（化学工艺专业论文）改进溶胶凝胶法和吸附法固定化醇脱氢酶的研究.pdf

摘要 传统溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 法进行酶的固定化具有酶活损失大和传质阻力大的 缺点。本文以聚乙二醇( p e g ) 为多功能试剂对传统s o i g e i 过程进行改进，以 提高固定化甲醇脱氢酶( a d h ) 的活性。以p e g 为模板剂修饰凝胶，使凝胶的孔 径由7 8 n m 增大到9 3 n m ，比表面积也由4 6 3m 2 g 。1 增加到5 3 4 m 2 g ，底物 在凝胶孔中的有效扩散系数提高到原来的1 4 倍。用修饰后的凝胶固定化的 a d h 的活性比传统凝胶固定化的a d h 的活性高。此外，利用活化p e g ( s c p e g ) 为修饰剂对a d h 进行修饰，以提高a d h 在固定化后的活性，a d h 的修饰度 约9 0 。对修饰后的a d h 进行固定化，a d h 的活性比未经修饰的a d h 的活 性有明显提高。由甲醛转化为甲醇的酶促反应比较两条提高酶活途径下的四种 固定化的a d h 的活性；未修饰凝胶固定化修饰a d h ( 固定化a d h i - i i ) 活性 修 饰凝胶固定化修饰a d h ( 固定化a d h i v ) 活t t 修饰凝胶固定化未修饰a d h ( 固定化a d h i i ) 活性 传统固定化方法下的a d h ( 固定化a d h i ) 活性。 而且固定化a d h i i 、a d h h i 、a d h i v 的稳定性均高于固定化a d hi 的稳定性。 可见凝胶的修饰以及a d h 的修饰均可提高固定化a d h 的活性和稳定性，但是 a d h 的修饰较凝胶的修饰对提高a d h 的活性效果明显。 另外，为了比较吸附法与传统s o l - g e l 包埋法固定化a d h 的优劣，对两种 方法固定化的a d h 的活性进行了比较。采用大孔硅胶对a d h 进行吸附，得到 吸附动力学曲线和吸附等温线，a d h 在硅胶上的吸附等温线可以用l a n g m u i r 方程拟合。并且分析了硅胶孔径对a d h 吸附量的影响，得到大孔径的硅胶对 a d h 有着更大吸附量的结论。由甲醛转化为甲醇的酶促反应动力学实验测得的 反应初速度及拟合得到的米氏常数表明吸附法固定化a d h 表现出比s 0 1 - g e l 法 固定化a d h 高的催化活性。 关键词：溶胶凝胶，聚乙二醇，吸附，固定化，甲醇脱氢酶 a b s t r a c t e n z y m ei m m o b i l i z a t i o nb yt r a d i t i o n a ls o l g e la p p r o a c hs u f f e r s f r o mt h e d r a w b a c k so f r e l a t i v e l yh i g he n z y m ea c t i v i t yl o s sa n dh i g hm a s st r a n s f e rr e s i s t a n c e ， s o l u t i o n st ot h i s p r o b l e m h a v e b e e n t e n t a t i v e l ye x p l o i t e dh e r e i n ，p e g s w e r e e m p l o y e da sm u l t i f u n c t i o n a la d d i t i v e st oe n h a n c e i m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t i e s ：1 t e t r a e t h y l o r t h o s i l i c a t e ( t e o s ) d e r i v e dg e l i sm o d i f i e di nt h e p r e s e n c e o f p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g , m o l e c u l a rw e i g h t6 0 0 ) ，t h ee f f e c t so f p e g a d d i t i o nt ot h e p r e c u r s o rs o l u t i o no nt h em i c r o s t r u c t u r eo ft h eg e la r es t u d i e d ，t h es i z eo fp o r e si s i n c r e a s e di nt h er e s u l t a n tg e l so nt h eb r i d g e - l i n k a g eb e t w e e np e ga n dp r e c u r s o r , t h u sd i f f u s i o nr a t e si s c o m p a r a b l y i n c r e a s e dt 0 1 4t i m e s 2 p e gs u c c i n i m i d y l c a r b o n a t e ( s c - p e g m o l e c u l a r w e i g h t5 ，0 0 0 ) i s u s e dt o m o d i f y a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( a d 玛b e f o r eb e i n gi m m o b i l i z e di nt h eg e li no r d e rt oa v o i dt h e d a m a g eo fe n z y m ei ns o l - g e lp r o c e s sa n da l s oi m p r o v e t h ep r o p e r t i e so f g e l ss u c h a s h y d r o p h i l i c i t y t h ea c t i v i t i e so f d i v e r s e i m m o b i l i z e da d hh a v eb e e ni n v e s t i g a t e db y t h ee n z y m a t i cr e a c t i o no f c o n v e r t i n gf o r m a l d e h y d ei n t om e t h a n o l ：u n m o d i f i e dg e l i m m o b i l i z e dm o d i f i e da d h ( i m m o b i l i z e da d h i i i ) m o d i f i e dg e li m m o b i l i z e d m o d i f i e da d h ( i m m o b i l i z e da d h i v ) m o d i f i e d g e li m m o b i l i z e d u n m o d i f i e da d h ( i m m o b i l i z e da d hi i ) u n m o d i f i e d g e l i m m o b i l i z e du n m o d i f i e da d h ( i m m o b i l i z e d a d hi ) a n dt h es t 曲i l i t i e so f i m m o b i l i z e d a d h i i 、a d h i 1 、a d h i va r eh i g h e rt h a nt h a to fi m m o b i l i z e da d hi t l l i sr e s u l ti n d i c a t e dt h a te n z y m e a c t i v i t i e sa f t e rt h em o d i f i c a t i o no fg e la n dt h em o d i f i c a t i o no fa d h r e s p e c t i v e l y s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e d t ot h en a t i v ei m m o b i l i z e da d h ，b u tm o d i f i c a t i o n o na d hi sm o r ee f f e c t i v e i na d d i t i o n i no r d e rt o c o m p a r et h ee n z y m e i m m o b i l i z a t i o nd i f f e r e n c e s b e t w e e na d s o r p t i o ni m m o b i l i z a t i o np r o c e s sa n ds o l g e le n c a p s u l a t i o np r o c e s s a d h i sr e s p e c t i v e l yi m m o b i l i z e do n t om a c r o p o r o u ss i l i c ac a r r i e rb ya d s o r p t i o na n di n t o m i c r o p o r o u ss i l i c ag e lb ys o l g e le n c a p s u l a t i o n t h r o u g ht h es t u d yo fa d s o r p t i o n k i n e t i c sa n da d s o r p t i o ne q u i l i b r i u m ，t h ek i n e t i c sc u l v ea n da d s o r p t i o ni s o t h e r ma r e o b t a i n e d t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r mi sf i a e db yl a n g m u i re q u a t i o n t h ee f f e c to fp o r e s i z eo nt h e a d s o r p t i o nc a p a c i t y i se x a m i n e d t h e s o l g e le n c a p s u l a t e d a d hi s p r e p a r e d w i t hs i l i c am a t r i x t h e c a t a l y t i c a c t i v i t i e so ft h ea b o v e m e n t i o n e d i m m o b i l i z e da d h st o w a r d st h ec o n v e r s i o no ff o r m a l d e h y d ei n t om e t h a n o la r e c o m p a r e d t h e i n i t i a lr a t e so f e n z y m a t i c r e a c t i o n c a t a l y z e db ya d s o r p t i o n i m m o b i l i z e da d hi s h i g h e rt h a nt h a tc a t a l y z e db ys o l - g e le n c a p s u l a t e da d h ， w h e r e a st h em i c h a e l i sc o n s t a n t so ft h ef o r m e ra r e1 e s st h a nt h a to ft h e1 a t t e lt h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fa d s o r p t i o ni m m o b i l i z e da d hi sh i g h e r 血a l lt h a to f s o l - g e le n c a p s u l a t e d a d h k e y w o r d s ：s o l g e l ，p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，a d s o r p t i o n ，i m m o b i l i z a t i o n ，a l c o h o l d e h y d m g e n a s e ( a d h ) + 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤洼盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：夤葛l 移 签字日期： 二口口争年月，a 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解叁盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权盘注盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：黄私苇 导师签名 签字日期：如升年月，0 日签字日期：土肿争年月乒日 前言 刖吾 酶作为专一、高效的生物催化剂具有非常广泛和良好的应用前景。相对于 游离酶，固定化酶具有易回收利用、可连续操作以及产物分离简单的优点。目 前酶的固定化方法包括物理吸附、共价键合、化学交联和包埋法。吸附是最容 易实现的方法，对酶活性影响较小，但要求基质孔径与被吸附分子尺寸相匹配， 且生物分子与吸附剂问的作用力往往很弱，易造成流失。共价键合法要求酶分 子具有与基质能发生反应的特殊的官能团，且固定化后的酶分子的取向是固定 的，使底物与酶反应活性点间的接触受到一定限制。另外，共价键合和化学交 联过程所发生的剧烈化学反应往往对酶的存活是极其不利的。相比之下，溶胶 凝胶( s o l g e l ) 包埋法具有独特的技术优势。该方法的突出优点是反应条件温和、 易控，制得的材料均匀性好、纯度高，可制得薄膜、块状、纤维等多种形式， 减小酶的热和化学变性的可能性。 然而，由于s o l - g e i 法固定化酶的研究历史较短，从最终结果看，大多数酶 通过s o l - g e l 法固定化以后，活性均会大幅度降低，如( 1 ) 由于传统的凝胶基 质的微观结构引起的底物与产物扩散缓慢、酶与底物的不易接触。固定化酶的 凝胶孔径需满足两方面的要求：孔应足够大以使体系分子( 包括缓冲液中的离 子、底物、产物以及分析物分子) 能不受限制地传递。而传统的凝胶材料微孔 性质导致底物分子扩散速率较低，与酶不易接触，从而影响酶活的充分利用； 孔又不能太大，以防止固定化的酶分子的流失和环境中存在的诸如微生物等杂 质的侵入。因此，调节出适当的凝胶孔径及有序的孔道结构是非常有意义的。 而传统的s o l - g e l 材料的孔属于微孔，因此需要增大凝胶孔径以提商底物与产物 分子在孔中的扩敖。( 2 ) 由于酶的微环境的改变引起酶活性的下降等。酶只有 当其分子本身具有一定的构象时才能表现出佬化活性。酶分子的构象主要由静 电作用力、范德华力、疏水作用以及氢键构成一个复杂的网络来维持。在酶的 固定化过程中，由于s i 0 2 凝胶粒子与酶的多肽链之间存在的相互作用以及体系 中甲醛、甲酵等有机物的存在会破坏维持酶构象的复杂网络，从而引起酶活的 降低。 针对上述s o l - g e l 法固定化酶过程中存在的酶活大幅度降低的缺陷，目前已 有多种方法用于提高酶在凝胶中的活性。其中的一条途径是通过增大凝胶的孔 径以改善底物和产物在凝胶孔中的扩散。模板技术已经成为增大材料孔径是有 效的工具之一，通过调变聚合物的大小和修饰胶体颗粒表面能够更有效地控制 凝胶的结构性能。通常使用的模板剂包括表面活性剂和非表面活性剂。由于大 部分表面活性剂模板含有破坏酶的试剂，因此在酶的固定化过程中多采用生物 相容性好的非表面活性剂作为模板。p e g 作为非表面活性剂的一种，具有亲水、 灵活、不带电、化学性质稳定且与酶相容等特点。目前以p e g 作为s o l - g e l 过程 模板荆的调孔机理已有大量的研究。建立在大量的p e g 调孔的理论基础上，本 文采用p e g 作为模板剂调节用以固定化a d h 的凝胶的孔径，并研究了固定化 a d h 的活性。 提高固定化酶活性的另一条有效途径是对酶进行修饰后再将其固定化。酶 的修饰可以掩盖酶的一些缺陷，同时赋予修饰酶新的功能与性质。在酶的固定 化过程中，利用活化p e g ( s c p e g ) 对酶进行修饰可以改善a d h 与凝胶基质的 生物相容性，从而减少a d h 在固定化过程中的活性损失。 以上是对s 0 1 g c l 包埋法进行改进，以达到提高固定化酶的活性的目的。此 外，为了比较固定化方法的不同对固定化酶活性的影响，本文对吸附法与s o l 鸣d 包埋法进行比较。因为在酶的众多固定化方法中，吸附固定化方法虽然存在酶 容易脱落的缺点，但在保持酶活性方面具有一定的优越性。吸附法中的吸附基 质一般孔径较大，反应中底物在其中的扩散阻力小，从而得到较高的固定化酶 活性。因此本文采用大孔硅胶对a d h 进行吸附，比较了吸附法固定化a d h 与 s 0 1 g e l 包埋法固定化a d h 的活性。 本文中a d h 的活性均通过以下其催化甲醛还原为甲醇的酶促反应的初速 度和米氏常数来评价： a d h n a d h + h c h o + h + 二= = = = n a d + + c h 3 0 h 第一章文献综述 1 1 酶的固定化方法概述 第一章文献综述 酶作为专一、高效的生物催化剂具有非常广泛和良好的应用前景。由于酶 的价格昂贵，游离酶难以回收利用，将酶进行有效的固定化一直是酶工程领域 的研究热点”j 。 迄今为止，已经开发出的传统的酶固定化技术有菇价键合、交联、物理吸 附以及包埋法【2 j 。共价键合法要求酶具有与基质能发生反应的特殊的官能团， 且固定化后的酶分子的取向是固定的，使底物与酶反应位点间的接触受到一定 限制。此外，共价键合和交联过程所发生的剧烈化学反应对酶的存活十分不利。 吸附法操作简便，而且对酶的活性没有太大的影响。但要求基质孔径与被吸附 分子尺寸相匹配，且酶与吸附剂表面结合力弱，易造成流失。而包埋法又分为 将酶包埋于有机聚合物基质中和将酶包埋于溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 基质中等。将酶 包埋于有机聚合物中则会导致酶的生物活性丧失。相比之下，s 0 1 g e l 法具有独 特的技术优势。s o l - g e l 法是物理包埋过程，凝胶网络是围绕酶逐渐形成的，对 酶的尺寸无特殊要求：温和的反应条件和凝胶的非晶态结构都有利于保持酶的 结构完整性和表面微观结构的各向同性；常用的基质材料如二氧化硅比有机聚 合物材料更具有化学和热稳定性，良好的坚固性、抗磨性。另外，由于基质含 有足够的水，生物酶处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，与在 水溶液中有相似的行为 3 】。 本文着重对s o l - g e l 包埋法与吸附法固定化酶进行了研究。 1 2 酶的包埋固定化方法 1 2 i s o l g e l 包埋法固定化酶的研究进展 早在2 0 世纪8 0 年代中期，人们就已经发现利用s 0 1 g e l 法可以将有机物分 子掺杂于无机基质中，并可保持有机物分子的物理化学性质不变。近年来，把 酶包埋到多孔的无机基质中已经得nt 广泛的关注。s o l g e l 过程以其条件温和、 适用范围广等优点为生物活性物质的固定化开辟了一条新颖高效的途径。1 9 9 0 第一章文献综述 年，以色列的b r a u n 等人 4 】利用s o l 唱e 1 法将碱性磷酸酶引入s i 0 2 基质中，成功 制取了具有一定生物活性的材料。s 0 1 g e l 法固定化酶技术的开发也从此进入了 一个迅速发展的阶段。美国、日本、欧洲等国家和地区相继投入大量的人力和 物力进行研究和开发，迄今为止，许多类型的酶如脂肪酶、脱羧酶、胰蛋白酶、 天冬酰胺酶以及单氨氧化酶等均可被包埋在s o i g e i 基质中，并保持了相当高的 构象完整性、催化活性和热稳定性吼 1 2 2 s o l g e l 法固定化酶的基本原理 s o l g e l 法一般是金属或半金属醇盐在水、助溶剂( 通常为醇) 及催化剂( 通 常为酸或碱) 存在下，发生水解和缩聚反应，释放出水和相应的醇，形成三维 氧化物网络，得到湿凝胶，凝胶经过陈化、室温干燥可得到干凝胶 6 】【7 1 。 在s o l g e l 过程中，醇盐的性质、各组分的用量及比例、催化剂和温度等因 素均对最终形成材料的性质有影响，控制一定的条件可以得到所需结构的基质。 s 0 1 g e l 固定化酶的过程如下： ( 1 ) 水解、缩合形成溶胶：绝大多数s o l 噌e l 技术是用低分子量的金属烷氧基化 合物如m ( o r ) x ( m 为s i ，t i ，a l 等，其中使用最多的是s i ；r 为甲基、 乙基、异丙基等) 作为前驱体和水反应。由于硅氧烷和水不互溶，通常需 加入相应的醇作为共溶剂。溶胶形成的化学反应有3 种类型：酯的水解、 硅羟基之间的缩合、硅羟基与酯的缩合。 ( 2 ) 凝胶化：在缩聚的初始阶段，胶体粒子表面负电荷之间的排斥作用使胶粒 稳定。但随着水解和聚合过程的进行，水被消耗，溶剂蒸发，胶粒浓度随 之增大，使这种稳定作用减弱从而发生凝胶化。在溶胶转化为凝胶的过程 中( 即凝胶化之前) 将酶加入，待溶胶发生凝胶化以后，酶就被包埋于凝 胶基质中。 ( 3 ) 老化和干燥：凝胶化发生后，反应继续进行，凝胶的结构和性质还将进一 步变化，这一阶段称为老化。将凝胶中的水和溶剂的蒸发掉。得到干凝胶， 这一过程中，由于毛细管力作用使凝胶网络聚集，凝胶体积会有一定程度 的收缩。 1 2 3 s 0 1 g e l 法固定化酶的优点与存在的问题 酶的s o l g e l 固定化方法与吸附法、交联法和化学键合法等传统的固定化方 法相比具有以下几个突出优点：( 1 ) 酶作为具有三维有序结构的有机物质，可 以从分子水平控制s 0 1 g e l 过程，从而形成具有特殊组装方式和多级结构特点的 第一章立献综述 生物矿化凝胶。( 2 ) s 0 1 g e l 法包埋酶是物理结合过程，它可使酶的微结构得以 很好的维持，而化学键合法则要求酶分子需要有一定的取向，从而可能会阻碍 底物分子进入酶分子的活性位点而影响其活性【8 l ：( 3 ) s 0 1 g e l 法包埋酶的过程 是在溶胶转变为凝胶的过程中逐步把酶包埋在基质中的，因此，酶对基质无特 殊要求，而吸附交联法则耍考虑基质孔与酶的适配性。s o i 一剥法基质对酶也无 特殊要求，而化学键合法则要求酶要有一定的功能基团【9 l ；( 4 ) s 0 1 g e l 法同时 克服了吸附交联法易使酶流失和化学键合法易使酶降解的缺点；( 5 ) 基质热稳 定性好，其耐热温度远远超过酶的热分解温度，且具有化学惰性；( 6 ) 基质具 有一定的刚性，从而提高了酶的热稳定性，另外，由于基质的笼效应【8 】，固定 在基质中的酶一般不会渗出，也不易结块和折叠；( 7 ) 由于基质可以吸附和包 容足够量的水，酶分子处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，并 呈现出与游离酶相似的行为；( 8 ) 根据需要可以控制基质孔的比表面积、结构 尺寸，并可以对基质的前驱体进行各种化学修饰；( 9 ) 含酶基质可以制成薄膜 状、块状、粒状或涂覆于其它载体的表面。( 1 0 ) 基质具有良好的生物相容性和 抵抗微生物侵袭的能力。 s o l - g e l 固定化酶的研究揭示了许多独特性。然而，研究确实也存在一些问 题【i “。主要体现在下述方面： ( 1 ) 凝胶结构与性能。凝胶基质的刚性强而柔性差，易破碎：在凝胶老化过程 中经常导致大幅度的孔倒塌【3 】，这在高乙醇含量s 0 1 驯过程中尤其成问题。 除了孔隙率的明显减小以外，基质压缩还会使构型敏感的酶失活，降低酶 的括性。虽然采用低乙醇含量的方法或加入葡萄糖，聚( 乙烯基乙醇) ，聚 ( 甘油硅氧烷) 等添加剂或进行干燥可以有较大的改善，但是在水前驱体 比率很大情况下，翻备凝胶仍然会遇到严重的倒塌问题。对于这方面的问 题还需要对s 0 1 g e l 机理作进一步研究，以更好地对其进行控制。此外，基 质的孔径偏d , l i i l ( 一般均小于1 5 r i m ) 且分布较宽，内扩散阻力大，底物 与产物在基质中的扩散速度慢。底物和产物扩散缓慢再加上凝胶的老化效 应控制方面的困难意味着重复地制备结构适宣、酶活性和稳定性高、机械 强度大的含酶凝胶到目前为止还面临着不少来自理论和实践两方面的困难 和挑战。 ( 2 1 凝胶制各所用前驱体多为烷基硅酸盐、烷氧基烷基硅烷，水溶性差需助溶 剂和催化剂，而助溶剂和催化剂都会对酶活性带来不利影i 自。水解反应释 放出的醇容易引起酶分子的折叠和团簇化而使二级和三级结构受到一定稗 度的破坏，醇蒸发在干凝胶形成时会引起较大幅度的收缩和孔塌陷。日阿， 采用低乙醇含量过程，这样即便对于高度敏感的物质也是有效的，对酶来 第一章文献综述 说其固定化率分别可达4 0 9 0 和2 0 9 0 。另外，采用生物相容性好的有 机大分子( 如活化p e g ) 对酶进行化学修饰，也可以减轻包埋酶的变性和 失活。 1 2 4 凝胶孔径的调控 1 2 4 1 凝胶孔径调控的研究进展 针对目前凝胶孔径和性能方面存在的缺陷，可以采用添加表面活性齐q 和非 表面活性剂模板剂【1 1 】对s i 0 2 凝胶进行修饰以达到调控凝胶孔径的目的，提高底 物及产物在凝胶中的扩散速率，且使底物与酶充分接触，提高反应速率和效率。 人们注意到生物矿化进程中分子识别和分子自组装及复制构成了五彩缤 纷的自然界，有意识地利用这一自然原理来指导特殊材料的台成【“j 。最初，人 们利用对s 0 1 g e i 化学的认识采用表面活性剂作模板剂对水解缩聚反应过程和溶 胶表面进行修饰以达到在一定范围内获得可控结构和可控粒度的凝胶材料的目 的。最近，a t t a r d 眩i 等人报道了利用非离子表面活性剂作为稳定的预组织模板 合成六角晶状中孔s i 0 2 材料，其形成机理类似于b e c k 等人最早提出的胶束导 向理论。液晶模板荆在反应混合的环境中形成胶柬并聚合为胶棒，胶棒在c 轴 方向按六边形堆积，然后这些s i 0 2 簇团或靠静电或靠分子间作用力围绕在这些 胶棒周围迸行堆积。y a n g i l 2 】等人将讵硅酸乙酯t e o s 与十六烷基三甲基氯忧铵 ( c t a c ) 的酸性水溶液混合，使其在新解离的云母表面上于8 0 0 下成核生长，制 备出具有取向生长的连续的中孔s i 0 2 薄膜，并由此提出表面胶团模板理论。 a k s a y 佗i 等人迸一步将此法扩展到其它介质表面，其结果是在憎水的石墨表面 也得到了连续的中孔薄膜，并在s i 0 2 表面得到了具有等级结构的中孑ls i 0 2 薄 膜。王金患等【1 3 l 利用两种表面活性剂作为双重模投技术合成有序介孑u 大疆二氧 化硅材料，具有高的比表面积和有序的孔通道，所有的通道都是相互连通的， 有助于物质的吸附和输运过程，在催化、分离和电子器件方面具有重要的应用 价值。具有不同大小的物种可以进入通道中并发生相互作用，为孔材料的应用 创造了条件。 利用表面活性剂虽然在增大孔径方面能起到明显的效果但是出于大部分 表面活性荆含有破坏酶的试剂，因此有人利用非表面活性剂代替表面活性剂作 模板1 1 1 4 1 。非表面活性荆不仅对中孑l 结构的形成来说是比较经济的模板，而且 它与许多酶都相容。如在用正硅酸乙酯t e o s 或正硅酸甲酯t m o s 包埋碱性磷 酸酶的过程中加入d 葡萄糖、d 麦芽糖、二苯甲酰酒石酸等非表面活性剂作为 模板剂，得到的凝胶孔径约3 n m ，孔体积约0 6 e r a 3 坦，比传统的凝胶孔( 孔径 6 第一章文献综述 1 5 r i m ，孔体积s o 2 5 c m 3 g ) 大。同时得到相互连通的孔道结构，且互连着的孔 尺寸小，可防止酶的泄漏。这样既有利于酶与底物之间的充分接触，同时也有 助于底物与产物的扩散，从而达到提高反应效率的目的：另外它与碱性磷酸酶 以及其它酶的相容性好，可以避免酶活性的显著降低。结果表明：基质中含有 d - 葡萄糖模板的酶的活性比不含d 一葡萄糖的酶活性大大提高了。不含模板的 s 0 1 g e l 基质，由于它的孔径和比表面积相对小。被包埋的酶的活性受底物和产 物分子较低的扩散速率的限制。在有些情况下，大体积的反应物分子也许永远 接触不到被包埋的酶。同时，随着模板浓度的提高，孔体积将增大，这样使被 包埋的酶更易接触且底物分子的流动性增强，活性提高。 利用非表面活性剂聚乙二醇( p e g ) 作模扳剩控制纳米凝胶材料的结构是 近年来s 0 1 g e l 化学发展的新动态，通过调变聚合物的大小和修饰胶体颗粒表面 能够更有效地控制材料的结构及性能【15 1 。最近，孙继红等人在醇水体系中以p e g 为模板剂，通过超临界相，以及高温煅烧除去p e g 的方法成功地合成出层状相 中孔分子筛，经p e g 修饰的材料的孔径比修饰之前有了明显提高，最可几孔径 达到7 9 姗【1 6 , 1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 。p e g 是一种线性、亲水、灵活而不带电的分子，它的 结构式为：h o 一( c h 2 c h 2 0 ) 。- - o h ，p e g 具有很好的与酶相容的特性。所以本 研究中采用p e g 为模板剂，以达到增大凝胶孔径的目的。 利用模板剂调节凝胶孔径已有大量研究 2 1 , 2 2 , 2 3 , 2 4 , 2 5 】，但是到目前为止还没 有人对模板剂作用后的凝胶固定化甲醇脱氢酶( a d h ) 的过程队及固定化后a d h 的活性进行研究。因此本研究中采用p e g 作为模板剂调节凝胶的孔径，并对 p e g 模板剂修饰后的凝胶固定化甲醇脱氢酶( a d h ) 的活性进行研究。 1 2 4 2 p e g 在s o l 唱e 1 过程中的作用机理 溶胶颗粒在凝胶化过程中的成长分为三个过程，即溶胶粒子的形成与生 长；小簇团的生长和大簇团的生长；凝胶化。而p e g 的加入，一方面限制了溶 胶粒子本身的生长，另一方面又促迸了经p e g 包覆的粒子簇团之间的团聚和交 联，使簇团颗粒问的交联有序化”6 】，逐渐形成环状网络结构【2 0 1 2 6 。 以t e o s 为前驱体，在溶胶形成早期，加入p e g 的溶胶粒子与未加入p e g 的溶胶粒子是相互独立和分散的，粒子大小仅为几个纳米，溶胶的早期是溶胶 粒子的形成过程；经过一段陈化时间，未加入p e g 的溶胶粒子形成的交联结构 是无序的，簇团粒度大小分布不均匀；在加入p e g 的溶胶中，颗粒闯的交联逐 步有序化，形成链状或环形的网络结构，同时也存在粒度大小分布不均的簇团。 这表明p e g 参与并修饰了t e o s 的溶胶凝胶过程。一方面，p e g 在对溶胶颗 粒表面进行包覆的同时限制了t e o s 的水解缩聚行为，使其速度减慢。因此， 第一章义献综述 与未加入p e g 的溶胶水解缩聚行为相比，在相同条件下，t e o s 的不完全水解 使溶胶中不断有小颗粒( 即产物粒子) 生成。小颗粒生成后，表面立即被p e g 所包覆；另一方面，由于表诬羟基的作用，p e g 又促进了被包覆的小颗粒之间 的团聚，形成小簇团。由于布朗运动，这些小簇团相互碰撞或渗透，形成大簇 团，逐步形成三维网络的凝胶结构，迅速凝胶化。p e g 在溶液中以链状结构存 在，t e o s 水解缩聚行为产生的溶胶粒子则以p e g 的这种结构“搭架”，逐步 形成有序的环状结构，说明p e g 不仅对颗粒表面有包覆作用，而且对溶胶中簇 团的交联起到导向作用。但是，这种结构是靠较弱的分子间范德华力或桥氧键 结合，很容易打开2 0 。 i 2 4 3 p e g 对凝胶孔径的影响 对于不含p e g 的空白凝胶，影响孔径的参数有p h 值、水t e o s 比、老化 时间等口7 1 。而对于含有p e g 的修饰凝胶，除了上述因素以外，单位凝胶中p e g 的添加量、p e g 的平均分子量等对凝胶基质的孔径产生影响。 最近有研究表明，p e g 模板剂的添加量较小时，孔分布较宽，增大添加量， 孔分布变窄，最可几孔径增大，当添加量进一步增大时，孔分布反而变宽，最 可几孔径减小。这种变化规律可以从p e g 与水分子和s i 0 2 溶胶粒子的相互作 用来认识。p e g 单体( 一c h 2 - - c h 2 - - o - - ) 。与水分子作用易形成多齿状的链 式结构。因此，在t e o s - p e o 体系中，水可能以结合水、束缚水、自由水3 种 形式存在：在p e g 链上，以氢键形式吸附的水为结合水，使得p e g 链式结构 变得疏松，从而可以提供足够的空间来容纳水分子，这部分被容纳的水称为束 缚水。结合水和束缚水形成后，剩余的水称为自由水。当p e g 添加量较小时， 结合水和束缚水较少，自由水较多，与不加p e g 的反应体系相比，对t e o s 的 水解缩聚过程影响不大，此对p e g 只是起到分散剂的作用。当p e g 添加量较 大时结合水和束缚水较多，自由水较少，相对于不加p e g 的反应体系来说，在 一定程度上限制了t e o s 的水解反应而且由于p e g 链式结构对溶胶粒子表面的 包覆作用，所形成的溶剂化层厚度增加，因而在簇团之间不可能形成有规律的 空穴和孔道，只是起到保护剂的作用。所以控制p e g 的添加最，使t e o s 水解 缩聚过程在一种温和的条件下进行，有利于溶胶粒子形成均匀的环状网络结构， 可以制备出具有孔分布集中、孔径较大的s i 0 2 凝胶i i 州i ”j 。 在p e g 的平均分子量方面有研究发现：随着p e g 平均分子量的增大，s i 0 2 凝胶孔径分布逐渐变窄。当p e g 平均分子量较大时，由于p e g 的链长增加， 在溶液中以扭曲形式存在，链越长，扭曲程度越严重。因此，它所吸附的结合 水和所容纳的束缚水反而减少，自由水增加，与不加p e g 的反应体系比较，当 第一章文献综述 p e g 平均分子量超过一定量时，对t e o s 水解反应的影响程度相对减弱。由于 分子链增长，加剧了溶胶粒子表面的包覆作用，限制了溶胶粒子的生长，p e g 单位链长上所吸附的溶胶粒子增多，空间位阻效应加强，因此不可能形成较大 的有规律的网状结构。所以，s i 0 2 干凝胶随着p e g 分子量增大，最可几孔径逐 渐减小，且孔分布范围变宽1 1 6 】 1 7 。 1 2 4 4 p e g 对凝胶性质的影响 ( 1 ) 凝胶的亲水性增强【2 8 】。由于前驱体中p e g 的加入，凝胶表面变得非常润湿， 亲水能力大大增强。这主要是由两方面的原因引起。一方面，加入p e g 使 凝胶孔径增大，可以使凝胶吸附更多的水分子，使其润湿性能改善i l “。另 一方面，p e g 含有亲水性基团，能通过范德华力和氢键与水很好的作用， 这也是添加p e g 后的凝胶里现强亲水性的一个重要原园。这一点对于固定 化酶的活性的发挥是非常有利的。 ( 2 ) 凝胶的稳定性增强【2 9 】。p e g 的羟基与溶胶粒子的表面相互作用，形成范德 华力或桥氧键，通过对粒子表面进行修饰，限制了粒子的生长，从而加强 了溶胶的稳定性。使s o l - g e l 过程更加容易控制，从而可以得到性质稳定的 终凝胶。 ( 3 ) 凝胶的机械性能优化。传统凝胶脆性很强，稳定性差，形状不易保持，由 于p e g 是一种大分子的柔性很好的有机聚合物，加入p e g 后凝胶的脆性 减小，柔性增强。 1 2 5 酶的化学修饰 1 2 5 1 酶化学修饰的研究进展 酶分子的化学修饰是以酶分子空间结构和生物学功能为基础，通过引入或 除去化学基团，使其共价结构发生改变来对酶分子定向改造得到性能更符合人 类要求的非天然大分子。化学修饰在酶的结构与功能研究中曾起到过十分重要 的作用。近年来，由于化学修饰剂专一性的提高，化学修饰过程分析技术和计 算方法的完善以及结构生物学的发展，化学修饰的应用领域不断得到拓宽。迄 今为止，化学修饰在以下方面得到了不同程度的应用：酶多级结构及作用机理 的研究；酶纯度分析与鉴定；酶分子的改性。 2 0 世纪5 0 年代，生物化学家出于酶空间结构和生物学性质功能研究的需 要。酶的化学修饰逐渐成为学术研究的热点。2 0 世纪7 0 年代后期，酶的化学 修饰引起学术界和应用部门的广泛关注m 川。1 9 7 7 年，d a v i s 等人证咀聚乙二 第一章文献综述 醇p e g 共价结合到过氧化氢酶上后，可以降低它们的免疫原性阢”j 。在生物技 术方面，用具有两亲性的p e g 来修饰生物酶。修饰的酶如过氧化物酶、过氧化 氢酶、脂肪酶、胰凝乳蛋白酶均可溶于有机溶剂，并呈现较高活性。修饰后的 水解酶在有机溶剂中对水解反应的逆过程有催化作用。这些发现极大地拓展了 酶的应用领域。 据不完全统计，已修饰过的酶有2 7 种：l 天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶天冬 酰胺酶、过氧化氢酶、尿激酶、链激酶、酰苷脱氨酶、精氨酸酶、苯丙氨酸氨 解酶、尿酸酶、尿酸氧化酶、脲酶、精氨酸激酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽 酶、溶菌酶、脂肪酶、核糖核酸酶、弹性蛋白酶、超氧化物歧化酶、胆红素氧 化酶、单氨氧化酶、淀粉酶、嘌呤核苷磷酸酶、醛缩酶、葡萄糖6 磷酸脱氢酶、 甘油酸6 磷酸脱氢酶。已修饰过的多肽、蛋白质、毒素有：血清白蛋白、卵清 自蛋白、胰岛素、血红蛋白、肌动球蛋白、多种免疫球蛋白、人绒毛膜促性腺 激素、凝血因子i i 、绿脓毒索、融合蛋白p g f 。p e 3 8 、i l - 2 、蜂毒、枯草杆菌 素、蓖麻籽提取物、花粉及粘菌素等。 总之，酶化学修饰作为一种有效的研究手段广泛地应用于基础和应用研 究。许多酶的空间结构至今还没有完全解析出来，相关的数据库中信息也很少。 有的酶甚至连一级结构都不清楚。在这种情况下，利用化学修饰很快可以获得 对这个酶的初步认识。另外，侧链基团改变与生物活性密切相关，很多情况下 我们需要同时检测某些基团和其生物活性的改变。更重要的是，利用化学修饰 可以灵活地对酶分子的某些缺陷进行改造，使酶符合使用要求。 1 2 5 2 酶修饰剂简介 目前已经研制出多种类型的酶修饰剂，其中包括小分子修饰剂如乙酰咪 唑、卤代乙酸、n 乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、 n 卤代琥珀酰亚胺等，以及大分子修饰剂如聚乙二醇、聚氨基酸、乙二酸丙二 酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮、多聚唾液酸、葡聚糖、环糊精 等1 3 4 , 3 5 。其中小分子修饰剂和大分子修饰剂都能与某一特定的氨基酸残基的侧 链基团发生化学反应，并形成共价键。但小分子修饰剂多用于酶的各级结构和 作用机理研究，而大分子修饰剂则多用于改变酶的免疫学和药物动力学行为， 保护酶的活性基团，增强酶在有机溶剂中的性能等。在大分子修饰剂中，聚乙 二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 类修饰剂以其优良的性能而应用最多。 p e g 类修饰剂与其他修饰剂相比，毒性小，具有良好的两亲性和生物相容 性1 3 6 1 。特别是，当酶经过p e g 类修饰剂修饰后，修饰剂的许多优良性质也会随 之移植到修饰酶中。p e g 分子末端有两个能被活化的一o h 基团，化学修饰时则 1 0 第一章文献综述 多采用单甲氧基聚乙二醇( m e t h o x y p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，即m p e g ) 的衍生物为 修饰剂。p e g 有许多种类型，除了线形p e g ，还有星形p e g ( 即通过中间物如 赖氨酸、三嗪等将两个或更多的p e g 链连接在一起) 和梳形p e g ”】。多数情 况下p e g 衍生物与酶的共价结合是以酶分子上的氨基作为修饰位点，这主要是 因为氨基具有亲核性，并且大多存在于酶分子的表面。 p e g 衍生物修饰剂的性能的主要评价指标是偶合反应的活性与选择性以 及修饰反应产物的生物活性和稳定性。修饰剂的活性决定着修饰反应的条件， 为了保持酶分子的生物活性，修饰反应应当在尽可能温和的条件下进行。修饰 反应对酶分子上特定的官能团的选择性决定修饰反应的专一性，也直接影响着 修饰产物的其它性能，如免疫原性等。修饰反应后，酶分子的活性( 如酶的催 化性能) 会发生变化，不同的修饰剂对偶合物生物活性的影响不一样。另外， 修饰反应往往是可逆反应，由于逆反应的发生，修饰剂分子也会从偶合物上脱 落下来。不同的修饰剂与酶分子形成不同类型的键，键能的差异导致偶合物的 稳定性也不同。例如，s s p e g 与赖氨酸氨基形成的是酯键，而s c p e g 形成的 是尿烷键，相比之下，尿烷键更稳定些，因此其它条件相同的情况下，s c p e g 与酶分子之间形成的偶合物要比s s p e g 与酶分子之间形成的偶合物稳定性好。 表1 1 列出了常见的p e g 衍生物用作