（光学工程专业论文）激光光谱技术用于肝病诊断的初步研究.pdf

摘要 本论文应用激光诱导荧光光谱技术，研究了肝纤维化白鼠及肝硬化患者血清的荧光 光谱，通过分析肝纤维化白鼠和对照组白鼠的荧光光谱，以及健康人及肝病变患者血清 自体荧光光潜，研究激光光谱技术用于肝病诊断的可能性。 文章在综述了激光光谱技术在医学诊断上应用及发展现状的基础上，使用氩离子激 光器为激发光源，利用5 1 4 5 n m 、4 8 8 o n m 和4 7 6 5 n m 三种波长的激发光激发白鼠( 5 9 例 健康8 例；肝纤维化5 l 例) 及人( 1 7 例健康6 例：肝硬化1 1 例) 的血清得到荧光 光谱。本文计算了荧光的相对强度比、半值宽度，对荧光光谱做了二阶导数，以及曾图 分离等处理，对荧光光谱数据作了深入细致的分析。 白鼠与人血清荧光光谱的二阶导数光谱分析表叫，在4 8 8 o h m 及4 7 6 5 n m 的激发光作 用下，在4 9 06 0 0 n m 的范围内，血清荧光光谱的二阶导数光潜在5 2 8 n m ( 人血清出现在 5 1 3 1 1 ) 、5 5 3 n m 、5 8 7 n m 附近出现极小值。健康时前两个极小值的比比肝病变时要小，使 用该参量区分样品时，得到约8 0 戢j 符合率；对荧光光谱进行非线性高斯拟合处理，得 到了相似的结果。 对人血清的荧光光谱，除进行了二阶导数分析外，还计算了相对强度比和强度为最 大强度1 2 倍时所对应的带宽( w m ) 。发现，4 8 8 o h m 激发的荧光光谱，健康组相对强 度比i 。i 。的值较病变组小，健康组的带宽w 。明显大于病变组( 平均值大约大于 4 2 n m ) ；激发光为4 7 6 5 n m 时，健康组相对强度比i m ，i m 的值较病变组大，健康组的 带宽( w 。) 明显大于病变组( 平均值大约大于4 2 n m ) 。 文章在查阅了大量相关文献的基础上，认为肝病变时相对强度比的变化，与肝病变 时血清中胆红素( 荧光峰位于j 1 5 n m 附近) 和卟啉衍生物( 荧光峰位于5 9 06 3 0 n m ) 的升 高有关，并认为，这一光谱改变可能是肝病变时，血清荧光光谱的特征改变。在本实验 的条件下，分析卟啉类衍生物荧光强度的变化以4 7 6 5 n m 作激发光结果较好，而研究胆 红素的荧光强度变化则以4 8 8 o n m 酗j 激发光为佳，另外导数分析法是一种分析肝病变血 清荧光光谱的有效方法。 关键词：肝，荧光光谱，导数光谱，多峰高斯拟合，胆红素，卟啉衍生物 a b s t r a c t l a s e r - i n d u c e da u t o f l u o r e s c e n c es p e c t r ao fs e r u mo fh e p a t o c i r r h o s i sp a t i e n t sa n dl i v e r f i b r o s i sr a t sa r ei n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e rt h ep u r p o s ei st of i n dd i f f e r e n c eb e t w e e ns e r u mo f h e a l t h yh u m a na n dl i v e rd i s e a s e sp a t i e n t si nf l t t o r e s c e l l c es p e c t r aa n dt os t u d yw h e t h e rt h e l a s e r i n d u c e da u t o f l u o r e s c e n c es p e c t r a m a yd i a g n o s el i v e rd i s e a s e s f i u o r e s c e n c es p e c t r ao fs e r u mw e r ec o l l e c t e da tt h ee x c i t a t i o no f a r - i o nl a s e r ( 5 1 4 、5 r a n ， 4 8 80 n ma n d4 7 6 5 n m ) t h es p e c t r aw e r ea n a l y z e dt o c a l c u l a t er e l a t i v e i n t e n s i t yr a t i o ， b a n d w i d t h a sw e l la st h es e c o n dd e r i v a i i v es p e e i r aa n dm u l t i p e a kg a u s sf i to fl ： u o r e s c e d c c s p e c t r u m t h er e s u l t so ft h es e c o n dd e r i v a t i v e s p e c t r aa n a l y s i s i n d i c a t et h a it h e r ea r et h r e e m i n i m u mv a l u e sn e a r5 2 8 n m ( 515 n m h u m a n ) ，5 5 3 n ma n d5 8 7 m nf r o m4 9 0 r i mt o6 0 0 r i m t h e r a t i oo ft h ef i r s ta n ds e c o n dm i n i m u mv a l u e so fh e a l t hi ss m a l l e rt h a nt h a to fd i s e a s e m u l t i p e a kg a u s s f i to ff l u o r e s c e n c es p e c t r u mm a yo b t a i ns i m i l a rr e s u t b e s i d e s a n a l y z i n g t h es e c o n dd e r i v a t i v e s p e c t r a ，t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y r a t i oa n d b a n d w i d t ho ff l u o r e s c e n c es p e c t r ao fs e r k l n lo f h e p a o c i r r h o s i sp a t i e n t sw e r ec a l c u l a t e d t h e r e s u l t si n d c a t et h a tt h er e l a t i v ei n t e n s i t yr a t i o ( i s o o 1 6 0 0 ) o fh e a l t h ys e r u mi ss m a l l e rt h a nt h a to f d i s e a s ea l4 8 8 o h me x c i t a t i o n w l l e r e a st h er a t i o ( 1 4 9 0 1 6 0 0 ) i sl a r g e ra t4 7 65 n me x c i t a t i o na t t h es a m et i m e t h eb a n d w i d t ho fh e a l t hi sl a r g e rt h a nt h a to fd i s e a s ea t4 8 8 0 n ma n d4 7 6 5 n m e x c i t a t i o n ， t h ep a p e rh a sa n a l y z e dt h em a i nf l u o r e s c e n tm a t e r i a l sf r o m4 9 0 n mt o6 4 0 n m ，a n d c o n s i d e r st h a td i f f e r e n c eo fs p e c t r ab e t w e e nh e a l t ha n dd i s e a s ei sd u et od i f f e r e n c eo ft h e c o n c e n t r a t i o no fb i l i r u b i n ( f l u o r e s c e n t p e a k l i en e a r515 r i m ) a n dp o r t ) h y r i nd e r h , a t i v e ( f l u o r e s c e n tp e a kl i e5 9 0 6 3 0 n m ) ，a n dt h ed i f f e r e n c ei sc h a r a c t e r i s t i cc h a n g eo ff l u o r e s c e n c e s p e c t r u mo f l i v e rd i s e a s es e r u m a tt h es a m et i m e ，t h er e s u l ti n d i c a t e sw h e ni n t e n s i t yc h a n g e o ff l u o r e s c e n c eo fp o r p h y r i nd e r i v a t i v ei s a n a l y z e d ，4 7 6 5 n m e x c i t a t i o ns h o u l db eu s e d ， w h e r e a si n t e n s i t yc h a n g eo ff l u o r e s c e n c eo fb r i l r u b i ni s a n a l y z e d ，4 8 8 0 n me x c i t a i o ns h o u l d b eu s e d ，a n dt h ed e r i v a t i v es p e c t r ao fs e r u mi sa ne f f e c t i v em e t h o dt oa n a l y s el i v e rd i s e a s e k e y w o r d s ：l i v e r , f l u o r e s c e n c es p e c t r u n a ，d e r i v a t i v es p e c t r a ，m u l t i p e a kg a u s sf i t ，b i l i r u b i n ， p o r p h y r i nd e r i v a t i v e 激光光谱技术用于肝病渗断的初步研究 1 绪论 光谱学是通过物质对光的吸收和发射，米研究光与物质相互作用的一门科学。通过 研究原子和分子光谱，可以对物质结构作出分析，因此在物理、化学、生物、地质、考 古、天文等许多领域起着十分重要的作用。荧光光谱分析是光谱学的重要组成部分，由 于荧光分析的灵敏度很高，并且在物质吸收光后发生荧光这很短的时间内会发生许多分 子过程，会影响到荧光物质的光谱特征，所以荧光分析在生物化学、医学、工业和化学 等研究中的应用越来越广。 在人体组织细胞和体液内，存在大量能够产生荧光的生物大分子，而且其结构及光 学性质的改变，能够反映组织细胞在功能、形态、以及微观环境上的变化，因而分析组 织与体液的荧光光谱能够获得细胞的代谢信息为疾病诊断提供可靠的依据。 1 1 组织荧光光谱在医学诊断中的应用 荧光光谱技术在医学上的应用目前主要集中在对癌症的早期诊断上。癌症是目前对 人类危害最大的顽疾之一，按世界卫生组织1 9 9 5 年的资料，全世界每年新发现癌症患 者达7 0 0 万人之多，死亡的人数多达5 0 02 7 a ，就其死亡率而言，高居各种疾病之首。 而且随着全球环境污染的日益加剧，癌症的发病率正逐年提高。然而癌症并非是不j ：i ：治 愈的疾病。随着现代医学的发展，人们在癌症的诊断和治疗上已经取得了令人鼓舞的成 果。大量临床实践证明，癌症的治愈率与其早期诊断和早期治疗的关系密切。因此找到 一种方便、快捷、有效的早期诊断方法的意义是十分重大的。激光光谱技术的出现，利 用其商灵敏度和高分辨率的特点，为癌症及至其它疾病的早期渗断提供了新的思路和方 法。 激9 t 9 蒋技术用于癌症诊断的一种主要方式是使用适当波睦的激光激发被检测物 的荧光，根据其荧光光谱特征进行癌症的诊断。而根据被检测物的荧光物质的不同，光 谱检测技术用于癌症诊断可分为两类：一类方法称作“敏化荧光法”：另一类方法称作 “自体荧光法”。 1 1 1 敏化荧光法 由于大多数细胞的主要有机成分在可见光的波长范围内没有明显吸收，所以对可见 光反应不敏感。但当有适当的光敏剂时，有机体、细胞及许多类型的在生物上有重要慈 激光光渚技术用于肝病诊断的初步研究 义的分子都能受到光的破坏。由于在些生物系统中的光敏化过程大都有分子氧参加，使 得这些生物系统为之所敏化，所以t 物系统中的这种反应被称为“光动力学作用”或“光 动力学反应”。光敏荧光法就是利用某些荧咒物质在恶变组织中比在正常组织巾滞留能 力大，形成很大浓度反差的特性，通过对患者注剿这种荧光物质，并用适当波长的光激 发使其产生荧光，从而实现恶性肿瘤的定位和诊断的方法。 光谱技术用于癌症的渗甥可以追溯到早期光动学治疗癌症尥研究。1 9 0 3 年， h t a p p e i n e r 和a j e s i o n e k 首次使用伊红染料作为光敏剂，注射到皮肤肿瘤部位，用白光 做光源，开始了“光动力学疗法”的首次尝试。在随后进行的研究中人们发现，有些 光敏剂对肿瘤细胞具有选择聚集性，并且当被光照射时，会发出荧光 2 , 3 1 。1 9 6 0 年，rl l i p s o n 等【4 0 人发明了制造血卟啉衍生物( h p d ) 的方法，大大的推动了光动力治疗癌症 的进展，也使人们看到了“光敏荧光法”在癌症渗断方面的潜力，推动了该方法在癌症 诊断上的研究进展。 目前在临床和实验中常用到的光敏剂主要有血卟啉衍生物( h p d ) 、5 一氨基乙酰丙 酸( 5 一a 【，a ) 等。 1 9 7 3 年，k y r i a z i s 司等对2 0 例宫颈癌病变患者进行宫颈癌检查，他们用肉眼观察 h p d 荧光，将检查结果与病理切片结果进行比较，得到了8 0 的符合率。1 9 7 7 年a e p r o f i o 等4 l 设计了一种用来直接显现支气管恶性肿瘤h p d 荧光的图像增强系统并于后 来对其进行了改进，使系统的实用性得到提高。k i n s e y 等一j 设计了支气管癌症诊断系统， 他们用滤光片将h p d 荧光选出，然后转换成声信号，从而消除了背景噪声和主观判断 的影响。 r 本学者s h u i c h ik i n o s h i t a 和中国的刘天福等【l 埘研究了溶液和生物细胞中的h p d 的 荧光特性，得出低浓度的血卟啉( h p ) 溶液的荧光光谱由6 1 5 n m 和6 7 5 n m 的两个波段 组成，按单指数衰减；随着染料浓度的增加，在6 3 5 n m 处出现了一个新的波段，该波段 的强度随染料浓度的增加而增加，认为该组分源于h p 的二聚物。在强的激光辐射下， 在6 4 0 r i m 处出现一个新的波段，为h p 的光产物，对辐射光的强度、波长、h p 的浓度和 是否有氧的存在敏感。得出在癌细胞中的h p d 浓缩的程度比i f 常淋巴细胞要高。 s i n a a s a p p e l ，m 等使用双波长激励和双波长检测方法进行荧光测量来研究h p d 在难常 组织与恶性病变组织中的含量，也得到了在恶变组织中h p d 的含量要高于相应的正常 组织的结果。 此外，一些学者对于h p d 的最佳漓注时间、p h 值等环境因素的影响及使用时的剂 量进行了深入的研究。1 9 9 6 年b i s s o n ，j e a nf 等 1 2 j 研究了鼠体内膀胱壁和猪体内膀胱的 h 口d 的分布情况，发现对于表层皮肤癌，特别是发生在尿道上皮或浆膜的原发癌，膀胱 内( i n t r a v e s i c a l ) 滴注h p d 是可行的，并且2 小时的膀胱滴注为最佳。c h r i s t ，a 等l i j j 发现在p h = 2 时，h p d 以生物碱单体( d i c a t i o n i c m o n o m e r ) 存在，当p h = 6 时，以二聚 激光光罄技术用于肝病诊断的初步研究 物( d i m e r i z a t i o n ) 或聚全体( a g g r e g a t i o n ) 状态存在，p h 6 时以中性的聚结成团 ( c o n g l o m e r a t e s ) 的形式存在。2 0 0 0 年，朱酱等 1 4 】提出用小剂量血卟咻( 2 m g k g ) 来检 洲4 肿瘤，以减轻它的副作用。 h p d 一直是国内外进行光动力学诊治恶- 盹肿瘸最常用的光敏剂药物之一，大量的实 验和临床结果表明其有较好的疗效，同时也发现它存在些不足，特别是肿瘤组织摄入 较低、持续较长时间的皮肤光毒性反应等，在一定程度上影响了它在激光诊治肿瘤应用 中的疗效和普及。 5 一氨基乙酰丙酸( 5 一a l a ) 在光动力学治疗和诊断中经常用到的光敏剂。5 一a l a 本身无光动力作用，水溶性，很容易被粘膜吸收，使用它可以使内在光敏剂p p i x 在许 多组织中进行积累，产生光动力效果。由于它可以直接口服，从体外引入a l a 到肿瘤 内1 6 小时，内部产生的p p i x 浓度可以达到高峰，并且仅在给药后的l 一2 天内皮肤出现 光致敏化【”1 ，所以5 - - a l a 越来越多的引起了人们的注意。近年来，众多学者在5 - a l a 在不同组织的药物代谢动力学响应、如何减小其光毒化作用及a l a 溶液的浓度、p h 值 等剥p p i x 积累的影响等进行了研究，取得了令人振奋的结果 1 ”j 。 此外，临床和实验中进行研究的光敏剂还有h y p e r i e i n ( 金丝桃蒽醌) b g , 2 0 1 , 血啉 甲醚【2 l2 2 1 ，磺化铝酞菁( a l s p c ) 【2 3 2 “，二氢卟酚( c h l o r i n ) 类光敏剂盼2 ”，p h o t o f r i n l 2 7 2 8 1 ，荧光素钠【2 93 。1 等。 由于用来作为肿瘤定位的荧光物质的荧光光谱己知，且光谱特性好，容易识别，又 有较高的荧光效率，易于检测，所以药物诱导荧光在珍断早期癌症上灵敏度很高，比利 用自体荧光更可靠【”1 。但是，应用光敏荧光法进行癌症诊断时，被检测者必须注射光敏 物质，丽大多数光敏物质都是有光毒化作用的。如使用h p d ，接受注射的患者必须避光 三周，否则将会产生光敏性皮炎，所以学者们一直在寻找高效、低毒的光敏剂。8 0 年代， 美国d o u g h e r t y 等从血卟啉衍生物中分离出一种有效成份双血卟啉醚( d h e ) ，它 剥肿瘤的光敏化效应l k g n b 啉大1 倍，而对皮肤的光敏毒性显著减少；我国北京的h p s 和扬州的y h p d 等制剂与美国的d h e 类似，已投入临床使用【3 ”。但是在找到高效，无 毒的新一代光敏剂前，这种癌症诊断方法还不能作为癌症早期诊断和普检的常规方法。 1 i 2 自体荧光法 为了克服敏化荧光法在诊断中的缺点，不使用任何光敏物质，直接使用激光诱导组 织自体荧光的“自体荧光法”开始受到人们豹重视。自体荧光来源于生物组织中的某些 生物分子被激发后产生的荧光。这些能够产生荧光的物质又叫荧光团或生荧团，研究表 明，它们广泛存在于人的组织和体液中。在恶变组织中，由于肿瘤在发生及代谢方面的 一墼垄娄堕垫查里三墅塑堡塑塑塑生堕塑 特殊性，导致某些物质的变化，使所含的可发荧光的生物分子和有机大分子的种类和浓 度与正常组织相比存在差异，这些因素可能对荧光产生影响，从而使其自体荧光光谱与 f 常组织的荧光光谱存在差异，主要表现在荧光强度和波形有改变 3 3 】。利用这些差异可 与正常组织作出区别，提供了对诊断癌变有用的信息，所以人们能够用白体荧光光谱进 行癌症诊断。 首先在实验中观察到肿瘤组织自体荧光的是p o l i c a r d ，他在1 9 2 4 年报道了肿瘤的自 体荧光，并认为是受细菌感染在肿瘤中形成的内源性卟啉所致 2 】。但自体荧光应用于癌 症诊断却玎始于二十世纪八十年代初。1 9 8 0 年，蜀本学者畸舀隆夫蹋波长5 1 45 r i m 的 氩离子激光照射胃癌组织，经滤光片在5 7 0 - 5 8 0 a m 范围内观察到较强的黄色荧光，而良 性组织中观察不到 3 4 j 。1 9 8 4 年o k u d a ，s h i g e t u 等成功鹊利用内窥镜拯摄了嫂4 8 8 n r a 的 激光激励的胃癌组织的自体荧光1 3 1 】。r r a l f a n o 等阢3 6 1 人研究了人体正常和癌变的乳腺 组织和肺组织的荧光光谱，发现与正常组织相比，肿瘤组织的荧光峰发生了蓝移，并且 形状平坦。指出根据这一结果可以对乳癌和肺癌进行诊断。1 9 9 0 年，p a l c i c ，b 等p ”用蓝 色激光诱导正常和癌组织的自体荧光，在两个不同的波长处用图像增强 ( i m a g e ，i n t e n s i f i e d ) c c d 对其进行测量，测得的自体荧光数据用计算机进行处理后， 能够在没有使用药物的情况下清晰地区分出早期肺癌。并用由此方法发展起来的检查仪 器用于临床实验，发现了用常规方法不能定位的隐避癌变。德国人s r o k a ，r o n a l d 等p 砷 对恶性病变时的内卟啉进行了激光辅助检测，结果表明内卟啉的禽量依赖于肿瘤的发展 程度。 c o t h r e n ( 3 9 1 等用低功率氮泵染料激光( 波长3 7 0 n m ) 激发胃肠组织作激光诱导荧光 ( l i f ) 光谱检测，结果发现在4 6 0 r m , 处正常牯膜的自体荧光强度是腺瘤的4 倍，丽在 6 8 0 r t m 处腺瘤的自体荧光强度较正常粘膜低，但与正常粘膜相近。k a t z ，a 等1 4 。j 使用u v 和可见光荧光发射光谱和激发光谱研究了离体食管组织标本，发现b a r r e t t 食管、正常和 恶变的食管组织的光谱是不同的。这些光谱上的不同可以清楚的区分正常、b a r r e t t 和恶 变的食管组织。z h iwh u a n g 等【4 j 测量并分析了结肠组织的正常粘膜和腺瘤的l i a f ( 激 光诱导自体荧光) 光谱，发现，在5 2 0 - - 6 2 0 n m 的范围内，其光谱非常相似，正常组织 自体荧光的强度大约比肿瘤组织自体荧光强度高三倍多。但是在6 2 5 - - 7 2 0 n m 的范围内， 肿瘤组织自体荧光的强度比正常组织高，用1 5 8 0 1 1 i 啪或1 5 以6 8 0 的自体荧光强度比能从正 常组织中识别结肠肿瘤，并且有较高的精度。1 9 9 1 年，d a s ，b b 等i 4 刮利用紫外荧光光潜 技术进行了乳腺、卵巢、子宫和富颈癌的诊断研究。指出在3 4 9 n m 到4 4 0 r i m 波段对荧 光强度比进行比较的方法能够有效的从非癌组织中区分出癌组织来。b e t z ，v o l k m a r 等【4 目 指出癌细胞的频繁转移使糠分解变得活跃，从两导致n a d + n a d h 的平衡发生改变，癌 组织和正常组织的n a d h 荧光光谱的研究表明，对于癌组织，其标准化的发射光谱存 在一个最大的蓝移。正常组织的光谱强度要强于癌组织。a r e n d t ，j t 等 4 a l 用自体荧光和 激光光谱技术用于肝病渗断的初步研究 反射光谱研究了膀胱粘膜组织的早期癌变，在研究了3 7 0 4 0 0 r i m 波段范围内的激励光 后，发现4 0 0 n m 的激励光能将各组更好的区分开来。位于4 6 0 r i m 的发射峰值随疾病的 严重程度而减小。应用4 6 0 n m 的发射能将浸润性癌与良性粘膜组织区分开来，而使用标 准化了的6 3 5 n m 的发射峰能将浸润性癌与c i s ( 原发性癌) 区分开来。同时指出，荧光团 主要为胶原和卟啉。k o j i r oo n i z a w a 等【4 5 】使用4 0 4 n m 激发波长研究了口腔鳞状细胞癌 ( s c c ) 的红色荧光的光谱特性。发现随着恶变程度的增加，光谱谱线的峰值在6 3 4 n m 和6 7 2 n m 处增加，在5 2 0 和5 8 2 n m 处减少，其中5 8 2 n m 处荧光强度的减小和6 3 4 n m 处 荧光强度增加在一般的实验和临床中均可被观察到，而5 8 2 n m 和6 3 4 n m 处荧光强度的 比率在所有的标本中均存在。认为红色荧光是由卟啉发射的，并臣随着恶变程度的增加， 卟啉在s c c 内部或癌组织表面积累量有所增加。a s i m ap r a d h a n 等一6 j 使用平面偏振的 4 8 8 n m 激光激发皮肤样品，研究了正常和病变皮肤组织的荧光，发现癌变皮肤组织的偏 振化的荧光光谱与正常人的有所不同，正常和癌变人组织的光谱最大值分别大约位于 5 4 0 m n 和5 3 0 h m 处，在不同波长处计算各向异性表明癌组织与正常的相应组织相比， 其偏振度的值更高。 1 1 3 国内应用荧光光谱诊断研究的现状 国内八十年代初开始对生物组织自体荧光进行研究，1 9 8 2 年，曾堑等用氮分予激光 器作光源，砑究了胃癌及胃正常离体组织的自体荧光，发现在氮分子激光作用下，胃癌 组织在波眨5 9 0 n m 左右有一个特征峰，并以此为判据，得到了8 0 的临床符合率h 7 。“j 。 1 9 8 3 年以来，马宝章、叶衍铭等 4 9 , 5 0 1 用氮分子激光器、氩离子激光器和脉冲氙离子激光 器的3 6 5 n m 线研究了口腔恶性肿瘤、胃、食道、下颚、舌的癌组织及相应的正常组织的 自体荧光。得出癌组织通常在6 3 0 h m 和6 9 0 n 由附近存在特征峰，而这两个峰值不出现 在相应的正常组织的光谱中。并对特征自体荧光的来源进行了研究，指出它们可能来自 人体内形成的卟啉混合物。 1 9 8 9 年，丁爱华等用氮分子激 1 e ( 3 3 7 m n ) 激发自体荧光，通过裸眼进行观察诊断早 期富颈癌和癌前病变 5 1 。连少辉5 2 5 3 】等在氮分子激光作用下，研究了宫颈癌的国有荧 光，发现富颈癌组织的发光特性主要表现在4 2 0 n m 和6 3 0 n m 左右，且宫颈癌组织的发 光与卟啉有关；另外在氮分子激光作用下，宫颈癌的4 2 0 n m 特征峰与蛋白一卟啉溶液的 敏化荧光峰相类同，认为宫颈癌的4 2 0 h m 左右的特征峰可能是在光作用下，宫颈癌中的 荧光物质与卟啉之间的激发能量转移所产生的敏化荧光峰。证明了在光作用下，其可见 区发光( ? 。m a x = 6 3 5 n m 左右) 与卟啉有关，而紫外区发光( m a x 5 4 2 2 n m 左右) 与蛋白 质的邑氨酸残基有关，其光谱特性与临床诊断选择的癌固有荧光特征峰基本相符。该研 激光光谱技术用于肝病诊断的初步研究 究结果为探讨癌的发光机理积累了有益资料。天津大学的林美荣等“1 使用y a g 激光器 的四倍频的2 6 6 n m 激光为激发光源，对正常和病态的向管和乳腺组织的荧光光谱进行了 观察和分析。发现正常乳腺组织的光谱主峰在3 6 0 n m 处，第二峰位于4 4 0 n m 处，在两 峰之间的4 1 6 n m 处有一明显的谷值，而良性组织和肿瘤组织没有第二峰值。正常的动脉 和病变组织都在3 6 5 n m 和4 7 0 n m 处出现两个峰值，但两峰值的强度比有明显不同。基 于上述观察和结果，指出，对于不同的组织应使用不同诊断标准。 1 9 9 3 年，方跃明 5 5 1 用氮分子激光为激发光源对7 5 例皮肤病进行荧光目测光谱分析， 与正常皮肤对照，发现皮肤恶性肿瘤特性荧光颜色为紫色( 紫红色) ，特征峰出现在 4 0 0 3 r m l 4 5 8 ，1 d a t i 波段，指出4 2 0 n m 附近特征是皮肤恶性肿瘤荧光光谱特征的直接表现， 而4 4 8 n m 附近的特征峰是皮肤恶性肿瘤荧光光谱特征的间接表现，是e 常皮肤主峰 ( 4 7 6 0 n m ) 和恶性肿瘤特征峰( 4 2 0 0 n m ) 叠加的综合荧光。 张阳德等口“5 7 研究了大肠癌组织的自体荧光，发现大肠癌组织能特异性积聚内源性 血n h 啉，其含量高于远癌组织。大肠癌组织的荧光光谱在( 6 4 4 3 5 7 ) n n l 处存在强度 高于正常大肠组织的特异波峰，对其荧光差异作病理学研究”m 表明i v 型胶原是大肠粘 膜基底膜和间质自体荧光主要来源，组织发生癌变后，基底膜和间质中i v 型胶原的降 解是癌组织自体荧光减弱。北京军区总医院的曹建彪等口“” 发现大肠癌组织与非癌组织 的l i f 波形形状相似，但癌组织的荧光波幅明显偏低，与非恶性肿瘤组织比较，恶性肿 瘤组织主峰波长略偏红光侧，次峰略偏紫光侧，主、次峰间的波变化速率相对较缓，认 为通过测定组织l i f 主、次峰及波谷的峰强度，可有效区别癌与正常组织。2 0 0 1 年，盛 剑秋等【6 76 2 j 使用氮分子激光器研究了肠镜下大肠癌组织激光诱发自体荧光光谱特征，检 出大肠癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为9 2 6 5 、8 8 0 0 、8 7 5 和9 2 9 6 。 谢洪波等【6 3 “j 在3 6 0 4 0 0 n m 波段范围内选择多种波长对结肠癌和结肠工f 常组织标 本进行了l 1 f 测试，认为3 8 0 n m 的为最佳激发波长，并以此波长激光激发结肠组织荧光， 发现在4 0 0 6 0 0 n m 之间，正常组织荧光强度明显高于病变组织，癌变组织光谱曲线变化 平缓；6 0 0 n m 7 0 0 n m 之间，癌变组织荧光强度高于正常组织，主要表现在6 4 0 n m 、6 9 0 n m 两处，病变组织出现两个特征峰，正常组织没有或仅有很微弱的小峰，认为是血卟啉衍 生物的特征峰；4 4 0 n m 、6 9 0 n m 处荧光强度幅值最稳定，正常与病变组织差异较大。以 1 6 9 0 1 4 4 ( ，为判据，获得将近9 0 的识别率。用低能氮分子激光器产生的3 3 7 n m 激光( 脉 宽6 n s 、重复频率1 0 h z ) 照射正常组织与癌变组织，得到l i f 光谱。发现两者的自体荧 光呈双峰结构，主峰在4 6 0 n m 左右，次峰在3 9 5 n m 左右，正常组织光谱强度在整个检 测范围内均大于癌变组织，主峰强度差别较大；在近红光侧，f 常组织光谱主峰下降幅 度较快，而癌变组织光谱主峰则下降缓慢，癌变组织次峰较正常组织向短波方向偏移， 但主峰又稍稍发生红移。 6 激光光潜技术用j “肝瘸诊断的初步研究 大连理工大学的r 建华等【6 5 研究了甲状腺正常组织、良性瘤及癌的离体组织标本的 自体荧光，发现三种不同组织的自体荧光光谱间在波形、峰值位置及强度上存在明显的 差异，这些差异对于甲状腺癌的光谱诊断有一定的参考价值。骆清铭等【“1 以氩离子激光 器( 工作波长为4 8 8 0 r i mp 。1 0 r o w ) 为激发光源，照射人工堵养的小白鼠的正常及肿 瘤组织，发现在5 1 0 r i m 一5 9 0 r i m 波段，同一机体肿瘤自体荧光的强度较正常组织弱，衰 减得更慢，但波长大于5 9 0 r i m 波段时，二者趋于一致，分析认为，j f 常组织与肿瘤组织 自体荧光光谱曲线的差异主要取决于细胞所处的局部微观环境，而与细胞结构和组分特 异性无关。陶长宝等 6 7 1 测量了人体内源性原u 啉( p p ) 和血清蛋白( b s a ) 及其混合液 的荧光衰减寿命和时间分辨光谱。发现b s a 和p p 的混合使得b s a 的荧光寿命变短， 而p p 的荧光寿命变长，进一步肯定了b s a 到p p 的能量传递过程的存在，为光敏治癌 的机理研究提供了有力的依据。 1 2 血清荧光光谱诊断研究的现状 由于恶性肿瘤细胞代谢异常，代谢产物及细胞内的非正常分子进入人体组织及血 液，引起血液组份、浓度以及血液微观环境的改变，并且这些变化与癌的位置和恶变的 程度有关。检测血清的光谱，也可能提供细胞癌变的信息。相对于组织切片，血清样品 容易获得，可以避免组织取样及切片制作时的种种限制。 血清的荧光光谱诊断研究在国外进行得较少，国内从二十挂上纪八十年代末开始对其 进行了研究。1 9 8 8 年，徐叙珞、盂继武、侯尚公等在研究癌症病人血清的荧光光谱时发 现，当用2 9 0 n m 的光激发正常人和癌症患者的血清时，在大约3 4 0 n m 处n j 以观察到”个 强的发射带；但用4 5 0 n m 的光激发样品时，对于癌症患者的血清，可以观察到6 3 0 n m 处 有半值宽度为2 0 n m 的主发射带和在6 9 0 n m 处的一个非常弱的第二发射带，而对正常 人的血清仅在红光波段有个漫散射背景。并认为，6 3 0 n m 和6 9 0 n m 两个带是癌症患者 m 清的特征荧光，起源于一种卧啉化合物的7 c 电子跃迁”“”1 。进一步研究确定这种卟啉 化合物就是原卟啉i v ，劳据此提出了肿瘤诊断的判据可以进行癌症普查，研究中还发现， 癌患者血清的特异荧光受溶剂p h 值的影响明显，p h = 7 时发光最强“”7 “。彭燕等”1 用i 个激发波长( 2 0 0 n m ，2 5 0 h a ，2 9 0 n m ) 激发i 靠l 清的自体荧光，在2 5 0 8 0 0 n m 和3 5 0 8 0 0 n r n 两个发射波长范围内对其光谱进行了研究，发现：在激发波长为2 0 0 n m 和2 5 0 n m 时，在 2 5 0 8 0 0 n m 范围内，血清白体荧光光谱主要有四个发射峰：选出对诊断有意义的五个变 量，进行多元l o g i s t i c 回归判别，对判别消化道癌的阳性预测值为9 0 0 ，阴性预测值 为9 2 1 。 1 9 9 8 年张祖贻等“3 1 分析了肺癌患者、良性疾病患者和正常人血清的荧光光谱，以波 激光光昔投术用于肝情诊断的初步研究 氏6 2 5 n m 处的荧光强度大于波长6 1 5 n m 处为阳性，小于者为阴性，对肺癌进行了早期荧 光诊断，发现肺癌组阳性率远高于其它组。林孟戈等”4 1 以5 0 5 n m 激发光激发健康人和癌 患者血清，发现健康人血清的荧光光谱在6 1 0 r i m 处有一发射峰( 为无水乙醇发射峰) 此 后平滑下降；恶性肿瘤患者衄清的荧光光谱除了6 1 0 n m 处的发射峰外，还在6 3 5 n m 处有 。尖峰，认为是恶性肿瘤患者血清的特征荧光，在判断标准上认为6 3 5 n m 处有尖峰的为 阳性，有明显肩峰的视为i 】疑，用上法为标准进行诊断，恶性肿瘤的符合率为8 3 6 ； 良性肿瘤的符合率为8 9 3 ；正常对照组的阳性率为5 3 。 应用血清荧光对恶性肿瘤进行诊断这一方法敏感度高、特异性好。但是由于血液是 由诸多生物分子组成的，其它分子的发光必然会对血清荧光恶性肿瘤的诊断符合率产生 影响。通常情况下血清中存在的具有共轭结构基团的分子如血清蛋白质、血红蛋白质等 蛋白质类和卟啉、类胡萝h 素( c a r ) 等共轭分子在紫外光、短波可见光的激发下均可能 发光。2 0 0 0 年，孟继武等【7 ”分析了c a r 与卟啉间的敏化荧光，发现c a r 的荧光光谱与 h p d 的激发光谱有很好的重叠，因此c a r 、h p d 之间可能发生能量传递，即c a r 对h p d 的荧光有敏化作用，卟啉浓度提高了就猝灭了c a r 的发光。由于c a r 与h p d 削的能量 传递，使得只有选择激发卟啉刁+ 能得到好的结果，因此激发光的光谱宽度要有一定的限 制。 1 3 拉曼光谱在癌症诊断中的应用 任何物质都有确定的分子结构，都有确定的分子振动光谱，拉曼散射光谱技术从物 质的分子振动光谱来识别和区分不同的物质结构，成为研究物质分子结构的有效手段。 在医学卜，拉曼光谱的主要用处之一是进行组织标本的体内、体外分析，它可以从疾病 引起组织、体液、细胞的分子组成的变化，在分子和细胞水平上来诊断疾病，用于区分 正常和病变组织的细胞和器官的不同化学状态。使它们在能够被常规方法检查到之静就 被清楚的观测到。因而，拉曼光谱技术在生物医学和临床诊断上的应用是目前的热门课 题。 1 9 9 5 年f r a n k ，c j 等【7 6 】比较了f 常乳腺组织、渗透性乳腺癌( i n f i l t r a t i n gd u c t a l c a r c i n o m a ( i d c ) 或纤维囊性病变等活组织检查标本的拉曼光谱，发现i d c 标本的光谱与 人的胶原质的光谱相类似，良性病变( 纤维囊性病变) 与恶性病变间的区别较正常组织 与i d c 标本间的区别要小。f e l d m s 等【7 研究了正常乳腺组织与肿瘤组织的拉曼光谱， 发现正常乳腺组织和乳腺肿瘤的拉曼光谱的主要区别在于：正常乳腺组织在1 6 5 7 c m 。 的脂类c = c 带的拉伸振动比乳腺肿瘤中在1 6 6 0c m 。的蛋白质酰胺i 带更尖锐、与c h ， 弯曲模的强度比要小得多。在1 4 4 2c m 。的c h 2 峰，在乳腺肿瘤光谱中位移到1 4 5 1c m ， 激光光渚技术用十片 确诊断的初步1 0 1 + 究 并且在乳腺肿瘤的拉曼光潜中观察到的在1 0 0 4c l t l 。的苯丙氨酸带和在9 5 lc m 。的脯氨 酸带在正常乳腺组织中几乎观察不到。 r a m a s a m ym a n o h a r a n t 等f 用2 4 0 n m 和2 5 0 n m 的激光为激发光源，获得了结肠组 织的共振拉曼谱。结果表明：在组织的拉曼光谱中，当激发光为2 4 0 n m 时，蛋白质的共 振带选择性增强，激发光为2 5 0 n m 时，核酸的共振带选择性增强：腺瘤2 5 0 n m 光谱 1 4 8 5 c m 。和1 3 3 5 c mo 处核酸带的强度要强于正常的结肠稻膜，并指出，这个区剐主要是 由癌组织中腺嘌呤和鸟嘌呤的残余物多所引起的。 丁敏华等( ”l 以氩离子激光为激发光源，对5 0 例患中枢神经系统疾病患者的瞌脊液 进行了光偏振及荧光物理特性的测量，研究了脑脊液激光拉曼光谱及荧光光谱。发现病 人脑脊液的分子对称性偏低，但荧光强度明显偏高，随时间的延长，其荧光强度变化较 大，且不同疾病变化不同。 高泽红等 8 0 l 研究了正常人、癌患者血清的可见拉曼光谱和d n a 的紫外共振拉曼光 谱，发现正常人血清在4 8 8 0 q t l y l 波长的单色光激发下其拉曼光谱的相对强度，小于由 5 1 451 1 1 1 1 波长的单色光激发的拉曼光谱的相对强度；而癌症患则相反：正常人与癌症患 者血清拉曼光谱存在差异，用拉曼光谱技术，能够从分子水平检测出正常人和癌症患者 向清中代谢产物存在差异的信息。由于人体血清的拉曼频移的平均值分别为1 0 0 6c m 一、 1 1 6 1c m o 和1 5 2 6c m 叭，核酸中碱基的拉曼频移为1 3 3 7c m - o 和1 4 8 5c r n 一。所以认为人 体血清拉曼光谱不是血清中的碱基分子产生的。郭萍等【8 l j 用激光拉曼光谱分别对正常 人，鼻斟癌患者、肝癌患者和慢性白血病患者四类受试者的血清在0 - 2 0 0 0 c m l 范圉内进 行测试，发现同类患者中不同受试者血清的激光拉曼光谱特征峰值大小虽然不同，但光 谱图特征基本一一致；不同种类癌症患者血清的激光拉曼光谱图存在较大差异，鼻咽癌患 者血清的拉曼散射峰位于8 7 5 c m 一、肝癌患者血清的拉曼散射峰位于1 0 0 0c m 。处，而慢 性白血瘸患者的血清无拉曼峰，但与正常人血清明显不同。在各类癌症患者血清的激光 拉曼光谱图特征峰附近，e 常人血清均没有拉曼光谱特征峰。 拉曼光谱使人们在分子水平上进行疾病的诊断，对提高激光光谱技术在医疗诊断时 的准确度和对疾病进行深入的认识提供了非常好的手段。 1 4 激光光谱技术在肝病诊断中的应用 肝脏是人体代谢中枢，担负功能众多，是合成和利用卟啉的主要部位，卟啉代谢紊 乱是其功能障碍的一种反应。近年的研究发现，各肝病都伴有卟啉代谢异常，且其生化 变化比组织学变化更早出现【吲。因此对于肝病 h i - 啉及与其相关的荧光光谱技术的研究 成为激光光谱技术的研究热点之一。 激光光潜技术用f 片f 病诊断的 ! 】_ j 步研究 1 9 9 2 年，刘柯等【8 h 研究了慢性肝病患者的皿卟啉变化，发现，在4 1 0 n m 的紫外光 的照射下，在红光谱区域中可见主峰在5 9 0 n m ，次峰在6 3 0 r m a 附近的锌卟啉与原卟啉 特征荧光光谱，慢性肝病患者血卟啉变化较剥照组明显升高，其中原卟啉的变化更为显 著。且原卟啉的增减与肝病的轻重，特别是肝功损害程度密切相关。高善玲等口4j 应用光 致发光荧光光谱技术，对7 6 例原发性肝癌、1 6 8 例慢性肝病及3 3 侧健康人进行全血卟 啉类物质测定，发现肝癌组锌卟啉和原卟啉峰值均明显高于慢性肝病组及对照组，尤其 是原卟啉峰值可高于慢性肝病组l 倍以上，各组间具有极显著性差异。李少华等蝉“的研 究得到了完全相似的结果。 1 9 9 4 年，赵晓杰等【“j 用氲离子激光器( 5 1 4 5 n m ) 为激发光源，研究了肝癌患者血 清的自体荧光光谱，发现其呈双峰结构( 1 5 0 0 c m - l 1 7 5