（植物学专业论文）花粉特异表达的微管结合蛋白sb401的特性分析.pdf

中国农业大学博士学位论文摘要 摘要 微管结台蛋白对微管骨架的组织和功能调控有重要的作用。马铃薯( s o l a m o nb e r t h a u l t i i ) 花 粉中特异表达的s b 4 0 1 蛋白具有类似于动物微管结合蛋白m a p l b 微管结合域的特征重复序列， 其中的k k e e 基序( m o t i f ) 也存在于微丝成束蛋白v i l l i n 头部( h e a d p i e c e ) 的微丝结合域中，因 此推测其具有与微管、微丝结合的能力，可能是一种新的植物花粉特异表达的微管结合蛋白。 本研究构建了s b 4 0 1 的原核表达载体，并通过原核表达，分离、纯化到s b 4 0 1 的融合蛋白， 对该蛋白的微管和微丝的结合、成束以及调控微管和微丝的效应进行了系统的研究。共沉淀实验 以及激光共聚焦显微镜和电镜观察结果表明：s b 4 0 1 蛋白可与微管特异结台，结合的摩尔比为 t u b u l i nd i m m e t ：s b 4 0 1 = l ：0 4 ；s b 4 0 1 蛋白诱导t a x o l 稳定的微管形成微管束，其成束能力依赖 于s b 4 0 1 蛋白的浓度，随s b 4 0 1 蛋白浓度升高，微管束从单束到交连成网团状，成束现象越来 越显著：微管束中微管与微管之间由s b 4 0 蛋白紧密粘结，微管与微管之间的距离约6 8n l n ， 微管之问发现明显的丝状横桥结构存在。s b 4 0 1 蛋自在溶液中主要以单体、二聚体、四聚体形式 存在，三种形式都可与微管结合，诱导微管成束。通过免疫印迹、g s t 融合蛋白沉降技术、3 5 0n l n 浊度测定和荧光显微镜观察等方法证明s b 4 0 1 蛋白与微管蛋白( t u b u l i n ) 特异结合。在s b 4 0 1 蛋白与微管蛋白的共聚合体系中，s b 4 0 1 蛋白能够促进或抑制微管的体外聚合，在高温( 3 7o c ) 或高浓度条件下，s b 4 0 1 蛋白与微管蛋白迅速结合，降低了聚合反应体系中游离微管蛋白的浓度， 抑制微管的聚合；在较低温度( 2 8 。c ) 和低浓度条件下，s b 4 0 1 蛋白优先与微管结合，诱导微 管成束稳定微管，促进微管的聚合。细胞免疫荧光的实验也证明，s b 4 0 1 蛋白在花粉管中与微管 共定位。 s b 4 0 1 蛋白也与微丝特异结合，结合的摩尔比为g a c t i n ：s b 4 0 1 = i ：o 2 2 。s b 4 0 1 蛋白诱导 微丝形成微丝束，但微丝成束需要的时问比微管成柬时间长。s b 4 0 1 蛋白对微丝的聚合动态没有 影响。在微管和微丝同时存在的条件下，s b 4 0 1 蛋白可与微管微丝同时结合，形成微管一微丝束， 使微管微丝共定位。微管、微丝与s b 4 0 1 蛋白的结合有竞争性，s b 4 0 1 蛋白与微管的亲和力高于 微丝，s b 4 0 1 蛋白优先与微管结合。 本论文证明了s b 4 0 1 蛋白是一个新发现的植物花粉特异表达的微管结合蛋白，具有诱导微管 成柬，调节微管聚合特性的功能；此外，s b 4 0 1 蛋白也可以结合微丝，诱导微丝成束。因此，s b 4 0 1 蛋白可能在植物花粉发育和花粉管生长等生理过程中有重要的作用。 关键词：微管，微管结合蛋白，微丝，花粉特异表达蛋白，马铃薯 v a b s t r a c t m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp r o t e i n s ( m a p s ) a r et h em a j o rf a c t o ri n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no f m i c r o t u b u l ef m t ) d y n a m i c sa n do r g a n i z a t i o nf o rf u n c t i o n so ft h em tc y t o s k e l e t o n n ep o l l e n - s p e c i f i c p r o t e i ns b 4 0 if r o ms o l a r i u mb e r t h a u l t i ic o n t a i n si m p e r f e c tr e p e a t e dm o t i f s ，w h i c hr e s e m b l e sa r e p e t i t i v ed o m a i nr e s p o n s i b l ef o rm tb i n d i n gi nv i t r oo ft h em i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i nm a p i bi n a n i m a lc e l l s ，a n da l s ok k e em o t i f si na c t i nb i n d i n gd o m a i no f v u l i n ，a nf - a c t i nb i n d i n gp r o t e i nt ob u n d l e a c t i nf i l a m e n t s i ts u g g e s t st h a ts b 4 0 1m a yb i n dt ob o t hm t sa n da c t i nf i l a m e n t s a n dr e p r e s e n t sa h o v e lp o l l e n s p e c i f i cm a pi np l a n t s i np r e s e n ts t u d y , w ee x p r e s s e ds b 4 0 1i nb a c t e r i u m p u r i f i e dr e c o m b i n a n ts b 4 0 1p r o t e i nw a s o b t a i n e dt oa n a l y z et h ea c t i v i t yo fs b 4 0 1p r o t e i ni nb i n d i n gt oa n db u n d l i n gm t sa n da c t i nf i l a m e n t s a n dt h e i rr e g u l a t o r yf u n c t i o n si nt u b u l i np o l y m e r i z a t i o na n dm t d y n a m i c s r e s u l t so f c o - s e d i m e n t a t i n n e x p e r i m e n t s f l u o r e s c e n c ea n de l e c t r o nm i c r o s c o p yo b s e r v a t i o n sd e m o n s t r a t e dt h a ts b 4 0 1b o u n dt om t s s p e c i f i c a l l y , w i t ha b i n dr a t i oo f t u b u l i nd i m m e rt os b 4 0 1o fl ：0 4 s b 4 0 1b u n d l e da l s ot a x o l - m t s i nac o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n tm a n n e lw j t l li n c r e a s eo f t h ec o n c e n t r a t i o no f s b 4 0 1 m o r em tb u n d l e s f o r m e da n dc r o s s - l i n k e di n t om i c r o t u b u l em e s h w o r k s m r si nb u n d l e sb u n c h e dt o g e t h e rq u i t et i g h t l y a l o n gt h e i rw h o l el e n g t h ，w i t hag a pb e t w e e nt h em t sa b o u t6 - 8n m h o w e v e r , o b v i o u sf i l a m e n t o u s c r o s s ：b r i d g e sw e r ed e t e c t e db e t w e e nt h em t si nt h eb u n d l e s s b 4 0 1p r o t e i n se x i s t e da sm o n o m e r s d i m m e r so rt c t r a m e r si nt h es o l u t i o n a l lt h e s es b 4 0 lm o d u l e sc o u l db i n dt om ta n dc a u s em t b u n d l i n gi nv i t r o o u rb i o c h e m i c a la n a l y s i sa l s os h o w e dt h a ts b 4 0 1b o u n dt o t u b u l i na sw e l l s b 4 0 1e x h i b i t e db o t hi n h i b i t o r yo re n h a n c i n ge f f e c to nt u b u l i np o l y m e r i z a t i o n ，a c c o r d i n gt os b 4 0 1 c o n c e n t r a t i o na n dt h et e m p e r a t u r e a th i g l lt e m p e r a t u r ea n ds b 4 0 1c o n c e n t r a t i o n s ，s b 4 0 1b o u n dt o t u b u l i na n dr e d u c e dt h ec o n c e n t r a t i o no ff r e et u b u l i n s ，a n di nac o n s e q u e n c e ，i n h i b i t e dt u b u l i n p o l y m e r i z a t i o n i nt h ec o n t r a s t ，a tl o wt e m p e r a t u r ea n ds b 4 0 1c o n c e n t r a t i o n s ，s b 4 0 1b o u n d p r e f e r e n t i a l l yt oa n db u n d l e dm t s a n de n h a n c e dt u b u l i np o l y m e r i z a t i o n d o u b l ei m m a n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n ga l s os h o w e dt h a ts b 4 0 1w a sc o - l o c a l i z e dw i t hm t si np o l l e nt u b e s f u r t h e ri n v e s t i g a t i o ns h o w e dt h a ts b 4 0 1b o u n dt oa c t i nf i l a m e n t s ，w i t hab i n d i n gr a t i oo fg - a c t i n t os b 4 0 1o fl ：o 2 2 i na d d i t i o n ，s b 4 f i lb u n d l e da c t i nf i l a m e n t s ，t o o ，b u tt a k i n gl o n g e rt i m et ob u n d l e a c t i nf i l a m e n t st h a nm t s h o w e v e r , s b 4 0 1h a dn oe f f e c to na c t i np o l y m e r i z a t i o n s b 4 0 1b o u n d b o t ht oa n dc o 1 0 c a l i z e dm t sa n da c t i nf i l a m e n t si nt h ep r e s e n c eo fb o t hm t sa n da c t i nf i l a m e n t s n e v e r t h e l e s s s b 4 0 1p r o t e i nh a dam u c hh i g h e ra f f i n i t yf o rm t st h a na c t i nf i l a m e n t s s b 4 0 1 p r e f e r e n t i a l l yb o u n dm t st of o r mm t b u n d l e s o u re x p e r i m e n tr e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h es b 4 0 1p r o t e i ni san o v e lp o l l e n s p e c i f i cm a p , w h i c h b i n d st oa n db u n d l e sb o t hm t sa n da c t i nf i l a m e n t sa n dr e g u l a t e st u b u l i np o l y m e r i z a t i o n ，a n dt h e r e f o r e m a y h a v ei m p o r t a n tr o l e sj np l a n tp o l l e nd e v e l o p m e n ta n dp o l l e nt u b eg r o w t h k e yw o r d s ：m i c r o t u b u l e ，m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e dp r o t e i n ，a c t i nf i l a m e n t s ，p o l l e n s p e c i f i cp r o t e i n ， s o l a n u mb e r t h a u l t i i v i 中国农业大学博士学位论文缩略词 英文缩写 m t a c r b i s a m p b c 狂 b s a c d n a d d h 2 0 d m s o d t t e c o l i e b e d t a e g t a g t p h r i p t g k m k b k d a m g l m l n b t n c p c r p i p e s r h o d a m i n e s d s s d s p a g e t a x 0 1 t e m e d t r i s 弘g p l p m m 缩略词 英文名称 m i c r o t u b u l e a c r y l a m i d e b i s a c r y l a m i d e a m p i c i l l i n 5 - b m m o - 4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y l - p h o s p h a t e b o v i n es e r l l l q la l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd n a d i d i s t i l l e dw a t e r d i m e t h y l s u l f o x i d e d i t l l i o e r y t h r e i t o l e s c h e r i c h i ac o l i e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i n i i r i l o t e t r a c e t i ea c i d e t h y l e n eg l y c o lb i s ( b - a m i n o e t h y l e t h e r ) - n ，n ，n ，n - t e t r a a e e t i ca c i d g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e h o u r i s o p r o p y l t h i o - b - - o - g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y c i n k i l ob a s ep a i r k i l od a l t o n m i l l i g r a m m i n u t e l i t r e m i l l i l i t r e n i t r o - b l u et e t r a z o l i u m n i t r o c e l l u l o s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p i p e r a z i n e - n , n - b i s ( 2 m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d 5 ( a n d - 6 ) c a r b o x y t e t r a * m e t h y l r h o d a m i n e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p o l y - a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p b o r e s i s p a c l i t a x e l n n n ，n - t e t r am e t h y l e t h y l e n ed i a m i n e t r i s ( h y t d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e m l c r o g r a m m e m i c r o l i t r e m i c r o m o l ep e rl i t r e m o l ep e rl i t r e v l i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下迸行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 两使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做购任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：首麓莉 时间：易行年月知1 3 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：董溆暂 时问：细r 年f 月勿日 导师签名时间：乒w ，年石月伽日 第一章文献综述 细胞骨架是由微管、微丝和中间纤维组成的动态的三维蛋白质网络，植物细胞骨架主要由微 管和微丝组成。微管、微丝在细胞分裂、生长、分化和信号转导等生理活动中都具有重要功能。 本文仅对微管和微丝的结构、动态，微管和微丝结合蛋白，以及花粉管中细胞骨架等方面的研究 进展做简要综述。 1 1 微管 1 1 1 微管及微管蛋白 微管( m i c r o t u b u l e s ，m t s ) 是真核细胞中普遍存在的蛋白质骨架，是由分子量为1 0 0 k d a 的 微管蛋白异二聚体( q1 3 - t u b u l i n ) 组成的外径约2 5n m ，管壁厚约5n m ，内径约1 5n m 的中空管 状结构。组成微管的基本单位为微管蛋白( 1 u b u l i n ) ，微管蛋自1 3 - t u b u l i n 异二聚体晟早由有丝 分裂的阻抑剂秋水仙素( c o l c h i c i n e ) 亲和纯化获得( w e i s e n b e r g e a l ，1 9 6 8 ) 。1 9 7 2 年w e i s e n b e r g 首先在体外由纯化的微管蛋白聚合成微管，为在体外研究微管的超微结构和微管的动态奠定了实 验基础( w e i s e n b e r g ，】9 7 2 ) 。微管聚合时1 3 - t u b u l i n 异二聚体头尾相连组成原丝，再由原丝通过 侧向结合形成微管的壁，通过体内和体外的研究表明微管一般由1 3 根原丝组成，但在体外由于聚 合条件的不同原丝的数目会发生一定的变化，在体内也有相似的情况，某些特化细胞中的微管或 特定条件下体外组装的微管管壁也可由1 2 - - 1 7 根原丝组成( s a v a g ee t a l ，1 9 8 9 ；c h r e t i e ne t a l ， 1 9 9 5 ) 。 微管蛋白除1 3 - t u b u l i n 女 l - ，还有另外一种微管蛋白t t u b u l i n ，t t u b u l i n 是后发现的一种新的微 管蛋白，不同于o - t u b u l i n 和卜t u b u l i n ， t - t u b u l i n 并不直接参与微管的组成，而在微管体内的组装成 核中起重要作用( j o be la l ，2 0 0 3 ) 。 1 3 - t u b u l i n 异二聚体与g t p 结合，利用g t p 水解提供的能量聚合成微管( w e i s e n b e r g e l a l ， 1 9 7 6 ) 。对紫杉醇( t a x 0 1 ) 稳定的锌诱导形成的微管蛋白片( t u b u l i ns h e e t s ) 的晶体学研究，得 到3 7a 分辨率的t u b u l i n 分子结构模型，确定了微管蛋白d 、b 亚基上g t p 的结合区域及其特征， b 亚基上的t a x o l 结合位点，从分子水平阐明了微管蛋白的结构与功能( n o g a l e s e l a l 1 9 9 8a , b ， 1 9 9 9 ) 。紫杉醇是存在于红豆杉属植物中的次生代谢产物，目前广泛用于癌症的治疗，在微摩尔 水平可促进微管的聚合，其作用表现在：降低微管蛋白聚合的临界浓度；与微管结合，抑制微管 的动态，抑制低温、钙离子诱导的微管解聚：t a x 0 1 只与聚合的微管结合。能在缺乏g t p 时启动 微管的聚合( a m o s ，2 0 0 4 ) 。 微管是不对称的结构，微管组装呈极性一端为快速生长端，称为正端，另一端生长较慢， 称为负端( a l l e n & b o r i s y1 9 7 4 ) 。a - t u b u l i n 抗体包被的小球特异结合在微管的负端( f a ne l a ， 1 9 9 6 ) ，g t p 包被的荧光小球绝大多数结合在微管的正端，g t p 与p - t u b u l i n 的e 位点结合 ( m i l c h i s o n1 9 9 3 ) 。在a m p p n p 存在下k i n e s i n 的马达区主要与p - t u b u l i n 结合，k i n e s i n 装饰在微 管的正端( h i r o s e e t a l 1 9 9 5 ) 以上实验证明i b - - t u b u l i n 暴露在微管正端，a - - t u b u l i n 在微管的 1 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 负端。 微管的正、负端有不同的动态特性，微管蛋白是g t p 酶，在聚台过程中g t p 水解，1 个， 卜i u b u l i n 二聚体与2 个g t p 分子结合。n 亚基结合1 个g t p ，结合g t p 的亚基上的位点为n 位点，即非交换位点，该位点埋藏在亚基内部，不能与溶液中的g t p 进行交换。g t p 不水解，n 位点对二聚体结构的稳定具有重要意义。另一个g t p 与1 3 亚基结合，这个位点称为e 位点，该 位点暴露在二聚体的表面，可以与溶液中的g t p 进行交换，称为可交换位点，e 位点与g t p 的 亲和力是与g d p 亲和力的三倍。t u b u l i n - - g t p 聚合成微管后，e 位点的g t p 水解，埋在微管晶 格中的g d p 不能与溶液中的g t p 交换，在微管解聚后，e 一位点的g d p 与溶液中的g t p 交换， 形成g t p t u b u l i n ，重新参与微管的聚合。在体外有g t p 存在，3 7 ，t u b u l i n 浓度1 0 州以上 时，t u b u l i n - - g t p 可以自发组装成微管( w e i s e n b e r ge t a l ，1 9 6 8 ；n o g a le l a l ，1 9 9 8 ，1 9 9 9 ) 与 g d p 微管相比，在非水解性的g t p 同系物g m p p n p 、g m p p c p 存在时，聚合的微管非常稳定， 没有显示动态不稳定性，说明g t p 水解不是微管聚合所必需的，岫u b u l i ne 位点的g t p 水解为 g d p m b u l i n 减弱了内部亚基之间的结合，导致微管晶格的不稳定( m e j i l l a n oe t a l ，1 9 9 0 ；h y m a ne t a ，1 9 9 2 ；m i c k e y h o w a r d ，1 9 9 5 ) 。 将己聚合的微管剪切，剪切后的微管正端迅速解聚。而新的负端非常稳定，并进入拯救性的 聚合，说明在聚合的微管正端存在一个稳定微管的结构( w a l k e r , 1 9 8 9 ) 。1 3 - t o b u l i n 暴露在正端， n t u b u l i n 在微管的负端，当新的二聚体加在微管正端，触发了已聚合在微管上的 3 - t u b u l i ne 位点 g t p 水解，在下一个异二聚体填加之前，新加上的异二聚体的i b - m b u l i n 的e 位点的g t p 不水解 导致在微管正端形成一层由g t p - - m b u l i n 组成的g t p 帽结构，而在微管的负端没有g t p 帽结 构。当异二聚体的填加速率大于g t p 的水解速率时，在镦管正端存在一定大小的g t p 帽( e d c k s o n & o b r i e n1 9 9 2 ) ，微管的稀释实验分析认为组成g t p 帽g t p - - t u b u l i n 在1 - 1 0 层之间( w a l k e r e ta 。1 9 9 1 ，d r e c h s e l k i r s c h n e r , 1 9 9 4 ；c a p l o w & s h a n k s1 9 9 6 ) 。异二聚体的填加速率快，可以增 加正端g t p 帽的长度，g d p 置换e 位点的g t p 形成g d p t u b u l i n ，加入g d p - t u b u l i n 使g t p - t u b u l i n 在正端去除，会导致g t p 帽失去，微管迅速解聚。研究推测微管末端的稳定主要取决于端部撮 外一层亚基之间的侧面结合，在微管负端最外层为d - t u b u l i n ，t u b u l i n 的n 位点有非交换的g t p ， 并在结构上稳定，因此亚基之间侧面结合较稳定，即使没有g t p 帽，负端也相当稳定微管正 端最外层g t p b - t u b u l i n 之间的侧面结合力强于g d p - 1 3 - t u b u l i n ，g t p 水解后正端构象发生变化， 原丝由直变弯曲微管解聚，所以g t p 帽可以稳定微管，微管的两端有不同的动态特性( n o g a l e s 1 9 9 9 2 0 0 0 ) 。 1 ，1 2 微管体外聚合的动态特性 微管的聚合过程分为成核、延长、稳定状态( n u c l e a t i o n ，e l o n g a t i o na n ds t e a d ys t a t e ) 三个连 续的阶段，微管体外聚合动态特性主要通过3 5 0u m 吸光值的浊度法测定微管聚合过程中微管的 总体数量；应用暗视野、微分干涉、荧光、激光共聚焦等显微镜观察、记录单根微管的聚合、解 聚过程( v a l i r o ne ta t ，2 0 0 1 ) 。 对微管体外聚合动态特性的研究经历了几个认识阶段，1 9 7 2 年w e i s e n b e r g 研究了微管蛋白 在含有钙的螫合剂和g t p 的聚合缓冲液中聚合成微管的可逆性( w e i s e n b e r g ，1 9 7 2 ) 。微管的动 2 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 态用传统的聚合理论解释认为，徽管蛋白二聚体在微管末端填加和解离，当达到平衡态时，徽管 的动态性即微管与微管蛋白库之问的亚基交换仅限于微管的两端，微管的长度基本保持不变，认 为这是一种真正的平衡过程( o o s a w a1 9 6 2 ，1 9 6 7 ，1 9 7 5 ；j o h n s o ne la l ，1 9 7 7 ) 。后来发现微管是一 种极性的结构，其两端性质不同，在微管的延长过程中两端的生长速率不同，微管蛋白在微管两 端结合的平衡常数也不同，因此微管的聚合不可能达到真正的平衡状态，而只有表观的稳定态， 达到稳定态时一端加进去的微管蛋白最终将从另一端失去，这就是踏车模型( t r e a d m i l l i n g ) ( m a r g o l i s w i l s o n1 9 7 8 ；m a r g o l i se l a l ，1 9 8 1 ) ，根据这个模型可以预测真正的平衡永远没法达 到，而是在稳定态时微管的长度和数目不变。 1 9 8 4 年，m i t e h l s o n & k i r s c h n e r ( 1 9 8 4 a , b ) 对体外微管长度分布的分析提出动态不稳定模型。 按照这一模型，当整体解聚的微管与聚合的微管在数量上相等时，即达到了所谓的稳定态，但对 于单根微管来说永远不会达到平衡，在微管聚合生长与解聚缩短之间存在着相的转变，从聚合相 转变为解聚相称为灾变( c a t a s t r o 曲e ) ，从解聚相转变为聚合相称为解救( d d s c u c ) ，描述微管动 态不稳定性有四个参数：聚合速率( t h er a t e so f p o l y m e r i z a t i o n ：g t pt u b u l i ns u b u n i t sa d dt ot h ee n d o f am ta tar a t e ) 、解聚速率( t h er a t e so f d e p o l y m e r i z a t i o n ：g d p t u b u l i ns u b u n i t sa r er e l e a s e df r o m m te n d sa tar a t e ) 、灾变频率( c a t a s t r o p h ef r e q u e n c i e s ：t h et r a n s i t i o nf r o mp o l y m e r i z a t i o n1 0d e p o l y - m e r i z a t i o n ) 和拯救颏率( r e s c u ef r e q u e n c i e s ：t h et r a n s i t i o nf r o md e p o l y m e r i z a t i o nt op o l y m e r i z a t i o n ) 。 后来用暗视野显微镜和微分干涉衬显微镜连续录相观察到微管聚合过程的动态不稳定性( h o r i o & h o t a n i1 9 8 6 ；w a l k e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。大量的实验表明微管的动态不稳定性是体外、体内徽管聚合动 态的主要机制( c a s s i m e r i se t 口，1 9 8 7 ；1 9 8 8 1 9 9 3 ；g e l f a n d & b e r s h a d s k y l 9 9 1 ；e r i c k s o n o b r i a n 1 9 9 2 ) ，体外聚合的微管正端、负端都显示动态不稳定性( w a l k e re l 缸1 9 8 8 ；e r j e k s o n o b r i e n 1 9 9 2 ) 。在一段时间内，微管有时即不聚合也不解聚的暂停( p a u s e ) ，微管长度保持不变，在体 内这种暂停是时常发生的，在体外较少发生( w a l k e r e t a l ，1 9 8 8 ；s h e l d e n & w a d s w o r t h1 9 9 3 ) 。 按照传统的聚合理论。微管成核、延陡的速率、解聚速率只依赖于溶液中微管蛋白的浓度， 当溶液中微管蛋白的浓度降低时。成核速率降低，延长速率与微管蛋白的浓度呈线性关系( v o t e r & e r i c k s o n l 9 8 4 ；f l y v b j e r g l e i b l e r l 9 9 6 ) 。按照动态不稳定模型微管成核、延长的速率不仅 依赖于溶液中微管蛋白的浓度，而且与微管正、负端部的不同结构特性有关，微管的聚合、解聚 是两个不同的生理过程( v a l i r o ne t a ，2 0 0 1 ) 。 1 1 3 微管结合蛋白 细胞内的微管与体外微管具有相同的动态特征，与体外微管动态相比，细胞内微管具有更高 的聚合速率和相变频率，在相同的微管蛋白浓度下，微管的体内组装速率是体外的5 1 0 倍。细胞 内微管存在动态不稳定模型和踏车模型( c a s s i m e d s , 1 9 9 3 ) ，单根微管的细胞内动态，最早采用 d i c 显微镜( c a s s i m e r i se l a l ，1 9 8 8 ) ；向细胞显微注射荧光标记的微管蛋白；g f p 融合蛋白技术 ( s t e a r n s ，1 9 9 5 ) 等观察到细胞内微管的动态不稳定性( h u s h e l a l ，1 9 9 4 ；y u a ne t a l ，1 9 9 4 ；m a r ce t a l ，1 9 9 8 ；s h a we t a l ，2 0 0 3 ) 。在细胞内微管的动态受许多蛋白的调节，这些蛋白主要分为两大类， 一类是以微管为轨道，负责物质运输的马达蛋白；一类是与微管结台调节微管动态的微管相关蛋 白。 3 中周农业大学蹲上学位论文 第一章文献综述 下面是一幅h e a l d n o g a l 发表在j o u r n a lo f c e l ls c i e n c e 上的各类微管相关蛋白调节动物细 胞微管动态的模式图( h e a i d & n o g a l ，2 0 0 2 ) 。 把调节微管动态的一类结台蛋白从功能上分为微管的稳定因子( s t a b i l i z i n g f a c t o r s ) 和解聚因 子( d e s t a b i l i z i n gf a c t o r s ) 两大类，在时空上调节细胞周期的不同微管列阵。稳定因子包括微管表 面结台蛋白、端部结合蛋白、共聚合因子、成核因子等：解聚因子包括q u b u l i n 结合蛋白、端部解 聚蛋白、剪切蛋自等。 微管蛋白要形成有功能的异二聚体，肽链必须经过正确的折叠，c c t ( e h a p e r o n i n - c o n t a i n i n g t c p - ! ) 负责微管蛋白单体的折叠( t u b u l i nf n o o o m e r f o l d i n g ) ，f o x i n g c o f a c t o r s a 、b 、c 、d 、e 与已正确折叠t u b u l i n 、1 3 - t u b u l i n 作用，形成功能性的异二聚体，并调节单体与二聚体的适合比 例( n o g a l e s 、2 0 0 0 ) 。微管聚合的第一步是微管成核，发生在微管组织中心( m t o c s ) ，由y - t u b u l i n 和g r i p s 蛋白组成? - t u b u l i n 环状复合体( 7 - t u r c ) 负责微管成核。微管的聚合稳定需要微管结合 蛋白( m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e dp r o t e i n s ，简称m a p s ) ，典型的m a p s 结合在微管的表面，在相邻 微管之间形成桥状连接以稳定微管，如神经细胞中的m a p i ，m a f 2 和t a u 蛋白，非神经细胞中的 m a p 4 是一类典型的侧面结合的结构性微管结合蛋白m a p s ，这类蛋白与微管结合稳定微管，促 进微管聚合，抑制微管灾变，促进拯救，降低了微管蛋白的周转率，增加微管的稳定。神经m a p s 含有重复序列的微管结合域，交连邻近的微管蛋白亚基，结合在礅管上与微管蛋白结合的比例为 1 ：4 - 1 0 ( m a p ：t u b u l i n )( l e w i se fa l ，1 9 8 8 ，d r e e h s e le ta 1 ，1 9 9 2 ，p t y e re la l ，1 9 9 2 ，t r i n e z e ke la 1 ， 中国农业大学博上学位论文第一章文献综述 i i t 9 9 5 ) 。与神经m a p s 不同，m a p 4 增强拯救频率，但对微管灾变没有影响( o o k a t ae l a 1 9 9 5 ) 。 另外一些m a p s 如x m a p 2 1 5 s t u 2 p t o g 可以富集于微管的表面。微管末端结合蛋白可与微 管麸聚合，选择性的结合于微管特定的末端，如正端结合蛋白c l i p 一1 7 0 和e b l ，与微管正在聚合 的或解聚的微管末端结合通过a p c ( a d e n o m a t o u s p o l y p o s i sc o l d 蛋白、c l a s p s ( c l i p a s s o c i a t e d p r o t e i n s ) 、曲n e i n d y n a e t i n l i s i 把微管固定在染色体的着丝粒或细胞膜上( r o g e r s ，“a l 2 0 0 2 ； c a r v a l h o ，e ta 1 ，2 0 0 3 ；g a l j a r t p e r e z , 2 0 0 3 ) 。 微管解聚因子k a t a n i n ，剪切微管，产生缺乏g t p 帽的新微管末端，导致微管解聚( h a r t m a n v a l e ，1 9 9 9 ；m c n a l l y , 2 0 0 0 ；m c n a l l ye t a l ，1 9 9 3 ；m c c i i n t o ne t a l ，2 0 0 1 ) 。k i n l 家族的x k c m l & m c a k 结合在微管末端，使末端构象发生变化，微管解聚：o p l 8 l s t a t h m i n 结合t u b u l i n 二聚体、 促进e 位点的g t p 水解解聚微管，稳定因子和解聚因子的活性在时空上受细胞其它因素的调节 ( h e a l d n o g a l ，2 0 0 2 ) 。 1 1 4 植物细胞中的微管结合蛋白( m i c r o t u b u i c a s s o c i a t e dp r o t e i n s m a p s ) 在植物细胞周期中。存在四种典型的微管列阵，这四种微管列阵在细胞的生长、分化、成熟 过程中具有重要的生理作用。 植物细胞具有细胞壁，在细胞生长过程中，细胞壁的微纤丝与细胞的长轴垂直排列，在细胞分 裂间期，微管紧贴质膜并与质膜平行排列，称为周质微管( c o r t i c a lm i e r o t u b u l e s ) 周质微管的组装 形成，更多的依赖微管结合蛋白( m a p s ) 形成的横桥。周质微管控制细胞壁纤维素微纤丝的排 列方向，通过调控微纤丝的排列方式，从而调控细胞的生长方向( b a s k i n 2 0 0 1 ) 。 在细胞分裂的早前期，平行的微管束形成环绕细胞周质的环状的早前期带微管列阵( p p b ) ， p p b 对细胞分裂时细胞板的定位具有重要作用，决定细胞分裂时细胞板的位置( w i c k ，1 9 9 1 ：l l o y d ， 1 9 9 1 ) ；微丝也存在于早前期带微管列阵中，可能对早前期带微管列阵的维持