（应用化学专业论文）真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究.pdf

学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注 和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本 人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 啤一 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：斟潍堙耻 指导教师签名： 签名帆沙加年白7 日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 本论文主要以真菌青霉菌q q 和细菌e x j g u o b a c t e r y u ms p t l 为研究对象，首先，考 察两种菌株单独作用对偶氮染料的脱色特性，同时将两种菌株协同处理偶氮染料活性深 蓝k r ；利用表面响应法优化厌氧无机盐培养基条件和脱色条件并考察了盐度及金属离 子的存在对协同脱色的影响；将青霉菌q q 作为生物吸附剂，研究其对铜离子的吸附去除 情况及吸附特性。 1 在脱色特性的考察中，改良马丁培养基为青霉菌q q 富集培养基；厌氧无机盐中 添加葡萄糖、酵母浸粉均可促进两种菌株对偶氮染料的脱色情况；青霉菌q q 、细菌t l 对 大部分染料均有较好的脱色效果。 2 利用表面响应法对厌氧无机盐培养基和脱色条件进行优化，结果如下：q q 接种 量1 5 、t l 接种量1 5 、葡萄糖浓度0 2 5 、酵母粉浓度0 0 4 ，2 4h 脱色率为9 9 ；t ( o c ) 3 5 8 5 ( o c ) 、p h 7 0 4 、染料浓度( m g l ) 为2 4 9 4 9 ( m g l ) ，2 4h 脱色率为9 9 ：n a c i 浓度在1 9 范围内，对活性深蓝k - r 协同脱色都在9 0 ，但当盐度由1 l 增至1 5 时，脱 色具有一定的抑制作用，当盐度为1 5 时，对活性深蓝k - r 协同脱色为6 8 ；随着染料浓 度的增加，青霉菌q q 和细菌t l 对活性深蓝k r 协同脱色率逐渐降低；s n 2 + 、m n 2 + 、m 9 2 + 离子 对协同脱色具有微弱促进作用，或是影响不大。c a 2 + 、k + 、z n 2 + 、f e 2 + 离子对协同脱色具有 微弱抑制作用。c u 2 + 、f e ”、b a 2 + 、h 9 2 + 、c 0 2 + 离子对协同脱色具有明显的抑制作用，n i 2 + 离子对协同染料脱色抑制作用强。 3 利用表面响应法对青霉菌q q 吸附重金属进行优化，得出吸附的最优条件为：青 霉菌q q 接种量为4 6 、p h 为4 8 5 、c u 2 + 浓度1 0 0m g l ，3 0m i m 青霉菌q q 对c u 2 + 瞬间去除率 为9 9 。吸附平衡时间为3 0m i n 。利用l a n g m u i r 吸附模型能较好的描述菌株q q 对c u 2 + 的等 温吸附行为，最大吸附量为5 0 7 6m g g 关键词：青霉菌q q ；e x i g u o b a c t e r i u ms p t l ；协同；表面响应法；偶氮染料； 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 d e c o l o r i z a t i o no fa z od y eb yf u n g ia n db a c t e r i ac o c u l t u r e s a n ds t u d yo nt h ec h a r a c t e r i s t i c s a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sd i s s e r t a t i o nw a st o i n v e s t i g a t et h ep o t e n t i a la b i l i t yo fd e c o l o r i z i n g a z od y e sb yp e n i c i l l i u ms p q q ，e x i g u o b a c t e r i u ms p t la n dt h es y n e r g i s mo ff u n g a ls t r a i n p e n i c i l l i u ms p q qa n db a c t e r i a ls t r a i ne x i g u o b a c t e r i u ms p t l t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o r d e c o l o r i z a t i o nw e r ed e t e r m i n e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) p e n i c i l l i u m s p q q w a su s e da sa san o v e lb i o s o r b e n tf o rt h er e m o v a lo fc o p p e rf r o ma q u e o u s s o l u t i o n a n dt h e o p t i m a lb i o s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r ee s t i m a t e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) u s i n g c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ( c c d ) m e t h o d 1 u n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n s ，g l u c o s ea n dy e a s te x t r a c tc o u l de n h a n c et h ed e c o l o r i z a t i o n f o rb o t hs t r a i n s ，s ot h e ys e l e c t e da st h eb e s tn u t r i e n tf o rd e c o l o r i z a t i o n 2 t h e o p t i m a l c o n d i t i o n sf o rd e c o l o r i z a t i o nd e t e r m i n e d b yr e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ( r s m ) w e r ea sf o l l o w s ：15 ( w v ) o fb o t hs t r a i n sq qa n dt l ，0 2 5 ( w v ) o f g l u c o s e ，0 0 4 ( w v ) o fy e a s te x t r a c t ，p h7 0 4 ，3 5 8 5 0 ca n d2 4 9 4 9m g lo fi n i t i a ld y e c o n c e n t r a t i o n i tw a ss h o w nt h a ta b o u t9 9 o f2 4 9 4 9m g lk rc o u l db ed e c o l o r i z e dw i t h i n 2 4hu n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h es y n e r g i s mo fs t r a i n sq qa n dt lc o u l dt o l e r a t e h i g h c o n c e n t r a t i o no fs a l i n i t y a n dm o s to ft h et e s t e dm e t a li o n ss h o w e dl i t t l ei n f l u e n c eo nt h e d e c o l o r i z a t i o ne x c e p tf o rn i p t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a ts t r a i n sq qa n dt lc o - c u l t u r e s c o u l db eu s e f u lf o rt h ep r a c t i c a lb i o r e m e d i a t i o n 3 t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rb i o s o r p t i o nc o p p e ro ns t r a i nq qd e t e r m i n e db yr e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w e r ea sf o l l o w s ：4 6 ( w v ) o fb i o m a s sc o n c e n t r a t i o n ，p h5 6 ， i n i t i a lc o p p e rc o n c e n t r a t i o no f10 0m g l u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s r e m o v a le f f i c i e n c yo f c o p p e r w a sa b o u t9 8 b i o s o r p t i o n e q u i l i b r i u mw a se s t a b l i s h e d a f t e r3 0m i n 1 1 1 e e x p e r i m e n t a lb i o s o r p t i o nd a t aw e r ef i t t e dw e l lt ot h el a n g m u i ri s o t h e r m s t h em a x i m u m b i o s o r p t i o nc a p a c i t yo ft h eb i o m a s sa c c o r d i n gt ol a n g m u i ri s o t h e r mw a s5 0 7 6m g g k e yw o r d s ：p e n i c i l l i u ms p q q ；e x i g u o b a c t e r i u ms p t l ；c o - c u l t u r e s ；r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ；a z o ； 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘；! i 要i a b s t r a c t i i 第一章绪论1 1 偶氮染料的研究进展1 1 1 染料废水的分类、特点及危害1 1 1 1 染料废水的分类1 1 1 2 染料废水的特点及危害1 1 2 国内外偶氮染料废水处理的研究进展2 1 2 1 物理处理法。2 1 2 2 化学处理法。2 1 2 3 生物处理法。3 2 重金属吸附研究进展9 2 1 重金属的来源、分布及危害9 2 2 处理方法9 3 本论文研究的内容及选题目的和意义1 0 第二章青霉菌q q 、细菌t l 脱色特性考察1 2 2 1 实验材料与方法1 2 2 1 1 实验材料1 2 2 1 2 实验方法15 2 2 结果与讨论1 8 2 2 1 青霉菌q q 脱色能力的考察。1 9 2 2 2 细菌t l 脱色能力的考察。2 1 2 3 小结2 4 第三章青霉菌q q 与细菌t l 协同脱色特性考察2 5 3 1 材料与方法2 5 3 1 1 实验材料2 5 3 1 2 实验方法2 5 3 2 结果与讨论2 9 3 2 1 厌氧无机盐培养基条件优化2 9 3 2 2 脱色条件优化3 5 3 2 3 盐度对青霉菌q q 和细菌t l 协同脱色的影响。3 9 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 3 2 4 染料浓度对青霉菌q q 和细菌t l 协同脱色的影响4 0 3 2 5 金属离子存在条件下对染料协同脱色的影响4 l 3 3 小结4 3 第四章青霉菌q q 对c u 2 + 瞬间去除条件优化。4 4 4 1 材料与方法4 4 4 1 1 实验材料4 4 4 1 2 实验方法4 4 4 2 结果与讨论4 7 4 2 1 二次多元方程4 7 4 2 2 方差分析4 7 4 2 3 青霉菌q q 对c u 2 + 瞬间去除最优条件确定51 4 2 4 最优值预测51 4 2 5 验证实验5 1 4 2 6 吸附动力学51 4 2 7 吸附模型5 2 4 3 小结5 3 参考文献5 4 攻读硕士学位期间发表学术论文情况6 0 至j 谢6 1 ，一 辽宁师范大学硕士学位论文 第一章绪论 1 偶氮染料的研究进展 传统染料的生产一直是从植物中提取。直到1 9 世纪西欧有机化学的研究工作迅速 发展，从炼焦工业副产品煤焦油中分离出苯、萘、蒽等芳烃化合物，为合成染料提供了 原料，染料生产遂逐渐发展成为一个独立的工业体系【m 】。1 8 5 6 年，英国化学家w h 珀金用重铬酸钾氧化苯胺硫酸盐，得到一种黑色沉淀物，发现它能把丝染成紫红色。次 年设厂生产，取名为苯胺紫染蚪或冒肤，供染色使用，开创了化学合成染料工业新纪元。 1 8 6 8 年，德国化学家格雷贝和利伯合成出茜素；1 8 8 0 年，德国化学家拜尔注册了合 成靛蓝的专利；1 9 0 1 年，德国化学家博恩合成了蓝色染料阴丹士林。这三种化 合物是合成染料工业发展中三个里程碑式的发明。1 8 7 6 年德国维特氏提出染料发色 团假说，认为染料要成为有色色素，色素分子必须要存在有特定的不饱和原子团， 他把这些特定的原子团分为发色团及助色团。该发色理论对染料化学及工业影响深 远。染料工业已有百余年的历史，并且发展日新月异。染料工业生产的各类染料、 有机颜料及荧光增白剂等广泛应用于纺织、食品、橡胶、皮革、塑料、涂料、油墨、 化妆品等各个领域，极大地丰富了人们的物质与文化生活。但随着染料与印染工业的 迅速发展，其工业废水已成为当前最主要的水体污染源之一f 3 - 5 】。 1 1 染料废水的分类、特点及危害 1 1 1 染料废水的分类 染料是一种人工合成的大分子芳香烃化合物，但只有吸收的光谱在3 5 0n i n 7 0 0a m 处才可以显示颜色。染料是指在一定介质中，能使纤维或其他物质牢固着色的化合物。 作为染料，必须有发色基团( 染料母体) 和助色基团( - - n r 2 、_ n h r 、- n h 2 、- o h 、 _ n 0 2 、- o c h 3 和卤素等) 相互配合，缺一不可。助色基团的存在使染料物质离子化， 极性增强，促进染料与组织间发生作用，产生染色效果。一般染料皆属有机物质，分为 天然与合成两大类。染料种类繁多，化学成分复杂，其分类方式主要有两种依据，即按 化学结构分类和按染料的应用分类。按应用分类，则可分为直接染料、氧化染料、硫化 染料、冰染染料、还原染料、活性染料、酸性染料、分散染料、媒染染料、阳离子染料 和荧光增白剂等。按化学结构分类，染料可分为偶氮染料( 单偶染料、双偶染料、三偶 染料、多偶染料等) 、葸醌染料、二苯甲烷染料、苯乙烯基染料、二苯乙烯染料、靛兰 染料、芳基甲烷染料等，其中偶氮染料产量最大，葸醌染料次之【6 】。 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 1 1 2 染料废水的特点及危害 ，目前，我国的染料年产量约为4 2 万吨，占世界总产量的4 5 ，居世界首位【7 j 。染 料在给人们带来经济效益和绚丽多彩的同时，也产生了大量的“三废”，特别是废水的大 量排放，每吨染料平均用水在5 1 8 吨【引。化学合成染料的制造以萘、蒽、甲苯、咔唑等 芳香族碳氢化合物为主要原料，使用的药剂有各种无机药品，如硝酸、硫酸、盐酸等无 机酸类；有机工业用品有醇类、酸类等；苛性钠碱类；氯化物、铁、氨、铜等盐类。由 原料合成中间产物最终合成染料，发生的反应有硝化、卤化、磺化、碱融、氧化还原、 重氮化偶合、水解、缩合等，几乎涉及全部有机合成所需的基本反应桫j 。染料工业废水 通常具有极大的色度，即使浓度不足1m g l ，有些染料在水中也可使废水显示出明显的 颜色。随着精细化工染料、颜料等行业生产流程延长，从原料到成品往往伴随有多种单 元操作过程，产品收率低，副反应多，所以废水中有机物含量比较高，可生化性较差， 成分非常复杂。在染料生产过程中，常用盐析的手段来回收染料，这就使得大量的无机 盐无法去除并随生产废水排至环境中。根据所生产染料的工艺和种类的不同，染料工业 废水中的含盐量在2 1 5 之间，而且硫化物含量较高。染料中某些化合物已被证明对人 体具有毒害作用。且浓度高时，所有染料对微生物都有抑制作用。此外，染料生产过程 中产生芳族硝基化合物、芳族卤化物、芳族胺类化合物、联苯等多苯环的取代化合物都 具有致突变、致癌和致疾效应。染料产品往往具有多品种小批量的特点，染料企业每年 要生产十几种甚至几十种产品，而且产品制造大部分是间歇性操作，故废水的水质和水 量极不稳定，因此处理难度较大。据统计，在染料生产过程中，约有2 0 的有机原料和 9 0 的无机原料转移到染料废水中，此外，每生产约1 吨染料，约有2 的产品随废水 流失，因此染料工业废水的成分极其复杂，对环境造成了巨大影响并对人类造成巨大危 室【1 0 】 白o 1 2 国内外偶氮染料废水处理的研究进展 1 2 1 物理处理法 ( 1 ) 吸附法 吸附法是目前工业上处理染料废水的主要方法之一，常用的吸附剂有活性硅藻和土 活性炭等，它不仅能去除染料废水中的各种有机物、色和毒，具有占地小、操作简单、 效果好等优点。其特点是具有很大的比表面积及多孔结构即吸附容量大。但物理吸附法 不能实现有机物的降解只是简单的污染物的富集过程，容易造成二次污染，并且吸附剂 以及吸附剂的再生过程运行成本较高，因此不适于作为染料工业废水处理的首选方法。 2 ， 辽宁师范大学硕士学位论文 1 2 2 化学处理法 ( 1 ) 化学氧化法 化学氧化处理技术具有效率高、适应能力强等优点，但具有能耗高，单位体积废水 处理成本高且在处理高浓度、大流量的染料废水时存在效率偏低等的缺点，主要包括臭 氧氧化法、光催化氧化法、过氧化氢氧化法以及新兴的湿式氧化技术等，所以不适于作 为独立的处理染料工业废水的方法。 ( 2 ) 混凝法 混凝法被认为是最经济、最有效的脱色技术之一，混凝法的主要优点是处理量大、 工程运行成本低、对疏水性染料脱色效率较高；具有需随着水质变化改变投药条件，对 亲水性染料的脱色效果低，对c o d 去除率低等缺点；主要包括混凝气浮法和混凝沉淀 法，采用的混凝剂可分为无机和有机两大类。在处理过程中产生大量泥渣且脱水处置困 难，严重的影响了该方法在染料工业废水处理中的应用。 ( 3 ) 电解法 电解法处理染料废水的原理是阳极铁不断地失去电子，大量的f e 2 + 进入溶液，形成 具有较高吸附絮凝活性的絮凝剂，它能有效地去除废水中染料胶体微粒和杂质。据报道， 电化学技术是处理色度、b o d 5 、c o d 和t s s 的有效方法。除阳离子染料外，它对其它 的染料的脱色率均大于9 0 ，然而c o d 的去除率随染料不同而不同，其顺序如下：还 原染料、活性染料 中性染料、直接染料 阳离子染料、硫化染料 酸性染料。 1 2 3 生物处理法 生物法是目前应用最广的废水处理技术，具有运行费用低、无二次污染、安全、对 环境友好等优点，在含染料废水处理中应用较广泛。目前，已发现许多使染料脱色的微 生物资源，主要有真菌、细菌和藻类。 ( 1 ) 真菌 近年来，真菌在染料脱色中的作用受到广泛的关注，目前报道的脱色真菌多达几十 种。白腐真菌是目前研究最多、染料脱色过程中最有效的真菌。白腐真菌为丝状真菌， 系木腐真菌的一种，着生在木材上，以能降解木材中的木质素、半纤维素和纤维素获取 自身生长和繁殖所需的养料和能量，并使木材呈现特征性的白色腐朽状而得名，多属于 担子菌纲( b a s i d i o m y e c e t ) 。白腐真菌的种类很多，其中典型的有如下几种：t i n c t o p o r i as p ， 黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ) ，特罗格粗毛盖菌( f u n a l i at r o g i o ， t r a m e t e sh i r s u t e ，烟管菌( b j e r 勉n d e r as p ) ，采绒革盖菌( t r a m e t e sv e r s i c o l o r ) ，p l e u t r o t u s o s t r e a t u s ，杂色云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) ，朱红密孔菌( p y c n o p o r o r u sc i n n a b a r i n u s ) 等。1 9 8 0 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 年，d e a t o n 报道白腐真菌p h a n e r o c h a e t tc h r y s o s p o r i u m 和t i n c t o p o t i as p 对含木质素的 纸浆和造纸废水的生物脱色【以引。由此展开了真菌对染料生物脱色降解的研究。近年来， 由于白腐真菌对染料的脱色特性，使白腐菌的研究成为环境科学研究的热点之一。 ( 2 ) 细菌 7 0 年代初，h o r i t s u 1 4 1 首次分离出可以降解偶氮染料的细菌b a c i l l u ss u b t i l i si f o 3 0 0 2 ，为微生物脱色染料开创了新纪元。迄今已发现具有偶氮还原能力的细菌主要有来 自假单胞菌属( p s e u d o m o n o s ) 、鞘氨醇单胞菌属( s p h i n g o b a c t e r i u m ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、 大肠杆菌属( e s c h e r i c h i ac o l o 、梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 等，同时还有许多其他属中的偶氮还 原菌，如k o l e k a l r 等人分离出了一株b a c i l l u sf u s i f o r m i sk m k 5 ，能够降解多种偶氮染料 【1 5 】；h o n g 等人【1 6 】分离出的s h e w a n e l l ad e c o l o r a t i o n i ss 1 2 能够以偶氮染料作为唯一电子 受体对其进行脱色。如前所述，由于对氧的敏感性程度不同，存在三种偶氮还原酶，因 此也相应存在三种类型的偶氮还原菌，即厌氧、兼氧及好氧偶氮还原菌。绝大多数偶氮 还原菌都是厌氧菌，也有少数兼性菌及好氧菌的存在。 1 2 3 1 染料脱色机理 ( 1 ) 生物吸附 生物吸附是真菌表面活性基团如甲壳素、酸性多糖、脂质、氨基酸及另外一些组成 细胞结构的物质和染料阴离子之间作用的结果。不同生理状态的真菌对染料的吸附机制 不同。活细胞的吸附作用比较复杂，往往菌体利用染料物质代谢生长与吸附脱色同时进 行，死菌体的吸附机制比较简单，主要为物化作用，如吸附、沉积、离子交换等【l 卜川。 2 0 0 7 年g u l a yb a y r a m o g l u 等研究了t r a m e t e sv e r s i c o l o ，对d i r e c tb l u e1 , nd i r e c tr e d1 2 8 的 吸附容量和吸附率，结果表明，t r a m e t e sv e r s i c o l o r 的结构、吸附基团、表面积、形态决 定了它对染料的结合能力。t r a m e t e sv e r s i c o l o r 细胞壁上的多聚糖作为离子交换剂的骨 架，蛋白质、脂质则提供了大量能结合染料分子的吸附基团，这些吸附基团如氨基、羧 基、巯基、磷酸基、硫醇基对染料有不同的亲和力和特异性【l 引。 ( 2 ) 生物降解 生物降解是在微生物的作用下，使复杂的化合物结构破坏并分解为简单物质的过 程。在染料降解过程中，真菌的作用受到广泛的关注，其中白腐真菌被誉为最有效的微 生物资源。大多数白腐真菌具有脱色及降解能力是因为它们在次级代谢阶段产生木质素 过氧化物酶( l i p ) 、漆酶( l a c c a s e ) 、锰过氧化物酶( m n p ) 。白腐真菌的降解机制是：依赖一 个主要由细胞产生分泌的酶系统组成的细胞外降解体系，需氧并靠自身形成的h 2 0 2 激 活，由酶触发启动一系列自由基链反应，实现对底物无特异性的氧化降解，主要包括单 4 辽宁师范大学硕士学位论文 电子氧化、酷质氧化、共代谢等过程【2 0 2 1 】。细菌主要通过偶氮染料还原酶进行偶氮染料 的生物降解。 1 2 3 2 脱色酶资源及其研究进展 近年来，许多研究表明，真菌能降解染料主要是由于其具有非特异性和非选择性的 胞外酶系。由于白腐真菌能产生木质素降解酶系并分泌到细胞外，为非底物专一性酶， 对多种有机物和染料具有广谱的氧化降解作用。木质素降解酶系主要由漆酶( l a c c a s e ) 、 木素过氧化物酶( l i p ) 、锰过氧化物酶( m n p ) 组成。 ( 1 ) 漆酶 1 8 8 3 年y o s h i d a 首先从漆树分泌物中发现了漆酶，但当时他并不了解漆酶的本质， 他把这种物质称之为“淀粉酶d i a t a s e ”。几年后，b e r t r a u c l 对这种奇妙的生物活性物质 进行了研究，第一次将其命名为“漆酶 ( l a c e a s e ) 。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广 泛的分布于自然界。漆酶可催化大量酚类化合物和芳香胺的氧化，而且在还原介体物质 存在下，漆酶的底物范围可进一步扩大。漆酶催化底物机制表现在底物自由基的形成和 漆酶分子中四个铜离子的相互协同作用。首先底物与酶活性中心一型铜原子位点结合， 通过c y s h i s 途径将电子传递至三核位点，该位点又把电子传递给氧分子，使其还原成水， 漆酶催化底物氧化和对氧的还原是通过四个铜离子协同地传递电子和价态变化实现的 【2 2 q 3 1 ，其实现过程如图1 1 l t f l k l ；驴i 妣i lm 斋州寺 e u o e u + c t t h 鲁驴咖计专蒲并c 台燃 逢蜃螽 邶甓 掣啊 叠w 图1 1 漆酶活性位点催化氧化机制 科学家对白腐真菌t r a m e t e ：v e r s i c o l o r 降解染料进行了研究，认为这类真菌在降解中 漆酶起重要作用，而且与染料的结构关系密切，部分非底物染料在媒介底物的作用下同 样能够达到比较好的降解效果【2 3 1 。研究人员等将编码白腐菌p h l e b i ar a d i a t a 漆酶基因克 隆于软腐菌t r i c h o d e r m ar e e s i 表达系统中，用纤维素的启动子来启动该酶基因的表达， 表达量达至0 2 0 m g l 。目前多采用固定化漆酶进行纺织染料的处理。但固定化漆酶与游离 酶相比，酶活有所下降，所适应的温度及p h 值范围更加广泛【2 4 1 。 ( 2 ) 锰过氧化物酶 1 9 8 5 年，g o l d 首次从白腐真菌模式菌种一黄孢原毛平革菌( p c h r y s o s p r i u m ) 中发现 锰过氧化物酶( m n e ) 【2 引。锰过氧化物酶( m n p ) 存在于大多数白腐真菌中，由一个红血素 基和一个m n 2 + 构成它的活性中心，是一种糖蛋白。酶促反应需要锰离子存在，在离子存 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 在条件下能将芳香环多聚体分解，被认为是木质素降解酶系统的一个重要组成部分。锰 过氧化物酶( m n p ) 的活性部位是通过氢键与1 个a s p 结合和1 个远侧的过氧化物酶结合 小区组成，其结构由5 个二硫键和2 个m n 2 + 维持。锰过氧化物酶( m n p ) 的催化是依赖其活 性中心的m n 2 + 离子，m n 2 + 离子在催化氧化中作为必要的电子供体，使缺失电子的酶中间 体恢复到原始状态，产生m n ”离子。如图1 2 所示锰过氧化物酶的催化循环反应如下： m n p + h 2 0 2 - - c o m p i + h 2 0 c o m p l + m n 2 + 一c o m p l l + m n 3 + c o m p l l + m n 2 + 一m n p + m n 3 + + h 2 0 2 h m n 蔗糖 乙酸钠 酵母粉 乳酸钠 蛋白胨。 夺i l葡绚秘藏她蛋i ，| 胨酚埘粉乙敞钠乳酸钠 图2 6 不同营养物质对青霉菌q q 脱色活性深蓝k r 的影响 f i g 2 6e e f f e to f n u t r i t i o ns o u r c eo nq qd e c o l o r i z a t i o no fr e a c t i v ed a r kb l u ek - r ( 3 ) 青霉菌q q 厌氧脱色染料广谱性考察 实验考察了青霉菌q q 厌氧脱色染料广谱性，表2 5 总结了青霉菌q q 厌氧脱色各种染 料的脱色效果，如表所示，青霉菌q q 对大部分染料无论是活性染料还是非活性染料均 具有较好的效果，说明青霉菌q q 厌氧脱色具有非特异性底物【4 3 。n i s h a n t 掣4 4 j 报道厌氧 驯化的细菌对多种染料具有较好的脱色效果。与c h e n 等【4 5 1 报道相似，他们筛选出的六种 细菌对2 4 种染料均具有有效地脱色特性。菌体对多种染料具有脱色特性可能是由染料的 结构和复杂性而定，特别是由芳环取代基的位置及其与偶氮键的相互作用决定l 。7 j 表2 5 青霉菌q q 厌氧脱色染料多样性 t a b l e2 5d i v e r s i t yo fq qd e c o l o r i z a t i o n 染料脱色率染料脱色情况 活性深蓝k r9 5 k 一2 g 7 0 活性黄m 3 b e 活性艳兰x b r 7 5 6 7 舳 帅 如 o 希v 静。蜜 辽宁师范大学硕士学位论文 2 2 2 细菌t l 脱色能力的考察 ( 1 ) 厌氧无机盐中添加不同营养物质对细菌t l 脱色活性深蓝k r 的影响 实验考察了2 4h 后厌氧无机盐中不同营养物质对细菌t l 脱色活性深蓝k r 的影响， 实验结果见图2 6 。从图中可以看出，含葡萄糖的厌氧无机盐中细菌t l 对活性深蓝k r 的脱色效果最佳，2 4h 内脱色率达6 2 。其次是酵母粉，酵母粉是染料脱色过程中最常 用的氮碳源。m o o s v i 掣4 3 】和k h e h r a 4 8 】等都报道菌体在酵母粉存在的条件下，都表现出对 不同染料有效的脱色特性。c a r l i e l l 等【4 9 】报道酵母粉是n a d h 再生过程中必不可少的， n a d h 作为脱色偶氮染料的电子供体，因此酵母粉在染料脱色过程中具有重要作用。无 机盐中不同营养物质对菌株t l 脱色效果的影响顺序为：葡萄糖 酵母粉 蔗糖 乙酸钠 蛋白胨 乳酸钠。 r 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 ( 2 ) 细菌t l 厌氧脱色染料广谱性考察 实验考察了细菌t l 厌氧脱色染料广谱性，表2 6 总结了细菌t l 厌氧脱色各种染料的 脱色效果，如表所示，细菌t l 对大部分染料无论是活性染料还是非活性染料均具有较好 的脱色效果，说明细菌t l 厌氧脱色具有非特异性底物。 表2 6 细菌t l 厌氧脱色染料多样性 t a b l e2 6d i v e r s i t yo ft ld e c o l o r i z a t i o n ( 3 ) 青霉菌q q 和细菌t l 脱色机理的初步探讨 微生物脱色染料主要有两种方式：生物吸附与生物降解 5 0 - 5 。发现在染料脱色过程 中染料溶液的颜色随脱色时间延长逐渐变浅，青霉菌q q 、细菌t l 均能够对染料具有一 定的吸附作用，其菌体从白色变为染料的颜色的过程可以证明，同时，青霉菌q q 、细 菌t l 均能够降解染料，恢复菌球原有的颜色( 如图2 8 ) 。从紫外一可见分光光度计( 2 0 0 n m - 8 0 0n m ) 光谱扫描图可以看出0 时刻与4 8 时刻波形按比例减小，但当1 4 4 时刻波形发生 变化，最大吸收峰消失出并现新的吸收峰，说明在染料脱色过程中产生新的物质，同时 说明染料脱色过程中既有生物吸附又存在生物降解。与g l e n n 和g o l d l 5 2 1 报道一致，他们 推断出p h c h r y s o s p o r i u n 对几种高分子染料脱色发生在次级代谢过程，吸附波长按比例减 少说明吸附作用，当吸附速率在两个吸收峰发生较大变化时，说明菌体开始降解染料。 c h a 等【5 3 】也有相似的报道。m o h a n t y 5 4 l 报道偶氮染料脱色第一部是使偶氮键断裂，在偶 氮染料脱色过程中可能由2 电子2 质子还原过程使是偶氮键断裂。可能是由于青霉菌q q 分泌到细胞外并对多种有机物和染料具有广谱的氧化降解作用的木质素降解酶系。该酶 系主要由漆酶( l a c c a s e ) 、锰过氧化物酶( m a n g a n e s e d e p e n d e n tp e r o x i d a s e ，m n p ) 、木素 辽宁师范大学硕士学位论文 过氧化物酶( l i g i 】j i lp e r o x i d a s e ，l i p ) 组成醐。对于细菌t l ，可能是由于在厌氧脱色过程 中直接或间接地酶促反应，直接酶促反应是通过酶氧化有机底物( 葡萄糖) 使染料脱色， 间接酶促反应通过酶解减少电子载体，使染料脱色。与w u h r m a n n 报道的脱色机理一致 【5 6 】 o 图2 8 吸附染料前后菌体颜色变化 f i g 2 8t h ec o l o rc h a n g e so fc e l lb e f o r ea n da f t e ra b s o r p t i o n a ：吸附前青霉菌q q ；b ：吸附前细菌t l ；c ：吸附后前青霉菌q q ；d ：吸附前后细菌t l ； a ：s t r a i nq qb e f o r eb i o s o r p t i o n ；b ：s t r a i nt lb e f o r eb i o s o r p t i o n ；c ：s t r a i nq qa f t e r b i o s o r p t i o n ；d ：s t r a i nt lb e f o r eb i o s o r p t i o n ； 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 2 3 ，j 、结 本章考察了不同培养基中收集的青霉菌q q 、厌氧无机盐中添加不同营养物质对活 性深蓝k r 脱色效果的影响，并考察青霉菌q q 、细菌t l 厌氧脱色染料广谱性。得出结 论： ( 1 ) 改良马丁培养基中收集的青霉菌q q 对活性深蓝k - r 脱色率 土豆培养基中收集的 青霉菌q q ，因此，后续实验应用改良马丁培养基为青霉菌q q 富集培养基。 ( 2 ) 厌氧无机盐中添加不同营养物质对青霉菌q q 脱色效果的影响顺序为：葡萄糖 蔗糖 乙酸钠 酵母粉 乳酸钠 蛋白胨。 ( 3 ) 厌氧无机盐中添加不同营养物质对菌株t l 脱色效果的影响顺序为：葡萄糖 酵母粉 蔗糖 乙酸钠 蛋白胨 乳酸钠。 ( 4 ) 青霉菌q q 、细菌t l 对大部分染料均有较好的脱色效果。 2 4 辽宁师范大学硕士学位论文 3 青霉菌q q 与细菌t l 协同脱色特性考察 3 1 材料与方法 3 1 1 实验材料 3 1 1 1 菌株 本章实验所用菌株同第2 章。 3 1 1 2 主要试剂 本章实验所用试剂见第2 章。 3 1 1 3 实验仪器 本章所用实验仪器见第2 章。 3 1 1 4 培养基 本章所用培养基见第2 章。 3 1 2 实验方法 表面响应法( r s m ) 是一种多元分析方法，采用该方法可以建立连续变量曲面模型可 同时对影响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价，因此可以快速有效地 确定多因子系统最佳条件【5 1 。本实验分2 个步骤：( 1 ) 厌氧无机盐培养基条件优化；( 2 ) 脱色条件优化。 3 1 2 1 厌氧无机盐培养基条件优化 综合第2 章厌氧无机盐中添加不同营养物质对青霉菌q q 和细菌t l 脱色活性深蓝 k - r 的影响。可以得出，含葡萄糖、酵母粉厌氧无机盐均对青霉菌q q 和细菌t l 脱色活 性深蓝k r 影响较大。且参照m o h a n a 等以葡萄糖、酵母粉浓度、接菌量作为培养基优化 因子1 7 】。因此，以青霉菌q q 接种量、细菌t l 接种量、葡糖糖浓度、酵母粉浓度作为厌 氧无机盐培养基优化因子。 ( 1 ) 实验设计 中心组合设计( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nc c d ) ，通常应用于生物过程优化的实验设 计，本研究采用s t a t e a s e 公司生产的软件d e s i g n e x p e r t 0 0 7 j 茳彳t 实验设计以及数据分析。 根据中心组合设计法，总的实验次数为2 k + 2 k + n o ，式中k 为考察的因子数，这里为4 ； 真菌和细菌协同脱色偶氮染料及其脱色特性研究 n o 为中心点的重复实验次数，这里为6 ；2 k 为轴点( a x i a lp o i n t s ) 的实验次数( 0 【- 2 1 r 2 ) 。中心 组合设计实验因子水平、厌氧无机盐培养基优化见表3 1 、3 2 。配制厌氧无机盐培养基， 装满厌氧小瓶中，每瓶盛液量约1 5m l ，活性深蓝k r 浓度1 0 0m g l ，温度t ( o c ) 3 0 0 c ， 按实验设计加入相