（生态学专业论文）中国皿蛛科常见属种蜘蛛分子系统发育的初步研究.pdf

摘要 为了探讨皿蛛科蜘蛛的分子系统发育关系，我们选择了线粒体细胞色素c 氧化酶 亚基i 基因和核1 8 s r r n a 基因作为系统发育研究中的分子标记。本项研究应用d n a 序 列测定技术对来自湖北省神农架林区、武汉、襄樊、江西省、广东省、云南省、河北省 等地区的i l 属3 1 种皿蛛及一个园蛛科和一个球蛛科外群的m t d n a c o i 和核1 8 s r r n a 基因部分序列进行了测定，并从g e n b a n k 上下载了2 种微蛛的同源序列。 基于m t d n a c o i 对皿蛛科蜘蛛构建的系统树将它们分为了两个类群，其中一个类群 与形态分类中的微蛛亚科相对应，包括了传统形态分类中微蛛亚科的几种和钩舟斑皿 蛛；另一个类群包括了形态分类中皿蛛亚科的盖蛛属，盾蛛属，侏儒蛛属，中皿蛛属， 斑皿蛛属和苔蛛属。基于1 8 s r r n a 基因对皿蛛科蜘蛛构建的系统树将它们分为了两个类 群，其中一个类群与形态分类中的皿蛛亚科相对应，包括了传统形态分类中盖蛛属、盾 蛛属和斑皿蛛属；另一个类群包括了形态分类中微蛛亚科的几种和皿蛛亚科的侏儒蛛 属，中皿蛛属，斑皿蛛属和苔蛛属。钩舟斑皿蛛与微蛛亚科始终聚到一起，因此建议将 它从斑皿蛛属中移出。未知斑皿蛛2 与盖蛛属始终聚在一支，因此须要进一步将它定种 并建议重新归属。另外，仅选取了盾蛛属、苔蛛属、侏儒蛛属和中皿蛛属各一种，斑皿 蛛属两种，可能是由于选取的种类太少，地理分布过于狭窄，代表性不够，导致它们的 归属和形态上的分类出现了分歧。 m t d n a c o i 和核l8 s r r n a 基因在研究皿蛛科系统进化方面是较有用的基因，然而 其序列所提供的遗传信息尚不足以得出完全正确的系统树。我们认为对于系统进化研 究，增加分类单元，增强分类单元的代表性，迸一步分析比较更多的d n a 序列，通过 多种途径的正确分析，是十分必要的。 关键词：皿蛛科；线粒体细胞色素c 氧化酶亚基i ( c o d 1 8 s 核糖体r n a 基因；分子系统发育 a b s t r a c t t ok n o wt h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so ft h el i n y p h i i d s ，w es e l e c t e dt h em i t o c h o n d r i a l g e n ec y t o c h r o m eco x i d a s es u b u n i tl ( c 0 1 ) a n dt h en u c l e a rg e n e18 s r r n aa sm o l e c u l a r m a r k e r so ft h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i s f r a g m e n t so fc o ia n d18 sg e n e so f31l i n y p h i i d s t a x a ( r e p r e s e n t i n g11o f t h eg e n e r a ) a n dt w oo u t g r o u p s ，c o l l e c t i n gf r o mh u b e is h e n n o n g j i a ， w u h a n ，x i a n g f a n ，g u a n g d o n g ，j i a n g x ia n dy u n n a np r o v i n c e s ，w e r es e q u e n c e d a n dw ea l s o d o w n l o a d e d2h o m o l o g o u ss e q u e n c e so f e r i g o n ef r o mg e n e b a n k t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： a c c o r d i n gt ot h ep h y l o g e n e t i ct r e e sc o n s t r u c t e d ，t h el i n y p h i i d sf a l li n t ot w og r o u p s o n e g r o u pi sf o r m e db yt h el i n y p h i i n a es p i d e r so f n e r i e n e ，f r o n t i n e l l a ，c e n r o m e r u sa n dm e i o n e t a w h i l et h eo t h e rg r o u pc o n t a i n st h es p e c i e so fe r i g o n i n a ea n dl i n y p h i i n a es p i d e r so f l e p t h y p h a n t e sa n dt a p i n o b a w ef o u n dt h a tl e p t h y p h a n t e sa d u n c u ss h o u l df a l lu n d e rt h e e r i g o n i n a eg r o u pa n dl e p t h y p h a n t e ss p 2f a l lu n d e rt h en e r i e n eg r o u p w es e l e c t e dj u s to n l y o n eo rt w os p e c i e so ft h eg e n e r a so ff r o n t i n e l l a ，c e n r o m e r u s ，m e i o n e t a ，l e p t h y p h a n t e s a n dt a p i n o b a ，s ot h e y 剐旧u n r e p r e s e n t a t i v ea n dc o n f i n e dg e o g r a p h i c a ld i s t r i b u t i n g ，t h e i r p o s i t i o ni nt h em o l e c u l a rt r e ei si n c o n s i s t e n tw i t ht h a ti nt h em o r p h o l o g i c a lt r e e w ef o u n dt h a tt h ec o ia n d18 sg e n e sw e r ee f f e c t i v eg e n e so nt h ep h y l o g e n ys t u d yo f l i n y p h i i d a e h o w e v e r ，t h eg e n e t i ci n f o r m a t i o np r o v i d e db yt h ef r a g m e n t so ft h et w o s e q u e n c e sc o u l d n tb es u f f i c i e n tt or e c o n s t r u c tt h ec o r r e c tp h y l o g e n e t i ct r e e s i ti sv e r y n e c e s s a r yt oi n c r e a s et h en u m b e ro ft a x a ，r e i n f o r c et h er e p r e s e n t a t i v e n e s s ，a n a l y s i si n m u l t i p l em e t h o d sa n dc o m p a r em o r eg e n es e q u e n c e s k e yw o r d s ：l i n y p h i i d a e ；m i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m ec o x i d a s es u b u n i ti 18 s r i b o s o m er n a g e n e ：m o l e c u l a rp h y l o g e n y 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：z 、客孚么 e l 期：少o g 年6 月彩日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影 印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校 可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：王楫乞 指导教师签名：侈旌 日期： 沙口g 6 6 e j 期：办叼9 f 罗 1 前言 1 1 分子系统学概述 1 1 1 分子系统学的产生 1 前言 生物系统学是研究生物多样性以及它们中间的任何一个类群和其他类群的各种关 系的科学。系统学的研究是建立在分类学基础之上的，而对生物进行分类是人类认识生 物世界的第一步。3 0 0 0 年前我国的甲骨文已有了许多动植物的名称，公元前4 世纪的亚 里士多德对动植物的记述，1 6 世纪李时珍的本草纲目等等都是人类对生物分类的初 步总结。1 8 世纪林奈( l i n n a e u s ，1 7 5 8 ) 双名法的建立为对生物多样性描述和分类奠定了 基础，由于林奈这一系统的严谨性、科学性而很快得到公认，并被进化学家拉马克、达 尔文、h a e c k e l 所采用。1 8 6 0 年海克尔提出了系统发生( p h y l o g e n y ) 这一概念。研究系统 发生的主要任务是探讨物种之间的历史渊源以及物种之间的亲缘关系。但早期建立起来 的生物系统发生史很少有客观标准。这样直到本世纪上半叶人们关注的焦点仍然是物 种、物种形成和地理变异而不是生物发生。1 9 4 2 年j h u x l e y 出版的进化论的现代综 合中仍未出现系统发生这个词。后来德国植物学家w z i m m e r m a n 建立了顶枝学说 ( t e l o m et h e o r y ) 和德国昆虫学家w h e r m i g 创建了分支系统学说( c l a d i s t i cs y s t e m a t i c s ) 。他 们都是基于现存生物和生物化石的共同特征来概括提炼出一些客观标准来重新构建生 物进化史的。6 0 年代开始，新的系统发生数据逐渐积累，计算机硬件和软件的建立，使 系统发生学取得了长足的进步，同时蛋白质和核酸分子结构检测方法得到迅猛发展，并 且这些方法很快被进化学家所接受并采用，这样就产生了一门新的学科分子系统 学。分子系统学是用分子生物学的技术和方法来研究生物多样性，以及它们之间相互关 系的科学。它主要包括两大领域，即种群遗传学( p o p u l a t i o ng e n e t i c s ) 和系统发生学 ( p h y l o g e n e t i c s ) ，前者主要研究种内分化，后者主要研究物种多样性及种间系统发生【l 】。 1 1 2 分子系统学的研究及分析方法 分子系统学的研究首先确定所要分析的生物类群，选择该类群中相关亚类群的一些 代表种类；确定所要分析的目的生物大分子( 包括d n a 序列、蛋白质序列等) 或它们的 组合；设法获得它们的序列数据或其它相关数据。1 ) 蛋白质分析技术中常用的方法有： 湖北大学硕士学位论文 免疫学技术，同工酶电泳、蛋白质电泳、氨基酸分析等；2 ) 染色体分析中常用的方法 有：核型分析、带型分析、荧光原位杂交、染色体原位隐藏杂交、引物原位标记、多( 探 针) 引物原位标记等；3 ) 核酸分析方法目前常用的：d n a 杂交、串联重复序列数目变异、 单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性d n a 、 测序和克隆。在上述方法中主要以核酸分析为主。特别是近几年测序技术的推广和普及， 自动测序技术的发展，序列分析技术越来越多地被采用。 对获得的相关数据进行比对或其它的数学处理，如转变成遗传距离数据矩阵；通过 一些遗传分析软件( 常用的计算机软件如：p h y l i p 、p a u p 、m e g a 等) 对这些处理后的 数据，并基于一定的反映d n a 序列进化规律的数学模型构建分子系统树。数据分析中 常用的一些方法有：1 ) 简约法，这种方法旨在确定最短的系统树，对该树核苷酸或氨基 酸的替代总数应取最小值，其中以f i t c h 和w a g n e r 简约法较为简单，影响较大的有最 大简约法，加权简约法和进化简约法；2 ) 距离矩阵法，此处的距离指相对替代率、遗传 距离或进化距离，距离的算法的单参数法和双参数法较为常用。在获取距离距阵后，按 一定的规则，根据各距离值间的内在关系构建系统树。距离法适合于分析各种方法获得 的分子数据，如序列测定、r f l p 、r a p d 等。常见的方法有：不加权成对群算术平均 ( u p g m a ) ，f i t c h - m a r g o l i a s h 法、转化距离法、邻接法( n e i g h b o rj o i n i n g ，n j ) 等；3 ) 最 大似然法，以各种假设的进化数学模型对观测结果进行检验，选出具有最大似然函数的 模型构树，常见的方法有l a n g l e y 法、f i t c h 法和f e l s e n s t e i n 法等；4 ) 由m l 法延伸的 贝叶斯法【2 j 。 对构建的系统树做相应的数学统计分析以检验系统树的可靠性。在分析具体的研究 对象时，上述各个环节是紧密联系的一个整体，要获得一个正确的结论，必须综合考虑 每一环节之间的内在联系。比如目的基因的选择、数据处理和分析的分类群之间、构树 方法和分析软件的选择之间都有密切的联系。数学统计分析不仅可以比较各种分析方法 的一致性，还可以用于检验系统树的稳定性。系统树的精确性程度不仅与上述的数学模 型和构树方法有关，还与所分析的性状数据本身，即性状的抽样有关。使用同样的构树 方法而取样不同往往得到不同的结果。因而重复抽样方法是目前应用十分广泛的一种检 测系统树精确度的统计检验方法，主要包括自展法和刀切法。前者是一种常用的检验方 法，它根据从原始数据集中随机抽样产生的自展数据集来构建多个谱系树，然后检验这 些谱系树和通过某种方法所构建的与其相对应的一致树之间各个分支的支持率，在同一 谱系树上，自展支持率的高低反映了该分支的稳定度。该方法具有较严格的统计学背景、 2 1 前言 较简洁的实现方案，因此，随着计算机模拟技术的不断发展，自展抽样检验法已成为系 统树的可靠性分析中最主要的方法之一。总之，在数据处理时最好用多种方法进行比较， 以期获得一致的结果，提高结果的可靠性。 1 1 3 分子系统学的应用 目前分子系统学主要应用于生物分类学，构建生物分子树或生物进化树 ( e v o l u t i o n a r yt r e e ) ，又名系统树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) ，是包括生命科学中的进化论、遗传学、 分类学、分子生物学、生物化学、生态学及数学中的概率论、图论、计算机科学和群论 交叉形成的边缘领域。以不同物种的分子数据( 如d n a ) 为依据构建的进化树称为分子进 化树。通过d n a 序列分析研究生物的进化过程，确定物种间的进化关系具有许多优越性。 基于d n a 序列的分子进化树的构建已成为生物系统研究中最重要的内容之一。b e c e r r a 应用分子系统学的方法，还成功地解释了昆虫和宿主植物之间的协同进化关系。除此之 外，分子系统学还能用于中草药的鉴定和分离、人类流行病的分析、病原体查找、基因 和基因组进化、行为学、生态学、生物地理学、发育生理学甚至犯罪学等领域的研究。 1 1 4 分子系统学的新进展 1 ) d n a 条形码 d n a 条形码就是能够用于识别和鉴定某一类群所有物种的一段d n a 序列，有以下 要求：在某一类群的所有物种中都有这段d n a 序列；必须是物种特异性的；可以使用 简便的方法进行研究；在物种之间长度变异不大。d n a 条形码识别原理：建立地球上 所有物种的d n a 条形码数据库，测定待鉴定标本的条形码序列，将待鉴定标本的条形 码序列与条形码数据库中的所有记录进行比对，根据比对结果中与最近邻居的条形码差 异做出结论：已知物种或未知物种。d n a 条形码的意义：快速而准确的识别和鉴定物 种；使非专业人员也能鉴定物种；野外物种识别。d n a 条形码是技术而非科学：d n a 条形码仅供物种识别；d n a 条形码应该跟物种学名一样有承载它的凭证标本或在微小 型种类中有数码图象凭证：d n a 条形码序列应该提交到专门的条形码数据库中；根据 d n a 条形码进行物种识别的前提条件是已经测得并建立了相关类群所有物种的条形码 标记的数据库。 2 ) 组装生命之树 现在是组装地球上所有生物的系统发育树的时候，基因组学和d n a 测序技术已经 3 湖北大学硕士学位论文 能够满足组装生命之树所需要的数据，生物信息学的理论和方法已经能够满足组装生命 之树需要的计算和数据管理任务。 3 ) 谱系基因组学 线粒体的谱系基因组学：从1 9 8 1 年a n d e r s o n 等人完成人类的线粒体基因组全序列 测定以来，已有8 0 0 余种生物完成了线粒体基因组全序列测定，其中，n c b ig e n e b a n k 数据库中收录的线粒体基因组序列中，后生动物7 5 1 种，真菌4 1 种，植物1 5 种，原生 生物3 4 种。动物线粒体基因组约1 4 k b - - - 1 7 k b ，缺乏内含子，所有基因紧密的排列于2 条链上，基因组成相对保守。直翅总目昆虫的线粒体谱系基因组学：目的就是建立直翅 目和直翅总目昆虫高级阶元之间的系统发育关系。通过线粒体全基因组测序、组装、注 释及系统发育分析来实现。到目前已测出2 0 余种直翅目昆虫的线粒体全基因组。 4 ) 系统发育信息学 系统发育信息学是存贮、管理、注释、开发和加工系统树及其相关生物学信息的交 叉学科。它所采用的方法是基于计算机和网络技术，包括大型系统树及其相关生物学数 据库的建立，系统树数据库网络的构架，系统树的可视化显示，小系统树的联合与超树 的建立、用户查询、搜索和下载等，最终目的是要建立一个囊括地球上所有生物的系统 树和其相关的生物学数据库，将各种生物在树上精确定位，并进一步通过对系统发育信 息的查询、搜索、联合与分析，从中获取生命进化的知识和进行生物学的预测。 5 ) 系统发育生物学 系统发育生物学是以系统树为基础的生物学研究，是比较生物学研究从种群思维向 系统树思维和网络思维发展的结果。其研究的主要范围：1 小进化研究：基因谱系；谱 系生物地理学；杂交研究；物种形成：k i n s h i pa n dp a r e n t a g e2 大进化研究；3 性状进 化研究；4 祖先状态估计；5 分歧时间估计；6 协同进化；7 流行病学；8 分子进化( 选 择、重组、漂变、基因流、l g t 、基因重复等) ；9 群体历史( 瓶颈效应、奠基者效应 等) ；1 0 保护生物学。 1 1 5 分子系统发育的理论基础及研究对象 系统发育研究所用的数据主要来自形态、化石和分子等几个方面。一直以来，形态 和化石是系统发育研究的主要数据来源。将物种几个大的主要形态作为分类的依据，这 些分类依据在日、科等分类水平中可以很好的反映物种的分类地位，但在小的分类单元， 如属、种内则不容易确定物种的分类地位。而同一形态种内的多个行为种、近缘种也很 4 1 前言 难区分，如用形态学很难区分库蠓( c u l i c o i d e sk i e f f e r ) l 约种 3 1 。随着分子系统学的兴起和 发展，分子系统发育逐渐占据了系统发育研究的主导地位。分子系统发育( m o l e c u l a r p h y l o g e n y ) 是在分子水平上研究各分类单元的起源及进化关系，可以分为以下几类：1 ) 建立类群之间的系统发育关系；2 ) 确认一个类群的单系性；3 ) 确定一个类群在系统树 上确切的位置；4 ) 检验几个竞争的系统发育假设的可靠性；5 ) 物种鉴定( d n a 条形 码) ；6 ) 种界确定；7 ) 应用分子钟估计分歧年代；8 ) 研究特定类型的性状的进化型 式。 1 1 5 1 分子遗传标记技术 分子系统发育中常用的生物大分子是蛋白质和核酸。2 0 世纪6 0 一8 0 年代，蛋白质的 应用达到高潮，其中以等位酶电泳为主要手段【4 】，另外还有蛋白质一级结构和立体结构 的分析等，而后，随着p c r 和d n a 序列测定技术以及分子数据处理方法的发展，用核酸 ( 主要是d n a ) 序列分析技术测定特定核苷酸序列，比较不同类群个体的核苷酸顺序，据 此推断不同类群之间的演化关系及分类地位，逐渐占据分子系统发育研究的主导地位。 在生物的系统发育应用到的分子生物学方法有分子杂交技术、p c r r f l p ( 限制性片段长 度多态性分析) 、r a p d ( 随机扩增d n a 多态性分析) 、s s c p ( 单链构象多态性) ，d s c p ( 双 链构象多态性) ，微卫星d n a ，核酸序列分析等方法，由于同功酶变异的基因座数日或 是每个基因座上的对偶基因数都l 匕d n a 序列少，在分析相近种的亲缘关系时，灵敏度不 够，无法将不同种分开，因而d n a 技术逐渐取代蛋白质标记，成为研究分子系统分类的 主要工具。r f l p 步骤繁琐、工作量大且成本高；r a p d 用在种以上类群间的比较时无法 得到可靠的遗传距离，且r a p d 还存在再现性低、电泳胶片上同一大小的片段可能不同 源等问题，因此这两种方法运用也比较少。相比之下，核酸序列分析应用于系统发育有 其独特性和优越性，具体表现在：d n a 测序方法的成熟，如毛细管凝胶电泳法、阵 列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法等，这些方法能简便、快速、准确的获得所 需要的核酸序列；应用范围广，无论是从目水平还是到种群水平，都能用核酸序列来 进行研究，尤其是在种、亚种及种群水平上的研究，用核酸序列研究可以得到精确量化 的结果；要求的材料数量少，而且用标本也能进行研究，这就解决了一系列的问题。 d n a 序列分析是目前分子系统发育运用最广、比较可靠的方法。它是通过比较各类 群个体间同源基因或基因片段的核酸序列，从而构建分子系统发育树，推断类群间系统 发育关系的方法。由于用于比较不同个体的差异的同源基因有很多种，并且不同基因进 化速率不同，因此可根据不同的需要，选择合适的区域研究不同阶元类群的系统发育。 气 湖北大学硕士学位论文 分子标记的选择至关重要。不同基因本身就存在着不同进化率和突变饱和率，对不同阶 元应有选择地使用不同的分子标记，也就是说目前还没有哪个基因可以完全作为分子标 记对整个生物界进行建树。因此，应该针对研究目的，有选择地使用分子标记。目前， 下列四种基因经常被用来作为核酸分子标记： 1 ) r d n a 的特点及在分子系统学研究中的应用 匕 = = ：= 卜叼叫= = 二= = = = = 工= = 编l 舔 l 儆嚣l 伐粥妫 l b 1 一 图l 昆虫r d n a 一个拷贝结构模式图 e t s ：外部转录间隔区；1 8 s ：小亚基r n a ：i t s - l ：内部转录间隔区l ；i t s - 2 ：内部转录间隔区2 ； 2 8 s 、5 8 s ：大亚基r n a ；i g s ：基因间隔序列 r d n a 是编码核糖体r n a 的基因，是一类中度重复的d n a 序列，以串联多拷贝形式 存在于染色体d n a 中，每个重复单位由非转录间隔区( h i t s ) 、内转录间隔区( i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r ，i t s ) 和3 种r r n a 基因编码区组成【5 1 ，如图1 。其中r r n a 基因组成一个 转录单元，产生一个前体r n a ；i t s 位于1 8 s 和5 8 s r d n a 之间( i t s i ) 以及5 8 s 和2 8 s r d n a 之间( i t s 2 ) ，在1 8 s r d n a 上游和2 8 s r d n a 下游还有外转录间隔区e t s ，i t s 和e t s 区的转 录物均在r r n a 成熟过程中被降解1 6 1 ；非转录间隔区i g s 将相邻的两个重复单位隔开，在 转录时有启动和识别作用。整1 - r d n a 基因簇从5 到3 ，包括e t s i ，1 8 s r d n a ，i t s i 序列， 5 8 s r d n a ，i t s 2 序列，2 8 s r d n a ，e t s 2 以及i g s l 7 j 。r d n a 3 个区域的d n a 进化速率各有 不同，编码区总的来说，进化速率很慢，非常保守，适合于构建生命系统树的基部分支， 但编码区内，又可分为高度保守区、保守区、可变区和高变区，这些不同的区域，适合 于不同阶元类群的系统发育研究：转录间隔区为中度保守，适合于推断5 1 0 6 年左右的 进化事件；非转录间隔区则进化速度较快，适合于种间关系的研究。由于r d n a 是生物 界普遍存在的遗传结构，具有多拷贝性及上述种种优点，因而在个体及群体内有较好的 均一性，少量样品能有效代表其来源群体的r d n a 的变异情况。因此，r d n a 已成为生物 系统进化研究中一个非常有用的分子标记。自h i l l i s ( 1 9 9 1 ) 最先将r d n a 用于系统发育分 析之后，r d n a 在不少昆虫类群的系统进化和分类研究中已得到广泛的应用。1 8 s r d n a 和2 8 s r d n a 已成为高级分类阶元研究的重点，其中，1 8 s r d n a 较大( 大约2 k b ) ，全序列的 分析结果可靠，基本上与传统形态学推断致，是r d n a 中保守性最好的部分，适于高 6 1 前言 级分类阶元和远缘物种关系的分析，以及推断早期的进化事件，其中存在一些变化的区 域，其可做为科水平以上的分类依据【8 9 】。2 8 s r d n a 更大( 3 - - - - 4 k b ) ，包含的系统发育的 信息则较多，d 2 、d 3 区主要用于昆虫高级分类阶元科、属水平以上的研究】。高可 变区序列也可用于属级或种级水平的系统发育关系研列1 2 1 ”。编码5 8 s r r n a 的基因片 段由于太短( 1 0 0 - - - , 1 5 0b p ) ，包含的系统发育的信息太少，进化较慢，适合于纲水平上的 研究，故在这一领域很少用其做为研究的依据。i t s l 和i t s 2 一般在昆虫中全长1 o 1 5 k b ，由于受到的选择压力小，变异较大，可用于属、种、种群水平的研究。目前，这一 区主要被用于近缘种或低级分类阶元的系统发育。c a m p b e l l 等将i t s 片段用于膜翅目金 小蜂科复合种的系统发育分析【l4 1 ，p o r t e r 等及p a s k e w i t z 等分别将i t s 片段用于双翅目按蚊 科复合种的系统发育分析中【1 5 1 6 1 ，k u p e r u s 等用i t s 进行蝗科蚱蜢贬科的系统发育关系分 析【l7 1 。基因间隔区i g s 区包括e t s 区和n t s 区，仁t i t s 区更长( 4 s k b ) ，属于高度变化区， 可用于低分类水平的研究，如：种、种群等以下水平的研究，尤其是对种的分类与鉴定， 但这一水平，因序列较长，测全序列较难，故一般结合其它分子生物学方法进行昆虫系 统发育【l 引。 2 ) m t d n a 的特点及在分子系统学研究中的应用 爿砰k 罅 t p 硝 图2 昆虫线粒体d n a 结构示意图 线粒体d n a ( m t d n a ) 为双链闭环分子，昆虫的线粒体d n a 大小为1 5 4 1 6 3 k b 左 右，其中含有2 个编码核糖体r n a ( 1 2 s r r n a ，1 6 s r r n a ) 、2 2 个t r n a 、1 个细胞色素 b 、3 个细胞色素c 氧化酶( c o l 、c o i l 、c o i i i ) 、6 个n a d h 降解酶( n d i - 6 ) 和2 个a t p 酶( 6 和8 ) 的基因。从全线粒体基因组数据可以获得5 类重要的进化信息，分别是：d n a 序列信息；蛋白质序列信息；结构信息( t r n a 和r r n a 的二级结构、d - l o o p 或w 富 7 湖北大学硕上学位论文 集区结构) ；基因排列顺序信息；遗传密码变异信息等。由于线粒体d n a 在分子进化 中有许多独特的优越性：m t d n a 的提取类似于质粒，相对于核基因的分离较为容易，基 因组小，具高拷贝数目：基因组中不含间隔区和内含子，无重复序列，无不等交换，在 遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变；遗传过程中遵守严格的母系遗传方式， 从而避免了双亲遗传方式引起的随机性；而且，虽然线粒体基因组的基因排列顺序高度 保守，结构稳定，但m t d n a 序列的取代速率却比核d n a 高5 1 0 倍，因此，由于以 上结构和进化上的特点，m t d n a 已成为研究进化的重要材料。l i u 等最先用m t d n a 的 c o i l 基因对昆虫纲1 0 个目进行了系统发育分析【1 9 1 ，其后不少学者采用m t d n a 对昆虫 不同阶元类群进行了系统发育分析，研究范围从种内种群之间至高级阶元之间的系统发 育分析均有 2 0 - 2 3 1 。m t d n a 序列是研究属、种问系统发育较好的分子标记，应用于系统 进化研究中最多的分子标记基因有c o i ，c o i i ，1 6 s r d n a ，1 2 s r d n a ，n d i 、n d 5 。各 区的进化速度不同，应用的范围也不同。编码区1 2 s r d n a 与1 6 s r d n a 是高度保守的， 适用于高级分类阶元和远缘物种关系的分析，但1 2 s r d n a 较短，包含的进化信息较少， 故在昆虫系统发育中一般不以其做为研究的依据，而1 6 s r d n a 有更多的变化区域，大 多数用于目水平上的系统发育，少数用于科水平上的研究1 2 4 5 1 。n d i 、n d 2 、c oi 、 c o 、c y t b 编码区的核酸序列进化较快，有较多的变化区域，可用于昆虫种、种群水 平的系统发育与区系研究，但从其氨基酸序列来看，属于中度保守的，其可用于科、目 水平上的研究瞄7 1 。另外至少有一个长度变化的非编码区，其中含有丰富的a t 碱基， 在m t d n a 的复制与转录过程中具有重要作用，称为控制区1 2 引，与r d n a 中的i g s 相当， 一般用于昆虫种、亚种和种群水平上的系统发育与区系研究【2 9 0 1 。 3 ) 核蛋白编码基因 m t d n a 由于碱基组成的偏爱及沉默位点的多替代，所以m t d n a 较少用于较高级阶 元的系统发育分析；而r d n a 则排序较为困难。因此，有的学者试图寻找能更好地用于 昆虫分子系统学研究的新基因。编码核蛋白的基因具有易于排定、能明确确定迅速进化 位点，而且在选择适当进化速率的适合某一系统学问题的基因上具有灵活性，因此目前 已经有一些编码核蛋白的基因被应用于昆虫的高级阶元的系统发育分析中。其中，延长 因子e f 1a ( e l o n g a t i o nf a c t o r - ia l p h a ) 是应用最多的一种分子标记基因，研究表明，它 的序列对种和科( 亚科) 内属的研究上特别有用【3 1 - 3 3 1 。r u s s o 等用乙醇脱氢酶基因( a i c o h o l d e h y d r o g e n a s eg e n e ，a d h ) 研究果蝇及其相关属的系统发育分析1 3 4 1 ；m a t z k i nlm 用葡 萄糖6 磷酸脱氢酶基n ( g 6 p d h ) 和a d h 基因在种水平上对果蝇进行了研究【3 5 】。此外， 8 1 前言 d d c 、h b 、p e r 、p e p c k 和w g 等非单拷贝核基因也较广泛应用于昆虫系统发育研究。 4 ) 卫星d n a 和微卫星d n a 卫星d n a 进化速率高，序列通常具有种的特异性，卫星d n a 可通过序列扩增，不 等交换，点突变和基因交换而发生变化。研究发现，仅有少数例子证明在整个属内有相 同的卫星d n a 序列，在许多属中，卫星d n a 可用于种的鉴别【3 6 1 。微卫星d n a 则可用于 产生d n a 指纹来进行近缘种或生物种的进化研究。 1 1 5 2 分子系统发育存在的热点问题 系统发育分析是系统学研究的热点，通过分子系统发育研究，对传统分类有疑问的 类群或形态分类不能解决的类群的系统发育进行分析和探讨，也可对传统的分类系统进 行验证。目前已有许多类群进行了分子系统发育分析，从种级至目级阶元都有研究。分 子系统学研究结果与传统的分类系统及形态支序分析的结果有的相一致，但有的却很矛 盾。一些学者认为分子特征相对来说要弱些，而另一些则认为形态学特征很可能引起误 差。经研究证明，在进化过程中，自然选择能导致形态的迅速分歧，即使当两个种群享 有一个共同祖先或一直存在着基因交流；自然选择可引起在进化上不同祖先的种群承受 着特征的趋同，造成形态上相似性，而且形态学特征( 如身体和角的大小等) 也会受到环 境因子如食性的影响、生物因子以及社群进化的影响。因此g e i s t 认为形态学特征不能 反映出系统进化关系，马渡峻辅也总结了分子学特征较形态学特征有更大的优越性，如 碱基数量大、碱基之间相互独立、容易比较它们之间的差异以及可完全排除环境因素的 干扰等，因而认为分子学特征适合于分类及系统进化的研究。哺乳动物的研究表明，分 子学能独立提供对依据形态学的系统进化关系的检测，并对这两种特征数据问的一致性 进行了讨论。但h i l l i s 等认为分子学与形态学上的矛盾已被过分强调了，虽然分子系统 学的发展并没有导致对形态学产生的进化假设上的广泛贬斥，但是分子学途径在产生和 难验证有争议的系统进化假设上，具有潜在的强大说服力。形态学特征可以从古代化石 中得到，且可广泛地保存收集，而分子学特征都有一个明显的遗传基础，得到的特征仅 受到基因组大小的限制，并且在许多情况下，依据分子比较而决定的关系是同由形态学、 行为学特征得到的关系是一致的。但是由单个多肽导出的分子系统相互之间经常不一 致，在真核生物的研究中，由形态学推出的和由氨基酸序列推出的系统关系也缺乏一致 性，针对某个蛋白质在所检测的分类群数目上有很大的不同，且在分子学研究中缺乏在 形态学比较中有代表性的分类群。p a t t e r s o n 等也讨论了形态学同分子学不一致的原因主 要是不同的样本数、不同的分析方法、同源性的估计问题以及人为误差等。分子系统学 9 湖北大学硕： ：学位论文 中，取样问题比在形态学中更为严重，有经验的形态学家主要基于众多的样本群体的研 究；而分子系统学家则被迫用有限的样本，且测定一个或两个种作为代表来产生系统树。 如果单从分子学角度来说，分子系统树间的不一致如同形态学上的不一致一样的显著、 普遍，且分子系统学还没有涉及到许多重要的高级分类单元( 如昆虫) ，但在原核生物中， 形态学还不能提供有价值的信息，但在一些形态学数据不完整、或存在缺陷、或很难分 析的情况下，分子系统学就显示出强大的应用能力。所以形态学特征与分子学特征是相 互补充的，只要用适合的分析方法进行研究，就会得出一致性的结论。如果把形态学特 征与分子学特征结合起来研究，将会对生物系统进化过程提供一个更完美的解释i ”】。 1 2 蜘蛛分子系统发育学研究概况 蜘蛛在动物分类系统中属于节肢动物门( a r t h r o p o d a ) ，螯肢动物亚门( c h e l i c e r a t a ) 的蛛形纲( a r a c l m i d a ) ，蜘蛛目( a r a n e a e a r a n e i d a ) 。蜘蛛是个庞大的家族，种类繁多， 适应性强，繁殖力高，分布极广。全球已知3 6 8 1 属、4 0 0 2 4 种，据统计，中国蜘蛛有 5 8 科5 2 7 属2 8 5 8 种。 长期以来，科学工作者为阐明现存蜘蛛的生物学特性，不断深入进行蜘蛛基础理论， 其中包括蜘蛛系统学研究。目前，该方面的研究业已迈入分子系统学水平。近年来，蜘 蛛分子系统学研究渐趋活跃。核酸( d n a 和r n a ) 是生物体内最重要的信息分子，也 是分子系统学研究中价值最大、信息含量最多的分子。本文结合国内外研究状况，对近 1 0 年来蜘蛛核酸分子系统学的研究从遗传多样性、近缘种鉴别以及分子进化和系统发育 重建3 个方面展开综述。 1 2 i 遗传多样性研究 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。广义地讲，遗传多样性就是生物所携带 遗传信息的总和，但一般所指的遗传多样性是指种内的遗传多样性，或称遗传变异( 3 s 】。 遗传多样性的研究方法除传统的形态观察以外，主要包括在细胞水平上研究染色体及其 变异，同工酶分析以及分子水平上采用r a p d ，r f l p ，s s c p 和d s c p ，d n a 序列分析等 方法。目前d n a 序列分析技术是针对部分d n a 进行的。从原理上可大致分为两类：一 类是直接测序，主要是分析一些特定基因或d n a 片段的核苷酸序列，度量这些片段d n a 的变异性；另一类是检测基因组的一批识别位点，从而估测基因组的变异性。由于重视 程度不够，有关蜘蛛的遗传多样性研究远远落后于其它动物，如水产经济动物，野生动 l o 1 前言 物，昆虫和螨类等。我们曾对美国国家图书馆收录的文献进行检索，2 0 多年来，仅有几 篇文章报道蜘蛛的遗传多样性，但仅在最近5 年内，就有几十篇研究螨类遗传多样性的 文献，而关于昆虫的文献则更多了。很有必要加强对蜘蛛遗传多样性的研究。 h e d i n 等用来自2 5 6 个体的m t d n a 序列数据研究了美国阿巴拉契亚地区洞穴蜘蛛 ( 类球蛛科n e s t i c i d a e 类球蛛属n e s t i c u s ) 种群遗传结构和物种形成机制之间的关系【3 9 1 。 p i e l 等发现已有的等位基因酶研究显示园蛛科( a r a n e i d a e ) m e t e p e i r a 属的四个墨西哥种 群是同种，这与形态学和行为学研究相悖，因此p i e l 等对其m t d n a l 2 s 核糖体r n a 亚 基部分序列测序并分析，认为由等位基因酶数据得出的种群结构可能不可靠【4 0 】。王新国 等曾利用酯酶同工酶从遗传和生化角度对8 种蜘蛛的遗传多样性和系统发育关系进行了 研究【4 l 】。 1 2 2 近缘种鉴别 有关蜘蛛的分类鉴定工作，从总体上看主要还是以成蛛触肢器和外生殖器的形态特 征为主要依据进行的。但是面对一些形态特征极为相似的近缘种，传统的方法分类起来 很困难。在分类学理论和方法的探索和研究空前活跃的同时，具体的分类方法也发生了 很大的变化。通过采用新技术新方法，使分类学性状的来源更加广泛、更加可靠。 如b o n d 等基于线粒体d n a l 6 s r d n a 序列数据发现采自四个地方的a p t o s t i c h u ss i m u s ( c y r t a u c h e n i i d a e ) 的遗传差异达到了6 一1 2 ，若以进化时间作为标准应分为两个种， 这意味着对某些扩散能力有限的蜘蛛类群而言，基于形态特征的物种概念可能低估了进 化上的多样性【4 2 1 。后来b o n d 又综合利用地理的，形态的和分子数据来分a p o m a s t u s 属 ( c y r t a u c h e n i i d a e ) 两种仅凭形态无法鉴别的种类，同时还评价了分子数据在分类学中 的作用，和很多其他学者一样，他也认为分子数据作为一种分类形状，还是一定要建立 在形态学分类体系的基础上【4 3 】。p a q u i n 等首次尝试用线粒体c o i 序列来鉴定濒危的 c i c u r i n a ( d i c t 3 r n i d a e ) 未成熟个体，尽管这显示了“分子分类学”的强大优势，但作者 同时也指出“分子分类学必须以已有的综合分类系统( 包括形态、行为性状等) 为基 础，建立“多维的 分类体系m 。此外，通过研究近缘种( 特别是那些在形态上已分化 成不同的种但还能杂交) 之问的遗传关系才能使人们更好地理解物种形成过程。如c r o u c h e r 等就通过用线粒体c 0 1 、1 6 s r r n a 、t r n a l c l l ( c u n 和n d i 基因序列研究t e g e n a r i a a t r i c a 组a g e l e n i d a e 3 种蜘蛛的遗传关系，可能存在从zg i g a n t e a 至：j t s a e l ，a 的不对称的基因渗入 4 5 1 。 湖北大学硕士学位论文 1 2 3 分子进化和系统发