（光学工程专业论文）微流控芯片荧光检测系统的研制.pdf

一 塑垩查堂堡主兰垡丝兰一 摘要p 9 3 6 0 f 微流控芯片技术被用于进行生化分析，与传统的毛细管电泳相比具有高效、 一秧遮：试样用重少、结果可靠的特点。它已成功地用于d n a 序列测定，蛋白质、 单细胞等的分离检测。本课题研制了一种采用4 8 8 n m 的氩离子激光器和f i t c 荧 光染料激光诱导荧光检测系统。 了解系统信噪比特性、进行系统优化设计是把微流控芯片荧光检测系统推向 实用化、商品化的关键。为此，我们根据已有资料，分析了影响系统整体性能的 因素，并使用有关器件，在光学平台上搭建了简易的透射式和反射式微流控芯片 荧光检测系统，包括光学、机械和电路部分的设计和实现。系统通过主物镜收集 微流控芯片微通道中的荧光信号，然后被光电倍增管接收并转换成电信号，最后 通过电路处理、采样，在计算机上显示出电泳的曲线。实验结果与理论分析基本 吻合，进一步明确了激光器、针孔尺寸和显微物镜等因素与系统整体性能( 信噪 比) 的关系，并对仪器的整体结构、器件参数和电路部分提出了改进和具体设计 r 结果：7 本论文共分为六章：第一章介绍了微流控芯片的概念、简要发展史、发展趋 势、主要应用领域和主要检测方式；第二章简单介绍了毛细管电泳的相关概念和 荧光的特性，以及共焦技术提高光学系统性能的理论基础；第三章详细介绍了我 们所搭建的透射式和反射式荧光检测实验系统；第四章给出了使用实验系统对样 品进行检测的结果以及对结果的分析：第五章从整体结构、主物镜、针孔、滤色 片组合和电路等几个方面阐述了现有系统的不足，并提出了相应的改进方法：第 六章是对全文的总结和对本课题的展望。 关键词：微流控芯片荧光检测共焦 一 塑垩奎兰堡主兰堡笙苎 a b s t r a c t m i c r o f l u i d i cc h i p ，w h i c hi sa l s oc a l l e di n t e g r a t e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( i c e ) p l a n a t , c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) c h i p ，i su s e di nt h eb i o c h e m i c a la n a l y s e ss u c h a sd n a s e q u e n c i n ga n dt h es e p a r a t i o no f t h ep r o t e i no rm o n o p l a s t a sc o m p a r e dt o t h ec o n v e n t i o n a lc a p i l l a r ye l e t r o p h o r e s i s ，i ts h o w sm a n ya d v a n t a g e s ：l e s sr e a g e n t ， m i n i t y p e ，h i g he f f i c i e n c ya n ds e n s i t i v i t y w ed e v e l o pal a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o ns y s t e mf o ru s ew i t ht h ei c ec h i p ，w h i c hi sb a s e do na4 8 8 n ma r g o n i o nl a s e ra n df i t cf l u o r e s c e n td y e o p t i m i z a t i o no f t h el i fd e t e c t i o ns y s t e mi st h ek e yo fc o m m e r c i a l i z a t i o na n du t i l i z a t i o n t h e r e f o r e ，w ea n a l y z et h ee f f e c to f v a r i o u sf a c t o r so ns i g n a l n o i s er a t i oi nl i fd e t e c t i o ns y s t e m t h e nw es e tu pa d j u s t a b l em i n il i fd e t e c t i o ns y s t e mo ft r a n s m i s s i o ns t y l ea n dr e f l e c t i o ns t y l e ， w h i c ha r cc o n s i s to f o p t i c a lm o d u l e ，m e c h a n i c a lm o d u l ea n de l e c t r o n i cm o d u l e i nt h i sd e t e c t i o n s y s t e m ，t h ee x c i t a t i o nl a s e rb e a m f r o mt h ea r g o ni o nl a s e ri l l u m i n a t e ss o m ep o i n tt h a t l i e si nt h es e p a r a t i o nm i c r oc h a n n e l t h e nt h ef l u o r e s c e n ts i g n a li se m i t t e dw h e nt h e f l u i dt h a tc o n t a i n sf i t cd y ef l o w st h r o u g ht h ep o i n t a f t e rt h a t , a no b j e c t i v el e n s c o l l e c t st h eo p t i c a ls i g n a la n dt r a n s m i t si tt ot h ep h o t o e l e c t r i cm u l t i p l i e r ( p m t ) f i n a l l y , t h es i g n a li ss a m p l e d a n dt h ee l e c t r o p h e r o g r a mi sd i s p l a y e do nt h ec o m p u t e r s c r e e n t h er e s u l t so f t h ee x p e r i m e n t sm a t c ht h et h e o r e t i c a lc o n c l u s i o n s f u r t h e r m o r e ， t h e yl e tu sk n o w t h er e l a t i o n s h i p sa m o n gt h el a s e r , t h es i z eo f p i n h o l e ，t h eo b j e c d v e a n dt h e s i g n a l n o i s e r a t i om o r ec l e a r l y s ow ei m p r o v eo u rd e t e c t i o n s y s t e mb y c h a n g i n gi t ss t r u c t u r e ，t h ep a r a m e t e ro f c o m p o n e n t s a n dt h ec i r c u i t t h i sp a p e ri n c l u d e ss i xc h a p t e r s c h a p t e ro n eg i v e sab r i e fi n t r o d u c t i o no fm i c r o f l u i d i c c h i pa n di t sd e t e c t i o nm e t h o d s c h a p t e rt w oe x p l a i n st h em u t u a l i t yt h e o r ya b o u tt h ed e t e c t i o no f m i c r o f l u i d i c c h i p ，i n c l u d i n g c o n f o c a i t h e o r y c h a p t e r t h r e ei n t r o d u c e se a c hm o d u l ei no u r e x p e r i m e n t a t i o ns y s t e m , i n c l u d i n go p t i c a lm o d u l e ，p h o t o e l c c b i c c o n v e r s i o n m o d u l e ，a n d e l e c t r o n i cm o d u l e c h a p t e rf o u ri sa b o u tt h em s u l t so ft h e s ee x p e r i m e n t s c h a p t e rf i v es h o w st h e s h o r t a g eo f o u rs y s t e ma n dg i v e st h ec o r r e s p o n d i n ga d v i c e st oi m p r o v ei tt h r o u g ht h ea s p e c t ss u c h a so b j e c t i v e 。p i n h o l e ，f i l t e r s ，c i r c u i t sa n ds oo n c h a p t e rs i xs b m s u pt h i sp a p e r k e y w o r d s ：m i e r o f l u i d i c c h i p ；l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ；c o n f o c a l 浙江大学硕士学位论文 1 - 1 微流控芯片 第一章绪论 科学技术的发展不断向分析科学提出新的挑战。2 l 世纪生命科学与信息科学 的发展，要求分析科学用更低的消耗、更简便的方法和设备、更快的速度提供更 准确的有关物质成分与结构的信斛“。微流控化学分析( m i c r o f l u i d i cc h e m i c a l a n a l y s i s ) 正是九十年代新兴的、与这一目标相适应的分析技术。它从9 0 年代初 兴起，到现在该技术已有了多种名称，如：微流控系统( m i c r o f l u i d i cs y s t e m ) 【2 】： 微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，即u t a s ) 1 3 】；微诊断系统 ( m i c r o d i a g n o s t i cs y s t e m ) 【4 l ；平板芯片系统( p l a n a rc h i ps y s t e m ) 【5 l ；微加工 化学分析系统( m i c r o f a b r i c a t e dc h e m i c a la n a l y s i ss y s t e m ) 【6 j ：小型化学分析系 统( m i n i a t u r i z e dc h e m i c a la n a l y s i ss y s t e m ) 芯片上的实验室( l a b o n a c h i p ) 哺溶。微流控芯片是微流控化学分析的重要工具。图1 1 是微分析系统的分类示意 徽分析系统 徽阵列芯片( 生物芯片) ll微全分析系统 徽流控芯片 l1非芯片系统 毛细管电泳芯片ii 其他分离芯片 ii 反应器芯片 ii 细胞计数芯片 li 集成化多功能芯片 图1 1 微分析系统及徽流控芯片的分类 图【9 j ，从中可以清楚地了解微流控分析技术在微化学分析中的地位。这一技术的 目标是通过分析化学、微机电加工( m e m s ) 、计算机、电子学、材料科学及生 物学、医学的交叉实现化学分析系统从试样处理到检测的整体微型化、自动化、 集成化与便携化。它的实质是采用微加工方法( 现多采用光刻蚀和腐蚀技术) 在 平板上制作出微米级的结构( 多数为通道网络，通道宽2 0 l o o 岫，深1 0 3 0 岬) ， 浙江丈学硕士学位论文 通过试样和试剂的液流在这些微结构或通道中的受控流动及混合完成试样分析。 四十年前微电子技术在信息科学的发展中引发了一场革命，并对2 0 世纪的科 技发展起了重要的推动作用。最近的发展表明，微流控分析系统预计在未来十年 内也将对分析科学乃至整个科学技术的发展发挥相似的作用。它不仅可使珍贵的 生物试样与试剂消耗大大降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度成千倍百倍她 提高，费用成十倍、百倍地下降，从而为分析测试技术普及到千家万户，实现分 析实验室的“家庭化”、“个人化”创造了条件。微流控分析( m i c r o f l u i d i ca n a l y s i s ) 是微全分析系统的主要组成部分，而将化学分析的多种功能集成在邮票大小的芯 片上的微流控芯片( m i c r o f l u i d i cc h p s ) 又是当前最活跃的发展前沿，代表着2 1 世纪分析仪器走向微型化、集成化的发展方向，已成为国内外许多著名实验室的 奋斗目标。 微流控分析芯片的构造一般为两片平板材料，其中一片用微加工技术刻有细 微通道，然后两片平板覆合在一起，形成具有封闭通道的芯片，在任意一片上还 有通道的进出口( 图1 2 ) 。其分析技术特点为：系统中试样与试剂体积为此 n l 或更小；液体流动一般为电场作用下的受控流动，但有时也辅以其他手段；分 析时间一般较短，为秒级甚至毫秒级，可在很短的时间内完成诸如混合、分流、 改变流动方向等复杂的操作程序。 田1 - 2 芯片毛细管电泳示意图 ( a ) i c e 芯片示意图 ( b )实验中实际使用的i c e 芯片，由浙江大学化学系提供 微流控芯片与前些时间报道较多的生物芯片( b i o c h i p s ) 或称微阵列芯片 ( m i c r o a r r a yc h i p s ) 统属芯片实验室系统，在我国常被混为谈，或把微流控芯 片包容在生物芯片之中，但实际上微流控芯片与生物芯片涉及的是两个完全不同 的学科技术领域，并经历了各自独立的发展过程【1 0 l 。因生物芯片的应用对象主要 浙江大学硕士学位论文 是d n a 分析，所以早期也称为d n a 芯片，其发展要早于微流控芯片4 5 年，始 - 5 8 0 年代末。其发展契机主要来自于现代遗传学的一些重要发现，并直接受益于 该领域的某些重要研究成果，即在载体上固定寡核苷酸的基础上以杂交法测序的 技术。这类芯片在前几年发展较快，在国外已实现深度产业化。在国内获得国家 较大的重视，形成了发展规划，得到较多的开发研究经费支持，从而得到较大发 展。微流控芯片则是9 0 年代初、中期主要在分析化学领域发展起来的，它以分析 化学为基础，以微机电力1 3 - 技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学 为目前主要应用对象，是当前微型全分析系统领域发展的重点，较生物芯片有更 广泛的适用性及应用前景。从表1 1 对微流控芯片与生物芯片的比较中可看出二 者之间应是互补与相互融合的关系而不是以谁为主包容另一方的关系。这样才能 有利于两种芯片在我国平行健康发展。 微流控芯片当前无论在基础研究还是产品开发方面国际上的竞争都日趋白 热化。参与竞争的既有世界名牌大学和研究所，也有世界最大的分析仪器厂家。 然而目前在微流控芯片各方面都领先的美国也仅在9 0 年代中期才有较大投入，起 步时间都还不久。如有相应的组织与投入，我们就有可能迅速赶上本领域的国际 先进水平。 表1 1 徽流控芯片与生物芯片的比较 1 1 2 微流控芯片的简要发展史 塑坚查兰堡主兰堡垒苎 一 微全分析系统的概念是在1 9 9 0 年首次由瑞士c i b a - g e i g y 公司的m a n z 与 w i d m , ：r 提出【3 】当时主要强调了分析系统的“微”与“全”，及微管道网络的 m e m e s 力1 1 i 方法，而并未明确其外型特征。次年m a n z 等即在平板微芯片上实现 了毛细管电泳与流动注射分析，从而把微系统的主要构型定位为一般厚度不超过 5 毫米，面积为数平方厘米至十几平方厘米的平板芯片j 。但直到1 9 9 4 j 年之前这 一新领域的发展前景并不十分明朗。1 9 9 4 年始，美国橡树岭国家实验室r a m s e y 等f 1 2 】在m a n z 的工作基础上发表了一系列论文，改进了芯片毛细管电泳的进样方 法，提高了其性能与实用性，引起了更广泛的关注。在此形势下，该年首届u t a s 会议以工作室的形式在荷兰e n c h e d e 举行，起到了推广微全分析系统的作用。1 9 9 5 年美国加州大学b e r k e l e y 分校的m a t l l i e s 等人【1 3 】在微流控芯片上实现了高速d n a 测序，微流控芯片的商业开发价值开始显现，而此时微阵列型的生物芯片已进入 实质性的商品开发阶段。同年9 月，首家微流控芯片企业，c a l i p e rt e c h n o l o g i e s 公司在荚成立，虽然只有三十多名雇员，但一年即集资近千万美元。1 9 9 6 年 m a t h i e s 等【1 4 1 又将基因分析中有重要意义的聚合酶链反应( p c r ) 扩增与毛细管 电泳集成在一起，展示了微全分析系统在试样处理方面的潜力，次年他们又实现 了微流控芯片上的多通道毛细管电泳d n a 测序，从而为微流控芯片在基因分析 中的实际应用提供了重要基础。与此同时，有关企业中的微流控芯片研究开发工 作也在加紧进干于，1 9 9 8 年之后专利之战日益激烈，一些微流控芯片开发企业纷纷 与世界著名分析仪器生产厂家合作，利用各自的优势技术平台抢先推出首台微流 控分析仪器。1 9 9 9 年9 月惠普( 现a g i l e n t ) 与c a l i p e r 联合研制的首台微流控芯片 商品化仪器开始在欧美市场销售，至2 0 0 0 ：年8 月已可提供用于核酸及蛋白质分析 的5 6 种芯片。其它几家厂商也于今年开始将其产品推向市场。 2 0 0 0 年5 月第四届国际t a s 会议的召开是对微全分析系统发展的一次全面 检阅，它预示着微全分析系统的一个更大的发展高潮即将到来。 1 1 3 微型全分析系统的发展趋势 继微阵列生物芯片之后，微流控分析芯片已成为微型全分析系统当前的发展 前沿。微流控分析系统的发展趋势为： 浙江大学硕士学位论文 以毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液一液萃取、过滤、无膜扩散等多 种分离手段； 从以电渗流为主要液流驱动手段发展到流体动力、气压、重力、离心力、剪 切力等多种手段； 从单道检测发展到多重平行检测： 从以激光诱导荧光及光度法为主要检测器发展到多种检测手段，如电化学、 质谱、原子光谱、光声光谱、化学发光等； 己从分离检测发展为包括复杂试样前处理的高功能全分析系统； 从成分分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段，在新药物 筛选中显示出强大的生命力； 从一般成分分析发展为单分子、单细胞分析； 从以玻璃基质为主发展到玻璃与高分子聚合材料并重，尤其在芯片的产业化 方面，后者将更具备优势； 开始从基础与应用基础研究阶段进入产业化及市场开发阶段。 目前发展中的一个主要薄弱环节是宏观试样与微芯片的衔接或接口问题，这 已在本领域的研究者中取得共识。它对微流控系统的实际应用与普及十分重要， 但目前进样多采用手工完成，效率低下，可靠性也较差。进样与换样的自动化、 微型化、集成化势在必行。 1 - 1 4 微流控芯片的应用领域 生物医学是当前微流控芯片的主要应用领域，针对人类基因与疾病关系的研 究，研制超过生物芯片某些性能的用于单核营酸多态性( s n p ) 检测、d n a 测序 及后基因组时代的蛋白质测序的毛细管电泳微流控芯片是当务之急。用于临床检 验的微流控芯片在我国将拥有最广泛的市场。新药物的合成与筛选是微型全分析 系统另一个可发挥重要作用的领域。由于微型化的反应及在线测定条件，筛选过 程可大大加速，费用大大降低。微流控分析芯片在新代药物问世的过程中将可 能起到至关重要的作用。其它重要应用领域包括食品和商品检验、环境监测、刑 事科学、军事科学、及航天科学等。由于微全分析系统的目标是取代常规分析实 塑堡盔兰堡主兰竺堡兰一 验室的所有功能，其应用领域进一步扩大到需要化学成分分析的所有方面只是时 间问题。微型全分析系统的研究除涉及到大量的微加工技术和芯片材料的内容 外，还包括广泛的基础理论和应用基础内容，例如微米通道中的传质、导热、吸 附及微区反应规律等。许多分析化学的传统理论在微、纳米尺度下将面临挑战而 需要深入研究。 1 2 微流控芯片的主要检测方式 微流控分析芯片的进样量为皮、纳升级，反应通道一般仅有数十微米宽，而 且许多混合及分离过程在秒级内就完成，这要求检测应具有灵敏度高、响应速度 快的特点【”】。下面将主要对近年来国内外微流控芯片在检测器系统方面的研究和 应用作简要介绍： 1 2 。1 激光诱导荧光检测 前面指出，芯片的一个重要的特点是极大地降低了样品和试剂的使用量，如 目前最低的进样量已可低至l p l ，由于流体和器件尺度的减小，对于检测技术灵 敏度的要求就被提到了一个重要的位置，这样，激光诱导荧光检测技术就以其高 灵敏度成为目前大多数微流体芯片采用的检测方式i l “。不同的研究小组在光路的 设计、光学元件的配置等问题上因其研究对象、理念和技术力量等实际情况的差 异而有所不同。目前，采用的光学系统根据主要设计原理大致可以分为透射式和 落射式共焦系统两类，而后者因其能够更有效地利用激发光源、降低噪音和便于 调节，已成为优先选用的设计。除了在光路上的硬件设计以外，为提高在微小管 道中痕量样品的检测灵敏度，信号处理也是研究者关注的一个热点。同时采用 c c d ( 电荷耦合器件) 对相关区域的流体行为进行观测的分析也广泛地被采用。 高处理量的要求是芯片发展的一个重大趋势，这不仅对芯片本身的设计和制 作提出了更高的要求，也对检测器和数据处理能力提出了新的挑战，如m a t h i e s 的小组1 9 9 9 年在直径为1 0 e m 的圆形基片上制作t 9 6 根管道的微流体芯片【1 7 1 ，特 殊设计的激光诱导荧光共焦检测系统能够同时检测所有管道中样品的分离。目 塑坚盔兰堡主兰垡丝兰 一 一 轧与c a l i p e r y e c h n o l o g i e s 合 、f l j a g i l e n t t e c l l l l o l o g i e s 推出的全球第一台微流 控芯片系统l a b c h i ps y s t e m ：a g i l e n t 2 1 0 0b i o a n a l y z e r 中所使用的芯片就是可同时 对1 2 个样品进行分析的多通道芯片，平台中采用激光诱导荧光技术对凝胶筛分的 d n a 或r n a 片段进行检测。 激光诱导荧光检测器的微型化也在m e m s 技术的支持下迅速发展，虽然到现 在为止，在大多数微流控芯片研究的实验室中，仍然是传统光电器件架构的检测 系统占主要地位，但不可否认，随着半导体光电器件在芯片上集成的进一步发展， 性能优越的微型化、集成化的光学检测单元将会成为主流。目前如光源、光纤、 滤光部件、反射部件和光敏二极管都已实现了在微流体芯片上的集成。 i - 2 2 质谱检测 由于使用激光诱导荧光检测常常需要进行荧光衍射，因此质谱正在成为微流 体芯片研究中最受关注的检测器之一。通过为质谱提供良好的样品前处理及分离 途径，并通过进行的设计极大地提高处理通量，微流控芯片与质谱的联用已经表 现出了极大的应用前景和良好的技术可行性。 微流体芯片与质谱连用的关键首先在于接口的制作，k a r g e r i l s l 和j m r a m s e y l l 9 l 的小组都采用从芯片末端流出的液滴直接在静电的作用下喷雾进入离 予源这种方式：f i g e y s 2 0 和h a r r i s o n 2 1 】等使用毛细管将芯片和质谱连接起来。各 和方式都各有其优缺点。 在质谱与微流体芯片的连用中，常常有研究者仅将芯片作为一个进样装置， 但质谱虽然可以同时对几种成分进行分析，检测复杂的样品时如果没有预分离就 往往会造成信号下降或是背景化学噪音，而如果能够利用芯片进行分离或预处理 则可降低干扰，改善峰形。 如何提高微流体芯片与质谱的接口性能，降低加工成本仍是目前有待研究解 决的问题，一个更有潜力的设计思想是利用现有的微细加工技术将电喷雾的喷嘴 直接制作在芯片上，这将为蛋白分析提供一个强健易用的装置，其中又以塑料作 为此微型结构材料的设计最具应用潜力。 尽管目前将质谱的微型化具有某些应用能力，但它对质谱分析的灵敏度和选 浙江大学硕士学位论文 择性的提高并不能起到多大作用，而芯片上各种样品前处理结构的集成将确实会 给实验室工作的自动化和成本的降低带来福音，将微流体芯片作为质谱的样品前 处理和进样装置已成为几个重要小组的明确研究理念。 1 2 - 3 化学发光检测 化学发光检测具有成本低、灵敏度高、线性范围宽、一般反应和检测装置相 对比较简单等特点，近年来它的应用发展很快，覆盖的范围也很广泛。但常规毛 细管电泳与化学发光检测器的接口较为复杂，同时容易引入死体积和湍流现象造 成分离效率下降，而微流体芯片上能利用微细加工技术制作零死体积的柱后反应 器从而避免这些问题，因此徽流体芯片利用化学发光达到高灵敏度和高选择性的 检测是具有潜力的。m a n g r u 并d h a r r i s o n 2 2 j 在微流体芯片上制作了柱后反应器，用 辣根过氧化物酶( h r p ) 过氧化物酶鲁米诺三元体系对其特性进行了探索，并进 行了免疫分析，表现了化学发光在生物大分子尤其是蛋白分析中应用的潜力。 1 2 4 电化学检测 电化学检测一向以其灵敏度高而著称，同时，加上超微电极的广泛使用，使 得微流体芯片与电化学检测器连用后，可望得到一个灵敏且真正集成化和微型化 的分析装置。如m a t h i e s 的小组在电泳芯片上集成了三电极体系的电化学检测f 捌。 由于微电子加工技术在电极、电路、和微细结构制作上的优势，通过对微流体电 化学检测芯片系统的集成化和微型化，最有希望得到一个体积小，甚至是便携的 装置。 1 - 2 5 结论 微流体芯片系统仍有许多问题有待解决，架构一个真正的“芯片上的实验室” 无疑还需要众多领域的科学工作者和工业界协同的努力。而检测系统及其接口的 研制、微型化、在高处理通量中的使用无疑是此领域最为重要的一部分，如何提 塑望盔兰堡主兰竺丝兰一 高其灵敏度和处理通量将是我们都需要面临和需要投入大量工作的重点。这些工 作需要多学科的融合与协作。微流控分析方法虽然尚不够成熟，但已显示出它的 巨大优越性，它的研究发展将会给分析化学带来一个新天地，并使分析实验室进 入低消耗、低污染、低毒性的绿色分析时代。 i - 3 荧光关联谱学( f c s ) 现在，基因工程、克隆等关于生命科学的概念在各种媒体上以惊人的频率出 现，与之相关的争论和进展充斥当今世界。无论赞成还是反对，生命科学已经成 为研究的热点领域。然而，由于生物系统的复杂性，目前的很多探讨和推断都显 得含糊、暖眯。我们知道许多生物机制的存在，但是却不能完全清楚其实质。当 今的生物研究的主要目标不再是识别，而是致力于了解生理过程在单个蛋白质和 核酸大分子层次的物理、化学特征，因为这些分子是被认为是生物系统最小的功 能单位。为了它们的特性，必须要依赖于非常灵敏的探测手段。进行单分子探测 的手段通常有两种，一种是原子力显微技术，一种是荧光光谱技术。相比较而言， 原子力显微术需要与探测物很近距离地接触，有一定的侵害性，因此对于活细胞 探测，荧光技术比前者更有优势。 荧光关联谱学( f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i cns p e c t r o s c o p y ，简称f c s ) 是对极 低浓度的生物分子进行高分辨率时间和空间分析的方法之一。与其他荧光技术 ( 如前面提到的微流控芯片检测技术) 不同，它感兴趣的不是光强信号本身，而 是小系统偏离热平衡状态时产生的自发强度涨落。f c s 方法是对微区内发光分子 的荧光涨落信号作其自相关函数g ( f ) ，以获得荧光粒子浓度、扩散速度，以及产 生涨落的物理机理等信息。如果主要考虑粒子的布朗运动，此时，荧光强度涨落 自相关函数g ( r ) 的衰减率取决于粒子的扩散系数和激发区域的空间尺寸，而 g ( ，) 的幅度取决于激发区域内荧光粒子的数目。 f c s 发展于七十年代早期，是作为弛豫分析的一种特例发展起来的。经典的 弛豫法是对一个反应系统施加特定的干扰如温度、压强等，然后从系统返回到平 衡态的过程中获得与动力学有关的信息。f c s 比这些经典弛豫分析新颖的地方在 于它利用分子发射的荧光来反映和自发强度涨落有关的物理量。对记录下来的荧 浙江大学硕士学位论文 光强度信号进行时域自相关计算可以量化这种涨落的大小和寿命，这也是f c s 这个名称的由来。f c s 首次由m a d g e ，e l s o n 和w e b b 在1 9 7 2 年提出，当时被用 于检测d n a 药物的扩散和化学动力学特征。之后，跟着出现了很多不同的小组 采用这种方法来确定二维或者三维尺度，甚至是细胞环境或流体系统的粒子浓 度、平移或转动迁移率。 田3 影响荧光涨落的分子机制包括粒子运动、构造变化、化学或光物理反应等 f c s 的基本概念是使观察的分子数量尽可能少，从而保证每个分子对检测信 号的贡献充分，这样才能真正实现对自发涨落的分析。显然，f c s 技术要求降低 浓度和观测体积使同时被探测的分子数少，同时又要设法增加单个分子的荧光量 子产率。在实际操作上，一般采取的方法是：使用高效的荧光染料标定感兴趣的 分子；使用高功率、稳定的激光器作为光源；使用单光子灵敏度的光探测器。最 终的突破来自r i g l e r 和他的合作者，他们把f c s 技术与共焦检测技术结合在一 起，使用数值孔径很大( 超过0 9 ) 的显微物镜把激光会聚成衍射极限的光斑， 浙江大学硕士学位论文 减小了照射区域的面积和受到激发的荧光染料分子。在像平面加入针孔限制轴向 的检测区域，阻挡非焦面的信号。 f c s 技术并不是近期的发现，已经证明它很有可能解决许多不同类型的问 题，是种通用的方法。然而，直到最近才开始有很多关于采用这种技术进行细 胞内检测的报道。这主要是因为受到探测系统性能的影响。由于自发体荧光、光 吸收和散射，无法很好地抑制系统噪声，从而导致信噪比非常低，探测不到这种 微量的强度涨落信号。另外一个重要的原因则是绝大多数用于细胞染色的荧光染 料会发生不可逆的光漂白。 图l - 4 中是采用了共焦技术的f c s 装置，除了该装置中所使用的显微物镜数 值孔径很大之外，整体结构和其他方面的要求几乎和微流控芯片检测系统一样。 也就是说，我们课题中研究的荧光检测装置同样适用于f c s 的检测。 图4 f c s 的实验装量原理圈 1 4 本课题主要研究内容及意义 浙江大学硕士学位论文 目前微流控芯片在我国的发展势头喜人，已有包括清华大学、浙江大学、武 汉大学、大连化学物理研究所等的多家科研单位投入到微流控化学分析的领域 中，并取得了初步的成绩。由于微流控芯片分析涉及到化学、微电子加工工艺、 圯学、信号处理等多个领域的交叉结合，因此需要不同专业的技术力量紧密结合。 尽管l i f 检测器的微型化研究在微机电加工技术m e m s 的支持下迅速发展， 但因为检测灵敏度等原因，目前在大多数微流体芯片研究中，传统光电器件的检 测系统仍然占主导地位，并且将延续很长一段时间。所以，研制结构紧凑、高性 能的小型化l i f 检测器仍然是芯片检测和微流控分析系统的关键课题。遗憾的 是，目前国内还没有l i f 检测器的生产厂家，其仪器大多是依赖进口或自行组装， 如大连化学物理研究所、上海微系统所、武汉大学化学系等。进口仪器的性能固 然优异，但价格很高：自行组装的l i f 检测器所用的光学器件也大多是进口元件。 我们的课题任务是设计一个小型的微流控芯片检测仪，在保证其体积小巧的 基础上提高系统的性能。随着微流控芯片研究的日渐深入和完善，它终将走进我 们的日常生活。而微流控芯片检测仪器的小型化，将更好地推动对微流控芯片的 研究和普及。 另外，f c s 的研究目前虽然在国际上比较热门，但是在国内除了清华大学开 始进行理论研究之外，暂时还是空白。因此，我们的工作也将会为今后开展这方 面的研究打下基础。 参考文献 l 王世立，方肇伦。光谱学与光谱分析，2 0 0 0 ，2 0 ( 2 ) ：1 4 3 1 4 8 2pch l i ，djh a r r i s o n a n a l c h e m , ，1 9 9 7 ，6 9 ：1 5 6 4 3 a m a n z ，y m i y a h a r a ，j m i u r a e ta 1 s e n s a c t u a t o r s b ，1 9 9 0 ，b 1 ：2 4 4 4 m a r o b e r t s ，js r o s s i e r , p b e r c i e r e t a l a n a l c h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ：2 0 3 5 5a m a n z , ev e r p o o r t e ，cs e f f e n h a u s e re ta j f r e s e n i u s a n a l c h e m ，19 9 4 ，3 4 8 5 6 7 6 scj a c o b s o n ，r h e r g e r t r o e d e r , lbk o u t n y e ta 1 a n a l c h e m , ，1 9 9 4 ，6 6 ：1 l1 4 7sc j a e o b s o n ，rh c r g e n r o e d e r , a w m o o r ee ta 1 a h a l , c h e m ，1 9 9 4 ，6 6 ：4 1 2 7 8 h t t p ：w w w c a l i p e r t e c h , c o m 一 塑堑查堂堡圭兰堡堡兰 9 方肇伦。大学化学，2 0 0 1 ，1 6 ( 2 ) ：1 1 0 方肇伦，方群。现代科学仪器，2 0 0 1 ，4 ：3 11djh a r r i s o ne ta 1 s c i e n c e ，1 9 9 3 ，2 6 1 ：8 9 5 1 2jm r a m s e y e ta 1 n a t u r em e d ，1 9 9 5 ，l ：1 0 9 3 13 a t w o o l l e y , r a m a t h i e s a n a l c h e m ，1 9 9 5 ，6 7 ：3 6 7 6 1 4a t w o o l l e y e ta 1 a n a lc h e m ，1 9 9 6 ，6 8 ：4 0 8 l 1 5 金亚，温涛等。现代科学仪器，2 0 0 1 ，4 ：1 3 1 6r a m a t h i e s ，xch u a n g n a t u r e ，1 9 9 2 ，3 5 9 ：1 6 7 l7 y s h i ，p cs i m p s o n ，r a m a t h i e se t a l a n a l c h e m ，1 9 9 9 ，7 1 ：5 3 5 4 1 8q f x u e ，f f o r e t , b l k a r g e r e t a l a n a l c h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ：4 2 6 1 9rsr a m s e y , jm r a m s e y a n a lc h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ：1 1 7 4 2 0d f i g e y s ，r a e b e r s o l d a n a l c h e m ，1 9 9 8 ，7 0 ：3 7 2 1 2 1n c h i e m , djh a r r i s o n a n a lc h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ：3 7 3 2 2sd m a n g r u ，d jh a r r i s o n e l e c t r o p h o r e s i s ，1 9 9 8 ，1 9 ：2 3 0 1 2 3at w o o l l e y , kq l a o ，ra m a t h i e s a n a l c h e m ，1 9 9 8 ，7 0 ：6 8 4 j 3 一 塑望查堂堡i 圭兰堡堡苎 第二章荧光检测系统的理论基础 1 5 7 5 年，m o n a r d e r 最早观察到荧光现象；可是，直到1 8 5 2 年，荧光发射机 制才被s t o k e s 阐明，并设计了一种包含直角光路和两个色散系统的荧光计。而 分子荧光分析方法和仪器设备的高度发展还是最近3 0 年的事【l j 。 本课题中所使用的微流控芯片属于集成毛细管电泳芯片类型，采用激光诱导 荧光方式检测。为了提高探测系统的信噪比，我们的探测光路采用了共焦原理。 因此，在本章中将分别介绍毛细管电泳、荧光和共焦的基本原理。 2 - 1 毛细管电泳 电泳是电介质中带电粒子在电场作用下以不同的速度向电荷相反方向迁移 的现象，利用这种现象对化学或生物化学组分进行分离分析的技术称之为电泳技 术【2 1 。电泳技术有很多种，可以按照电泳所使用的载体来命名，如自由溶液电泳、 琼脂电泳等；按照电泳支持物的形状或位置命名，如u 型电泳、柱状电泳等： 还有按照原理命名的，如等速电泳、免疫电泳等。毛细管电泳( c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s c e ) 泛指在极细的毛细管内实现的一大类电泳技术。 2 - 1 1 传统毛细管电泳 电泳作为一种工具出现，已有近百年的历史，但真正被视作一种在生物和生 物化学中有重要意义的技术，则是在1 9 3 7 年由瑞典科学家a t i s e l i u s 首先提出 的。由于他对电泳技术发展和应用的杰出贡献，使他成为1 9 4 8 年诺贝尔化学奖 的得主。1 9 6 7 年h i c r t e n 最先提出在高电场强度、直径为3 m m 的毛细管中作自 由溶液的区带电泳。1 9 7 4 年，v m a n e n 提出用2 0 0 5 0 0 1 a m 内径的毛细管作电泳 分离。他们的工作缩短了其和现代电泳的距离。目前所谈及的那种在细管径毛细 管内实现电泳的开创性工作是由j o r g e n s o n 和l u k a e s 在1 9 8 1 年首先提出的。他 们使用7 5 i m a 内径的毛细管柱，用荧光检测器作在线检测，对不同的对象实现了 高效的分离，同时还就分离的机理、高电场和小内径对高效的决定性影响等问题 塑里奎兰堡主兰堡笙苎 进行了讨论。之后，不同的研究小组为毛细管电泳引入了新的分支，他们的开创 性的工作使毛细管电泳显示出巨大的潜力，正好适应了各国在生命科学的各个领 域对各种对象的分离分析和微量制备的迫切需求。 进口槽 田2 1 毛细管电泳示意田 出口槽 图2 1 是毛细管电泳设备 的示意图。进口槽和出口槽 是分别独立的两个容器，它 们中间的毛细管电泳柱一般 短于7 0 c m ，根据实际分析情 况确定。在此范围内，分离 度和效率大体随柱长增加而 增加，超过此长度则保持恒 定不冉增大，再增加管长只会使电压增高，绝缘困难。从8 0 年代后期起，电泳 所使用的毛细管直径一直稳定在2 5 7 5 1 t m 这一范围内。细柱子的最大优点有两 条：一是减小电流，因此减少自热；二是增大散热面积( 侧面积与截面积之比) ， 因此能加快散热，其结果可以大大降低管中心和管壁之间的温差，从而减少粘度 和速度在径向上的差异，保持电渗流流型的扁平性，最终保持分离的高效。但是， 直径的减小也会增加管子的侧面积与体积之比，不利于对吸附的抑制。同时，又 会造成进样、检测和清洗等技术上的困难。 传统电泳最大的局限性是难以克服由两端的高电压所引起的电介质离子流 的自热，或称焦耳热。这种焦耳热会引起载板从中心到两侧或管子内部径向的温 度梯度、粘度梯度和速度梯度，从而导致区带展宽，影响迁移，降低效率。这种 影响还会由于电场强度的增加迅速加剧，因此极大地限制了高压的使用，当然也 就难以加快整个过程的速度。毛细管电泳和传统电泳的根本区别在于前者设法使 电泳过程在教热效率极高的毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度，全面改 普分离质量。 与传统的电泳相比，毛细管电泳主要的特点有四个：一是高效，二是快速， 三是微量，四是可以自动化。 2 - 1 。2 芯片毛细管电泳 浙江大学硕士学位论文 一_ 一 最近几年，以毛细管电泳为核一心技术、以芯片为操作平台的芯片毛细管电泳 技术迅速崛起，并成为微全化学分析系统的主流技术，有可能在化学分析领域引