毕业设计（论文）-魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏MDA的影响分析.doc

学 号 0827054017分类号Q5-33 本科生毕业论文题目： 魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏MDA的影响分析院 （系） 农学与生命科学院 专 业 班 级 08 生物科学 学 生 姓 名 指导教师（职称） 提 交 时 间 二一二 年 五 月 目 录摘 要1Abstract2第一部分 前言11. 魔芋资源简介12. 魔芋葡甘聚糖12.1 结构12.2 性质12.3 应用价值23. 膳食纤维33.1 生理功能33.2 作用途径34. 酒精性脂肪肝4第二部分 实验部分51. 魔芋精粉中魔芋葡甘聚糖含量的测定51.1 仪器与材料51.2 实验方法51.3 实验结果71.4 结果分析82. 魔芋精粉中硒含量的测定82.1 仪器与材料82.2 实验方法82.3 实验结果92.4 结果分析93. 魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏MDA的影响分析93.1 仪器与材料93.2 实验方法103.3 实验结果123.4 结果分析16第三部分 结论17参考文献18致 谢2020魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏MDA的影响分析吴丹丹(安康学院，农学与生命科学院，陕西安康，725000)摘 要 饮酒对人体器官造成的损伤日益成为一个全球性的问题。酒精对肝脏损伤的早期变化酒精性脂肪肝是最常见的疾病之一。因其可逐渐发展为肝纤维化、肝硬化而危害极大。目的：本实验通过分析魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏组织丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的影响，来探论魔芋硒多糖对酒精肝的预防作用。方法：用3，5-二硝基水杨酸测法测定魔芋中魔芋多糖的含量。用PF6-2型非色散原子荧光分光光度计测定魔芋精粉中硒的含量。酒精肝模型的建立和魔芋硒多糖的干预。将大鼠随机分为空白对照组，阳性对照组，酒精肝建模组和4组干预组共7组。其中5%魔芋硒多糖+酒精组；5%魔芋多糖+酒精组；10%谷胱甘肽(GSH)+酒精组；10%魔芋多糖+酒精组；酒精肝建模组；空白对照组；10%魔芋硒多糖+酒精组。12周后剖杀大鼠，取肝脏组织，分装称重，测定大鼠肝脏组织的MDA含量。实验结果及结果分析：一级精粉、魔芋微粉、纯化精粉葡甘聚糖的含量分别为46.97%、54.98%和75.98%，为后续试验的进行做了准备。实验表明魔芋多糖富集硒能力很强，以硒多糖的形式存在。为后期KGM干预实验奠定基础。统计学结果显示酒精肝模型组与干预组统计学差异达极显著水平(P0.05)；阳性对照组与干预组统计学差异不显著(P0.05)；空白组与酒精肝模型组统计学差异达极显著水平(P0.05)；干预组中浓度梯度组之间统计学差异不显著(P0.05)。结论：魔芋硒多糖对酒精肝大鼠有潜在的防治作用。关键词 魔芋多糖 酒精性脂肪肝 大鼠 MDAThe Affect of Koujac Selenium - polysaccharideon MDA level of the rats with alcohol fatty liverDandan Wu(Ankang University，College of Agriculture and Life Sciences，Shaanxi Ankang，725000)Abstract With more and more people who are drinking heavily，alcoholic liver disease（ALD）has already been a popular disease. AFL can be a serious damage to liver because it can lead to the fatty hepatitis and the liver fibrosis.Objective: By observing the effect of Koujac Selenium-polysaccharide on the level of MDA，the study analyze its potential pharmacological effect of alcoholic liver injury in SD rats. Methods:The study used 3，5 - dinitrosalicylic acid to test in content of KGM in Konjac.The study determined the lever of Se in KGM using PF6-2 non-dispersive atomic fluorescence spectrometry. The establishment of alcoholic liver model and the intervention of Koujac Selenium - polysaccharide. Rats were randomly divided into normal control group，positive control group， drinking alcohol and feeding 5% Se-KGM ; drinking alcohol and feeding 5% KGM; drinking alcohol and feeding 10% GSH; drinking alcohol and feeding 10% KGM; drinking alcohol; normal group; drinking alcohol and feeding 10% Se-KGM . 12 weeks later, researchers dissect rats，take liver tissue，pack，weigh, and determine each groups MDA level .Results and analysis:The study showed that the first class powder，the contents of KGM of konjac powder，and the purified konjac glucomannan powder were 46.97%，54.98% and 75.98 % respectively which provide the basis for the latter experiment.This study indicted that Konjac glucomannan has a powerful ability which contains Se. it also can provide some experimental evidence for the intervention process.The statistical results is that there was highly significant difference between alcoholic liver group and intervention group in statistics(P0.05); there was not significant difference between the positive control group and intervention groups(P0.05); there was highly significant difference between blank control group and alcoholic liver group in statistics(P0.05); there was not significant difference between the concentration gradient between the groups in the intervention groups(P0.05).conclusion: The result illustrates that the therapy effect on rats with alcohol fatty liver.Key words Konjac glucomannan alcoholic fatty liver rat MDA第一部分 前言1. 魔芋资源简介魔芋(Amorphophallus konjac C.Koch)多年生草本植物，为天南星科(Araceae)魔芋属(Amorphophallus Bl.ex Decne)的总称。全属记载163种。魔芋原产于亚洲中南半岛北部和云南南部北纬1624地带。我国魔芋主要分布于南方各省山地丘陵地区，其栽培历史悠久而且资源丰富，迄今己发现并命名的有26种，占世界魔芋种数的26%，其中10多种为我国特有如白魔芋(Am orphophallus albus P.Y.Liu et J.F.Chen)、田阳魔芋(Am orphophallus corrugatus N. E. Brown)、西盟魔芋(Am orphophallus krausei Engler)等1。陕南地区具有适宜魔芋生长的环境条件，因此魔芋分布广泛，2009年陕南地区魔芋种植总面积达到约1.2万hm2，其中安康市约0.87万hm2。2. 魔芋葡甘聚糖2.1 结构魔芋葡甘聚糖(Konjak Glucommannan，KGM)是由D-葡萄糖和D-甘露糖约按1:1.6(mol/mol)的比例，以-1，4-糖苷键连接而成的高分子杂多糖2。为一种优良的膳食纤维。在其主链甘露糖的C1位上存在着以C3键结合的支链结构，大约每32个糖残基上有3个支链，支链只有几个残基的长度，并且某些糖残基上有乙酰基团。一般认为，KGM分子量约为70、80万3，散射法测得KGM的重均分子量为81052.6191064。天然魔芋葡甘聚糖是由放射状排列的胶束组成，其结构可分为型(非晶型)和型(晶型)两种。2.2 性质2.2.1 水溶性KGM易溶于水，可以吸收自身体积100倍的水，形成魔芋胶(KG)。魔芋胶在溶解过程中，水分子的扩散迁移速度远远超过KGM大分子的扩散迁移速度，使魔芋胶颗粒发生溶胀或肿胀，颗粒表面产生一层薄高聚糖的粘稠溶液。魔芋胶的颗粒互相粘联而结块，妨碍了魔芋葡甘聚糖的进一步溶解。2.2.2 成膜性KGM有很好的成膜性，可以制成透明度和致密度高的硬膜，单一的KGM膜具有水溶性，该膜在冷、热水中及酸液中稳定。通过改变添加剂的品种和用量，可以改变膜的柔软性和透气性，如添加保湿剂甘油可以改变成膜的机械性能，随着甘油量的增加，膜的机械强度降低，透明性增加。2.2.3 持水性KGM大分子可以与水分子通过氢键、分子偶极、诱导偶极、瞬间偶极等作用力聚集成庞大而难于自由运动的巨大分子，在水中使KG溶液变为粘稠的非牛顿流体，在凝胶食品中促成KGM大分子建立网络结构，其持水量为KG本身质量的30150倍。2.2.4 增稠性KGM具有分子量大、水合能力强和不带电荷等非离子特性，决定其具有良好的增稠性。与黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶增稠剂相比，它属于非离子型，受食品体系中盐的影响很小。2.2.5 衍生性KGM主体长链结构上和支链上存在着许多羟基和可置换的活泼基，用化学能量可使其进行各种甲基化、酯化、醚化等多种衍生物反应和水解。这些反应有的可以提高原有黏度和稳定性，有的可以提高原有的溶解度，有的可以提高悬浮性或成膜性。2.3 应用价值魔芋是一种低热能、低蛋白质、低维生素、高膳食纤维的食品，高膳食纤维才是它有效的营养成分。魔芋精粉是魔芋球茎经物理方法加工获得的，是有效营养成分的浓缩品，其中主要有效成分是葡甘聚糖，属可溶性半纤维素。魔芋的营养保健作用就是发挥膳食纤维对营养不平衡的调节作用，如防治便秘、降血糖、降血脂、减肥等。魔芋精粉对高脂血症患者降血脂效果显著，而对血脂水平在危险临界值者，基本维持原有水平，可起到预防高血脂的作用。可溶性纤维调节脂代谢的独特机理，除增加胆酸排泄外，还有减少脂肪和能量摄入、减少脂肪和胆固醇吸收等作用。2.3.1 抗癌KGM对胆汁分泌有一定的影响，在一定程度上可防止人体对胆固醇的吸收，还能有效地干扰癌细胞的代谢功能。另外，魔芋凝胶进入人体肠道后就形成孔径大小不等的半透膜附着于肠壁，能阻碍包括致癌物质在内的有害物质的侵袭，从而起到解毒，防治如甲状腺癌、胃喷门癌、结肠癌、鼻咽癌等癌肿的作用5。2.3.2 改善糖代谢，防治糖尿病KGM中的膳食纤维不会被消化吸收，不含热量，又有饱腹感，且能减少和延缓葡萄糖的吸收。同时，KGM可以改善末梢组织对胰岛素的感受性，降低对胰岛素的需要，从而调节糖尿病患者的血糖水平，是糖尿病良好的辅助药物。有文献研究了魔芋精粉对四氧嘧啶糖尿病大鼠的降糖作用6。2.3.3 减肥魔芋葡甘聚糖是一种可食用植物纤维，不易被消化。KGM热量极低，且具有吸水性强、黏度大、膨胀率高的特点，进入胃中吸收胃液后可膨胀20100倍，产生饱腹感，在充分满足人们的饮食的同时不会增肥，无须刻意节食，便能达到均衡饮食，从而实现理想减肥的效果。2.3.4 补钙魔芋食品中的钙比较容易洗脱出来，特别是在酸性溶液中钙的洗脱率更高。人们在食用魔芋时，嚼烂的魔芋与酸性胃液接触，钙便开始溶化，再经肠胃吸收，从而达到补钙的作用。2.3.5 洁胃魔芋食用后消化吸收慢，大量可溶性植物纤维促进胃肠蠕动，可减少有害物质在胃、肠、胆囊中的滞留时间，有效地保护胃粘膜，清洁胃壁7。2.3.6 调节肠道内环境、排毒通便魔芋丰富的植物纤维素，帮助活跃肠道功能，加快排泄体内有害毒素，预防和减少肠道系统疾病病变发生8。KGM也能软化粪便，增加每日便量和降低肠道内pH值。食用KGM后，粪便中乙酸盐、丁酸盐和异丁酸盐含量上升，乳酸杆菌和双歧杆菌的繁殖明显增多，肠道致病菌受到明显抑制。3. 膳食纤维膳食纤维曾被认为是对人体不起营养作用的一种非营养成份，其被称为粗纤维。营养学家认为粗纤维吃多了会影响人体对食物中的营养素，尤其是微量元素的吸收不利。然而通过近20多年来的调查和研究，发现并认识到这种“非营养素”与人体健康密切相关，它在预防人体的某些疾病方面起着重要的作用。膳食纤维分为两类：一类为可溶性的，一类为不可溶性的，二者合并即为总的膳食纤维。这两类膳食纤维对人体的某些慢性非传染性疾病起着预防和保健作用。因此也可以说“膳食纤维”是食物中具有保健功能的“功效成份”。因此它被称为第七营养素。3.1 生理功能膳食纤维是健康饮食不可缺少的，其生理功能包括：膳食纤维促进结肠运动，防治结肠癌；膳食纤维能防治冠心病；增加膳食纤维的摄入量可以改善末梢组织对胰岛素的感受性，降低对胰岛素的需求，调节糖尿病患者的血糖水平； 膳食纤维可调节肠内微生物菌群组成，提高人体免疫力，增强抵抗疾病的能力；膳食纤维能增加饱腹感，减少产能营养素的摄入，控制肥胖，减少高血压发生的机会；膳食纤维对肠癌等癌症有一定的防治作用；通便等。3.2 作用途径3.2.1可溶性膳食纤维的作用途径可溶性膳食纤维摄入体内后，经结肠细菌酵解，可产生短链脂肪酸，提供结肠膜所需能量的70%，并可调节神经系统功能、平衡激素水平、刺激消化酶分泌等。此外，它还可以直接扩张血管，促进结肠血液循环，这些作用是维持胃肠道正常结构与功能的重要保证。 可溶性膳食纤维的容水量大，可为肠内菌群提供理想的增生场所，使肠内细菌在数量上得以增加，从而抑制某些病原菌如沙门菌、霍乱弧菌等的生长；但当肠内细菌增生过度时，膳食纤维又能通过促进肠蠕动而加速其排出，以此维持肠内菌群的动态平衡。而且膳食纤维也参与维持肠戴膜的完整性，可防止肠内细菌透过肠壁向外移动而致病，从而有效保护人体健康。 3.2.2 不可溶纤维的作用途径不可溶纤维可以大量吸附膳食中的胆固醇，减少肠绒毛与胆固醇的接触几率，减缓吸收速度，延长吸收时间，甚至带走一些多余的胆固醇，有利与肝脏对胆固醇的处理和其他生理反应的过程，而可溶性纤维可以直接在血管中吸附胆固醇，加速胆固醇在血液中的转运。4. 酒精性脂肪肝随着生活水平的提高，越来越多的人选择饮酒做为人际沟通的手段。据报道，我国约有超过50%的人饮酒，其中成年男性饮酒高于70%，所以酒精对人们健康的影响备受关注。长期大量饮酒对人体各系统都有损害，主要表现为肝脏的损害及中枢神经和周围神经的损害，同时也会导致血脂代谢的异常。近来调查资料表明，饮酒及血脂异常都是脑血管病的高危因素。与西方国家比较我国的脑血管病发病率远高于冠心病9。世界卫生组织在一份报告中提出，酒精中毒是当今世界范围内的第一公害，其毒性作用可累及全身主要脏器，对肝脏的影响尤大。在西方国家，肝硬化的原因80%是酒精中毒引起，对脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝癌等的发生和预后都有着不可忽视的影响10。酒精(乙醇)摄入后对人体有一定的刺激性、麻醉性，会使人兴奋，代谢过程产生大量热量，加速血液循环，有活血御寒作用。饮料酒其酒度即为乙醇含量的百分比。酒精饮料对人会产生一定的嗜好性，俗称上“瘾”。所谓“酒精中毒”应称“酒精依赖综合症”，是指当摄入的酒精超过极限(人体血液中酒精含量超过0.4%时)会出现“急性酒精中毒”现象，使人呈现中毒症状，严重时会导致短时间内死亡；另一种是长期过量饮酒，会使人出现“慢性酒精中毒”现象，喝酒上瘾程度越大发生慢性酒精中毒的可能性越大，慢性酒精中毒使人呈现神志不清、反应迟钝、手脚有麻木抽搐症状，依赖酒精可降低不适反应现象，表现为轻度中毒。不论急、慢性酒精中毒均是长期或过量酒精刺激的反应。适量饮用酒精饮料不会有中毒现象，因此酒精不是“毒物”，其负面作用是过量后刺激的不良反应。酗酒成“瘾”的恶习不仅影响自己健康，还会遗传给下一代11。乙醇在肝细胞代谢直接氧化产物为乙醛，乙醛由乙醛脱氧酶(Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)氧化为乙酸。近期研究表明，酒精本身可妨碍乙醛脱氧酶的活性，使大部分蛋白穿透线粒体膜的运动减慢。而乙醛脱氧酶是一种必须从细胞浆进入线粒体而发挥作用的酶，所以该酶的膜运输受损可导致乙醛代谢率降低，使乙醛水平升高。乙醛有强烈的生化反应和毒性，它可与磷脂、氨基酸残基、5-羟色胺、多巴胺等结合，产生病理活性反应，使蛋白质解聚或改变细胞膜表面的抗原性，影响肝细胞膜的性状。即乙醛可损伤肝脏细胞的微结构，引起纤维变性，影响能量代谢并产生自由基，使肝脏损害的风险增加。研究结果表明酒瘾者的正常抗氧化保护机制可能受到损害12。 第二部分 实验部分1. 魔芋精粉中魔芋葡甘聚糖含量的测定1.1 仪器与材料1.1.1 实验仪器上海司乐J2-781型电磁加热搅拌器，上海精科-721型可见分光光度计，美国热电Thermo Micro-17R离心机，微量电子天平(赛多利斯)，浙江临海市精工真空设备厂HSG-IB-2型电热恒温水浴锅，海尔冰箱BCD-196TXZ，上海雷磁pH计，TGL-16C高速离心机，101-2B型电热鼓风干燥箱。1.1.2 实验材料魔芋精粉购自安康魔芋加工生物科技有限公司，酒石酸(国产分析纯)，亚硫酸钠(国产分析纯)，3，5-二硝基水杨酸(国产分析纯)，苯酚(国产分析纯)，酒石酸钾钠(国产分析纯)，甲酸(国产分析纯)，氢氧化钠(国产分析纯)，葡萄糖(国产分析纯)。1.2 实验方法1.2.1 各溶液配制方法1.2.1.1 苯酚显色剂的配制：苯酚显色剂(DNS)13 A液：溶解6.9g结晶的重蒸馏的苯酚于15.2mL10 %氢氧化钠溶液中，稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。B液：称取225g酒石酸钾钠，加入到300mL10%氢氧化钠溶液中，再加入880mL1% 3，5-二硝基水杨酸溶液。将A液与B液混合，贮于棕色试剂瓶中。在4放置710d以后使用。1.2.1.2 甲酸-氢氧化钠钠缓冲液的配制2mol/L的甲酸25mL加酚酞指示剂1滴，加入2mol/L的NaOH 20mL再加入2mL/L的甲酸75mL，用水稀释至200mL，调节pH至3.25-3.30。1.2.1.3 葡萄糖标准工作液的配制用101-2B型电热鼓风干燥箱干燥葡萄糖3g，至前后两次称重的差值小于310-4为止，放置室温。准确称取1.802g葡萄糖，溶解于12mmol/L的苯甲酸溶液中，放置于100容量瓶中，加12mmol/L的苯甲酸溶液至100mL。放置2h。制的100mmol/L的葡萄糖标准储藏液。取葡萄糖标准储藏液5mL，用12mmol/L的苯甲酸溶液稀释至100mL，即得到5mmol/L的葡萄糖标准工作液。1.2.1.4 魔芋葡甘聚糖测定液的配制准确称取样品0. 1950 g，加入盛有50mL甲酸氢氧化钠缓冲液并处于电磁搅拌状态的100mL容量瓶中30搅拌溶胀4h，溶胀过夜用甲酸-氢氧化钠缓冲液定容至100mL搅拌均匀后在离心机上以4000r/min离心20min，此上清液即为魔芋葡甘聚糖提取液(该步骤去处了魔芋粉中的游离还原糖对测定结果的影响。)准确移取25.0mL魔芋葡甘聚糖提取液于100mL容量瓶中准确加入3mol/ L硫酸20mL，摇匀在沸水浴中具塞密封水解1.5 h，冷却加入6mol/ L氢氧化钠20mL，摇匀加蒸馏水定容至100mL即得待测液。1.2.2 标准曲线的制作摇匀后将6个容量瓶放在沸水浴中加热5min，立即冷却。用蒸馏水定容至25mL，摇匀。以蒸馏水显色反应液做空白调零，用1cm比色皿在556nm处测其吸光值。记录不同浓度葡萄糖工作液的吸光值A。以吸光度为纵坐标(M)，葡萄糖毫克数为横坐标(A)，绘制标准工作曲线。制作标准曲线方法见表1。表1 标准曲线的制作方法123456葡萄糖工作液（mL）0.40.81.21.62.00水(mL)1.61.20.80.402.0显色剂DNS(mL)2.02.02.02.02.02.0摇匀沸水浴加热5min冷却蒸馏水定容至25mL摇匀测吸光值(以蒸馏水显色反应液做空白调零，用1cm比色皿在556nm处测定）。记录不同浓度葡萄糖工作液的吸光值A，以吸光度为纵坐标(M)，葡萄糖毫克数为横坐标(A)，绘制标准工作曲线。1.2.3 样品中葡甘聚糖的测定准确移取以上制得的葡甘聚糖待测液2.0mL于5mL比色管中，加入2.0mL显色剂DNS，在沸水浴中加热5min，冷却后用蒸馏水定容至5mL，在分光光度计上556nm处比色，以蒸馏水显色反应液做空白调零，测定溶液的吸光度值A，做7个重复。在标准曲线上查出(或通过回归方程计算)吸光度所对应的葡萄糖毫克数。结果按下式计算：魔芋葡甘聚糖含量=(式中，：葡甘聚糖中葡萄糖和甘露糖残基分子量与其水解后生成的葡萄糖和甘露糖分子量之比，= 0.914，为多糖的校正系数；M：在标准曲线上查出的葡甘聚糖水解液葡萄糖毫克数，单位为mg；m：魔芋粉样品质量，单位为g)。1.3 实验结果1.3.1 标准曲线从图1可以看出，标准曲线为y = 0.509x + 0.004(R = 0.999)。表2 葡萄糖标准液光密度值123456葡萄糖标准液(mL)00.40.81.21.62.0OD556nm值00.1810.3830.5710.7270.919图1 葡萄糖标准曲线1.3.2 样品测定结果见表3。表3 待测样品光密度值01234567含量一级精粉00.1450.1870.2200.2120.2000.1840.20246.97%魔芋微粉00.3200.3250.3280.2950.2950.3060.28154.98%纯化精粉00.3830.4220.4220.4330.4400.4230.43875.98%由表3得出：纯化精粉中葡甘聚糖含量最高，其次是魔芋微粉，最后为一级精粉。可见，纯化精粉的纯度最高，此结果为后续实验中给大鼠添加魔芋精粉辅料的准确用量奠定基础。1.4 结果分析多糖(Polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子化合物。包括糖原、淀粉、氨基聚糖如(透明质酸)和纤维素。具有治疗肝肾病、消炎阵痛、降血糖、抗病毒、抗癌及美容等作用。近几年，糖生物学成为继基因组学、蛋白质组学之后的另一研究热点。近期研究表明：许多植物多糖能提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-px)等抗氧化物酶的活性，降低脂质过氧化物含量15。魔芋为天南星科魔芋属的多年生草本植物，含有丰富的KGM。KGM是作为魔芋抗氧化的重要成分，具有多种药理作用和生物活性功能。它能清除自由基，调节脂质代谢，抗脂质过氧化等活性越来越受到人们的关注16。KGM含量的测定方法有多种，主要有乙醇沉淀法、费林滴定法、甘露糖腙重量法、蒽酮比色法、苯酚比色法(DNS法)、3，5-二硝基水杨酸比色法、高效液相色谱法等。其中3，5-二硝基水杨酸比色法不需要昂贵的大型分析仪器，操作较简便，因此是魔芋KGM含量测定较为理想的方法。此方法是国标和魔芋行业中规定所用方法，它的原理是利用KGM在酸性条件下，完全水解后变成11.6的葡萄糖和甘露糖的混合液，葡萄糖遇3，5-二硝基水杨酸显色的原理来测定其分光光度值，从而可以得到葡萄糖的含量换算成KGM。乙醇沉淀法得到的产品，水溶性好，凝胶性能无太大变化，得率和纯度都较理想，且生产工艺简单，过程中只用了乙醇一种试剂，安全性得到保证，成本低廉，但乙醇沉淀法过程复杂，耗时长。费林滴定法生产工艺简单，成本低廉，但其滴定过程颜色变化较快，操作过程中不容易掌控。甘露糖腙重量法因KGM分子中葡萄糖与甘露糖组成比例的变化，不便测出KGM含量。蒽酮比色法因有游离糖的干扰，KGM含量并不能准确测定。HPLC由于其结构和流程多种多样，应用十分广泛，但是高效液相色谱仪价格昂贵。2. 魔芋精粉中硒含量的测定2.1 仪器与材料PF6-2型非色散原子荧光分光光度计，SY2200-T型超声波清洗机。2.2 实验方法2.2.1 样品处理：称取风干的待测样品1.0000g于100mL锥形瓶中，加入硝酸高氯酸(3+2)混酸15mL，放入超声波清洗机中超声20min。超声后，在160自动控温消化炉上消化。向锥形瓶中加入盐酸(1+1)溶液5.0mL，将其置于沸水浴中加热10min，取下锥形瓶，冷却至室温，用去离去水将消化液转入50mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。2.2.2 标准溶液配制：分别移取硒标准工作溶液0. 00，2. 00，4. 00，8. 00，12. 00，16. 00，20. 00mL置于50mL容量瓶中，用盐酸(5+ 95)溶液稀释至刻度，摇匀，按照仪器工作条件测定系列标准溶液。2.2.3 样品分析：开机，设定好仪器工作条件，输入样品质量、定容体积等有关参数，原子化器点火，仪器预热20 min。启动自动进样系统，依次测定空白溶液、系列标准溶液、样品溶液的荧光强度。由仪器自动计算结果。2.3 实验结果2.3.1 按试验方法对硒系列标准溶液进行测定，硒的质量浓度与其对应的荧光强度在20g/L以内呈线性关系，线性回归方程y=62.91x-0.1529，相关系数为0.9996。2.3.2各样品中硒含量结果：纯化魔芋精粉多糖中硒含量的平均值为0.23860.0136mg/kg。蜡烛山品牌一级精粉硒含量为5.068mg/kg。2.4 结果分析硒是人体必须的微量元素之一，它是构成GSH-Px、谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶(PHG-Px)和硒蛋白P(Se-P)的必需成分17。这些氧化酶可清除自由基，保护肝细胞免受自由基的损伤。硒有增强机体免疫，提高机体抗氧化能力等生物功能。Llaneza P等研究18表明，在超重、过度肥胖的绝经后的女性中，其血清中低硒与血液中高胆固醇、高低密度脂蛋白、高甘油三酯存在一定的相关关系。研究发现硒多糖的生物学活性普遍高于多糖和硒，使硒和多糖的生理和药理功能得到优化19。本次实验表明魔芋中多糖富集硒能力很强，魔芋中的硒主要是以硒多糖的形式存在。本次实验结果将为后期分析其生物学功能以及魔芋硒多糖的开发提供一定的实验依据，为综合利用陕西硒资源和魔芋资源奠定基础。3. 魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏MDA的影响分析3.1 仪器与材料3.1.1 实验仪器实验仪器：美国电热Thermo micro-17R高速冷冻离心机、上海精科-721型可见分光光度计、101-2B型电热鼓风干燥箱、超纯水仪(购自重庆华创生物科技有限公司)、海尔超低温冰箱、冷冻干燥机。实验设备：大鼠饲养笼、鼠饲料购自西安交大医学院动物实验中心。3.1.2 实验材料3.1.2.1实验对象：28只SPF级SD雄性大鼠购自西安交大医学院动物实验中心。3.1.2.2 实验药品：无水乙醇(国产分析纯)，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，含硒魔芋精粉(购自安康魔芋加工生物科技有限公司)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物有限公司)，专用鼠粮(购于第四军医大学动物实验中心)。3.1.2.3 MDA试剂盒：试剂一：液体20mL1瓶，室温保存。试剂二：液体12mL1瓶，用时每瓶加340mL双蒸水混匀，4冷藏。试剂三：粉剂1支，用时将粉剂加入到90100的热双蒸水45mL中，充分溶解后用双蒸水不足至60mL再加冰醋酸60mL，混匀，配好的试剂避光冷藏。标准品：10nmol/mL四乙氧基丙烷5mL1瓶，4冷藏。3.2 实验方法3.2.1大鼠编号采用颜色与位置相结合编号的原则：品红涂屠成的红色表示个位，美蓝涂成的蓝色代表十位，左前腿、左腹、左后腿、头、背、尾、右前腿、右腹、右后腿分别表示1、2、3、4、5、6、7、8、9。大鼠编号见表4。表4 大鼠编号左前腿 红左腹红左后腿 红头红背红尾红右前腿 红右腹红右后腿 红123456789左前腿 蓝101213141516171819左腹蓝2021232425262728左后红11223.2.2大鼠饲料装置的设计及制作方法3.2.2.1 装置设计和饲料的制作将10mL一次性注射器前端用手术刀片切除，然后将注射器活塞插入套管即可。把大鼠粉末状饲料、添加成分和适量的水按一定比例混合后，成团，把混匀的饲料团块填充到10mL的一次性注射器套管中，压实，然后用注射器的活塞将饲料推出。可根据试验情况的要求，对饲料进行干燥，本实验中分别用了冷冻干燥和高温烘干。3.2.2.2 饲料相关形状的监测分析根据中华人民共和国国家标准GB/T6435-2006，测定手工捏制和自制装置制作饲料经过冷冻或高温干燥后其中的水分。3.2.3 大鼠肝脏组织MDA的测定3.2.3.1大鼠分组28只大鼠称质量、编号后，用简单随机法将其分为7组，每组四只。分别为空白对照组，阳标对照组，酒精肝建模组，4组干预组。第一组为干预组：5%魔芋硒多糖特配饲料+酒精；第二组为干预组：5%魔芋多糖特配饲料+酒精；第三组为阳性对照组：10%GSH特配饲料+酒精；第四组为干预组：10%魔芋多糖特配饲料+酒精；第五组为酒精肝建模组：普通饲料+酒精；第六组为空白对照组：普通饲料+水；第七组为干预组：魔芋硒多糖特配饲料+酒精。3.2.3.2 给药方法及各组处理在酒精肝大鼠模型建立和药物干预过程中，7组大鼠均自由取食、饮水，分笼饲养。在室温及稳定湿度条件下，采用魔芋硒多糖、魔芋多糖和谷胱甘肽(GSH)添加到饲料里，用自制装置制成特配饲料，干燥后制成大鼠的特配饲料经口给，进行干预实验。特配饲料用自制装置制作好后，在电热鼓风干燥箱内60-70烘干，4保存。因GSH有抗氧化作用，即其本身易被氧化，在高温下烘烤至干容易失去抗氧化的药效，所以含10%GSH的特配饲料用自制装置制作好后用冷冻干燥机冻干， 4保存。每只大鼠按5g/(kgd)含质量分数进行干预，喂养时间持续12周。建模过程中各组的处理见表5。表5 建模各组处理序号大数个数水及饲料GSH饲料酒精含硒KGM浓度无硒KGM浓度14+(5n)+5%24+(5n)+10%34+5%+(5n)44+(5n)+5%54+(5n)64+74+(5n)+10%注：“+”表示加入；空格表示不加入；“n”表示周数，例如：“5n” 表示第一周酒精蔗糖(蔗糖浓度为15%)溶液浓度是5度，第二周是10度，直到达到40度。酒精度数达到40度后，以40度的酒精浓度建立酒精肝模型，直到12周，实验结束。每天早晚记录各组大鼠饮用酒精的和食用饲料的量。每周定期称体重，并做记录，用此来调整各组大鼠特配饲料的食用量。同时可以为大鼠再次标号，以防时间太长，同笼中大鼠编号混乱。每隔34天换一次垫料，以保证大鼠的卫生状况和健康状况。12周后处死大鼠。大鼠处死前12小时内禁饮禁食。处死前称重，用吸入乙醚法麻醉后处死。然后取大鼠肝脏组织，称重分装，超低温下保存。分批测定大鼠肝脏组织重MDA的含量3.2.3.3 MDA含量的测定 测定方法见表6。 表6 肝脏组织中MDA含量的测定标准品标准空白管测定管10nmol/mL标准品（mL）0.1无水乙醇（mL）0.1测试样品（mL）0.1试剂一（mL）0.10.10.1混匀(摇动几下试管架)试剂二（mL）333试剂三(mL)11150%冰醋酸（mL）漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95水浴40分钟，取出后流水冷却，然后35004000r/min，离心10min取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。3.2.3.4统计学分析：MDA含量测定完毕后，其数据采用spss13.0统计软件进行分析，分析比较有组内比较和组间比较两种。其中多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用SNK法。3.3 实验结果3.3.1 大鼠一般情况与干预组比较酒精肝模型建立及干预过程中：空白对照组大鼠皮毛光泽，行动灵活，进食量及大便正常，体质量增长较快。4个干预组大鼠皮毛光泽稍暗，进食量略低于空白对照组，饮水量在试验前3周(适应性饲养)接近空白对照组，随着饮水中酒精浓度的增高，饮水量在第4周后明显少于空白对照组。10%GSH干预组有2只大鼠出现颈部淋巴节肿大外(组织切片为淋巴结脓肿，原因不明)。其余大鼠体质量增长较快。酒精肝建模组大鼠在饮用乙醇后数十分钟出现困倦，动作迟缓，步态不稳，部分酣睡，约需23h方完全恢复常态，进食减少，体质量下降，精神不振，2周后上述症状减轻，但皮毛渐粗糙，失去光泽，体质量增长缓慢，各组大鼠均无一死亡。3.3.2 大鼠自制装置特配饲料与手工捏制饲料比较：自制装置制作饲料和手工捏制饲料比较分析结果见表7。表7 饲料相关性的比较饲料性状手工捏制-烘干制止装置制作-冻干制止装置制作-烘干色状色泽均匀度较差色泽均匀度好色泽均匀度好形态均一性较差好好含水量101510硬度均一性较差较好较好适口性一般好，大鼠喜食好，大鼠喜食手捏的均一性差，干燥过程中不同步，大鼠偏食性差。简易装置制作的饲料均一度、外形、大鼠偏食性较好。实验动物模型建立与实验动物干预过程中，经口给和经口灌胃为两种常用的方法。尽管经口灌胃给药量相对精准，但不适合周期较长的实验，同时经口灌胃时，由于灌胃插管刺激易出现相关的并发症而导致实验动物死亡20-21。而将待测物添加到实验动物饲料中制成特配饲料为一种方便、简单、可操作性强的方法。经口给特配饲料时，若是机器加工，因有最小量的限制而增加了饲料的成本且会造成浪费，而且加工的饲料只适合耐高温的添加剂饲料制备；若是手工捏制，费时费力，且饲料均一度差也不便于同步干燥。而用自制装置制作的饲料可根据实验要求对饲料的量进行调整，省时省力。既可以减少对材料等的浪费，自制装置本身又经济实用，操作简单；且干燥方式可以随实验要求而有不同。如：易氧化变质、不耐高温的添加剂可以用冻干方式。总之自制装置经济、实用、方便、快捷，为后续的实验做了良好的准备。3.3.3 MDA含量测定 3.3.3.1 原始数据：用MDA试剂盒测定各组大鼠肝脏组织的MDA含量。测量结果见表8。表8 MDA含量测定原始数据分组1234567相当于MDA的含量1.071.061.261.702.941.262.381.161.121.552.172.090.492.091.160.531.151.293.722.052.181.061.241.081.184.122.062.063.3.3.2 统计学处理 把测定的酒精肝大鼠肝脏组织MDA的含量用spss13.0统计学分析软件进行统计学分析得统计学结果分别见表9和表10。表9 方差分析 (ANOVA)MDASum of SquaresdfMean SquareFSig.mdaBetween Groups14.57862.4309.799.000Within Groups5.20721.248Total19.78427表10 多重比较分析 (Multiple comparison)MDADependent Variable(I) z(J) zMean Difference (I-J)Std. ErrorSig.mda LSD 1 2.12500.35209.7263-.14750.35209.6804-.47250.35209.1945-2.10500(*).35209.0006-.35250.35209.3287-1.06500(*).35209.0062 1-.12500.35209.7263-.27250.35209.4484-.59750.35209.1045-2.23000(*).35209.0006-.47750.35209.1897-1.19000(*).35209.0033 1.14750.35209.6802.27250.35209.4484-.32500.35209.3665-1.95750(*).35209.0006-.20500.35209.5677-.91750(*).35209.0174 1.47250.3520