（信号与信息处理专业论文）叶绿素a荧光计设计与开发.pdf

摘要 由于海水浮游植物中的叶绿素a 含量与光合作用产量之间存在相关性，因而叶绿素a 浓度被作为描述海洋初级生产力的重要指标，并且叶绿素a 浓度也是评价海洋水质、有 机污染程度和探测渔场的重要参数，同时海域叶绿素a 的时空变化包含着海区的基本信 息。 目前，叶绿素a 荧光计的发展主要呈现小型化、低功耗和模块化的发展趋势。本系 统主要基于荧光分析法，以m s p 4 3 0 f 2 0 1 3 单片机作为核心控制单元，通过控制波长为 4 6 0 h m 的超高亮度发光二极管激发叶绿素a 产生荧光信号，并利用高性能的$ 8 7 4 5 - 0 1 光敏器件作为荧光信号的感应装置。系统中通过有源低通滤波网络对信号进行去噪，并 通过两级放大电路进行信号的放大，然后经模数转换后进入单片机，并通过对测量值的 多次采样平均有效滤除噪声信号，最后将采样获得的数据通过r s - 2 3 2 串口上传至上位 机并实时显示。 实验结果表明，本系统测量的叶绿素a 浓度与荧光光强具有良好的线性关系，并且 拥有较小的检出限和较低的功耗。本系统采用模块化、低功耗、小体积设计方案，从而 有利于本系统与其它传感器系统的集成，也有利于整个系统的维护、安装与调试。同时 本系统可适用于系泊式和走航式两种测量方式，可以测量海域某点叶绿素a 的垂直分布， 也可以进行海域叶绿素a 的空间分布测量，因而对海区的叶绿素a 分布研究具有重要意 义。 关键词：叶绿素a ；荧光计：低功耗：模块化 d e s i g na n dd e v e l o p m e n to fc h l o r o p h y l laf l u o r o m e t e r f a n c h e n - q i n g ( s i g n a la n di n f o r m a t i o np r o c e s s i n g ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rd a iy 0 n g - s h o u r e s e a r c h e rz h a n gj i e r e s e a r c h e rw a n g y a n - f e n g a b s t r a c t c h l o r o p h y l law a sr e g a r d e da st h ei m p o r t a n ti n d i c a t o rt od e s c r i b et h em a r i n ep r i m a r y p r o d u c t i o nb e c a u s et h ec h l o r o p h y l lac o n t e n to fp h y t o p l a n k t o ni nt h eo c e a ni sr e l a t e dt oi t s p h o t o s y n t h e s i sp r o d u c t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fc h l o r o p h y l lai sa l s ot h em a j o rp a r a m e t e rt o e v a l u a t em a r i n ew a t e rq u a l i t y , o r g a n i cp o l l u t i o na n dd e t e c tt h ef i s h i n gg r o u n d , a n dt h e t e m p o r a la n ds p a t i a lv a r i a t i o no fc h l o r o p h y l lac o n t a i n st h eb a s i ci n f o r m a t i o no fs e aa r e a s n o w , t h ed e v e l o p i n gt r e n do fc h l o r o p h y l laf l u o r o m e t e rw a sm i n i a t u r i z a t i o n , l o w c o n s u m p t i o na n dm o d u l a r i t y t h es y s t e mi sb a s e do nt h ef u o r e s c e n c ea n a l y s i s ，t h e m i c r o c o n t r o l l e rm s p 4 3 0 f 2 013a st h ek e yc o n t r o lm o d u l e ，b yc o n t r o l l i n gt h eu l t r a - h i g h b r i g h t n e s sl e dw h i c hw a v e l e n g t hi s4 6 0 n mt oe x c i t ec h l o r o p h y l lat op r o d u c et h ef l u o r e s c e n t s i g n a l ，a n da d o p tt h eh i g hp e r f o r m a n c ep h o t o s e n s o r $ 8 7 4 5 - 0 1a st h ei n d u c t i o ns y s t e mo ft h e f l u o r e s c e n ts i g n a l t h es y s t e mu s e sa c t i v el o w - p a s sf i l t e rt o r e j e c tn o i s e ，a n da m p l i f y i n g s i g n a lt h r o u g ht w os t a g ea m p l i f y i n gc i r c u i t ，a n di n p u tt h em i c r o c o n t r o l l e ra f t e ra n a l o g d i g i t a l c o n v e r s i o n ，a n dc o m p l e t e st h es a m p l i n ga n di n t e g r a lo fm e a s u r e m e n t sm a n yt i m e st of i l t e rt h e n o i s es i g n a lv a l i d t h es a m p l e dd a t aw o u l d u p l o a dt ot h ec o m p u t e rw i t hr s - 2 3 2a n dd i s p l a y r e a l t i m e t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l ts h o w st h ec o n c e n t r a t i o no fc h l o r o p h y l lam e a s u r e db yt h e s y s t e mh a st h el i n e a rr e l a t i o nw i t ht h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ，a n dh a ss m a l l e rd e t e c t i o nl i m i t a n dl o w e rc o n s u m p t i o n t h es y s t e ma d o p t st h em o d u l a r i t y ，l o w e rc o n s u m p t i o n ，s m a l lv o l u m e d e s i g nd e c i s i o n ，t h i st ot h eb e n e f i to fi n t e g r a t i o no ft h es y s t e ma n dt h eo t h e rs e n s o r s ，a l s ot o t h eb e n e f i to fm a i n t a i n ，i n s t a l l a t i o na n dd e b u g g i n g i na d d i t i o n ，c h l o r o p h y l laf l u o r o m e t e r c o u l db eu s e di nm o o r i n gm e a s u r e m e n ta n dp r o f i l em e a s u r e m e n t ，s oi tc o u l dm e a s u r et h e v e r t i c a ld i s t r i b u t i o no fc h l o r o p h y l lai no n ep o i n to fs e aa r e a , a l s oc o u l dm e a s u r et h es p a t i a l d i s t r i b u t i o no fs e aa r e a , t h u si th a si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ef o rr e s e a r c h e so fc h l o r o p h y l la d i s t r i b u t i o ni nt h es e aa r e a s k e yw o r d ：c h l o r o p h y l la ；f l u o r o m e t e r ；l o w e rc o n s u m p t i o n ；m o d u l a r i t y 关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的 成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致i j i j , i - ， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均已在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：芝殖，遣 日期：歹钟7 年f 月冲日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印 刷版和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部f - j ( 机 构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、 借阅和复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、 缩印或其他复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者 指导教师签名 日期：研年厂月冲日 日期：2 研年夕月土学日 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第1 章引言 叶绿素a 荧光计是通过特定波长的强光对叶绿素a 进行照射，促使其发出具有更长 波长的红色荧光信号，并通过测定荧光信号强度获知叶绿素a 浓度的一种装置。本章对 叶绿素a 浓度测量的主要研究意义、背景以及国内外研究现状进行了分析，并确定了本 文的主要研究内容和论文框架。 1 1 课题研究背景及意义 目前海洋环境受到了人类越来越多的关注，针对海洋环境进行的各种探测活动也越 来越频繁，因此高效获取海洋环境的有效数据已经成为研究的主要内容之一。 各国对于叶绿素a 荧光计的研究一直没有停止过，自上个世纪6 0 年代末期开始，一 些发达国家已经开始使用荧光测量法进行海洋水体混合扩散实验现场检测的应用研究。 7 0 年代中期，德国、苏联海洋学家首先采用脉冲氙灯作光源，窄带干涉滤光片作光谱滤 光和脉冲检测技术研制成脉冲式水下荧光计。此后，丹麦、日本、英国、美国也进行了 这方面的工作。4 0 多年来，各国研制的水下荧光计已广泛应用于物理海洋、海洋生物、 海洋光学、海洋地质、河口港湾和海洋环境检测等方面。 构成海洋生物并维持其生活的基础有机物质主要是由很多种类的浮游植物在真光 层水域中合成的，其参与光合作用的主要色素为叶绿素a ，因此借助海水浮游植物中的 叶绿素a 含量与光合作用产量之间的相关性，叶绿素a 的浓度被用作描述初级生产力的重 要指标【l 】。同时叶绿素a 的浓度是评价海洋水质、有机污染程度和探测渔场的重要参数。 海域叶绿素a 的时空变化包含着海区的基本生态信息，是同光照、温度、盐度以及风潮 流等各种因素密切相关的，因此它对于海区的各种科学研究具有重要意义。 随着技术的日益进步，对叶绿素a 荧光计也提出了新的要求，主要要求更加小型化、 标准化。由于在实际应用过程中，通常需要集成多种水质传感器，因此各传感器在体积 和重量上越小越好，同时带有标准接口，这样有利于将各传感器高度集成，而又无需提 供过多的转换接口电路，从而便于安装和维护。仪器的小型化、标准化也有利于商业化， 符合用户的使用要求。 本课题的研究意义主要有两个方面：一、实现叶绿素a 荧光计的小型化和标准接口 问题，从而有利于荧光计的集成、安装和维护；二、对叶绿素a 荧光探头进行实验室标 定。 第1 章引言 1 2 国内外研究现状 自1 9 6 6 年，l o r e n z e n 率先探讨了利用荧光法进行海洋现场连续测量叶绿素a 含量的 方法以来【2 j ，随着海洋调查对现场作业设备操作简便、高精度和高集成度的要求越来越 高，叶绿素a 荧光现场测量设备也有了长足的进展，主要体现在以下几个方面：一是叶 绿素a 荧光激发光源由早期的激光、脉冲氙灯逐步过渡n l d 和l e d o , 4 l ，从而使设备更加小 型化；二是s c h r e i b e r 提出的调制式( p a m ) 叶绿素荧光计【5 j 逐步从陆地应用拓展到海洋上， 专门研究藻类等海洋植物体的叶绿素荧光诱导动力过程【6 ，7 】；三是叶绿素荧光成像系统开 始在水体中尝试应用【8 】，提供二维空间分布特性；四是针对不同观测平台和使用环境， 多种类型的设备被提出，包括光纤式荧光计【9 , 1 0 、用于拖曳系统的荧光计【l l 】等。而利用 激光雷达【1 2 , 1 3 1 钡1 j 量海洋表层叶绿素浓度的技术也在不断发展之中，工作平台包括了调查 船和海监飞机。但总体而言，在现场作业中，小型化叶绿素荧光计依然占据主要地位。 人们曾采用显微镜下的计数法、黑白瓶法、c 法、分光光度法、实验室荧光测量 法【1 4 】等多种方法测量海水中浮游植物体内的叶绿素a 含量。目前测量叶绿素a 主要使用分 光光度法和荧光光度法。分光光度法大多采用l o r e n z e n 提出的单色分光光度法。该方法 只测定叶绿素a 的含量，采集的样品必须经过处理后才能进行测定，叶绿素a 浓度的检测 极限为1i lg l 。若水中叶绿素a 的含量极低，则采用荧光光度法测定，荧光光度法的灵 敏度比分光光度法高1 0 倍。荧光光度法测定水中叶绿素a 的原理是，用4 3 0 n m 波长的光照 射水中浮游植物，浮游植物中的叶绿素将产生波长约为6 7 7n m 的荧光，测定这种荧光的 强度，通过其与叶绿素浓度的对应关系可以得出水中叶绿素a 的含量。 由于分光光度法测量需要进行叶绿素的取样、萃取和离心等工序，在操作上较为繁 琐，而荧光测量法测量简便，并具有较高的精度和较宽的测量范围，所以在叶绿素a 的 实时检测系统中使用较为广泛。在叶绿素a 检测过程中，由于水体中叶绿素a 的含量较低， 所以不容易检测，且极易受到外部信号的干扰。同时激发光源和发射光会受到水体中悬 浮微粒的散射作用影响而减小光强，并且水体受到光照时，除了荧光物质发光外，还存 在入射光相同的液体分子散射，无机悬浮物的粒子散射等。所以目前研究遇到的问题主 要是有效激发光的选择、小信号的提取、电路抗干扰能力以及缩小整个系统的体积和重 量等。 目前国际上专注于海洋现场叶绿素a 荧光计研发的公司主要包括c i ，s e a p o i n t ， w e t l a b s ，t u r n e rd e s i g n s 等。综合分析以上几家公司在近几年技术研发的重点，主要 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 体现在以下几个方面：新型材料的应用，包括a b s 、钛钢等在内的新型材料被用做仪器 外壳，大大降低了仪器的整体重量；新型光源的应用：低功耗l e d 器件的广泛应用，原 来占据主导地位的脉冲氙灯荧光计由于体积、重量、功耗、干扰等问题，逐渐退出市场； 小型化设计与接口功能的完善：仪器体积大大缩小，使用操作十分方便；采用标准接口， 可以方便地与其它设备组合成功能更加完备的监测系统。 1 3 课题主要研究内容 本文通过对叶绿素a 荧光测量原理的研究，设计一套能够用于系泊式和走航拖曳式 实时测量的叶绿素a 荧光计，其原理框图如图卜1 所示，其主要包括光通路系统和信号检 测与通讯系统。 激发光源 - i 叶绿素a _ 叫光敏器件 光通路系统 雌墅惟蛰悃i ： 信号检测与通讯系统 ； 图i - 1 叶绿素a 荧光计系统框图 f i g l - 1b l o c kd i a g r a mo fc h l o r o p h y l laf l u o r o m e t e r 其中光通路系统主要包括： 1 ) 激发光源：产生特定波长的蓝光。 2 ) 光敏器件：接收叶绿素a 产生的荧光信号，并将光信号转换为相应的电信号。 信号检测与通讯系统包括 1 ) 前置放大滤波电路：对微弱的荧光信号进行前置的放大以及滤波。 2 ) a d 转换及处理电路：将接收到的荧光模拟信号转换为数字信号，并进行相应处 理转换为叶绿素a 浓度值。 。 3 ) 通讯电路：将叶绿素a 浓度值通过r s 一2 3 2 发送给上位机，以及通过上位机向荧光 计发送控制命令。 本论文的主要章节安排： 第一章主要介绍了叶绿素a 荧光计的研究背景及意义，叶绿素a 荧光计、调制荧光计 和高重复率荧光计的国内外研究现状以及本文的研究内容和主要方案。 第二章主要介绍了叶绿素a 荧光测量原理，通过对低浓度物质测量技术的介绍说明 叶绿素a 荧光信号产生的主要原理，同时通过介绍叶绿素a 荧光现场测量原理的介绍说明 叶绿素a 荧光信号与叶绿素a 浓度的对应关系，从而证明利用荧光分析法测量叶绿素a 浓 3 第1 章引言 度的可行性。 第三章主要介绍了叶绿素a 荧光检测系统的硬件设计，主要包括光学通路以及测量 电路的介绍。 第四章主要介绍叶绿素a 荧光计系统的软件设计，主要包括主控程序设计，通讯程 序设计和a d 转换控制程序。 第五章主要介绍了叶绿素a 荧光计的实验室标定以及性能测试，通过对相应数据处 理对叶绿素a 荧光计测量精度、可靠性及功耗等参数等进行分析。 第六章对本论文的主要工作进行了总结和分析。 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第2 章叶绿素a 荧光测量原理 目前利用荧光分析法测量海洋浮游植物体内叶绿素a 含量已成为比较普遍的方法。 不同物质的激发荧光有着不同的荧光激发谱，因此可以针对不同的物质利用不同的激发 光源进行激发，从而产生具有物质本身特点的荧光，进而达到测量物质浓度的目的。 2 1 叶绿素介绍 叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂脂，因此可以与碱反应生成醇和 叶绿酸的盐，其可以溶于水中。叶绿素吸收光量子而转变为激发态，激发态的叶绿素分 子很不稳定，当它回到基态时将会产生红色的荧光，同时叶绿素也很容易因为光照而降 解，因此其化学性质也极不稳定【l 5 1 。 2 2 叶绿素的重要地位 叶绿素的浓度是评价海洋水质、有机污染程度和探测渔场的重要参数。海域叶绿素 的时空变化包含着海区基本的生态信息，是同光照、温度、盐度以及风潮流等各种因素 密切相关的，因此它对于海区的各种科学研究具有重要意义，而单单靠测量船的走航取 样调查显然无法满足这一要求。遥感定量反演技术能获取大范围连续的海洋水色信息， 克服了常规方法的不足。利用卫星数据反演叶绿素浓度来评价海洋环境污染，尤其是预 测、探测赤潮，是一种有效的方法。而利用海洋遥感技术研究海洋初级生产力，有助于 了解海洋中碳的生物地球化学循环，有助于了解海区的环境质量，从而了解全球的碳循 环以及气候变化，对海洋生态、全球碳循环研究有重要意义u 6 1 。 海洋叶绿素是光合作用的主要光合色素。海洋叶绿素存在于浮游植物中，它能吸收 太阳光，进行光合作用，合成制造有机物。光合作用是植物在光合色素作用下吸收太阳 辐射能，把二氧化碳和水同化为碳水化合物的过程，光合作用大小与光合色素浓度密切 相关。 海洋叶绿素是浮游植物现存量的表征。浮游植物的现存量是用来描述浮游植物利用 光能进行光合作用将无机物转变为有机物时，有机物生产力的一个重要指标。人们习惯 于把浮游植物的现存量用单位体积或单位面积中生物的数量或质量表示。基本上所有的 浮游植物均含有叶绿素，因此海水叶绿素浓度直接反映了浮游植物数量，即反映海域初 级生产者的现存生物量。根据叶绿素的光学特征，叶绿素可分为叶绿素a 、叶绿素b 、 叶绿素c 、叶绿素d 共4 类。但由于所有的藻类浮游植物基本都含有叶绿素a ，而且其 5 第2 章叶绿素a 荧光测量原理 它3 类叶绿素进行光合作用所吸收的光能，最终都要传送给叶绿素a ，因此基本上用叶 绿素a 就可以表征浮游植物的数量和生长情况。因此测定海洋中叶绿素a 的含量，就可 以定量地了解海洋中浮游植物的情况。所以，海洋水色遥感中所说的叶绿素一般指的是 叶绿素a 。 海洋叶绿素是环境评价参量。海洋浮游植物繁殖速率也是水体营养程度的示踪物， 从而用于判断水体富营养程度。叶绿素浓度成为己衡量水体初级生产力浮游植物的生物 量和富营养化程度的最基本的指标，监测叶绿素浓度是水环境遥感监测的主要项目之 一。在海洋中叶绿素浓度还可以作为评价水质、营养状态、有机污染程度的一个重要的 环境参量。水体营养化程度高，浮游植物繁殖快，叶绿素浓度就高。过高的叶绿素可能 是将要发生赤潮的前兆。当水体富营养时，浮游植物大量繁殖，会使海水水体中的氧气 大量被消耗，造成海洋生物窒息死亡。赤潮现象就是这样发生的。有些赤潮生物能够释 放毒素，毒死吞食赤潮生物的鱼贝类，再通过食物链危害人类。大量的赤潮生物还能遮 蔽照射到水下的阳光，影响海洋生物的光合作用，进而影响海洋食物链的正常循环。 此外，叶绿素易于测量。叶绿素在浮游植物中所占的比例比较稳定，而且在实验室 易于测量。因此测定海洋中叶绿素含量，就可以定量地了解海洋中浮游植物的情况，因 此，海水中的叶绿素浓度的获取对海洋一大气系统中碳循环研究有重要意义，对海洋生 态系统中初级生产力的研究至关重要。 总之，研究海洋叶绿素及初级生产力分布待征可以了解大尺度时空范围内海洋初级 有机物的生产、分布和变化规律。通过研究海洋叶绿素可了解在一定时间内海洋有机物 的生产及其分布规律，分析水域生态环境的特征，评估生物资源蕴藏量及生产潜力，为 合理开发利用海洋生物资源和实行渔业生产农牧化等提供基础资料。调查研究海水中叶 绿素浓度，评估海域环境的初级生产力，对评价海域尤其是与人类活动密切相关的近岸 海域和岛屿周围海域的生态环境具有重要的科学意义。 2 3 低浓度物质测量技术 叶绿素荧光属于微弱光信号，当荧光物质受光照后，该物质的分子吸收了和它特征 频率相一致的光，使得通常在室温时处于基态最低振动能级的分子跃迁到第一单线电子 激发态或第二单线电子激发态的各个不同的振动和转动能级( 如图2 - 1 ( a ) ，( b ) ) 。然后 急剧地降落到单线第一电子激发态的最低振动能级。在这个过程中，它们和同类或其它 分子的撞击而消耗了相当于这些能级差的能量，因而是无辐射的跃迁( 图2 1 ( c ) ) 。处 6 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 于单线第一电子激发态最低振动能级的分子在平均寿命只有1 0 。8 秒的时间内，继而又下 降到基态的各个不同振动能级，并通过发出相应的光量子来释放能量，这就是荧光( 图 2 - 1 ( d ) ) 。 上述过程表明，由于激发光子的能量在无辐射跃迁中损失了一部分，因此发射光子 ( 即荧光) 的能量要小些。即： e 发= h y 发= _ h c ，= 芋。 以发7l激 e 发 九 式中办是普朗克常数，y 是频率，c 是光速，旯是波长。 l ( b )( c ) 吸收 尤辐射譬疋迁 i i ( a ) ( d ) 吸收 荧光 3单线第二 ：电f 激发态 v 叫 。单线第一 ：电予激发态 v - - - 0 3 2 单线基态 v z 0 图2 - 1 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示恿图 f i 9 2 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fe n e r g yl e v e lt r a n s i t i o n o fa b s o r p t i o ns p e c t r u ma n df l u o r e s c e n c es p e c t r u m 在吸光过程中，荧光物质的分子可由基态跃迁到几个不同的电子激发态，因此它可 以有几个不同的吸收带，但荧光仅发生在从单线第一电子激发态的最低振动能级降落到 基态的瞬间，因此，荧光只有一个峰带，吸收和荧光呈带状是由于基态和激发态都各自 有不同的能级分布。显然，不同的荧光物质由于它们的分子结构和能量分布的差异各自 显示出不同的吸收光谱和荧光光谱特征。 用丙酮萃取浮游植物体内的叶绿素。图2 2 是这种萃取液用分光光度计测出的吸收 光谱，它表明叶绿素在4 3 0 n m 和6 7 5 n m 附近有两个明显的吸收峰。 用9 5 的丙酮从菠菜中提取的叶绿素溶液以及在实验室培养的几种单细胞藻类海水 悬浮液，测量荧光光谱( 图2 3 ) 。 菠菜提取液中叶绿素a 是主要的，其荧光峰值在6 7 5 n m ，而藻体内的叶绿素a 的荧 光峰则略向长波方向移动，约在6 8 5 n m 附近。根据参考文献，叶绿素a ，b ，c 的荧光峰 7 第2 章叶绿素a 荧光测量原理 6 篇 6 钟耵57 液长( 皂馥欷) 图2 - 2 叶绿素的吸收光谱 f i 9 2 2a b s o r p t i o ns p e c t r u m o fc h l o r o p h y l l 囊) 图2 - 3 叶绿素萃取液和藻类的荧光光谱 f i 9 2 - 3f l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fe x t r a c tl i q u o ra n da l g a eo fc h l o r o p h y l l 长( 毫微米) 图2 - 4 叶绿素a ，b ，c 的荧光光谱 f i 9 2 4f l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fc h l o r o p h y l la ba n dc 分别为6 7 6 n m ，6 6 0 n m ，6 4 2 n m 。从实测曲线中可看到荧光峰的右侧很陡，而在左侧 显得较平缓，这是由于菠菜样品中除主要成分叶绿素a 外，还含有一定量的叶绿素b 。 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 同样，用过滤海水培养的三角褐指藻、角毛藻、微球藻、等鞭金藻的荧光光谱除了在6 8 5 n m 附近有明显的主峰外，还由于它们体内有一定量的叶绿素c ，使得在6 3 0 6 5 0 n m 附近有 小的次峰。 测量叶绿素a 时，放置激发滤光片使得激发光正处于叶绿素的吸收带上，同时也避 免了激发光中含有荧光的光谱成分。接收荧光发射的接收滤光片使得光电接收器件所接 收的光通量基本上反映了叶绿素a 的荧光。虽然从图2 4 可看到接收滤光片的光谱响应 曲线能阻挡叶绿素c 的荧光，但会把叶绿素b 的一部分荧光同时接收进来。 海中的浮游植物除了少数藻类含有叶绿素b 外，其余占海中绝大部分的藻类都只含 有叶绿素a 和叶绿素c 。同时海洋中除了偶尔有极少量的卟啉化合物外，几乎所有的其 它物质的荧光光谱都远离叶绿素的荧光带。因此，设置接收滤光片可以认为仪器所接收 的荧光基本反映了海中浮游植物体内叶绿素a 的含量。 液体中的溶解物质或悬浮物质在吸光后所发出的荧光强度与荧光物质的吸收系数、 含量及荧光效率有关。 图2 5 为激发荧光的示意图。厶为激发光强，为透过样品槽的透射光强，f 为荧 光强度。 根据比尔定律： ，= i o e 咄7 ( 2 1 ) 式( 2 1 ) 中s 是荧光物质的分子吸光系数，c 是荧光物质的浓度或含量，z 为液槽长度。 f 图2 - 5 液体的荧光 f i 9 2 - 5f l u o r e s c e n c eo fl i q u i d 当考虑到离液槽x 处的薄层幽的吸光和发射荧光的情况，可用( 2 2 ) 式表示： d f = 尼卿 ( 2 2 ) 式中为荧光物质的荧光效率( 或称量子产率) ，k 为荧光接收器的常数。 9 第2 章叶绿素a 荧光测量原理 d i _ - - i o e 一蒯。 1 一e 一韶出】 对于无限小薄层的稀液中e c c l x 是一个小量。 p 一日c d x 竺1 一e c d x ( 。e 一留出= 1 一e c d x ) 以= i oe c e 一纵出( 2 - 3 ) ( 2 3 ) 代入( 2 2 ) 并求积： f = 尼织叫鲫c l x = k 谚i o ( 1 _ e - 目c 1 ) ( 2 - 4 ) 事实上，上述结果与式( 2 4 ) 一致，当液体中荧光物质很稀少时( 如实验中，浓度c 1 0 。8 ，式( 2 - 4 ) 中e 一耐按幂级数展开，二次项以后可忽略不计，则式( 2 4 ) 可写成： f = k 谚i o e c l ( 2 5 ) 式( 2 5 ) 表明当荧光物质含量低，即cf 6 4 , 时，荧光强度，与其含量c 呈线性关系。 根据海中浮游植物的实际分布状况，无论是近岸水域或是大洋水，测量范围从 0 0 5 5 0 微克升是足够的。 当液体中荧光物质的含量过高时，由于自吸收现象和内滤光效应现象，使得荧光强 度不再随含量的增加而线性地增大。同时，从图2 可看到，叶绿素除了在4 3 0 r i m 附近有 一个吸收带外，还在6 7 0 n m 附近有一个与荧光峰有重叠的第二吸收带，因此，浓度过大 时，如果海水中存在着某种对激发光或发射荧光有吸收作用的杂质，同样能降低荧光强 度。 具有相等叶绿素含量的活藻液与萃取液其荧光强度是不相等的。这就是说，它们之 间不仅荧光峰略有偏移，并且量子效率有相当大的差别，实验表明，用同一中心波长为 6 9 7 n m 的滤光片来接收二者的荧光时，它们的荧光效率相差数倍。随着藻种的不同，其 荧光效率也有差别。显然，如果分别用中心波长为6 8 5 n m 和6 7 5 n m 的窄带干涉滤光片来 接收时，它们之间的荧光效率会相差更大。 综上所述，荧光强度是由很多因素确定的，它除了被测物质的含量、吸光系数、荧 光效率等数外，还与测量仪器中的光源强度、光电接收器件的转换系数、电子放大倍数 等因素有关。因此，荧光强度只是相对强度，在实际测量时，采用标准浓度的叶绿素萃 取液和活体藻液定标，然后根据工作曲线，通过测量海水样品的荧光值，直接求得浮游 植物体内叶绿素a 的含量。 1 0 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 在正常情况下，浮游植物细胞体内并不具有脱镁叶绿素，但作为浮游动物的排泄物， 海水中存在一定量的脱镁叶绿素，这种物质的荧光光谱与叶绿素的荧光光谱几乎完全相 同。因此荧光法所测的数据实际上包含了脱镁叶绿素。要分离这二种物质各自对荧光的 贡献，须对海水样品作酸化处理，这对于现场测量是做不到的。 荧光法对于完成大面积的海洋生产力调查是非常有效的手段。但由于浮游植物在海 中分布的不均匀性会带来误差，实验室用荧光法或分光法测量一般要取一千毫升以上的 水样，通过过滤、研磨、萃取后再进行测量，因此，取样处理过程的差异也是造成这两 种方法测量结果有所不同的原因之一。 温度对荧光有一定的影响。一般的荧光物质随着温度的降低而荧光效率增加。对于 活的藻体来说，由于温度实验要求严格的控制条件，提供可靠的实测数据。根据参考文 献，在0 - 3 5 的范围内，萃取液每升温1 荧光降低0 3 。天然海水中活藻在1 2 _ 3 0 的范围内，每升温l 荧光降低1 4 。 叶绿素的激发峰和荧光峰的波数差很大，可以使用窄带的干涉滤光片。但在低含量 的微光测量中，为提高测量灵敏度，要求滤光片截止得深，以避免极微弱的光泄漏。同 时，当水样受光照时，除了荧光物质的荧光发射外，还存在着与入射光波相同的液体分 子散射，无机悬浮物的粒子散射。此外，拉曼散射的红外线虽然与荧光相比要弱得多， 但波长却相对来说较靠近荧光带，甚至可能有部分的重叠。所以，荧光计中的干涉滤光 片截止度为零是很困难的，目前装置中滤光片的截止度为1 0 4 。故在沿岸浑浊海域，由 于大量泥沙颗粒的强烈散射，提高了测量本底值，使数据偏高。而在开阔海域的清洁水 时，这种影响可忽略不计。 2 4 叶绿素a 荧光现场测量原理 由于荧光测量法具有以下特点：灵敏度高、简便以及在样品不作任何处理的情况下， 能够现场实时测量物质的浓度；荧光仪器的输出量与被测样品的未知浓度成比例关系； 对荧光物质具有良好的鉴别性，使得在测量该物质时不受其它微粒物质的干扰等。因此 利用荧光测量法对海洋中浮游植物体内叶绿素a 含量进行现场测量是完全可行的，并且 相对比较方便。 根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理，在吸光过程中，荧光物质的分子 可以有几个不同的吸收带，但荧光只有一个峰带。吸收和荧光呈带状是由于基态和激发 态都各自有不同的能级分布。显然，不同的荧光物质由于它们的分子结构和能量分布的 第2 章叶绿素a 荧光测量原理 差异，各自显示出不同的吸收光谱和荧光光谱特性。叶绿素a 的两个明显的吸收光谱带 的峰值分别在4 2 0 n m 和6 6 5 n m 附近。浮游植物体内叶绿素a 的存在基本上决定了自然 密度浮游植物的吸收光谱特性，浮游植物的两个强烈吸收光谱带峰值波长基本上在 4 4 0 n m 和6 7 0 n m 附近【1 7 】。 当用一种波长的光照射某种物质时，该物质会在极短时间( 1 0 一s ) 内，发射出较照 射波长为长的光( 如可见光) ，这即称为荧光。对某一待测物质，只要选择一组合适的 激光滤光片和荧光发射滤光片，即可将物质发射的荧光和激发光分离，从而达到检测荧 光信号的目的。其所发射的荧光强度f 与物质的摩尔吸收系数、浓度厌荧光效率巾、 样品的光程b 、荧光仪器常数及激发光强度，有密切关系。根据比耳定律，物质的荧 光相对强度可用下式表示【1 8 1 ： f = 尼甄( 1 一p 肋) 用于海洋环境检测的水下荧光计一般采用对数工作方式。将上式取对数得出物质的 浓度f 与物质的荧光强度f 的关系式： c = a b l o g ( d f ) 当测量物质和仪器确定后，式中彳：三子l o gk 。，b ：i 2 3 ，d ：k 。，皆为常数。因 u e u 此，通过测量物质的荧光强度，即可得出该物质的浓度。 2 5 本章小结 本章主要介绍了叶绿素以及叶绿素重要地位，说明进行叶绿素a 测量的重要意义和 作用，同时介绍了叶绿素a 荧光发光原理，分析了叶绿素a 吸收光谱和藻类的荧光光谱 特征，说明使用荧光法测量低浓度叶绿素a 的可行性和有效性。最后通过介绍叶绿素a 现场测量原理，说明叶绿素a 浓度与荧光强度的相对关系。根据叶绿素a 荧光测量原理， 下一步进行测量电路的硬件部分和软件部分设计。 1 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第3 章叶绿素a 荧光计硬件设计 由叶绿素a 吸收光谱可知，叶绿素a 对一定波长的蓝光信号具有吸收作用，因此通 过采用该波长的蓝光光源对叶绿素a 进行照射，可以促使叶绿索a 产生波长更长的红色 荧光信号，通过荧光信号的强度可以获得叶绿素a 的相对浓度值。基于此原理，本文对 叶绿素a 荧光计系统进行了详细的设计，其主要包括光通路部分及测量与处理电路部分， 通过对各功能模块的分析，完成相关器件的选型和结构设计。 图3 1 叶绿素a 荧光计功能模块图 f i 9 3 - 1f u n c t i o nm o d u l e sd i a g r a mo f c h l o r o p h y l laf l u o r o m e t e r 图3 - 1 中给出了叶绿素荧光计系统的功能模块图，其主要工作流程如下，首先通过 激发光源对叶绿素a 溶液进行照射，然后通过接收光路接收叶绿素a 受激产生的荧光信 号，并将其转换为电路所能处理的电信号，并通过检测和处理电路进行信号的相应处理， 最后通过通讯电路上传给上位机。每个功能模块的具体功能将在以下部分进一步介绍。 3 1 叶绿素a 荧光计光通路设计 叶绿素a 实时检测系统主要利用高亮度l e d 激发光源对浮游植物进行照射，使其内 部叶绿素a 受激产生红色荧光信号，从而利用光敏器件接收荧光信号以及完成光信号至 电模拟信号的转换。本部分主要介绍系统光路主要机械结构、激发光源的选型，激发光 源的控制以及荧光信号的接收电路。 对于激发光源以及接收光路的设计是本系统中的一个关键内容，由于叶绿素a 本身 含量较低，因此需要保证激发光信号的强度足以保证最低限浓度下叶绿素a 荧光信号的 有效激发，但是长时间强光照射又会导致叶绿素a 的降解，因此需要选择合适的照射方 式。接收光路需要具有较高的灵敏度，因为即使是强光下激发的叶绿素a 荧光信号，其 信号值依然非常小，所以接收光路的高灵敏度可以保证最低限荧光信号可以被接收，从 而保证整个系统设计的有效性。 】3 第3 章叶绿素a 荧光计硬件设计 3 1 1 光学通路机械结构设计 图3 2 系统光通路 f i 9 3 - 2o p t i c a lp a s so fs y s t e m 图3 - 2 显示了本系统的主要光学通路的机械结构，主要包括激发光源、光敏器件及 相应的光学聚光和滤光器件。整个光学通路结构比较紧凑，其激发光源采用发光二极管， 由于发光二极管产生的光源具有发散特性，因此激发光源需要经过凸透镜进行聚光，使 得产生的光强能会聚于一点，并且该点位于靠近光敏器件接收孔的位置，如此能最大限 度的利用l g d 产生的光强，并使能接收到的荧光信号最强。l e d 光源激发产生的荧光信 号相对较弱，因此也需要经过凸透镜进行会聚，同时由于进入接收孔的光还包括环境光 以及除叶绿素a 外其它物质受激产生的荧光，因而本接收光路中加有滤光片，以尽量减 小噪声光源的干扰。 3 1 2 激发光源电路 由于不同物质具有不一样的吸收光谱和荧光特征光谱，因此在本系统中激发光源的 选取非常重要。而以往国内研究大多采用氦氖激光器或氙灯，但其存在供电电压高、稳 定性差、体积大、功耗大、使用寿命短以及对电路干扰大等缺点。因而本系统针对叶绿 素a 的光学吸收特性，选用超高亮度的蓝色发光二极管( l e d ) 。使用l e d 作为激发光源 主要有以下优点： l e d 功耗较小，比较适合现场在线测量仪器使用。 体积较小，有利于系统设计的小型化和便携式。 成本低。 电路设计简单。 】4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 ( 1 ) 发光二极管特性 1 极限参数 允许功耗p m ：允许加于l e d 两端的正向直流电压与流过它的电流之积的最大 值。超过此值，l e d 发热、损坏。 最大正向直流电流i f m ：允许加的最大正向直流电流。超过此值可损坏二极 管。 最大反向电压v r m 所允许加的最大反向电压。超过此值，发光二极管可能 被击穿损坏。 工作环境t o p m ：发光二极管可正常工作的环境温度范围。低于或高于此温度 范围，发光二极管将不能正常工作，效率大大降低。 2 相关使用参数 光谱分布和峰值波长：发光二极管所产生的光源并非单一波长，其波长大 体按图3 - 3 所示。 炙i 光 光 强 一 b 图3 - 3 发光二极管波长分布 f i 驴- 3w a v e l e n g t hd i s t r i b u t i o no fl i g h te m i t t i n gd i o d e 由图可见，该发光管所发之光中某一波长入。的光强最大，该波长为峰值波长。 发光强度i v ：发光二极管的发光强度通常是指法线( 对圆柱形发光管是指其轴线) 方向上的发光强度。若在该方向上辐射强度为( 1 6 8 3 ) w s r 时，则发光1 坎德拉( 符 号为c d ) 。由于一般l e d 的发光二强度小，所以发光强度常用毫坎德拉( m c d ) 作单位。 光谱半宽度a 入：它表示发光管的光谱纯度。是指图3 - 2 中1 2 峰值光强所对应 的波长之间隔。 半值角e 和视角：em 是指发光强度值为轴向强度值一半的方向与发光轴向 ( 法向) 的夹角，半值角的2 倍为视角( 或称半功率角) 。 1 5 第3 章叶绿素a 荧光计硬件设计 图3 - 4发光二极管发光强度角分布 f i 驴- 4a n g u l a rd i s t r i b u t i o no fl u m i n o u si n t e n s i t yo fl i g h te m i t t i n gd i o d e 图3 4 给出的二只不同型号发光二极管发光强度角分布的情况。中垂线( 法线) 的 坐标为相对发光强度( 即发光强度与最大发光强度的之比) 。显然，法线方向上发光强 度最大，离开法线方向的角度越大，相对发光强度越小。由此图可以得到半值角或视角 值。 正向工作电流i f ：它是指发光二极管正常发光时的正向电流值。在实际使用中应 根据需要选择i f 在0 6 i f i t l 以下。 正向工作电压v f ：参数表中给出的工作电压是在给定的正向电流下得到的。一般 是在i f = 2 0 m a 时测得的。发光二极管正向工作电压v f 在1 4 - 3 v 。在外界温度升高时， v f 将下降。 l i j 三 - 1 f 1 5一l o