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层层组装与纳米材料结合制备新型d n a 电化学生 物传感器的研究 摘要 本论文的研究目的是希望通过纳米材料、层层组装技术构建聚合物d n a ，纳 米材料d n a ，聚合物纳米材料等多层膜，然后在多层膜的基础上制备新型的 d n a 电化学生物传感器，以实现对d n a 的高灵敏高选择性的检测，为d n a 检 测提供了新的手段与方法。主要包括以下内容： 1 利用f 电性的纳米z n o 和负电性的d s d n a 之问的静电吸附作用，把它们 层层组装构成( z n o d s d n a ) n 多层膜，并运用循环伏安和交流阻抗的方法对多 层膜的构建进行了监测。通过检测负载在多层膜上的电活性探针m b 的微分脉冲 伏安( d p v ) 响应信号研究了镍的化合物对d n a 的损伤，m b 在多层膜上“负载 释放重复负载”的过程能够有效地区别出完好的d n a 膜和损伤后的d n a 膜。 2 把讵电性的阳离子聚合物聚赖氨酸( p l y s ) 和负电性的d n a 层层组装在 碳纳米管修饰的碳糊电极表面，然后利用电活性探针亚甲基紫( m v ) 与d s d n a 的相互作用，制备了( p l y s d s d n a ) n m v ，微分脉冲伏安响应信号表明， ( p l y s d s d n a ) 。上的m v 经过空白溶液的沈脱之后，能够获得释放，同时 ( p l y s d s d n a ) n 还具备再次i 吸附m v 的能力，具有很好的可逆性；我们将制备 的( p l y s d s d n a ) n m v 用于致癌金属镉的化合物对d n a 氧化性损伤的检测及 锌对d n a 的保护作用，研究结果表明，这种d n a 电化学传感器能够有效的检测 镉对d n a 的损伤，在锌离子存在的情况下对d n a 能够起到一定的保护作用。 3 在带负电的巯基丙酸修饰的金电极表面吸附上带正电的阳离子聚合物聚 赖氨酸，然后利用纳米金碳纳米管杂合体( a u c n t ) 表面带负电的纳米金和带 正电的聚赖氨酸之i 、日j 的吸附作用，用层层组装的方法构建了( a u c n t p l y s ) n 多层膜，并运用电化学的方法对多层膜的性质和制备的最优化条件进行了研究， 最后在多层膜的基础上，利用多层膜最外层带正电的聚赖氨酸和d n a 上带负电 的磷酸骨架之i 日j 的吸附作用，成功地实现了探针d n a 的固定和目标d n a 的杂交， 制得d n a 电化学生物传感器，并对传感器的制备条件进行了优化。实验表明， 该d n a 电化学生物传感器对转基因玉米p a t 基因片段有较好的选择性，能有效 地区分不同的碱基序列，对互补序列检测的线性范围为1 0 1 0 j o m o l f l 1 0 1 0 击 m o l l ，检测限达到2 4 5 l0 _ 1m o l l 。 4 利用共价键合的方法在带负电的毓基丙酸修饰的金电极表面吸附上包裹 着氨基( n h 2 ) 的会纳米粒子( a u n p ) ，依靠金纳米粒子表面带正电的- n h 2 与聚 氨基苯磺酸( p a b s a ) 带负电的磺酸根( s 0 3 ) 之间的静电吸附吸附作用，用层 层组装的方法构建了( a u n p p a b s a ) 。多层膜，多层膜表现出良好的转移电子能 力以及在中性媒介巾的氧化还原活性；然后在多层膜上固定d n a 探钳。并使用了 计时电位法研究了d n a 的同定和杂交，同时对传感器的制备条件进行了优化； 最后应用此d n a 电化学传感器对经h i n d l i i 限制性内切酶酶切后的转基因大豆样 品进行了测定，并用传感器检测含量不同的转基因大豆d n a 和非转基因大豆 d n a 的混合溶液，杂交前后的电流差与转基冈d n a 的含量呈良好线性关系，可 以直接用于转基凶大豆d n a 中转基因成分的定量检测。 关键词d n a 电化学生物传感器层层组装d n a 损伤聚氨基苯磺酸纳米金 计时电位法 s t u d yo nt h en o v e ld n a e l e c t r o c h e mi c a ls e n s o r sb a s e do n l a y e rb yl a y e ra n dn a n om a t e r i a l s a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so nf a b r i c a t i n gn o v e lp o l y m e r d n a ，n a n om a t e r i a l d n a a n dp o l y m e r n a n om a t e r i a lm u l t i l a y e rb a s e do ne l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i st e c h n i q u e ， c o m b i n i n gn a n o m a t e r i a la n dl a y e r - b y l a y e rt e c h n o l o g y , t h u sd e v e l o p i n gan e w d e t e c t i o nm e t h o df o rd n aw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i 够t h ep a p e rc a nb e s u m m a “z e da sf o l l o w s ： 1 p o s i t i v e l yc h a r g e dn a n o z n oa n dn e g a t i v e l yc h a r g e d n a t u r a ld n aw e r e a l t e m a t e l ya d s o r b e d o nt h es u r f a c eo fg o l de l e c t r o d e ，f o r m i n g ( z n o d s d n a ) n l a y e r - b y 1 a y e rf i l m s v a l u a b l ed y n a m i ci n f o r m a t i o nf o rc o n t r o l l i n gt h ef o r m a t i o na n d g r o w t ho ft h ef i l m sw a so b t a i n e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n de l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) t h es p e c i f i c i n t e r c a l a t i o no fm bi n t od s d n ab a s e p a i r sa n dt h es e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s eo fm b ，c o m b i n e dw i t ht h eu n i q u e f e a t u r eo fl o a d i n gr e v e r s i b i l i t yo fm bi nt h ed n al a y e r b y l a y e rf i l m s ，m a d et h e d i f f e r e n c ei nd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) r e s p o n s eb e t w e e nt h ei n t a c ta n d d a m a g e d d s d n af i l m si n d u c e db yn i ( 1 1 ) b e c o m ep r o n o u n c e d i nt h e “l o a d i n g r e l e a s e r e l o a d i n g ”p r o c e d u r e 2 p o l y l 1 y s i n e ( p l y s ) a n dd n a w e r ea l t e r n a t e l ya d s o r b e do nt h es u r f a c eo f c a r b o n p a s t ee l e c t r o d e ，f o r m i n g ( p l y s d s d n a ) n l a y e r b y l a y e rf i l m s c y c l i c v o l t a m m e t r ya n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p yc o u l dg i v e t h ev a l u a b l e d y n a m i ci n f o r m a t i o nt oc o n t r o la n dm o d i f yt h e f i l mf o r m a t i o na n dg r o w t h d p v s h o w e dt h a tt h ee l e c t r o a c t i v ep r o b e ，m e t h y l e n ev i o l e t ( m v ) ，c o u l db el o a d e di nt h e ( p l y s d s d n a ) nf i l m sf r o mi t ss o l u t i o n ，d e s i g n a t e da s ( p l y s d s d n a ) 一m v ，a n dt h e n r e l e a s e df r o mt h ef i l m si nb l a n kb u f f e r h o w e v e r , a f t e ri n c u b a t i o ni nt h es o l u t i o no f k n o w nc a r c i n o g e n i cm e t a lc a d m i u m ( c d ) ，t h ed a m a g e d ( p l y s d s d n a ) n m vf i l m s c o u l dn o tr e t u r nt ot h e i ro r i g i n a la n df u l l y l o a d e ds t a t ew i t hr e l o a d i n go fm b ，a n d s h o w e ds m a l l e rd p v p e a kc u r r e n t st h a nt h o s eo fi n t a c t ( p l y s d s d n a ) n m vf i l m s a t t h es a m et i m e ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ea n t i o x i d a n tz n ( i i ) c a n p r o t e c td n af r o m o x i d i z i n g 3 a ne l e c t r o c h e m i c a ld n a s e n s i n gs y s t e mi sp r o p o s e db a s e do nt h em u l t i l a y e r s c o m p o s e do fp o l y l l y s i n ea n da u c a r b o nn a n o t u b e ( a u c n t 、h y b r i d ap r e c u r s o r f i l mo fm e r c a p t o p r o p i o n i ca c i d ( m p a ) w a s f i r s t l ys e l f - a s s e m b l e do nt h ea ue l e c t r o d e s u r f a c e l a y e r b y - l a y e ra s s e m b l yf i l m so fp l y sa n da u c n th y b r i dw e r ef a b r i c a t e d b ya l t e r n a t e l yi m m e r s i n gt h ee l e c t r o d ew i t hp r e c u r s o rf i l mi n t ot h es o l u t i o n so fp l y s a n da u 。c n t h y b r i d c y c l i cv o l t a m m e t r ya n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) w e r eu s e dt oc o n f i r mt h ec o n s e c u t i v eg r o w t ho ft h em u l t i l a y e rf i l m sb yu t i l i z i n g t h er e d o xi n d i c a t o r 【f e ( c n ) 6 川舢t h eo u t e rl a y e ro ft h em u l t i l a y e ri st h ep o s i t i v e l y c h a r g e dp l y s ，o nw h i c ht h ed n ap r o b ew a se a s i l yl i n k e dd u et ot h es t r o n g e l e c t r o s t a t i ca f f i n i t y t h eh y b r i d i z a t i o nd e t e c t i o no fd n aw a s a c c o m p l i s h e db yu s i n g m e t h y l e n eb l u ea st h ei n d i c a t o r , w h i c hp o s s e s s e sd i f f e r e n ta f f i n i t i e sf o rd s d n aa n d s s d n a t h ed i f f e r e n t i a l p u l s ev o l t a m m e t r yw a se m p l o y e dt or e c o r dt h es i g n a l r e s p o n s eo fm ba n dd e t e r m i n et h ea m o u n to ft h et a r g e td n as e q u e n c e t h e e s t a b l i s h e db i o s e n s o rh a sh i g hd e t e c t i o ns e n s i t i v i t y ，ar e l a t i v e l yw i d el i n e a rr a n g ef r o m 1 0 x10 一ut o1 o xlo 6m o u la n dt h ea b i l i t yt od i s c r i m i n a t ec o m p l e t e l yc o m p l e m e n t a r y t a r g e ts e q u e n c ea n ds i n g l eo rd o u b l eb a s e m i s m a t c h e ds e q u e n c e 4 p o l y ( a m i n o b e n z e n es u l f o n i ca c i d ) ( p a b s a ) ，a n dg o l dn a n o p a r t i c l e s ( a u n p ) w e r ea s s e m b l e da l t e r n a t e l yo nt h eg o l de l e c t r o d et h r o u g hl a y e r - b y l a y e rt e c h n o l o g y t h e ( a u n p p a b s a ) nf i l m ss h o ws a t i s f a c t o r ye l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r sa n de x c e l l e n t r e d o xa c t i v i t yi nn e u t r a lm e d i a c h r o n o p o t e n t i o m e t r yh a sb e e n e m p l o y e di nt h e d e t e c t i o no fd n ah y b r i d i z a t i o n u s i n gm ba sar e d o x a c t i v ei n t e r c a l a t o ra n d f e r r o c y a n i d ea st h em e d i a t o ri ns o l u t i o n s i g n a la m p l i f i c a t i o nh a sb e e nd e m o n s t r a t e d b yt h eu s eo fa ne l e c t r o c a t a l y t i cc y c l e ；m bi n t e r c a l a t e db e t w e e nb a s ep a i r so fd n ai s e l e c t r o c h e m i c a l l yr e d u c e dv i ae l e c t r o nt r a n s f e rf r o mt h eu n d e r l y i n gg o l ds u b s t r a t e ，a n d t h ep r o d u c ti sr e o x i d i z e di ns o l u t i o nb yf e r r i c y a n i d e h e r e ，r e s t r i c t e de n z y m e ( h i n d l i i ) w a si n t r o d u c e dt od i g e s tt h es a m p l ed n af o re n h a n c i n gd n a h y b r i d i z a t i o ne f f i c i e n c y t h ed n as e n s o r sw e r eu s e df o rt h ed e t e c t i o no ft h ed n a c o m p l e m e n t a r ys e q u e n e e e x t r a c t e df r o mt h eg e n e t i c a l l ym o d i f i e ds o y b e a ns a m p l e ，t h ed y n a m i cd e t e c t i o n r a n g e o ft h i ss e n s o rt ot h es a m p l ed n a ，a n dt h er e s u l t sw e r es a t i s f a c t o r y t h e r e f o r e ，t h i s b i o s e n s o rc a nd i r e c t l yd e t e c tt h eg e n e t i c a l l ym o d if i e dd n ao ft h eg e n e t i c a l l ym o d i f i e d s o y b e a n k e yw o r d sd n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r , l a y e rb yl a y e r , d n ad a m a g e ，p o l y a m i n o b e n z e n s u l f o n i ca c i d ，n a n og o l d ，c h r o n o p o t e n t i o m e t r y v 青岛科技人学研究生学伊论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请 的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：同期：年月同 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科 技大学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 ( 请在以上方框内打“) 本人签名： 导师签名： 同期： 同期： 7 8 年月同 年月r 青岛科技人学研究生学位论文 1 1 层层组装法 第一章文献综述弟一早义陬跞硷 化学修饰电极( c h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e s ，c m e ) 是当前电化学、电分 析化学方面一个十分新颖而又活跃的研究领域。纳米材料以其新颖独特的物理、 化学性质自2 0 世纪8 0 年代以来逐渐成为各国研究开发的重点，引起人们极大的 关。近年来，利用纳米材料对电极进行人工修饰已经成为化学修饰电极的一个重 要研究方向i i 喵j 。根据制备方法的不同，可以将其分为以下几种：( 1 ) 蘸涂法和滴 涂法；( 2 ) 氧化、还原电化学沉积；( 3 ) 组合法；( 4 ) 层层组装法。 层层组装法是近几年来发展起来的一种在电极表面构建多层复合薄膜的新 方法陟。与自组装单层膜相比，由层层自组装法制备的多层膜，由于其每一层 的组成、厚度、取向均可巧妙的控制和操作，可在分子水平上设计和制备各种功 能器件，更具潜在的优势。多层膜上所负载的物质的量和种类都i l 丁以成倍地增加， 这将会极大地丰富膜的功能并最终实现功能的集成。由于电子器件的h 趋微型 化，自组装超薄膜必将在微电子器件的制备中发挥重要的作用。同时，由于多层 膜允许将不同种类和功能的物质按照某种需要进行顺序组装，它必将赋与多层膜 更新的功能。这种新的功能来自于不同功能的物质的特定组合，它是任何一种物 质单独所不具备的。 随着生物传感器的发展，人们丌始把层层组装技术引入到生物传感器中。常 见生物传感器的组装方法基于以下几种作用力：( 1 ) 基于静电作用；( 2 ) 基于生 物分子特异性亲合作用；( 3 ) 基于共价作用；( 4 ) 电沉积；( 5 ) 多种作用方式( 不 同组装方法构建的电化学生物传感器如表1 一l 所示) 。上述几种方法各有特点，又 互为补充，在科学研究和实际应用中发挥着积极的作用。 1 1 1 静电作用 静电作用是层层组装中最主要的作用力。1 9 9 1 年gd e c h e r 等1 5 8 l 提出了一种 由带相反电荷的聚电解质在油固界面通过静电作用交替沉积形成多层膜的技术。 这种组装技术十分简单，只需将离子化的基片交替浸入带有相反电荷的聚电解质 溶液中，静置一段时间，取出冲洗干净，循环以上过程，就可以得到多层膜( 图 l 一1 ) 。在层层组装中常用的阳离子聚合物有：聚丙烯胺( p o l y ( a l l y l a m i n e ) ，p a a ) ， 聚赖氨酸( p o l y ( 1 一l y s i n e ) ，p l l ) ，聚乙烯亚胺( p o l y ( e t h y l e n e i m i n e ) ，p e i ) ，聚二 甲基二烯丙基氯化铵( p o l y ( d i m e t h y l d i a l l y l a m m o n i u mc h l o r i d e ) ，p d d a ) ，聚氢氯 膳垃 l i 址1j 纳米材 ： 坫台制器新型d n al u 化 十物传感器的研究 化内烯恢( p o l y ( a l l y l a m i n eh y d r o c h l o f i d e ) ，p a h ) 和壳檗精( c h i t o s a n ，c i l l t ) ：刚 离r 聚什物由：泉苯乙烯磷魑特( p o i y ( s y r e n e s u l f o n a t c ) ，p s s ) 粜已烯碳酸盐 ( p o l y ( v i n y l s u l f o n a t e ) ，p v s ) ，聚氯基苯磺酸( p o l y ( p a m i n o b e n z e n s u l f o n i ca c i d ) p a b s a ) ，聚山烯酸( p o l y ( a c r y l i ca c i d ) p a a ) 和聚 基丙烯酸( p ol y ( m e t h a c r y l i c a c i d ) p m a ) 。返此聚合物构建的多层膜山于具有；制备过程简巾，成膜物质丰富， 成脱币受丝底火小和j 睁状的限制，近年柬已经应川于田栽蛋白质，d n a ，纳米粒 州“簖1 物传感器 a 7 ，7 、 b 褰竺攀 饕2 ”“ c = 静麟 耐- 叫、 脚il ( a ) 多屡膜妇装的示意图，( b 两个幔附步骤的分子放托图像( c ) 两种典型 的聚合物结构：聚苯l 烯磺酸钠和聚氢氯化雨烯脑 f i g i - l ( a ) s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o r lo f t h e f i l md e p o s i t i o np r o c e s su s i n gs l i d e sa n d b e a k e r sf b 、s i m p l i f i e dm o l e c u l a rp i c t u r eo f t h c1 w oa d s o r p t i o ns t e p sd e p i c t i n gf i l m d e p o s i t i o ns t a r t i n gw i t h8p o s i l i v e l yc h a r g e ds u b s t r a t e ( c ) c h e m i c a ls t r u c t u r e $ o f t w o t y p i c a lp o l y i o n s t h es o d i u ms a l to f p o l y ( s t y r e n es u l f o n a t e ) a n dp o l y ( a l l y l a m i n e h y d r o c h m r i d e ) 卜 图： j 青岛科技人学研究生学位论文 表l l 基于各种层层组装法构建的电化学生物传感器 t a b l e1 le l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sb a s e do rv a r i o u sl b la s s e m b l ym e t h o d s ：层层组装的方法：多层膜里的生物识别分子二一一被分析物；+ 文献 静电q 及附作用葡萄糖氧化酶葡萄糖 【1 2 2 0 】 ；细胞色素氧化酶细胞色素c 【2 1 】 l 辣根过氧化酶 h 2 0 2【2 2 ，2 3 】 ；多酚氧化酶多巴胺 【2 4 】 ； 苯磷二酚 2 5 1 尿酸酶尿酸 【2 6 】 ；过氧化氢酶 h 2 0 2 2 7 】 ；胆固醇氧化酶胆固醇 2 8 】 ；乳酸氧化酶! 乳酸【2 9 ，3 0 】 5 心肌黄酶，葡萄糖磷酸脱氢酶i葡萄糖磷酸盐 【3 1 】 ；肌球素棘根过氧化酶 ；三氯乙酸0 2 h 2 0 2 ：【3 2 ，s s 葡萄糖氧化酶挝氧化氢酶 葡萄糖f t - 1 2 【3 4 】 葡萄糖氧化酶葡糖糖化酶； 葡萄糖，麦芽糖 【3 5 】 l 胆固醇氧化酶悝固醇酯酶 胆固醇 3 6 】 ； 乙肝表面抗体 乙肝表面抗原【3 7 】 = 二_ 呈= 二二二幽d n a 二：二三：d n a 僦) j 二：i ：两- ! ，一氧化的d n a一一 3 9 , 4 0 二 8 羟基乌嘿吟【4 1 】 特异性亲和作用：葡：甍糖氧化酶i 葡萄糖 ； f 4 2 ，4 3 】 ；酒精氧化酶 酒精【4 4 】 i ” 了一 。 共价作用葡萄糖氧化酶 葡萄糖【4 5 4 7 】 ； 喹啉并蛋白谷氨酸脱氢酶 氨基酸【4 8 】 ；i 一_ 电沉积 i 葡萄糖氧化酶葡萄糖 【4 9 】 一 l “。 j ；一：。一 一一 i 一 ；多种作用葡萄糖氧化酶i 葡萄糖j 5 0 胆碱氧化酶胆碱 【5 1 】 胆固醇酯酶 i 胆固醇 【5 2 】 ； 葡萄糖脱氢酶 n a d h ； 葡萄糖【5 3 】 辣根过氧化酶爿宣酸；h 2 0 2 0 2 f 5 4 1 人免疫球蛋白，羊抗人免疫球蛋古人免疫球蛋白 【5 5 】 目标d n a 磷酸脱氢酶葡萄糖磷酸盐 【5 6 】 碱性磷酸酶 ；d n a 免疫球蛋自： 【5 7 】 3 层层细装与纳米材料结合制备新型d n a 电化学乍物传感器的研究 1 1 1 1 聚合物蛋白质 酶是一种生物蛋白质分子，通过控制其溶液的p h 值，可以调控其表面所带 电荷的性质，当其溶液的p h 值在其等电点以下时，其所携带的净电荷为j 下电荷； 反之，当其溶液的p h 值在其等电点以上时，其所携带的净电荷为负电荷，因此 恰当地选择聚合物，可以通过静电组装的方法来构筑含有酶的多层膜。由于层层 组装技术是在温和的条件下进行的，通过静电力结合的酶相比于通过共价键结合 的酶，可以在最大程度上不破坏酶的构象，这样就不会导致酶的失活。l v o v 掣5 9 1 通过使用静电吸附的方法组装了多组分的蛋白质膜，参与组装的水溶性蛋白质包 括：细胞色素c ( c ”o c h f o m ec ) ，肌球素( m y o g l o b i n ，m b ) ，溶解酵素( 1 y s o z y m e ， l y s ) ，组蛋白t 3 ( h i s t o n ef 3 ) ，血红素( h e m o g l o b i n ，h b ) ，葡糖糖化酶( g l u c o a m y l a s e ， g a ) ，葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o x ) 。 葡萄糖氧化酶作为一种理想模型，首先被用于层层组装制备生物传感器。 1 9 9 6 年，m i z u t a n i 等1 删把g o x 与p l l 交替组装在负电性的巯基丙酸表面，制备 了一科，氧作为媒介体的葡萄糖传感器。一年后，c h e n e t 等川和h o d a k 等【6 2 1 同时 报道了一种反应物葡萄糖传感器，这种传感器分别把二茂铁修饰的聚嘧啶或二茂 铁修饰的聚丙烯酸与负电性的g o x 交替组装到金电极上。 树枝状大分子( d e n d r i m e r ) 是当前正在蓬勃发展的新型聚合物，这种聚合物表 面堆砌致密，内部有空隙，分子尺度在纳米级，其结构有着高度的几何对称性， 而且分子的体积、形状可以得到精确控制，典型的分子形状为球形，并且具有良 好的生物相容性。h u 等f 6 3 】在实验中使用一种聚已二胺树状聚合物 ( p o l y a m i d o a m i n e ，p a m a m ) ，他们把这种聚合物与包括h b ，m b ，过氧化氢酶 ( c a t a l a s e ，c a t ) 在内的蛋自质分子交替组装，组装后得到的球型结构具有生物分 予的三维结构以及良好的生物相容性，同时，在p a m a m 膜的环境下实现了蛋白 质分子的直接电化学研究。这种( p a m a m 蛋白质) n 多层膜明显得降低了还原 过电位，具有良好的分析灵敏度和稳定性，并有望发展成为新型免媒介体的电化 学生物传感器。 1 1 1 2 纳米粒子蛋白质 在电极上构建无机有机纳米结构是分析化学发展的一个重要方向，利用层层 组装技术可以把多种无机材料组装到多层膜中。由于在含有蛋白质的多层膜中组 装了某些拥有功能化基团的无机纳米微粒，从而赋予了这些生物分子膜更多特殊 的光电性能。 l v o v 等【“j 把m b 分别与m n 0 2 和s i 0 2 纳米粒子层层组装得到了1 0 层电活性 4 青岛科技人学研究生学位论文 的蛋白质膜，与前面所述的l v o v 制备的聚合物蛋白质多层膜( 比如p s s m b 多 层膜层数为7 ) 相比，层数要多一些。两种纳米粒子制备的蛋白质膜同时显示了 良好的对氧还原的催化能力。 c h e n 等l l5 j 层层组装p d d a 包裹的普鲁士蓝纳米粒子( p p b ) 构建了p p b g o x 多层膜，p p b 能够在低电位条件下催化h 2 0 2 的还原并且抑制干扰物的信号。 另外，许多纳米粒子如t i 0 2 、黏土、铂以及功能化的量子点都可以通过层层 组装的方法构建多层膜1 6 5 - 6 9 1 ，这些多层膜普遍都表现出良好的电化学和催化能 力，和聚合物蛋白质膜相比，这些纳米粒子蛋白质多层膜具有更好的稳定性。 1 1 1 3 聚合物纳米材料 碳纳米管( c n t ) 作为一种经典的纳米材料，也被广泛地应用于层层组装制 备电化学生物传感器中。科研人员们为了能够使碳纳米管拥有带电性的基团，通 常把碳纳米管羧基化或者用聚合物包裹碳纳米管，这些聚合物包括c h i t ，p d d a ， p a b s a 等1 3 ，5 ，5 2 ，7 0 ，7 。例如，k n o l l 等7 1 1 在中性条件下制备了一种完全导电的聚 苯胺碳纳米管多层膜，他们通过静电作用把聚苯胺和聚氨基苯磺酸修饰的单壁碳 纳米管层层组装得到了多层膜。这种多层膜拥有良好的稳定性，并且在较低的电 位下对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( 还原态，n a d h ) 的氧化具有很强的电催化能 力，为n a d h 的检测提供了一种理想的基底。 1 1 2 特异性亲合作用 由于依靠带相反电荷物质相互作用来实现多层膜的组装会在选择成膜物质 和实验条件如p h 值、溶液的离子强度时引起不便，尤其是可供利用的生物分子 种类较少，因此一部分生物分子多层膜的制备是基于蛋白质和相应配体之f h j 的特 异性亲合作用，如抗原一抗体问f 7 2 1 ，生物素一亲合素问例的相互作用。另外，抗 原标记的酶和抗体作用也可制得层数易控的酶多层膜。或用生物素标记酶，通过 生物素和亲合素l 、日j 很强的结合性进行自组装，得到的多层膜极其稳定。或用生物 素标记抗体与亲合素交替组装，可制备含抗体的多层膜。被标记物如酶和抗体在 多层膜中仍能很好的保持其生物活性。 1 1 3 共价作用 基于共价相互作用所形成的多层膜稳定性更高，例o n - 硫化物与会纳米粒子 或会属离子的多层组装，形成m s 共价键1 7 引。基于分子问特定官能团之间的化学 反应进行层层交替组装也能形成有序多层膜。例如h b 与醛基化葡萄糖氧化酶之 间层层组装1 7 副。刚性共价多层膜的组装多采取在电极表面上直接发生聚合反应， 5 层层组装! 纳米材料结合制箭新型d n a 电化学生物传感器的研究 但必须控制单体在电极表面的接着以及掌握聚合反应易于终止的合成路线。研究 较多的是硅烷与羟基聚合来组装多层膜。 1 1 ，4 电沉积 x i a 等1 4 9 j 制备了一种多层膜的葡萄糖传感器，他们用层层组装的方法，在会 电极表面电沉积了普鲁士蓝纳米粒子( p b ) 和表面固载了g o x 的聚甲苯胺蓝。 其中聚甲苯胺蓝不但充当了g o x 的载体，同时还可以抑制干扰物的扩散；通过电 沉积得到的p b 层可以催化h 2 0 2 的还原。尽管由于聚甲苯胺蓝的导电性较差，并 且电沉积得剑的膜厚度较大，阻碍了葡萄糖向酶的扩散，但足基于前面所述的两 个优点，传感器还是可以得到较好的响应信号。为了改进这种传感器，以后可以 尝试使用导电聚合物代替聚甲苯胺监。 1 1 5 多种作用 为了使传感器具有更好的性能，人们把多种作用结合的模式引入到层层组装 构建多层膜中。k u h n 等【5 3 j 通过静电作用和配位作用相结合的方式构建了一种超 分子结构( 媒介体c a 2 + n a d + g d h ) ，这种超分子结构在旋转圆盘电极上非常稳 定，能够得到线性的葡萄糖响应信号。 s h e n 等【5 1 ，5 2 峙艮道了两种基于碳纳米管多层膜的传感器。他们首先利用静电作 用组装碳纳米管的多层膜，然后通过生物分子与戊二醛的交叉耦合作用在电极表 面固载了胆固醇氧化酶和胆碱。这两种传感器都表现出很好的性能，如快速的信 号相应、良好的稳定性等。 x u 等1 5 4 l 通过c h i t 良好的稳定作用，首先用电沉积的方法在电极修饰了 f e 3 0 4 c h i t ，这样就简化了电极的制备过程，然后与植酸层层组装得到了多层膜， f e 3 0 4 c h i t 与植酸之间除了静电作用外，磷酸盐与铁的氧化物之间的相互作用也 增强了多层膜的稳定。这种多层膜可以作为固载平台，加快h b 的直接电子转移， 并保持很高的催化能力。 m a o 等1 7 6 j 利用i ；一7 1 ：键和疏水作用把亚甲基蓝( m e t h y l e n eb l u e ，m b ) 分子 修饰到单壁碳纳米管( s w n t ) 上，得到了m b s w n t 纳米结构。这种纳米 复合膜具有很好的稳定性和良好的催化能力，为进一步制备电化学生物传感 器提供了广阔的前景。 1 2d n a 电化学生物传感器 1 9 6 9 年p a l e c e k 发现核酸的电化学活性，到上世纪9 0 年代，电化学d n a 生 物传感器技术研究才f 式开展起来。电化学d n a 生物传感器是以电极( 包括金属 6 青岛科技人学研究生学位论文 电极、碳质电极等) 为换能器，把d n a 作为分子识别元件的传感器。电化学d n a 尘物传感器因其仪器简单、分析速度快、灵敏度高等优点而引起越来越多的重视， 已成为目前研究最多的一类d n a 生物传感器。 根据传感器d n a 识别模型的不同，d n a 传感器分为：( 1 ) 双链d n a ( d s d n a ) 传感器，即固定化d s d n a ，利用d n a 与其他分子或离子问的相互作用产生的信 号进行测定。( 2 ) 瞥链d n a ( s s d n a ) 传感器，即利用固定化s s d n a 探针，在碱 基配对原则基础上进行分子识别检测系统，通过d n a 分子杂交反应，直接或间 接产生的信号变化检测目标基因。 1 2 1d n a 损伤 氧化性的d n a 损伤能够引起老化，癌变和基因突变。d n a 的四个碱基中， 鸟嘌呤( g u a n i n e ) 是最容易被氧化的，它在汞电极上的氧化电位为1 0 6v ( v s s c e ) 。鸟嘌呤最原始的氧化产物为8 羟基鸟嘌呤( 8 - o x o g u a n i n e ) ，这种产物是d n a 氧化性损伤中常见的标志1 7 引。在传统的电化学研究中，d n a 通常被集中吸附在 汞电极上，在分析过程中以是否出现放大的伏安信号判断是否存在氧化性损伤。 d n a 的高灵敏伏安测定可以通过一些过渡金属配合物( 如r u ( b p y ) 3 2 + ) 的电化学 催化氧化完成1 7 9 1 。 近年来，r u s l i n g 小组利用层层组装对d n a 损伤测定开展了较多的研究工作。 文献 3 8 1 报道了r u s l i n g 等在裂解石墨电极上通过静电作用构建了 【r u ( b p y ) 2 ( p v p ) l o c i 】c l ( p v p = p o l y ( 4 v i n y l p y r i d i n e ) ，聚4 乙酰基吡啶) 和d s d n a 的多层膜。内层的 r u ( b p y ) 2 ( p v p ) l o e l e