（应用化学专业论文）叶酸拮抗剂Alimta及其类似物的合成研究.pdf

天津大学博士学位论文摘要 中文摘要 叶酸拮抗剂a l i m t a 及其类似物的合成研究 毗咯并【2 ，3 - d 嘧啶类叶酸拮抗剂a l i m t a 是一种多靶向的抗癌药物，它能抑 制至少五种叶酸依赖性酶：胸苷合成酶( t s ) 、二氢叶酸还原酶( d h f r ) 、叶酰 多聚谷氨酸合成酶( 1 1 p g s ) 、甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰酶( g a r t f ) 及c 1 四氢叶酸合成酶( c i s 1 。 本文对a l i m t a 进行了反合成分析，建立了合成该化合物的新方法，并对其 合成进行了研究。 以苯作为起始原料，经过f r i e d e l c r a f t s 酰基化反应、黄鸣龙还原、皂化和 酯化等合成了其关键中间体4 ( 4 乙氧基4 氧正丁基) 苯甲酸乙酯( 6 ) ，收率为 3 6 6 。利用k b h 4 l i b r 对化合物进行选择性还原得到4 降羟基正丁基) 苯甲酸 乙酯( 7 ) ，以p c c 氧化化合物7 得产物醛，再用d d b a 溴化而合成出溴代醛， 它能和2 , 6 - 二氨基4 羟基嘧啶进行环合反应合成4 - 2 - ( 2 氨基- 4 。7 二氢- 4 氧3 h 吡咯并【2 ，3 - d l 嘧啶一5 基) 乙基】苯甲酸乙酯( 1 0 ) ，通过皂化得到相应的羧酸形式 1 1 。以d e p c 作为偶合试剂，使化合物l l 与谷氨酸二乙酯盐酸盐进行偶合，可 得到化合物n 一 4 - 2 - ( 2 - 氨基一4 ，7 - 二氢- 4 一氧3 h - g 咯并f 2 ，3 - d 嘧啶5 基) 乙基】苯甲 酰基 山谷氨酸二乙酯( 1 2 ) ，该化合物经皂化反应后再酸化处理即可得到我们的 目标产物a l i m t a 。总收率4 8 。 此外我们还设计了a l i m t a 类似物并对其合成进行了研究。 以n - c b z l - 谷氨酸为起始原料，通过多聚甲醛，在对甲苯磺酸的催化下， 形成嚅唑烷酮中间体，对谷氨酸叶位羧基加以保护。该中间体以p c i 3 为偶合试 剂，与对氨基苯甲酸甲酯作用合成出l - 4 一【3 f 3 ( 苄氧羰基) 5 - 氧1 3 嗯唑烷4 - 基 丙酰胺基】苯甲酸甲酯( 1 5 a ) ，1 5 a 在甲醇钠的甲醇溶液中开环，再经过p d - c 脱 c b z 保护可获得n s - ( 4 甲氧羰基苯基) l 广谷氨酸甲酯( 1 7 a ) ，再用d e p c 为偶合试 剂，1 7 a 和化合物1 1 偶合，我们得到了n 2 - 4 【2 ( 2 氨基4 ，7 _ 二g - 4 氧3 王，_ 吡咯 并【2 ，3 - d 嘧啶一5 - 基) 乙基】苯甲酰基】- n 5 - ( 4 甲氧羰基苯基) - l 谷氨酸甲酯( 1 8 a ) 。 天津大学博t 学位论文摘要 本文所得到的关键中间体及耳标化合物的结构均经核磁共振谱等手段予以 确定。 关键词：a l i m t a 叶酸拮抗剂吡咯并【2 ，3 - a q 嘧啶，抗癌药物，a l i m t a 类似物 天津大学博士学位论文 摘要 a b s t r a c t s y n t h e s e so f a n t i f o l a t e sa l i m t aa n di t s a n a l o g s a n t i f o l a t ea l i m t ad e r i v e df r o mp y r r o l o 2 ，3 卅p y r i m i d i n ei sam u l t i t a r g e t e d a n t i t u m o ra g e n t ，i tc a ni n h i b i ta tl e a s tf i v em a j o rf o l a t e - d e p c n d e n t z y m e s ： t h y m i d y l a t es y n t h a s c ( t s ) ，d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s e ( d h f r ) ，掣”i n a m i d er i b o n u c l e o - t i d ef o r m y l t r a n s f e r a s a ( g a r f t ) a m i n o i m i d a z o l er i b o n u c l e o t i d ef o r m y lt r a n s f e r a s e ( a i c a r f t ) a n dc - 1t e t r a h y d r o f o l a t es y n t h e t a s e ( c 1 s 1 an o v e ls y n t h e t i cr o u t et oa l i m t aw a se s t a b l i s h e db yr e t r o s y n t h e t i ca n a l y s i si n t h i sp a p e r t h ek e yi n t e r m e d i a t e ，e t h y l4 - ( 4 - e t h o x y - 4 一o x o b u t y l ) b e n z o a t e ( o ，w a so b t a i n e d f r o mb e r l g e n ev i af r i e d e l - c r a f l sa e y l a t i o n , h u a n gr e d u c t i o n ，s a p o n i f i c a t i o nf o l l o w e d b ya c i d i f i c a t i o na n de s t e r i f i c a t i o ni n3 6 6 y i e l d s e l e c t i v er e d u c t i o no f6w i t h k b h 4 l i b ra f f o r d e d4 - ( 4 一h y d r o x y l b u t y l ) b e n z o i ca c i de t h y le s t e r ( 7 ) 限s ) - 4 ( 3 - b r o m o - 4 - o x o b u t , j 1 ) b e n z o i c a c i de t h y le s t e r ( 9 ) c o u l db eo b t a i n e dt h r o u g hp c c o x i d a t i o n ，d d b ab r o m i n a t i o n f r o m 7 c y c l o c o n d e n s a t i o n b e t w e e n7a n d c o m m e r c i a l l ya v a i l a b l e2 , 6 一d i a m i n o - 4 - h y d r o x p y r i r a i d i n ey i e l d e d4 - 2 - ( 2 一a m i n o - 4 ，7 - d i h y d r o - 4 o x o 一1 h - p y r r o l o 2 ，3 d p y r i m i d i n e ( 1 0 ) s a p h o n i f i c a t i o no f1 0w i t ha q u e o u s n a o ha f f o r d e dt h ec a r b o x y l i cd e r i v a t i v e1 1 b ym e a n so fd e p c ，ap e p t i d e c o u p l i n gr e a g e m ，t r e a t m e n to fi tw i t hd i e t h y ll - g l u t a m a t ea f f o r d e dn 4 4 一【2 ( 2 - a m i u o - 4 ，7 - d i h y d r o - - 4 一o x o - 1 h - p y r r o l o 2 ，3 卅p y r i m i d i n e - 5 - y 1 ) e t h y l b e n z o y l 一l g l u t a m i c a c i dd i e t h y le s t e r ( 1 2 ) s a p h o n i f l c a t i o no f1 2f o l l o w e db ya c i d i f i c a t i o ng a v ea l i m t a i n o v e r a l ly i e l do f 4 8 i na d d i t i o n ，s y n t h e s i so f a l i m t at h ed e s i g n e da n a l o g sw a si n v e s t i g a t e d n - c b z - o x a z o l i d i n o n e ( 1 3 ) w a so b t a i n e df r o mn c b z - l - g l ub yr e a c t i o n w i t h ( c h 2 0 ) 。t h e ni tw a sc o u p l e dw i t h p - a m i n ob e n z o i ca c i dm e t h y le s t e r ( 1 4 ) u s i n gp c h r e a g e n t t o y i e l dl - 4 一( 3 - ( 3 - b e n z y l o x y i ) - 5 - o x o - i ，3 o x a z o l i d i n - 4 - y 1 ) p r o p a n a m i n o ) b e n z o i ca c i dm e t h y le s t e r ( 1 5 a ) a c t i o no f c h 3 0 n ao n1 5 ay i e l d e dn 2 一( b e n z y l o x y l ) 天津大学博士学位论文摘要 - n - ( m e t h o x y c a r b o n y l p h e n y l ) 一l - g l u t a m i n a t ed i m e t h y lo s t e t ( 1 6 a ) r e m o v a lo fo b z a n d c o u p l i n g w i t h 1 1 ，柑- 4 2 - ( 2 - a m i n o - 4 ，7 d i l l y d r 0 4 0 x o - l h - p y r r e l o 2 ，3 d 】 p y r i m i d i n e - 5 - y 1 ) e t h y l b e n z o y i - n 5 - ( 4 - m e t h o x y c a r b o n y l p h e n y i _ 卜l - g l u t a m i n a t e d i m 眦h y le s t e r ( 1 8 a ) w a ss y n t h e s i z e d t h es f f u c t u r c so ft h ek e yi n t e r m e d i a t e sa n dt h et a r g e tc o m p o u n d so b t a i n e di n t h i sp a p e rw e r ed e t e r m i n e db yn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es p e c t r a ( n m r ) ，e t c k e yw o r d s ：a l i m t a ，p y r r o l o 2 ，3 - d p y r i m i d i n e ，a n t i f o l a t e ，a l i m t aa n a l o g s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外。论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得：叁鲞盘茎或其他教育机构的学位或 证书而使用过酶材料。与我一舟工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：却应礁签字日期：争卯z 年；月如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫盗叁茔有关保留、使用学位论文的规定， 特授权鑫鲞盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名；即表艟 导师签名：叩易矽砷 ， 签字日期：山力乒年月妒蜀签字r 期：倒挣6 月口7 只 天津大学博t 学位论文前言 前言 叶酸属于维生素b 族中的一员，作为一碳代谢的载体，在氨基酸、嘌呤和 嘧啶的合成中起着十分重要的作用。当叶酸代谢被阻断，就会影响细胞d n a 的 合成。因此它对生物生长与繁殖至关重要。 叶酸拮抗剂也叫抗叶酸剂，它通过抑制叶酸代谢过程中叶酸依赖性酶，从 而阻断叶酸代谢过程，破坏细胞d n a 的合成。因此，这种抗叶酸代谢的药物在 疾病特别是癌症的治疗过程中应用十分广泛。 随着世界人口寿命的增长，癌症发病率和死亡率持续上升。据调查，2 0 0 0 年世界全世界癌症新病例达一千万，死亡人数6 0 0 万，生存的癌症患者达到两千 多万。去年l o 月1 5 日，美国“癌症状况年度报告( 1 9 7 5 2 0 0 2 ) ”出笼。这份报告 由国立癌症研究所( n c i ) 、疾病控制和预防中心( c d c ) 、美国癌症学会( a c s ) 和北美肿瘤登记中心联合会( n a a c c r ) 共同完成，今年报告的原始资料截止 日期到2 0 0 2 年。今年报告的主要结论：从1 9 9 3 年到2 0 0 2 年，美国癌症总体死亡 率每年以1 1 的平均水平下降，其中男性癌症患者的总体死亡率每年下降1 5 ， 女性( 1 9 9 2 年到2 0 0 2 年) 是0 8 ，从病种看，肺癌仍然占据了男女癌症死因的 第一的位置。美国是世界上公认的第一流经济强国，也是现代医学最发达的国 家，但癌症仍然是困扰美国人的头号疾病。同时，英国的癌症死亡率呈上升趋 势，新发病例9 6 5 万，死亡1 2 万。我国现患病人数为3 0 0 多万，在2 7 亿个家庭中， 平均每9 0 个家庭就有1 个癌症病人。肿瘤死亡分别列为我国城市和农村死因的第 一位和第二位。目前胃，肝、肺、食管，结肠、乳腺、宫颈癌等为我国最多发 的恶性肿瘤。因此，抗癌药物的研发就显得十分重要了。 氨基蝶呤( a m t ) 和甲胺蝶呤( m t x ) 是最早应用治疗肿瘤的叶酸拮抗剂 药物，它们的出现使得叶酸拮抗剂在在癌症治疗领域占有了重用的地位。但是 这种药物但这种药物存在着毒性和抗药性的难题，特别是对骨髓细胞有着很大 的影响。因此，在过去的6 0 多年期间，人们一直致力于开发具有更大治疗效价 或治疗选择性的新的叶酸拮抗剂。 a l i m t a ( 又称p e m e t r e x e d ，l y 2 3 1 5 1 4 ) 是美同礼来公司开发的一种新型叶酸拮 天津大学博士学位论文前言 抗剂，它能阻断叶酸代谢途径中的多种叶酸依赖性酶，如胸苷合成酶( t s ) 、叶 酰多聚谷氨酸合成酶( f p g s ) 、甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶( g a 且t f ) 和二氢叶 酸还原酶( d h f r ) ，因此又被称为是一种多靶酶抑制剂( m 1 a ) 。目前主要应用 于恶性胸膜间皮瘤和非小细胞性肺癌治疗。 本文首先综述了叶酸代谢过程中所涉及的各种酶在叶酸代谢过程中所起的 作用以及相关酶抑制剂的研究进展，对各种抑制剂结构上的特点及对药物活性 的影响做了较深入的探讨。同时对a l i m t a 的合成进行了研究，在参考相关文献 的基础上，成功合成出这种新型的叶酸拮抗荆，并建立了合成该化合物的新方 法。最后，本文设计了一种对a l i m t a 谷氨酸修饰的化合物，并设计了一条合成 该类化合物的新路线，在此基础上对其合成进行了初步的研究。 目前，我国对叶酸拮抗剂研究还很不充分，尤其对其合成还未见报道。因 此，我们开展这方面的工作就具有了十分重要的理论意义和社会经济价值。 第一章文献综述 第一章文献综述 一碳代谢对所有的生物体的生长及生存均是十分重要的。叶酸作为一碳单 位的运载体，在氨基酸、嘌呤和嘧啶的生物合成中起着重大的作用，自养微生 物能利用自身的酶合成叶酸，动物细胞因不能合成对氨苯甲酸并且不能将第一 个谷氨酸连接到蝶酸上，无法自身合成叶酸，因此动物必须从外部摄取叶酸。 叶酸的基本结构如图l - 1 。喋呤被一个对氨基苯甲酸偶合形成化合物的主干 结构，它再通过酰胺键连接在谷氨酸残基上。叶酸通过多聚谷氨酸合成酶的作 用多聚谷氨酸化，在细胞内部其他酶的作用下呈现多种形式。 h ：焱y 鹞铲甘 p 眙加p - a m i n o - l r 一， h 咖m 酬。 b e n z o y l 删：t a m 柏 t a j l f i g u r el 1g e n e r a ls t r u c l u r eo f f o l i ca c i d 图i - i 叶酸的基本结构 由于微生物和人在酶配置上的差异使得对引起超增殖疾病的病原体有了治 疗的可能，一种方法就是药物靶向存在于微生物体内的特定的酶”。另一种通常 采用的方法与普遍存在酶的物种专一性相关。随着在此领域的不断深入，研究 工作取得了重大成果【2 】，如抗菌药( t r i m e t h o p r i m ) ，抗疟药( e y c l o g u a n y l ) 和抗 癌药( m e t o t r e x a t e ) 等。 近些年来，人们不断认识到在叶酸代谢过程中涉及到的酶可能是疾病治疗 的主要靶点。 例如胸苷合成酶( t s ) 在细胞复制过程中起着关键的作用，这种酶在肿瘤 组织中有着很高的浓度，因此它就成为了治疗超增殖疾病的一个有趣的靶点， 但d h f r ( 二氢叶酸还原酶) 由于在肿瘤细胞和健康组织中的结构和功能差异性 h h p ，u 第一章文献综述 图1 - 2 叶酸代谢过程中一些关键酶 f i g 1 - 2s o m ek e ye n z y m e si nm e t a b o l i s mo f t h ef o l a t e 第一章文献综述 不大，基于此靶点开发的药物就容易产生细胞毒性的难题。 在具有高度功能和结构同源性的酶中寻求种属特异性，这是一项十分复杂 的工作。在不同种属中酶的活性位点有着相类似的特征，抑制剂的分子识别也 是相似的。现代生物学的发展使得蛋白克隆及获得其三维结构成为可能，它使 得人们了解了这些活性位点结构差异的更为详细的信息，从而使得活性部位的 分子识别更有其种属的专一性。 对细胞水平上耐药机制的研究衍生出一种治疗方法。事实上现在由于长期 的给药引起的耐药性是疾病治疗的一个很大的难题，它对广泛应用的药物，如 抗癌药的影响是长期性的。这种耐药性主要表现在p 4 1 ：l 细胞内抑制剂酶的降 解水平的增加，如y 谷氨酰水解酶( y - g h ) ，它水解多谷氨酸叶酸衍生物的谷 氨酰基团：2 涉及药物活化过程酶的水平的降低。如多聚谷氨酸合成酶( f p g s ) ( 图二) ；3 涉及到治疗靶点的酶的变化；4 细胞内叶酸转运机制的改变。抗 药机制研究的发展有助于发现新的叶酸作用靶点。 图1 3 t s 循环 f i g1 3t h y m i o y l a t es y n t h a s ec y c l e 应用药物基因组学发现新药是近年来药物设计的策略，众所周知结构和叶 酸类似的抑制特定酶的抑制剂( 如d h f r 的抑制剂m t x ) 并没有特别高的选择 性，就是说它也会和其他以叶酸作为辅酶或者底物的酶发生作用。不能作用于 单一的靶点会部分降低药物的有效性，但是它却可能揭示以前我们所未知的新 第一章文献综述 的生物靶点的存在，通过结构修饰可能找到更多可选择的衍生物。通过识别蛋 白的过表达发现新的作用靶点使得药物的设计和发现超越了传统模式，实现了 从靶点到分子而不是从分子到靶点的药物设计。 长期以来，叶酸代谢中的各种酶特别是二氢叶酸还原酶( d h f r ) 和胸苷 合成酶( t s ) 成为药物学家研究对象。甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶( g a 圈r f ) 和 氨基咪唑碳酰胺核苷酸转甲酰酶( a i c a r 聊近年来特别是随着晶体结构的解析 也逐渐成为了研究热点。丝氨酸羟甲基转移酶( s h m d 和y 谷氨酰水解酶( y - g h ) 是一个有潜力及吸引力的靶点，目前对它的研究正处于初始阶段。 1 1 叶酸代谢途径中各种酶及抑制剂 1 1 1 胸苷合成酶( t s ) 抑制剂 t s 通过还原甲基化反应催化2 ，脱氧尿苷5 单磷酸o u m d 为2 ，脱氧胸苷 5 ，- 单磷酸( d t m p ) ，同时n 5 n m 四氢叶酸转变为二氢叶酸。d t m p 通过细胞激 酶的催化转变为5 - - - - 磷酸脱氧胸苷( d r r p ) ，它作为d n a 聚合酶的底物参与 d n a 的合成。 t s 作用机制如图1 3 。 t s 是一种高度特异性的酶，对它的构效关系已经有了深入广泛的研究【”。 t s 是7 4 0 0 0 道尔顿的同型二聚体，包含有大约3 1 6 个氨基酸，现已有3 0 多种t s 被分离出来。 t s 抑制剂有d u m p 类似物和叶酸拮抗剂，5 氟尿嘧啶( 5 f u ) 最经典的 d u m p 类似物抗癌药物，通过在细胞内转化为5 氟尿嘧啶脱氧核苷酸( 5 f d u m p 抑制t s ，阻止d u m p 甲基化为d t m p ，从而抑制d n a 的合成。5 f u 作为一种 是作为一种前药，能对多种癌症如胃癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌等。 通过尿嘧啶5 或6 位碳上的结构修饰，些核酸类药物被开发出来唧。 核酸类衍生物面临的最主要难题是低选择性和高的细胞毒性。当前，抗肿 瘤药物的注意力已经转移到各种类型的叶酸拮抗剂的研究。最早针对t s 开发出 来的叶酸拮抗剂是c b 3 7 1 7 1 1 0 1 ，喹唑啭为2 - 氮基4 羟基模式，这种取代模式和 第一章文献综述 鑫e n ：- - ， “如 d r 1 毛“ 量 h 规： a 出； 2 坤砧：抄 人人。 _ f i d m 建：玲。乞：玲c ：一妙。： d 山一一 d - “山 。f z 图1 di s 作用机制 f i g1 4m e c h a n i s mo fa c t i o n o ft s d h f r 抑制剂2 小二氨基模式相比显示出了对t s 的较好的选择性。c b 3 7 1 7 显 示对d h f r 抑制活性( k i = 2 3 1 0 8 m ) 和t s 抑制活性( k i = 4 9 r i m ) 。它对人 体肿瘤如乳腺癌、卵巢癌和肝癌具有相当高的活性，但是有很多病例显示其对 肝脏、肾脏的毒性【”】。尽管由于其存在严重的毒性而阻碍了它进一步临床，但 是由于它强的t s 抑制活性，使得人们更加努力去寻找设计出低毒性的叶酸拮抗 剂。 在叶酸的类似物中，特别要提到的是z d l 6 9 4 ( r a l t i t r e x e d 商品名：t o m d e x ) ， 它是市场上出现的第一个t s 特异性抑制剂，现在已用于对肿瘤的治疗 1 2 , 1 3 , 1 4 j 。 。玲 第一章文献综述 g w l 8 4 3 z 0 1 6 9 4 英国癌症研究中心设计了一系列的c b 3 7 1 7 类似物，在保持母体化合物强 大的 i s 抑制活性的同时降低它的肾毒性。其毒性产生的原因可能是由于2 氨基 4 羟基模式生成分子间的氢键引起水溶性的降低，在肾脏的酸性环境下会产生沉 积，随后的试验揭示2 位脱氨基和2 位甲基的c b 3 7 1 7 类似物( i c i1 9 8 5 8 3 ) 相 对于母体化合物而言，尽管会引起t s 抑制活性的减少，但具有很好的水溶性并 降低了其肾毒性陋9 1 ，这种取代模式在后来的很多叶酸拮抗剂包括z d l 6 9 4 的设 计中得到体现。这种取代模式还有助于药物转运进入细胞，并对细胞内的f p g s 有着很好的结合性能。i c i1 9 8 5 8 3 相对于c b 3 7 1 7 和2 位去氨基的类似物，能够 通过还原叶酸载体( i 江c ) 更有效地进入l 1 2 1 0 细胞内，同时它又是更好的f p g s 底物，通过多聚谷氨酸化，能增加药物在细胞内的保留水平【”l 。i c i1 9 8 5 8 3 在体 外实验中尽管相对于c b 3 7 1 7 对t s 抑制活性有所降低，但是治疗指数增加了l o 倍【1 2 】。有助于药物转运和多聚谷氨酸化的化学修饰产生的效果在后来几乎所有 叶酸拮抗剂的设计中成为一个重要的考虑因素。 通过r f c 的药物传递是药物设计要考虑的一个方面，它能增加药物在胞内 的浓度，但是它的一个负面影响可能增加对非恶性肿瘤细胞的毒性，如骨髓细 胞等1 2 0 川，同时也可能会由于r f c 的变异增加恶性肿瘤细胞的耐药性1 2 2 j 。有效 的多聚谷氨酸化由于能提高药物的胞内浓度，因此它是药物设计所期望的。多 第一章文献综述 聚谷氨酸化的t s 抑制剂能更加紧密的结合t s ，约为单一抑制剂的6 0 倍。然而， 会由于y - g h 水平的增加提高了多聚物的水解而引起肿瘤细胞的耐药性。f p g s 的变异和减少表达也会使药物的活性降低 2 3 2 4 1 。由于以上原因，现在人们已开始 关注一些不需要r f c 和非f p g s 底物的叶酸拮抗剂例。 z 黼2 1 鹋8 8 叶酸拮抗剂多聚谷氨酸化物与t s 结合的稳定性可通过x - 衍射晶体学和 分子模型进行研究 2 5 1 0 通过计算机模拟的i c i1 9 8 5 8 3 = 肽衍生物、d u m p 和e c o l i t s 三元复合物结构显示：第一个羧酸盐通过一个水分子和t s 的l y s4 8 作用， 而末端的谷氨酸和a r g4 9 作用【捌。最初，它的二肽类似物的两个氨基酸都是l 构型【2 q ，它和母体化合物相比显示出和t s 更高的结合活性，然而这种化合物在 体外实验中发现易于水解，是f p g s 的底物。当存在耐药性时，多聚谷氨酸的水 解也会增，由此入们努力去寻找能抵抗化学和酶水解的叶酸拮抗剂。分子模型 研究表明：当第二个氨基酸为l 或d 构型时仍然能保持对t s 的a r g4 9 稳定的 静电作用1 2 5 。由此设计了一系列包含有d 构型的i c i1 9 8 5 8 3 二肽衍生物，结果 表明它们不再是f p g s 的底物，并且对水解具有稳定性，具有较强的t s 抑制活 性，该类化合物有望进一步临床。z d9 3 3 】作为具有以上属性的化合物被合成出 来，当前正被应用于临床的评剧2 7 瑚, 2 9 1 。它的谷氨酸d 位的羧基同i c i1 9 8 5 8 3 相同，但是t 位的羧基被一个四氮唑杂环所取代。z d9 3 3 1 能通过r c f ，也能通 过被动扩散进入细胞内部，此外在7 位有一个甲基，2 位f 取代，这些取代基 的存在能提高其抑制活性，如z m 2 1 4 8 8 8 t 3 0 j 。 h 第一章文献综述 通过x 衍射，这种三元复合物能为新颖叶酸拮抗剂基于结构的药物设计 ( s b d d ) 提供结构上的信剧3 1 j 2 】。d u m p - c b 3 7 1 7 e c o l it s 结构揭示：4 氧喹 唑啉环与对氨基苯甲酸部分成6 5 。角，在t s 结合的叶酸拮抗剂喹唑噼的c 7 仍 有一个可利用的空间，由此c b 3 7 1 7 和i c i1 9 8 5 8 3 的7 位甲基取代的衍生物被合 成出来并显示更强的t s 抑制活性。近来，为了更进一步对这种空间构型进行限 制，一些环戊并喹唑啉的化合物被设计出来，这种立体化学控制成为t s 更为理 想的结合模式并使抑制剂具有更好的抑制活性【3 3 】。 通过叶酸拮抗剂与d u m p - e c o l it s 共价结合结构的分析也应用于抑制剂 a g 3 3 1 和a g 3 3 7 ( n o l a t m x c d ) 的设计中p 町。通过计算发现萘能很好对接到喋啶 环和t s 的结合位点，由此a g 3 3 l 及相关的一些化合物的研究得到了进一步的 发展【3 5 1 ，在这些化合物中，用对甲苯磺酰基衍生物替代叶酸对氨基苯甲酸部分 有利于和萘环5 位更容易的结合，吗啉环能增加抑制剂的水溶性，a g 3 3 1 被设 计为依靠被动的方式进入细胞内部并且不是f p g s 底物。随后在基于结构的叶酸 拮抗剂设计中，发展了含5 芳硫基的化合物，其中a g 3 3 7 ( 诺拉曲特t h y n f i t a q ) 正在进一步的临床p “。 叶酸的喋啶环部分苯并喹唑啉所取代显示出了潜在的t s 抑制和抗肿瘤活 性，其中一个成功的例子是1 8 4 3 u 8 9 ( g w l 8 4 3 ) ，g w l 8 4 3 尽管是f g p s 的底物， 但不需多聚谷氨酸化就能和t s 紧密结合，它被包埋在脂质体中( g s 7 9 0 4 l ) 并 用于临床评估口 引。 当前个新的抑制剂设计策略是设计一种是结构不是叶酸的类似物但却 有叶酸拮抗剂的活性( n o n - a n a l o ga n t i f o l a t ei n h i b i t o r s , n a a i ) ，它主要是抑制除人 类以外病原微生物的t s ，如由病菌或真菌感染的增生性疾病。在方面研究的第 一篇正式发表的文献出现于1 9 9 3 年d 9 1 ，它指明酚酞( p 1 h ) 能够抑制 l a c t o b a c i l l u sc a s e i ( k = 4 5um ) 。研究应用基于结构的药物设计，通过对接的方 法搜寻针对病菌t s 作用的化合物。事实上，p 1 r h 上是一种非特异性的 is 抑制 剂，它能同时以竞争的方式抑制细菌和人类的t s ，因此它的生物活性和我们先 前所知道的t s 酶抑制剂( 如c b 3 7 1 7 ，z d l 6 9 4 等) 活性相似，文献也给出了 p t h 和酶的复合物的x 衍射晶体结构图。可采用的x 衍射晶体结构促进了基于 结构的药物设计的发展，一些p t h 的衍生物被设计出来1 4 0 , 4 “，这些化合物大多 第一章文献综述 数都展示出与人类t s 相比对细菌t s 有着更好的生物活性，如化合物1 1 ，1 2 。 1 1 2 二氢叶酸还原酶( d h f r ) 抑制剂 二氢叶酸还原酶是普遍存在于所有的原核和真核细胞中，它以n a d p h 2 + 作 为辅酶，催化还原7 ，8 二氢叶酸为5 , 6 ，7 ，8 四氢叶酸。这是d n a 核酸生物合成中 关键的一步，阻断d h f r 将会导致细胞的死亡。因此，d h f r 被认为是抗癌药 物一个非常重要的靶点。 甲氨喋呤( m 1 x ) 是第一个用作抗癌治疗的d h f r 抑制剂，但这种药物存 在着毒性和耐药性的难题，特别是对骨髓细胞有着很大的影响。为了解决克服 这个困难，一些新的化合物被设计合成出来，和传统的m t x 类似物不同，它们 被定位为亲脂性的非经典叶酸拮抗剂。由于它们的亲脂性，他们可通过被动扩 散的方式穿过细胞膜，同时，因为没有聚谷氨酸侧链，不能被f p g s 聚谷氨酸化。 m e t o p r i n e 是第一代非经典的叶酸拮抗剂，被证明具有很高的毒性。第二代主要 有：三甲曲沙( t r i m e t r e x a t e ，t m q ) 和比曲克辛( p i r i t r e x i n ，p t x ) 。它们具有 亲脂性好，抗瘤谱广，活性高的特点。但是遗憾的是：尽管它们没有m t x 产生 的耐药机制，但是会被已建立的多药抗药性( m d r ) 所影响，如结构和功能不 同药物的抗药性。m d r 产生的原因是由于m d r 基因编码的p 糖蛋白( p g p ) 的 高表达，使得该类药物从细胞内泵出而导致m d r 。t m q 的氯代的衍生物( 1 3 ) 不易受到m d r 影响，但研究表明这类化合物由于不能达到足够的细胞内水平， 药物动力学不能令人满意。这常常使药物学家面临进退维谷的情况：经典的叶 酸拮抗剂活性强，但是会因转运和细胞内累积而产生耐药性，非经典叶酸拮抗 第一章文献综述 剂没有此类耐药性问题，但是不能达到足够的细胞内水平。 ov h o c h 3 抽取n h 2 孙矿一吖oh 州n 妙h 2c h 3 。仗： t m q 刚妙n i t 2 c i a 联： 当前人们为了降低此类化合物的毒副作用，着力于开发新颖的非经典叶酸 拮抗剂，它们能达到一定的细胞内浓度或者是即使在浓度比较低的情况下也能 有高的活性。 另外一个常用的经典叶酸拮抗剂剂是依达曲沙( 1 0 e d a m ) 【4 2 】，研究表明： 它对肿瘤细胞而不是正常组织细胞有着很好的亲和性，累积和多聚谷氨酸化优 先产生在肿瘤细胞中，因此使得细胞毒性降低。 早期关于叶酸拮抗剂药物大都局限于嘌呤或6 - 6 芳香杂环化合物，由于基于 嘌呤的化合物并没有显示任何的抗癌活性，6 - 5 杂环系统一直没有引起人们的关 注。近年来有人报道吡咯并嘧啶类化合物对癌细胞具有优异的抑制活性，使得 6 - 5 稠环类叶酸拮抗剂的研究成为了热门的研究课题。 t n p 3 5 1 1 4 是由武田公司开发的一种新型d h f r 抑制剂，通常叶酸拮抗剂中 的喋啶结构被毗咯并嘧啶代替，并于5 位引入可塑性大的三亚甲基桥以提供最 有利的构象，以满足抑制剂在靶酶空腔中能与活性部位最大程度的氢键和疏水 作用。体外实验证明，t n p 3 5 l 抗k b 人表皮样癌细胞和a 5 1 9 人非小细胞肺癌 细胞的作用比m t x 高l o 倍。 第一章文献综述 。 在研究非聚谷氨酸类型的d h f r 酶抑制剂的过程中，r o s o w s k y 州4 5 斯1 报道 了p t 5 2 3 及它的第二代类似物，并对其活性和毒性进行了评估。 p t 5 2 3 ( c o o h ) 。 近年来d h f r 在药物抗感染性疾病研究方面的作用引起了人们的普遍关注， 特别是：由原生生物引起的寄生感染，如l e i h s m a n i am a j o r 和d o n o v a n i ， t r i p a n o s o m ac r u z i 和b r u c e i 等；由p n e u m o c i s t i sc a r i n n i i 引起的机会感染，由此 导致的免疫系统缺乏对病人来说经常是致命的，如a i d s ；由e n t e r o c o c c u s 或其 他病菌引起的细菌感染，如皮炎、肠炎和膀胱炎等。由于微生物体对当前使用 的药物发展了耐药性，合成一些新化合物是很有必要的。目前最常用的用来抑 制d h f r 的叶酸拮抗剂是t m p ( t r i m e t h o p r i m ) 和p m ( p r i m e t h a m i n e ) 1 4 7 】。 扫 洲 、 n h o 儿 n h 一 2 r l 最 第一章文献综述 t m p 寻找治疗感染性疾病的d h f r 抑制剂，关键在于找到基于不同酶选择性的 化合物，也就是说对病原体有高的抑制活性而对人类d h f r 却要适度。通过x - 衍射和核磁共振技术已获得7 0 多种不同物种的d h f r 晶体结构。现在研究重点 又转向变异d h f r ，这些常被用来分析耐药性机制和开发新型的抑制剂。 在研究对寄生生物d h f r 的抑制性能时，人们研究了寄生生物d h f r 与其 它细胞相应的酶在结构上的差异。结果表明：它的d h f r 和人类的d h f r 结构 上有很大的不同，而这类生物的d i - i f r 却有很大的相似性，这使得人们可能发 现对寄生生物d h f r 有选择性和对寄生性疾病具有广泛活性并具有低毒性的化 合物【4 s 】。如比较人类d h f r 和t r i p a n o s o m a c r u z i 在酶的活性位点上的结构差异， 发现人类d h f r 有一个g l y 2 0 - a s p 2 1 的序列，而t r i p a n o s o m ac r u z i 是 a r 9 3 9 s e r 4 0 ，这说明前者带有负电而后者带正电。因此在结合部位带有负电荷 的化合物会与t r i p a n o s o m ac r u z id h f r 作用而实现选择性。由此m t xn 1 0 带有 羧基的衍生物被合成出来。尽管最后结果并不能令人满意，但却为如何获得选 择性指明了一个方向m 明 对p n e u m o c i s t i s c a r i n n i i 和t o x o p l a s m a g o n d i i 引起的的感染性疾病，当前治 疗通常使用t m p 和p m 。这些化合物有着温和的选择性，但由于活性不高需和 磺胺联合给药，而具有更高活性的化合物如t m q 或p t x ，由于其低的选择性而 由此产生的高细胞毒性常不推荐使用。g a n g j e d 删进行了对这些病原体有选择性 的新化合物的研究，最近合成了一些具有6 - 5 杂环的新化合物【5 l 】，这些化合物中 有一些相对哺乳动物d h f r ，对p n e u m o c i s t i sc a r i n n i i 和t o x o p l a s m ag o n d i i 的 d h f r 都有抑制活性和选择性，其中化合物1 4 h 抑制活性为t m p 的1 6 倍而选 择性却与之相似。 1 4 第一章文献综述 t 4 ar = 2 。3 c 咐 1 4 br = 3 - c l 1 4 cr = 4 - c l 1 4 dr = 2 - 0 m e 1 4 er = 3 - 0 m e 口 1 甜r ；o m e 1 4 9r = 2 ，4 ( c 1 ) 2 1 4 hr = 2 4 ( o m e ) 2 1 4 r o s o w s k y t 5 2 恰成了一些双环p t x 类似物，并对其抗癌活性和对p n e u m o c i s a s c a r i n n i i 和t o x o p l a s m a g o n d i i 的d i - i f r 抑制活性及选择性进行了研究。 1 1 3 丝氨酸羟甲基转移酶( s h m t ) 抑制剂 s h m t 是一种吡哆醛5 ，- 磷酸( p l p ) 依赖性酶，它利用四氢叶酸作为一碳 单位的受体催化丝氨酸转化为甘氨酸。s h m t 是自然界中普遍存在的酶，它在 嘌呤的生物合成中起十分关键的作用。n 5 ，n 1 0 亚甲基四氢叶酸是嘌呤、胸苷酸、 蛋氨酸以及其它甲基化反应所必需的，同时和肿瘤的发生发展关系密切。对于 真核细胞，在细胞质( s h m t l ) 和线粒体( s h m t 2 或m s h m t ) 都存在。迄今 分离得到的3 2 个物种的s h m t ，已经获得它们的e d n a 序列 s 3 l ，人们对它的 反应机制迸行了研究但还不是完全清楚，仍有待迸一步的阐明。除了丝氨酸生 理学反应以外，它还在没有四氢叶酸存在的情况下非选择性地将3 羟基氨基酸 切割为甘氨酸和相应的醛。和其它p l p 依赖性酶一样，这种酶也能慢慢催化其 它的反应。最近人类细胞质s h m t 被揭示，表明该酶具有与0 t 螺旋组相同的折 叠方式。由于脱氧核苷和嘌呤是d n a 生物合成所必需的，因此s h m t 的活性可 能会影响细胞的分裂速率。研究表明：在肝细胞瘤和骨髓瘤细胞中的s h m t 的 活性高于正常细胞，该酶可作为癌症化疗的一个合适靶点，s h m t 的抑制剂可 能在癌症的治疗中起到作用，但到目前为止关于该酶抑制剂的报道很少。 1 9 8 1 年有报道l - 2 氨基4 甲氧基反3 丁烯酸( r 0 0 7 7 9 5 7 ) 对s h m t 的影 响【叫，发现r 0 0 7 - 7 9 5 7 非竞争性与l 丝氨酸和s m t h 作用。对生长的抑制并没 有涉及到丝氨酸向甘氨酸的转化。最近又文献报道【5 5 】合成一种丝氨酸类似物 4 氯l 苏氨酸，结果显示它是s h m t 的底物，被分解成为氯乙醛和甘氨酸。 由于对该酶的抑制作片j 使得氯乙醛在活性位点生成。 第一章文献综述 尽管对该酶抑制的药物设计非常少，但最近几年人们一直在致力于该酶在 生物系统中的研究，随着x 衍射技术的使用，酶结构、克隆、表达、纯化和折 叠模式的阐明，将会有助于人们对该酶生物活性和动力学特征的了解，寻找到 对该酶具有选择性的抑制剂。 1 1 4 叶酰多聚谷氨酸合成酶( f p g s ) 抑制剂 f p g s 催化带叶酸辅酶或类似物转化为多聚谷氨酰衍生物： p t e g l u n + m g a 3 v + l