多地逆向转运至肝脏，并在其中经代谢生成胆固酸排出体外，从而起到 调节血脂、预防心脑血管疾病的作用。此外，茶多酚对人体糖代谢障碍具有调节 作用，从而有效地预防和治疗糖尿病及其并发症，是糖尿病患者的首选保健品。 2 ) 抗癌、抗突变作用 3 4 j s l 茶叶能防癌、抗癌、抗突变的研究在国内外许多国家都有报道。研究表明， 在复杂的癌变过程中，过量自由基起着重要作用，而茶多酚具有很强的抗氧化活 性和清除自由基的能力，其抗肿瘤机理和功效主要表现在：a 阻断致癌物的形 成，抑制机体内的代谢转化；b 抑制具有促癌作用的酶的活性；c 提高机体的 免疫力；d 抑制肿瘤细胞d n a 的复制，诱导癌细胞凋亡；e 对肿瘤放、化疗 引起的白细胞、血小板减少有显著的提升作用。因此茶叶对于多种癌症均有不同 程度的预防和治疗作用。 3 ) 抗菌作用p 6 l 茶多酚作为一种广谱、强效、低毒的抗菌药已经被世界上许多国家的学者所 公认。在众多的抗菌试验中，人们发现它对普通变形杆菌、金葡球菌、表皮葡萄 球菌、变形链球菌、肉毒杆菌、乳酸杆菌、霍乱弧菌等许多致病菌，尤其是对肠 道致病菌具有不同程度的抑制和杀伤作用。此外，茶多酚对能引起人体皮肤病的 病原真菌，如头部白癣、斑状水泡白癣、汗状泡白癣和顽癣等寄生性真菌也具有 很强的抑制作用。 4 ) 抗病毒作用吲 近年来，许多国家如英、美、日、中对茶多酚类物质抑制人体免疫缺陷病毒 一i 逆转录酯( h i v - - i r t ) 的作用进行了大量的研究。日本学者研究证实茶多酚 确是一种新型h i v - - i r t 的强抑制剂。我国学者则证明了儿茶素衍生物对h 一 i r t 及d n a 聚合酶具有抑制作用，并指出e g c g 抑制作用比迭氮胸苷三磷酸 ( a i t ) 的作用还要强。从构效关系上分析，e c g 比e c 的活性提高8 6 倍，而 e g c g 比e c g 的活性又高出1 2 倍。 5 ) 减肥轻身作用1 3 8 l 世界卫生组织研究认为，肥胖症是引发许多非传染性疾病的重要根源，它是 脂肪细胞增大或( 和) 脂肪细胞增多的结果。茶多酚可以通过促进脂肪酸的代谢和 脂肪水解以及通过抑制蔗糖酶、葡萄糖苷酶、a 淀粉酶的活性，减少碳水化合物 的吸收来减肥。 6 ) 有效防护身体免受x 光、电脑、手机等辐射的危害【3 9 1 随着社会的发展，人们越来越多地受n x 光、电脑、手机等越来越严重的低 剂量长时间电磁辐射的危害。茶多酚通过直接竞争辐射能量及清除辐射产生的自 由基以及修复造血干细胞和骨髓细胞，使损伤组织得到恢复来抵抗辐射危害，因 而用它加工的饮品被誉为“电脑时代的饮料”。 7 ) 有助于护齿明目【钟】 茶叶中含氟量较高，每1 0 0 9 干茶中含氟量为1 0 m g - 1 5 m g ，且8 0 为水溶性成 分。若每人每天饮茶叶l o g ，则可吸收水溶性氟l m g 1 5 m g ，而且茶叶是碱性饮 料，可抑制人体钙质的减少，这对预防踊齿，护齿、坚齿都是有益的。据有关资 料显示，在小学生中进行“饭后茶疗漱口”试验，踊齿率可降低8 0 。另据有关医 疗单位调查，在白内障患者中有饮茶习惯的占2 8 6 ，无饮茶习惯的则占7 1 4 。 这是因为，茶叶中的维生素c 等成分，能降低眼睛晶体混浊度，经常饮茶对减 少眼疾、护眼明日均有积极的作用。 1 3 3 2 茶多酚在食品工业中的应用 1 ) 用作抗氧化剂【4 1 l 茶多酚是天然油脂的抗氧化剂，其抗氧化活性优于人工合成的抗氧化剂丁基 羟基茴香醚( b h a ) 和二丁基羟基甲苯( b f i t ) ，也优于v e ，可广泛用于食品 工业，用以防止和延缓脂质的氧化或酸败。它是最早列入我国食品添加剂使用标 准的天然添加剂。 2 ) 用作色素保护剂【4 2 】 茶多酚可防止天然色素和8 一胡萝h 素的降解褪色，可以作为保色剂，使食 品和饲料色泽保持鲜艳和稳定。据称其效果比v o 高出2 0 倍。 3 ) 用作除臭剂【4 ，1 由于茶多酚对去除甲硫醇臭味具有良好效果，日本己利用茶多酚制成商品除 臭口香糖、香烟滤嘴，可去除和防止吸烟者口臭。 4 ) 用作饲料添加剂【删 由于配合饲料中含有维生素、脂肪等易氧化的营养成分，因此为保证饲料中 的各种营养成分不受损失或减缓氧化，提高饲料的利用率，在饲料中必须添加抗 氧化剂。试验证明，茶多酚作为没有潜在毒性的饲料抗氧化剂可有效提高维生素 a 的保存率，减缓维生素的氧化；并且能够抑杀动物体内的真菌和病毒，同时对 肠道内有益菌却起着保护作用，改善动物肠道内的微生物结构，提高肠道的免疫 功能，对增进动物健康有积极作用。 1 3 3 3 茶多酚在日用化工中的应用 茶多酚在日用化学工业的应用也有极为广泛的发展前景。茶多酚的黄烷醇类 化合物在波长2 0 0 - 3 0 0 h m 处有较多的吸收峰，有“紫外线过滤器”之美称，可减 少紫外线引起的皮肤黑色素的形成。此外，茶多酚具有高效的抗氧化清除自由基 能力【4 5 】，将其添加于化妆品中，可防止皮质胶原蛋白的氧化一褐色素的形成【撕】， 且茶多酚属小分子，更易被皮肤吸收。 1 4 本课题的研究价值 以茶叶为原料提取茶多酚最具中国特色和优势，也是茶叶生产的副产品粗 老茶再次利用的必然出路，这一变废为宝的开发，可使茶叶的保健功能更好地造 福于人类，并具有相当大的经济效益。2 1 世纪被称为“绿色世纪”。追求安全、 优质、营养、保健食品生产正成为全球食品工业发展的主流。在公众越来越重视 健康的今天和明天，无毒害残留的茶多酚、咖啡碱产品的研发注定是茶叶深加工 领域中的一个大大的热点。 现今生产茶多酚的工艺中，大都采用有机溶剂萃取法，产品有机溶剂残留较 多，是产品出口的一大障碍。树脂吸附法生产茶多酚工艺，污染环境少，符合化 工“清洁生产”的发展趋势，在茶多酚的生产上具有良好的开发应用前景，但存在 的主要问题是树脂分离茶多酚、咖啡碱的选择性差，造成产品质量低，尤其是咖 啡碱的含量超标；或吸附选择性很好的树脂，由于对一种成份( 茶多酚或咖啡碱) 的吸附力太强而造成洗脱困难，用乙醇溶液洗脱不下来( 而茶多酚又不能用碱 洗) ，这是目前树脂法生产茶多酚的技术难点所在。另外树脂堵塞污染问题也阻 碍了其工业化应用。 本文在茶多酚生产的提取和树脂分离阶段加入抗坏血酸来降低工艺过程中 茶多酚的氧化损失。工艺中采用了超滤操作，不但精制了料液、防止了树脂污染， 而且还提高了产品纯度：以无机溶液a 作为第一级树脂层析洗脱剂脱除咖啡碱， 用第二级树脂处理咖啡碱洗脱液，咖啡碱被吸附，透过液为得到再生的a 洗脱 剂，简便地实现了有机物咖啡碱与无机洗脱剂a 的有效分离，不但可以回收咖 啡碱，还实现了洗脱剂a 的再生，对于节省原料，减小环境污染具有非常重要 的意义。此外，本文还对化学氧化茶多酚生产茶黄素的工艺条件进行了初步研究。 工艺流程如下： 压互卜咂亟蛩础匿圃 8 匝驷笛篙 n 甲辛甲 匦堕蛩d 甄圈匿蜩 w j 乞 匝壶蔓睁趣囹 图1 - 1 整体工艺流程图 1 5 本文完成的工作及劬新点 本文通过对提取阶段分别添加复合纤维素酶和抗坏血酸对茶多酚提取率的 对比，最终确定在提取阶段加入抗坏血酸可以有提取率高，操作成本低等优点。 对于茶叶提取液，本研究采用a n d e u f - 0 1 超滤中试机对提取液进行精制， 滤除杂质。对操作压力、操作流速等工艺参数进行了探索。 以产品质量为指标，针对提取、吸附洗脱过程中所造成的少量茶多酚氧化， 作者研究了在不同洗脱阶段添加抗氧化剂v c ，将洗脱剂a 对茶多酚的氧化降到 最低。 通过选取的酸性氧化剂对茶多酚进行氧化实验，确定了体外化学氧化法生产 茶黄素的工艺参数。本研究的创新点： 1 ) 超滤与树脂层析法结合，解决了树脂污染问题，提高了产品质量，并且超滤 的浓缩液可以用来副产茶多糖。 2 ) 通过利用抗坏血酸的抗氧化性质，解决了茶多酚在提取，吸附分离过程中易 发生氧化而降低产品质量的问题。 3 ) 全部采用无毒溶剂进行洗脱，产品中不存在有害溶剂残留的问题。 4 ) 本文还初步筛选出一种酸性氧化剂，以茶多酚为原料氧化生产茶黄素。 8 第二章茶多酚的酶解提取和加抗坏血酸提取研究 2 1 茶多酚酶法提取的原理 针对茶叶的有效成分均处于原生质体中，而原生质体又处于细胞壁和细胞间 质包裹下的特点，选用主要成分是纤维素酶和果胶酶的复合酶液来分解构成细胞 壁及细胞间质的纤维素、半纤维素和果胶质，使细胞壁及细胞间质结构产生局部 疏松，膨胀、崩溃等变化，从而增大有效成分的扩散面积，减小传质阻力，提高 有效成分的提取率。应用酶解技术来提取茶叶中的有效成分有以下显著优点：1 、 反应条件温和。提取温度控制在酶的活性温区内( 约5 0 ) ，不仅减少了能耗， 而且还有效地避免了茶多糖的降解、儿茶素的高温氧化”“。2 、有效成分提取率 高。相比较同条件下的水提取，可大幅度提高各有效成份的提取率。3 、安全、 无污染。酶亦是生物蛋白质，而且对作用物具有高度专一性，它的加入对提取体 系无污染，也不会对有效物质的结构和活性造成影响，符合“绿色科技”的时代 主题。 2 2 儿茶素的氧化机理 茶鲜叶中多酚类物质主要分为儿茶素( 黄烷醇类) ；黄酮黄酮醇类；花青素、 花白素类；酚酸及缩酚酸类。其中儿茶素的含量最高，约占多酚总量的7 0 一8 0 9 6 。 儿茶素属黄烷醇类，是2 一苯基苯并吡喃的衍生物。茶鲜叶中的儿茶素类主要包 括表没食子儿茶素( e p i g a l l o c a t e c h i n ，e g c ) 、表儿茶素( e p i c a t e c h i n ，e c ) 、表 没食子儿茶素没食子酸酯( e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e ，e g c g ) 、表儿茶素没食子 酸醋( e p i c a t e c h i n g a l l a t e ，( 一) 一e c 6 ) 。 儿茶素属黄烷醇类物质，是2 一苯基苯并毗喃的衍生物，性质活泼。儿茶素 的b 环酚羟基易氧化形成邻醌，而邻醌又很不稳定，易发生复杂的聚合、缩合反 应，而形成双黄烷醇类( b i s f l a v a n o l s ) 、茶黄素类( t h e a f l a v i n s ) 和茶红素 ( t h e a r u b i g i n s ) 等。儿茶素除了b 环酚羟基易氧化形成邻醌外，还存在着许多其 它活性部位，如c 6 ，c 8 位由于c 5 ，c 7 位羟基以及1 位氧原子的p 一共扼效应的 影响，而呈现出极强的亲核性；c 2 ，c 6 ，c 4 位山于邻位羟基的吸电子效应，易形 成正碳离子，随后氧化成双黄烷醇、原花青素类( p r o a n t h o c y a n i d i n s ) 、茶红素 9 等，因而使得儿茶素的氧化途径变得极其复杂。 2 3 抗氧化剂种类及其作用机理 抗氧化剂是能防止或延缓食品成分氧化变质的一类食品添加剂，主要用于防 止油脂及富脂食品的氧化酸败，以及由氧化所导致的褪色、褐变、维生素破坏等。 抗氧化剂的种类繁多，性质各异，不同的应用领域有不同的分类方法。按照 抗氧化剂的溶解性可以将其分为水溶性抗氧化剂( 如维生素c ) 和脂溶性抗氧化 剂( 如维生素e 、6 一胡萝b 素等) 两大类。按照抗氧化剂的化学结构可将其分 为类胡萝h 素抗氧化剂、维生素类抗氧化剂、多酚类抗氧化剂、黄酮类抗氧化剂、 酶类抗氧化剂等。 按照抗氧化剂的来源可将其分为天然抗氧化剂和人工合成抗氧化剂。天然抗 氧化剂有时也称为生物抗氧化剂，主要是指在生物体内合成的具有抗氧化作用或 诱导抗氧化剂的一类物质，如植物体内的多酚类物质、黄酮类物质等，以及微生 物细胞器产生的类胡萝卜素、维生素类物质等。 按照抗氧化剂的性质可以分为预防性抗氧化剂和脂质过氧化链反应阻断剂 两大类。预防性抗氧化剂可以清除脂质过氧化链启动阶段的自由基引发剂，如 s o d 、过氧化物酶、谷光甘肽过氧化物酶等；脂质过氧化链反应阻断剂可以捕捉 脂质过氧化链式反应所产生的自由基，缩短过氧化反应链长度，从而阻断或减缓 脂质过氧化反应的进行，如维生素e ，维生素c 等。 按照抗氧化剂的作用方式可以分为自由基吸收剂、金属离子鳌合剂、氧消除 剂、酶类抗氧化剂、紫外吸收剂或单线态氧淬灭剂等h 9 1 。 2 4 抗氧化剂的作用机理 若一种物质能够提供氢原子或正电子与自由基反应，使自由基转变为非活性 的或较稳定的化合物，从而可中断自由基的氧化反应历程，达到消除氧化反应的 目的，该物质即为自由基吸收剂。提供氢原子的形式有两种：一种是向已被氧化 脱氢的物质提供氢，使其还原到来的状态，从而阻止其继续氧化。 a h ：+ r a h + r h 另一种是向过氧化自由基提供氢而使之成为氢过氧化物，终止由过氧化自由 基向未氧化的物质的自由基传导，从而阻止物质的自动氧化过程。 a h 2 + r 0 0 _ + a h + r o o h 研究表明，一些抗氧化剂的抗氧化活性与加入量不呈线性关系，过量加入还 可能变成促氧化剂4 引。 2 5 抗坏血酸的结构与抗氧化性质 维生素c 具有防治坏血病的功能，故又称为抗坏血酸( a s c o r b i ca c i d ) 。维 生素c 是一种含有6 个碳原子的酸性多羟基化合物，分子中c 一2 及c - 3 位上两个 相邻的烯醇式羟基易解离而释放h + 。所以维生素c 虽然没有自由羧基，但仍能 具有有机酸的性质。维生素c 结构如下。 图2 一l 抗坏血酸结构式 抗坏血酸是一种强还原剂，其生物化学性质和生理功能是由它的还原性质一 作为一种电子载体所驱动的。由于同氧或者金属离子相互反应失去一个电子成为 半脱氢一l 一抗坏血酸( s e m i d e h y d r o - l a s c o r b a t e ) ，一种话性自由基，可被动物 和植物中各种酶还原成为l 一抗坏血酸。抗坏血酸和脱氢抗坏血酸形式是一种有 效的氧化还原系统。氧化型的抗坏血酸仍有维生素c 的活力。但氧化型的抗坏血 酸易水解，内酯环被破坏而生成l - 酮基古洛糖酸，则失去维生素c 的活性，如 果继续氧化则生成草酸和l 一苏阿糖酸。 。 抗坏血酸结晶体在空气中稳定，它的水溶液则易被空气和其他氧化剂氧化， 首先可逆地氧化成脱氢抗坏血酸，如果氧化作用强烈，生成了l 一酮基古洛糖酸， 则失去维生素c 的活性。抗坏血酸的氧化易受到碱、热、光及微量重金属离子， 特别是铜、铁离子的催化。 抗坏血酸作为食品抗氧化剂具有以下作用i 首先作为氧清除帮，抑制食物成 分的氧化，其次还能对鳌合剂起增效作用，还原某些氧化产物”。 2 6 实验 2 6 1 材料与仪器 h 一6 0 0 吸附树脂上海树脂厂 光栅分光光度计 7 2 2上海第三分析仪器厂 台式离心机4 k 1 5s i g m a 多用途烘箱s h e u 刀bs h e l d o nm a n u f a c t u r i n gi n c 紫外同见光分光光度计u p v 2 5 0 0日本岛津 振荡培养箱 b s 也 国华电器有限公司 硫酸亚铁( g b 6 6 4 - 7 7 )a r天津市化学试剂三厂 酒石酸钾钠( g b l 2 8 8 8 1 )a r西安化学试剂厂 磷酸氢二钠( g b l 2 6 3 7 7 ) a r 西安化学试剂厂 磷酸二氢钾( g b l 2 7 4 7 7 ) a r河南焦作市化工三厂 浓盐酸( g b 6 2 2 8 9 ) a r 西安化学试剂厂 无水乙醇( g b t 6 7 8 9 0 ) a r 天津化学试剂有限公司 氢氧化钠( g b t 6 2 9 9 7 ) a r 天津市化学试剂三厂 香荚兰素( q b h f l 8 7 ) a l l 浙江温州东升化工试剂厂 茶叶 陕青陕西汉中 2 6 2 实验试液的配制 1 ) 酒石酸亚铁溶液 称取1 9 ( 准精确至0 0 0 0 1 9 ) 硫酸亚铁( g b 6 6 4 - 7 7 ) 和5 9 ( 精确至0 0 0 0 1 9 ) 酒石酸钾钠( g b l 2 8 8 8 1 ) ，用蒸馏水溶解并定容至1 l ( 避光、低温保存，有效 期为一个月) 。 2 ) p h 7 5 磷酸盐缓冲液 准确称取2 3 9 0 0 9 磷酸氢二钠( g b l 2 6 3 7 7 ) ，用蒸馏水溶解并定容至l l 准确称取9 0 7 8 9 磷酸二氢钾( g b l 2 7 4 7 7 ) ，用蒸馏水溶解并定容至1l 分别取 8 5 m l 磷酸氢二钠溶液和1 5 m l 磷酸二氢钾溶液，混合均匀得p h 7 5 的磷酸盐缓 冲溶液。 3 ) 饱和碱式乙酸铅溶液 准确称取碱式乙酸铅( h g 3 1 3 9 6 - 8 1 ) 5 0 9 ，加入l o o m l 水，摇匀静置过夜， 实验取其上清液。 4 ) 9 t o o l l - 1 h 2 s 0 4 溶液 准确量取2 4 4 m l 分析纯硫酸( g b 6 2 5 8 9 ) ，缓慢倒入2 5 0 m l 纯水中，稀释时 要边加酸边搅拌。 5 ) 香荚兰素盐酸溶液 1 9 香荚兰素溶于1 0 0 m l 浓盐酸中，搅匀即可。配好的溶液应呈淡黄色，变 蓝绿色者不能使用。该试剂应随配随用，放冰箱中可用1 天。 2 7 分析方法 2 7 1 中性条件下茶多酚的分析方法 1 ) 原理 茶多酚含量的测定采用酒石酸亚铁分光光度法。酒石酸亚铁能与多酚类物质 生成蓝紫色络合物，此络合物在波长5 4 0 r i m 处有最大吸收，并且在一定浓度范 围内，浓度与光密度之问遵循郎伯一比尔定律，可用分光光度法测定其含量。 2 ) 中性条件下茶多酚的含量测定步骤剜 准确吸取试液l m l ，注入2 5 m l 容量瓶中，加4 m l 蒸馏水和5 m l 酒石酸亚 铁溶液，充分混合，加入p h = 7 5 的磷酸盐缓冲溶液至刻度，用1 0 m m 比色皿， 在5 4 0 r i m 处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度a 。 3 ) 计算公式 茶多酚的含量，以干态质量百分率表示，按下式计算： 茶多酚。a x l 9 5 7 x 2 j ! x 1 0 0 1 0 0 0 l 2 m x m 式中：l 1 试液的总量，m l ： ip 期5 定时的试液用量，m l ； m 试样的质量，g ； m 一试样的干物质含量，： a 试样的吸光度； 1 9 5 7 一用1 0 r a m 比色皿，当吸光度等于o 5 时，每毫升茶汤中所含茶多 1 3 酚相当于1 9 5 7 m g 。 2 7 2 儿茶素的分析方法 1 ) 原理 茶叶中的儿茶素和香荚兰素( 香草醛) 在强酸性条件下生成橘红色产物，红 色的深浅和茶叶中儿茶素的含量成正比，该反应不受花青昔和黄酮苷的干扰。该 方法显色灵敏度高，最低检出量可达0 5 , g 5 2 ) 操作步骤 吸取1 0 t l 或2 0 “l 供试液，加入装有l m l 9 5 乙醇的刻度试管中，摇匀， 再加入1 香荚兰素盐酸溶液5 m l ，加塞后摇匀，显红色，放置4 0 r a i n 后立刻测 定吸光度a 。另以l m l 9 5 乙醇加香荚兰素盐酸溶液5 m l 作空白。波长5 0 0 h m ， 0 5 e r a 比色杯。 3 ) 计算公式 儿茶素含量_ i a x l 4 5 6 8 吾( m g x m l - 1 ) 1 0 0 0v 、 式中：v 1 吸取试样体积，m l ； a 样品在5 0 0 r i m 处的吸光值； 1 4 5 6 8 一当吸光度为1 0 0 时，被测液中儿茶素含量为1 4 5 6 8 u g 。 2 8 抗坏血酸对茶多酚提取率的影响研究 在沸水浴中，茶：水= l ：2 0 ( w v ) , 抗坏血酸加量控制o - o 9 1 ( 抗坏血酸与干 茶质量比的百分数) ，隔l o m i n 搅拌一次，浸提3 0 m i n 。冷却后用滤布进行过滤， 滤液再经过离心分离，取上清液测定其中茶多酚、儿茶素含量。结果见图2 2 。 由图2 - 2 可知，当v c 与干茶质量之比在o r 0 9 1 之间时，茶多酚提取率缓 慢提高，这是由于随着抗坏血酸添加量的增加，其在提取液中主要起清除氧的功 能，从而降低了茶多酚的氧化损失，提高茶多酚提取率。当添加量为0 6 左右时， 茶多酚提取率达到最大值；而后，提取率显著下降，这是由于随着维生素c 含 量不断增加，生成的半脱氢一l - 一抗坏血酸也逐渐增多，由于半脱氢一卜抗坏 血酸是一种活性自由基，当其积累到一定程度就会对茶多酚起氧化作用，从而影 响茶多酚的提取率。即过量加入抗坏血酸会起促氧化作用。 图2 - 2 不同加量v c 对茶多酚提取率的影响 2 9 复合酶的筛选 经初步筛选，宁夏夏盛实业集团有限公司提供了三种复合酶较为适合茶叶体 系有效成分的提取，其分别为：复合酶s a c 一0 1 5 、复合酶s a d - 0 1 6 以及超滤酶， 以上三种酶的主要成分均为纤维素酶和果胶酶，但所含比例不同。为探讨茶叶酶 解的机理，分别对这三种酶测定纤维素酶和果胶酶的活性，然后进行酶解茶叶实 验，根据实验结果选择最佳用酶。 2 9 1 纤维素酶活的测定 1 ) 方法 采用“滤纸糖化力法”，滤纸糖化力代表“纤维素糖化”酶活力或总纤维素 酶活力。 试管底部预先竖放一张卷曲的1 6 c m 的新华一号滤纸( 约重5 0 0 m g ) ，加 入l m l 柠檬酸缓冲液( 0 0 5 m o l l ，p h 4 8 ) 和0 5 m l 适当稀释的酶液，混匀， 于5 0 ( 2 水浴中保温1 h 。用d n s 试剂测定反应液的吸光度，查葡萄糖标准曲线， 计算生成的葡萄糖量，扣去空白后，换算成每毫升酶液产生的葡萄糖毫克数。以 每毫升酶液每小时分解滤纸生成l m g 葡萄糖为一个酶活单位，计算酶活。 2 ) 葡萄糖标准曲线的绘制 准确称取1 0 0 m g 分析纯的无水葡萄糖( 预先在1 0 5 。c 干燥到恒重) ，用少量 蒸馏水溶解后，定容至1 0 0 m l 容量瓶中，摇匀，得到浓度为l m g m l 的葡萄糖 将各管溶液混合均匀，于沸水浴中加热5 分钟，取出后立即用冷水冷却至室 温，再向每管中加入2 1 5 m l 蒸馏水，摇匀，于5 2 0 砌波长处测吸光度值，结果 见图2 - 3 。 冀 l - 2 霎。三 昏o 6 冀 o o 葡萄糖量m g 2 图2 3 葡萄糖标准曲线图 3 ) 酶活测定 取3 支试管，底部各放一张1 x 6 c m 的滤纸，分别加入等量适当稀释的s a c 一0 1 5 酶液，s a d 一0 1 6 酶液，超滤酶液及p h = 4 8 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液，于5 0 水 浴中反应l h ，沸水浴5 r a i n 终止反应，流水迅速冷却，过滤除去滤纸残渣。取四 支试管，一支为空白参比，分别按表2 - 2 加入试剂。 表2 - 2试剂加量表 项目 空白参比 12 3 将各试管内液体混匀，在沸水中加热5 m i n ，取出后立即冷却至室温，再向 各管中分别加入2 1 5 m l 蒸馏水，摇匀，于5 2 0 n m 波长处测吸光值，查葡萄糖标 准益线，计算生成的还原糖量。以每毫升酶液每小时产生1 m g 葡萄糖为一个酶活 单位，计算酶活，结果表示为整数。 4 ) 结果与分析 酶活测定结果见表2 - 3 。 表2 - 3纤维素酶活 做柱状图比较： | _ 窖 兰 蜉 罐 s a i ) - 0 1 6超滤酶 1 图2 - 4纤维素酶活柱状图 由图2 4 可见，超滤酶中纤维素酶活较其它两种酶高，其纤维素酶活由高到 低排列为：超滤酶 s a d - 0 1 6 s a c - 0 1 5 ，这也表明超滤酶中的纤维素酶含量最多。 2 9 2 果胶酶活的测定 1 ) 方法及原理 次亚碘酸法，果胶酶水解果胶，生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸具有还原性糖 季!咖瑚鲫番枷蓍瑚瑚。 醛基，可用次亚碘酸法定量测定，以此来表示果胶酶的活性。 2 ) 酶活测定 准确吸取浓缩酶液1 o o m l 于一定体积的容量瓶中，用p h = 3 5 的柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲液稀释定容，准确稀释至一定倍数，酶液浓度应控制在消耗0 0 5 m o l l 硫代硫酸钠标准溶液( a b ) 之差在0 5 1 o m l 范围内。必要时可做预备实验。 a 于甲、乙两支试管中分别加入l o g l 果胶溶液5 m l ，在5 2 _ + 0 2 c 水浴中预 热5 1 0 m i m b 向甲管( 空白) 中加入p h = 3 5 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液5 m l ，乙管( f t 品) 中加稀释酶液l 皿i l ，p h = 3 5 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液4 m l ，立刻摇匀并计 时。在此温度下准确反应0 5 h ，立即取出，加热煮沸5 m i n 终止反应，用流水冷 却；1 c 取上述甲、乙管反应液各5 m l 放入碘量瓶中，准确加入0 5 m o l l 碳酸钠 溶液i m l ，0 0 5 m o l l 碘液5 m l ，摇匀，于暗处放置2 0 r a i n ： d 取出碘量瓶，各加入i m o l l 硫酸溶液2 m l ，用0 0 5 m o l l 硫代硫酸钠标 准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3 滴，继续滴定至蓝色刚好消失为其终点， 记录甲管( 空白) 、乙管( 样品) 反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，同时 做平行样品测定， e 实验结果的计算 l m l 浓缩酶液在5 0 c ，p h = 3 5 的条件下，1 h 分解果胶产生i m g 半乳糖醛酸 为一个酶活单位，计算式为： x = ( a b ) c x 0 5 1x1 9 4 1 4 x n 1 0 ( 5 xl 0 5 ) = ( a b ) x c x n 3 9 6 0 5 ( 2 1 ) 式中：x - 样品的酶活力，u m l ； a 一空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，m l ； b 样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，i n l ； c 硫代硫酸钠标准溶液的浓度，m o l l ： 0 5 l 一1 删o l 硫代硫酸钠相当于0 5 1 m m o l 的游离半乳糖醛酸； 1 9 4 1 卜半乳糖醛酸的毫摩尔质量，m g ； n 酶液稀释倍数； 1 8 1 卜反应液总体积，m l ； 5 一滴定时取反应混合物的体积，i i l l ； l - - 反应时加入稀释酶液的体积，m l ； 0 卜反应时问，h 。 3 ) 结果与分析 用上述方法分别对s a c 一0 1 5 ，s a i ) - 0 1 6 及