（应用化学专业论文）紫菜藻胆蛋白的分离及其抗氧化活性研究.pdf

紫菜藻胆蛋白的分离及其抗氧化活性研究 摘要 本研究以蛋白质含量丰富的紫菜为原材料，使用溶胀法和组织捣碎法相结合 的方法处理紫菜，再用硫酸铵盐析制得藻胆蛋白粗提液，最后采用连续二次不同 柱长规格的羟基磷灰石柱层析法进行纯化，快速高效的分离纯化紫菜藻胆蛋白， 获得纯度和得率均较高的藻红蛋白，并对该蛋白的光谱学性质，亚基组成，稳定 性，以及其在体外清除自由基和体内抗氧化能力方面的活性进行研究。 本实验将冻干紫菜粉碎后用4 0 倍体积的水溶涨6 天后经组织捣碎2 分钟，再用 饱和度为4 5 的硫酸铵盐析沉淀，经透析脱盐后即得藻胆蛋白粗提物( c p p ) 。c p p 经过连续二次不同柱长规格的羟基磷灰石柱层析，离子浓度梯度洗脱，从而分离 得到较高纯度的藻红蛋白。最终纯化的紫菜藻红蛋白的纯度系数( a 。a ：。怖。) 为 4 0 。根据其可见光光谱学特征判断紫菜藻红蛋白属于r 一藻红蛋自( r p e ) ，r p e 的吸收峰在5 6 5 n m 和4 9 8 n m ，在5 4 0 n n l 处有一个吸收肩。用s d s p a g e 测定组成藻红蛋 白各亚基的分子量，q 亚基的相对分子质量约为1 9 k d a 2 1 k d a ，亚基的相对分 子质量约为2 0 k d a 2 2 k d a ，y 亚基的分子质量约为3 6 k d a 。推测坛紫菜r p e 的分 子量约为2 9 0 k d a 。 稳定性试验结果表明：藻胆蛋白在p h 值为中性及偏酸性时，具有较好的稳定 性，p h 为强酸性或强碱性时，蛋白质不稳定。藻胆蛋白在温度低于4 0 时，具有 较好的稳定性，酒精浓度不超过4 0 时对其稳定性影响较小。若要长时间保存紫菜 藻红蛋白，需将蛋白放在低温( 4 左右) 的中性缓冲溶液中，且要求避光。 本实验采用邻二氮菲一f e 2 + 氧化法和邻苯三酚自氧化法分别测定藻胆蛋白粗体 物和纯化后的藻红蛋白清除0 h 和0 - ：能力。并灌胃给予小鼠1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 ( m g k g d ) 的c p p ，连续灌胃2 5 天后，分别测定小鼠全血过氧化氢酶( c a t ) 和谷胱甘肽氧化物酶( g s h p x ) 活性，以及红细胞丙二醛( m d a ) 含量和血清总s o d 活性。体外清除自由基的实验结果显示：紫菜藻胆蛋白租提物对羟自由基的半数 清除率( i c ；。) 为9 2ug m 1 ，对超氧阴离子自由基的i c 为1 0 1ug m l ；纯化后的藻 红蛋白对羟自由基的半数清除率( i c 。) 为9 7ug m 1 ，对超氧萌高子自由基的l c ；。 为1 4 2 pg m l 。动物实验的结果显示紫菜藻胆蛋白能在一定剂量范围内提高小鼠血 液中c a t 、g s h p x 和s o d 活性，并降低m d a 的含量，以中等剂量时效果最为显著并且 i 浓度过高时其作用有所下降。说明c p p 在适当剂量下具有明显的抗氧化能力，但无 量效关系。由此可见，藻胆蛋白能够以多种途径发挥抗氧化作用，以减少组织细 胞损伤，延缓机体的衰老。 关键词：紫菜，藻胆蛋白，分离，纯化，稳定性，自由基，抗氧化 s t u d j e so np u r i f i c a t i o na n da n t i - q x i d a t i o na c t i v i t yo f p h y c o b i l i p r o t e i n sf r o mi a v e r a b s t r a c t ac o n v e n i e n ta n df a s ti s 。l a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fp h y c o b i l i p r o t e i nf r o m1 a v e rw a s d e s c r i b e d ， i t s s p e c t r ap r o p e r t i e s ， s u b u n i tc o m p o s i t i o n ， s t a b i l i t y t h ea n t i o x i d a t i o n a c t i v i t y o fp h y c o b i l i p r o t e i n s切 1 ，i f m a n t i o x y g e n f r e er a d i c a la n d跏 v f 阳w e r e i n v e s f i g a t e d l a v e rw a se x t r a c t e dw i t hd e i o n e i l - w a t e ra t4 0v o l u m e sf o r6d a y sa n dt i s s u e t r i t u r a t e df o r2m i n u t e s t h ec r u d ep h y c o b i l i p r o t e i n ( c p p ) w a s p u r i f i e db yp r e c i p i t a t i n g w i t ba m m o n i u m s u l p h a t e o f 4 5 a n d d i a l z i n g a f t e rs u c c e s s i v ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h yo nh y d r o x y l a p a t i t e ( h a ) ，p h y c o e r y t h r i nw a si s o l a t e da n dp u r i f ：i e df r o m l a v e r t h ep u r i t y ( a 5 6 5 办也8 0 )o f p h y c o e r y t h r i nf r o ml a v e rw a sm o r et h a n4 o a b s o r p t i o ns p e c t r ac h a f a c t e r i s t i co fp u r i f i e dp h y c o e r y t h r i nf r o ml a v e rs h o w e dt h a ti t w a s r 。p h y c o e r y t h r i n ( r p e ) a b s o r p t i o ns p e c t r ao fp u r i f i e dr p es h o w e dc h a r a c t e r i s t i c p e a k sa t5 6 5 m na n d4 9 8 n m ，a n das h o u l d e ra t5 4 0 m n t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e 适h t so fs u b u n i t sc o n s i s t i n gi nr p ew e r ed e t e c t e db y s d s p a g e t h em o l e c u l a rw e i g h t so fqs u b u n i tw e r ea b o u t1 9 k d a 2 1 k d a ， b s u b u n i tw e r ea b o u t2 0 k d a 2 2 k d a ，a n dyw e r ea b o u t3 6 k d a i tc a nb ec o n j e c t u r e d t h a tt h em o l e c u l a rw e i g h t so fr p ef r o m1 a v e rw e r ea b o u t2 9 0k d a t h es t a b i l i t yo fp h y c o b i l i p r o t e 姬sw e r ei n v e s t i g a t e da td i f 绝r e n tp h s ，t e m p e r a t u r e s a n dc o n c e n t r a t i o n so fa l c o h 0 1 p h y c o b i l i p r o t e i n ss h o w sg o o ds t a b j l i t yb e t w e e np h 5 0 a n dp h 8 0a tr o o m t e m p e r a t u r e ，a n dt h e ya r ea l s os t a b l eu pt o4 0 a tp h 7 0 h o w e v e r ， p h y c o b i l i p r 。t e i n ss h o u l dk e e pa w a yf r o ml i g h te x p o s u r ea n da tl o wt e m p e r a t u r e ( 4 ) f o rl o n gt e n l ls t o r a g e t h e s c a v e n g i n g a c t i v ic i e so fb o t hc r u d e p h y c o b i l i p r o t e i n a n d p u r i 6 e d p h y c o e r y t h r i no n 0 ho ft h es y s t e mo f1 ，1 0 一p h e n a n t h f o j i n e f e ( i i ) h 2 0 2a n d0 。2 o f p y r o g r a l l 0 1a u t o x i d a t i o nw e r es t u d i e d a n dt h em i c ew e r et r e a t e db vg a s t r i ci n c u b a t i o n w i t hc r u d e p h y c o b i l i p r o t e i n，a t d o s e so f1 0 0 、2 ( ) 0 、 3 0 0 m g k g d t h ea c t i v i c yo f e r v t 量l f o c v t ec a t a l a s e ( c a t ) a n d 舀u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ( g s h p x ，s e f l l ms u p e r o x l d e d i s m u t a s e ( s o d ) a n dt h ec o n t e n to fe r y t h r o c y t em d a i nm i c ew e r ed e t e 珊l n e do nt h e 2 5 hd a vo ft h et r e a t m e n t t h er e s u l to f i nv i 打da n t i o x y g e nf r e er a d l c a le x p e n m e n t s h o w e dt h a tt h ei c 5 0o fc r u d ep h y c o b i l i p r o t e i nf r o ml a v e ro n 。o hw a s9 2u m la n d t b a to fc r u dp h y c o b m p r o t e i no no 2 w a s1 0 1pg 细1 ；i c 5 0o fp u r i f ：i e dp h y c o e r y t h 姗 o no hw a s9 7u m la n dt h a to fp u r i f i e dp h y c o e r y t h r i n o n0 + 2 。w a s1 4 2u m l t h e r e s u l to ff 挖y f v da n t i o x i d a t i o na c t i v i t ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a tc m d ep h y c o b l l i p r o t e l n c o u l di n c f e a s e dt h ea c t i v i t yo f e r y t h r o c y t ec a r g s h p x ，s e m ms o d a n dd e c r e a s e dt h e c o n t e n td fm d as i g n i f i c a n t l yw h e n i tw a sa tp r o p e r yd o s e s s ot h ec r u d e p h y c o b i l i p r o t e i nf r o ml a v e r h a sa n t i o x i d a t i o na c t i v i t yi nd i f f e r e n tw a y s k e yw o r d s ： l a v e r p h y c o b i l i p r o t e i n ，i s o l a t i o n ，p u r i f i e d ，s t a b n i t y ；f r e e r a d i c a l ， a n t i o x i d a t i o n 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：甄毖旋 日期：口子年厂月上- 同 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 晤 学位论文作者签名： 镢观 r 期：一孑年f 月，乙同 指导教师签名：膳却一 日期砂舛妇瑚 上海海洋太学硕七学位论文 第一章 引言笫一早jl 吾 海藻( a l g e a ) 是生长于海洋中的低等隐花植物，全世界藻类约有3 0 o o o 余 种。由于特殊的生态环境( 高盐、高雅、缺氧、缺光照等) ，海藻在其生长和代谢 过程中，产生了大量具有奇特结构的天然产物和具有特殊生理活性和功能的物质 n 1 。除了含般营养成分，如碳水化合物、钙、镁、锌等矿物质、维生素外，海藻 还含有特殊的生物活性成分，如不饱和脂肪酸、藻多糖、藻类色素等。藻类对环 境适应性强，养殖成本低，适宜规模化生产，被联合国粮农组织推荐为人类明天 最理想的食品瞳1 。藻类可作为功能因子用于保健食品和功能食品，也可用作鱼、虾、 贝等海产品的特殊饲料。藻胆蛋自( p h y c o b i l i p r o t e i n s ) 是其中最具代表性和 极具应用潜能的藻类的蛋白质类天然产物。藻胆蛋自在藻类中的含量可达细胞干 重的2 5 2 8 h 3 ，目前，国际上对藻胆蛋白的基础研究发展十分迅速并取得了很 大的进展，同时，人们还发现藻胆蛋白有着广阔的应用前景，因而对这些藻胆蛋 白的研究备受关注，其提取技术与生物活性研究受到食品、化妆品、医药等领域 的普遍重视。 1 1 藻胆蛋白 藻胆蛋白是大量出现于红藻( r h o d o p h y t a ) 、蓝绿藻( c y a n o p h y t a ) 和隐藻 ( c r y p t o p h y t a ) 和少数甲藻中的捕光色素蛋白，主要包括藻红蛋白 ( p h y c o e r y t h r i n ，p e ) 、藻蓝蛋自( p h y c o e y a n i n ，p c ) 、异藻蓝蛋自 ( a 1 l o p h y c o c y a n i n ，a p c ) 和藻红蓝蛋白( p h y c o e r y t h r o c y a n i n ，p e c ) 四种。1 。在海 藻的正常生理过程中，藻胆蛋白在藻体细胞中除了作为细胞的储存蛋白使藻类在 氮源缺乏的季节得以生存之外，还具有在光合作用中作为捕光色素系统进行吸收 和传递能量的功能，它是蓝藻、红藻和隐藻中除叶绿素a 之外的另一种光合色素。 藻胆蛋白把捕获的光能高效地传递给叶绿素，从而使海藻的光合作用得以发生。 细菌、藻类和高等植物的光合作用的共同特征是具有很多“天线分子”，这些“天 线分子”吸收光能并通过非放射性过程将激发能传递到含囱oj 绿素的“反应中 心”，在红藻、蓝绿藻和隐藻中，藻胆蛋白就充当这种“天线分子”的角色“。 藻胆蛋白是一类寡聚体蛋白，基本构建单位是a 和b 亚基，在b 一和r 一藻红蛋白 中还存在少量的y 亚基每种亚基是由脱辅基蛋白( a p o p r o t e i n ) 和丌链四毗咯结 l 上海海洋人学硕士学侮论文 构的色基组成，色基通过硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氧酸残基交联。一般来说， 藻胆蛋白的q 亚基与b 亚基形成稳定的单体( ab ) 。，再由单体聚合为多聚体( a b ) n 。从蓝藻和红藻中分离的藻e 旦蛋白是三聚体( q ) 。，或六聚体( qp ) 。藻 胆蛋白在溶液中的状态往往与藻胆蛋白的种类、浓度、溶液的p h 和离子强度等因 素有关m 藻胆蛋白是一种水溶性的色素蛋白，用途极为广泛，既可用作用作天然色素而 广泛用于食品、化妆品、染料等行业脯1 ，又可制成荧光试剂，扇于临床医学诊断和 免疫化学以及生物工程等研究领域中，它还是一种重要的生理活性物质，可制成 功能性食品和药品用于医疗保健上。此外，它还是一种最具开发潜力的光敏剂， 可介导肿瘤光动力学治疗一3 。 1 2 藻胆蛋白的研究现状 1 2 1 藻胆蛋白的提取和纯化技术 由于藻胆蛋白具有良好的开发前景，从红藻、蓝藻和隐藻等海洋藻类中提取藻 胆蛋白己成为研究热点。r p e 等藻胆蛋白由于他们复杂的空间结构和分子构成 目前还无法用基因工程手段在大肠杆菌和其他表达体系实现有活性蛋白亚基组分 的体外表达，因为这涉及到脱辅基蛋白亚基、色素分子的合成以及他们的组装等 问题h0 l 。此外，由于受各种条件的限制，用转基因方式生产藻类蛋白的技术也尚 未成熟，所以，目前获取藻胆蛋白的主要途径是直接从藻类植物中分离提取。 藻胆蛋白是水溶性蛋白，提取比较方便，但属于细胞内蛋白，必须要破碎细胞 壁和细胞膜，使藻胆蛋白以溶解状态释放出来，并保持活性。许多方法和试验 条件都被尝试用于处理大量的细胞和提取藻胆蛋白例如冻融法、球磨法、机械 破碎法等，是通过压力、剪切力来达到目的的圳。目前用于藻胆蛋白提取过程中 的细胞破碎法主要有以下几种： 反复冻融法，将收集的藻体用蒸馏水洗涤重新：悬浮，在2 0 以下冰冻， 再在5 融解，反复几次，利用细胞内冰粒的形成和盐浓度增高引起溶胀，使细 胞破碎”q n h 。据彭为民等的经验用此法破碎细胞效果更理想，操作也简单方便。：， 一般适于实验室少量样品的处理。 化学试剂处理法，用十二烷基磺酸钠( s d s ) 处理藻体细胞，破坏其细胞膜束提 取藻胆蛋白。据林卫红等的试验。引，用此法破坏纯顶螺旋藻细胞膜提取藻蓝蛋白， 上淘海洋火学硕+ 学侮论文 提取率高达9 8 ，并明显优于用冻融法提取的对照组1 。此外，有人用0 2 n a n 0 3 或k c l 和溶菌酶联合作用提取藻胆蛋白。用化学法适用于大量样品的制备，但因 加入了化学试剂，后期纯化难度增加，且操作不好易引起蛋白变性。 溶胀法，直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂，释放出 藻胆蛋白。但此法提取周期长，蒸馏水浸泡要1 0 天，低盐溶液浸泡也要3 4 天。 超声波破碎法，运用超声波破碎细胞壁使藻胆蛋白溶出，该法常作为辅助方 法，还须与其它方法合用以最大限度破碎细胞。且超声波破碎细胞产热大，多用 在实验室小量操作。 组织捣碎法，将材料配成稀糊状液，用高速组织捣碎机老破砰藻体细胞。蔡 春尔等通过实验发现将溶胀法和组织捣碎法结合使用提取效果比较好n7 1 。在实际 生产中，常把反复冻融法和超声波破碎法结合使用来破碎细胞n8 | ，此法对设备要 较高，要注意散热，以免温度过高使蛋白变性，破坏产品成分。也有使用化学试 剂处理的，但此法增加了后期操作难度。 藻胆蛋白粗提液中杂蛋白含量较高，还需进一步纯化。其纯度高低一般采用 最大可见吸收峰波长处的吸光值与2 8 0 n m 处的吸光值之比( a 、。，a 删) 来表示。藻胆 蛋白的纯度一般要求a 。a 。印 4 h 1 。 通过加入盐溶液使蛋白沉淀析出，在藻胆蛋白粗提中常用的盐溶液为硫酸胺。 用2 5 ( w v ) 饱和度硫酸胺可将藻红蛋白沉淀出，用3 0 ( w v ) 饱和度硫酸胺可将藻 蓝蛋白沉淀出，5 0 ( w v ) 饱和度硫酸胺可将别藻蓝蛋白沉淀出1 9 1 。但也有研究 结果表明3 0 和5 0 的硫酸胺析出沉淀物中，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的比例几乎一 样，即用此法不能分离出藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白h 1 。 利用不同藻胆蛋白在低浓度硫酸胺中可产生不同晶体的特占用结晶方法来 提取藻胆蛋白。先用硫酸胺盐析，然后将沉淀放置2 0 天以上，再用低饱和度的硫 酸胺沉淀可得到藻胆蛋白沉淀，且纯度很高，在粗提中较为难得。但此法周期较 长。 调节溶液p h 至藻胆蛋白等电点，使藻胆蛋白溶解度下降而沉淀析出。但是藻 胆蛋白对p h 敏感，需注意p h 引起藻胆蛋白的变性。 运用超滤膜过滤藻胆蛋白粗溶液，制得藻胆蛋白粗制品。国外有人用n a n 0 。高 渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小 分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微 囊藻脱毒瞳，提高产品的安全性。用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于 纯化；超滤的优点还在于脱水方便，产品易于干燥。n a n 0 。高渗一超滤法是提取藻胆 蛋白的简单易行的方法心0 2 。但使用膜分离的方法报道较少。 3 上海水产：人学硕十学位论文 羟基磷石灰( h a ) 柱层析法是通常采用的方法，所用沈脱液为梯度浓度的磷酸 盐缓冲液，搜集不同离子浓度的洗脱液，浓缩，再进行一次h a 柱层析。往往需要 经过多次h a 柱层析，再经s p h a d e xg 1 0 0 层析，得单一蛋白溶液。”n 圳。用该法反 复提纯效果较好，得到的蛋白纯度达4 ，5 6 n 引。 单独使用d e a e 一纤维素离子交换柱法效果并不理想，需要和其它方法配合使 用。先用硅藻土5 4 5 杜层析，用梯度浓度的p h 7 0 的硫胺溶液分级洗脱，分部搜 集，再分别上d e a e 一纤维素柱，用磷酸盐缓冲液( p h 6 o ) 沈脱。洗脱液再经盐析， 沉淀，渗析，离心，上清液即为纯化的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，能达到4 以上的 纯度m 刳。 葡聚糖凝胶柱层析法和其他方法结合使用，在纯化后期常能取得较好的效果。 如先用h a 柱层析纯化，再用葡聚糖凝胶柱b i o g e lp 3 0 0 层析可得纯度大于4 的 藻胆蛋白n 。最常用的是盐析提取，羟基磷石灰( h a ) 柱层析纯化的方法，但是该 法加入了化学试剂，增加了纯化难度。在工业生产中，采用膜分离的方法来提纯 较好，此法易于规模化生产，而且将提取和纯化同时进行，操作简便，产品安全 无毒，也有利于后期处理。 1 2 2 藻胆蛋白的生物活性 藻胆蛋白是红藻和蓝藻中的光合作用主要捕光色素蛋白复合体，由藻胆素和 脱辅基蛋白组成。其中藻胆素的结构与胆红素非常相似，胆红素是一种高效的自 由基清除剂。许多研究表明，藻胆蛋白也具有抗氧化活性，而藻胆蛋白清除自由 基主要是由藻胆色素完成的。藻胆素在体内和体外都可以防止脂质体过氧化，保 护i r q a 不受破坏，同时还具有消除炎症的功能，并且藻胆蛋白的抗氧化活性随其 纯度的增加而增加。周站平，陈秀兰登经研究发现在光照下，藻胆蛋白能够产生 自由基，黑暗中，则能够清除自由基，因此，藻胆蛋白具有产生和清除自由基的 双重功能。在光照下，提高蛋白浓度，增加p h ，用s d s 、脲及碱处理对藻胆蛋白 进行变性，其产生自由基的能力消失，清除自由基的能力明显增强心3 3 。 此外，陈美珍，张永雨等对龙须菜藻胆蛋白进行清除自由基研究。发现龙须 菜藻胆蛋白粗提物和分离的p e 均有清除自由基作用，但存在差异0 引。汪兴平，谢 笔均等研究了葛仙米藻红蛋白的清除氧自由基的能力，发现清除氧自由基的能力 为粗提物 藻红蛋白 藻蓝蛋白。 动物试验表明藻胆蛋白还能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免 疫力；增强机体的防病抗病能力1 。日本学者还曾证实藻胆蛋白能促进动物对铁的 上海海洋人学硕士学侮论文 利用，恢复造血功能。藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素( e p o ) 活性，它能直接 刺激c f u e 的形成，对骨髓造血具有刺激作用。引。 陈美珍，余杰等曾经口给予小鼠l o o 、2 0 0 、3 0 0 ( m g k g d ) 的藻胆蛋白粗提 物，连续灌胃1 5 和3 0 天后，分别测定小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力及小鼠脾、胸 腺指数。结果发现藻胆蛋白粗提物能有效增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，刺 激小鼠脾脏和胸腺器官的发育口7 1 。 藻胆蛋白还是一种非常重要的光动力药物的原料，其具有捕光作用即光敏效 应，可作为光敏剂用于辅助激光治癌，用于肿瘤和光动力治疗，它对肿瘤细胞比 对诈常细胞有更强的亲和力，主要在病灶部位富集，吸收光后高效产生自由基和 活泼态氧，从而实现对肿瘤细胞的杀伤。有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢 快乜吼2 9 3 。现在一般认为，藻红蛋白对肿瘤的杀伤作用主要是3 方面机制共同作用的 结果：通过单线态氧、过氧化氢、羟基自由基等氧化剂直接杀死肿瘤细胞，包 括启动细胞凋亡；光疗对上皮细胞的作用导致肿瘤中的血管收缩和形成血栓， 使肿瘤的供氧和养分不足；主体免疫系统的作用。光动力治疗的总体效果类似 于刺激机体产生炎症，当主体免疫系统注入后会出现水肿和红斑， 而与肿瘤相 关的巨噬细胞可能变得失去光动力学活性，或能识别并杀死那些在光动力治疗过 程中破坏较少的肿瘤细胞。m 3 。 1 2 3 藻胆蛋白的应用 藻胆蛋白是一种从藻类中提取的天然的蛋白质，是一种安全无毒的蛋白产品， 而且由于藻类易于养殖，蛋白含量极为丰富，所以，近年来，这种天然蛋自被歼 发利用得较多，在食品，化妆品等轻工业及医疗诊断，生物工程等方面有着广阔 的应用前景。 藻胆蛋白就是藻类特有的捕光色素蛋白，很早就曾报道在红藻和蓝藻中存在 强烈荧光性的红色、紫罗兰色和蓝色蛋白，例如紫球藻中有丰富的藻红素，尤其 是b p e ，已成为具有较高商业价值的天然色素蛋白，它有很好的着色能力，且无 毒，可在食品，软饮料和化妆品中广泛应用。“3 ，不仅对人体无害，其独特丰富的 营养成分还能发挥特殊功效。 天然藻类，特别是螺旋藻等，本身就是一种优良的营养保健食品，其含有丰 富的优质蛋白，b 一胡萝卜素，人体必需的不饱和脂肪酸及多升矿物质能起到补 充营养，增强抵抗力的作用。从天然藻类中提取的藻胆蛋白是一种重要的生理活 性物质，有重要的食品功能成分。因其具有抗氧化和抗肿瘤的生物活性，可用于 癌症、溃疡等疾病的防治，提高机体免疫力，清除体内自由基，延缓人体衰老， 降低各种疾病的发生率。藻胆蛋白含有高等动物所必需的氨基酸，且含量较高， 可用作食品优质蛋白添加剂，强化食品中的蛋白质，在功能食品和保健食品中有 广泛的应用前景。 藻胆蛋白是一种非常重要的光动力药物的原料，可用于肿瘤和光动力治疗， 藻红蛋白介质的光敏反应对肿瘤细胞有相当大的杀伤和诱导作用，还可增加机体 免疫功能。 日本学者将从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白饲喂已经接种肝癌的实验组小鼠，结 果表明实验组小鼠的存活率明显高于对照组，且淋巴细胞活性也显著增高。我国 科学家用s 1 8 0 移植小鼠，分别给予藻蓝蛋白注射2 m g k g 或口服2 0 m g k g ，经铜激 光辐照瘤体1 5 d 后，有效率分别为5 0 和5 3 ，而对照组肿瘤不断长大，证明藻胆 蛋白对癌激光疗法具有增敏作用n 躬 3 。 目前对藻胆蛋白用作光敏剂的研究还处于离体实验阶段，陆续有报道表明， 藻红蛋白与细胞的结合能力是其自身荷电性质和游离浓度这两种因素相互作用的 结果，而这两者又都受溶液p h 的影响。藻红蛋白的等电点接近3 ，大多数肿瘤所处 生长环境的最佳p h 值是5 ，而正常细胞的p h 环境为7 。结果证实，当培养液的酸度 为p h 5 时，既能保证有效的电荷，又能确保溶液有足够的游离藻红蛋白，因此此时 藻红蛋白与瘤细胞有了最佳的结合状态。以p e 为光敏剂光动力学治疗离体的8 1 1 3 人口腔上皮癌细胞、s 1 8 0 小鼠腹水癌细胞株、7 7 2 1 人肝癌细胞株，均取得了较好 的效果。最近也有人用r p e 的b 亚基作为光敏剂在波长为4 9 6n m 的氩离子激光 照射下对s 1 8 0 小鼠移植瘤进行光动力学治疗，发现激光剂量2 0 0j c m 2 时为治愈 剂量；另外，实验也设了只进行激光照射及不做任何处理的s 1 0 0 荷瘤小鼠作对照 组，遗憾的是缺少单用p 亚基对正常细胞损伤的对照组，没有有关其副作用的数据 3 0 o 藻胆蛋白能发射强烈荧光，比常用荧光素强3 0 倍，大大提高了检测敏感性， 且性质稳定，不与蛋白、核酸、细胞等发生非特异性吸附，安全无毒，无污染。 近年来开发藻胆蛋白荧光探针，制作免疫荧光标记抗体，检测灵敏度远远高于传 统的荧光标记物，可用于特殊分子定位和重要分子检测，包括s a r s 病毒的免疫分 子检测，能准确地诊断肿瘤、确定病变部位和病情轻重程度等。用藻胆蛋白制荧 光探针可以克服常用放射性同位素标记法的半衰期短，需防护，废物处理等缺点， 在临床诊断和生物工程研究中有重要作用，该法常采用双功能试剂一琥珀酰贬股 一3 一( 2 一毗啶二硫代) 一丙酸酯( s p d p ) 分别对藻胆蛋白与单克隆抗体( m a b ) 进行预 处理，再混合反应，获得交联物荧光抗体。荧光抗体与被测样品中抗原结合形 6 上海海洋入学硕十学位论文 成固化抗原，检测抗体与固化抗原的另一抗原决定簇结合，形成抗原桥连的免疫 复合物，荧光标记受激发发射荧光，显色为阳性反应。硭j 。 1 。3 藻红蛋白 藻红蛋白( p e ) 是许多海藻的重要的捕光色素蛋白，与藻蓝蛋白( p c ) ，异藻蓝 蛋白( a p c ) 等藻胆蛋白组成棒状的藻胆体，附着在类囊体膜的外表面上，通过锚定 蛋白与类囊体的光和膜相联，构成藻类的捕光系统，光能由位于藻胆体顶端的藻 红蛋白捕集，依次传递给藻胆体中的藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白，最后到达叶绿素a ， 在光系统i i 中将光能转变为化学能，光能传递效率达9 5 以上。如。 最初依据其来源，p e 主要分为r p e ( r 一，r h o d o p h y c e a e ，红藻纲) ， b p e ( b 一，b a n g i p h y c e a e ，红毛菜纲) ，c p e ( c 一，c y a n o p h y c e a e ，蓝藻纲) 等三种。 而按其特征吸收光谱则可分为两峰一肩吸收型藻红蛋白i ( p e i ) 和三峰吸收型的藻 红蛋白i i ( p e i i ) 。p e 中以r p e 最具代表性。根据吸收光谱的特点，r p e 还可以分 为三类，分别是双峰型r p e ( 仅4 9 8 n m 和5 6 5 n m 为吸收风，5 3 5 为吸收肩峰) 、三峰 型i 一型r p e ( 有三个完全的吸收峰，分别位于4 9 8 n m ，5 3 5 n m 和5 6 5 n m ，而且4 9 8 n m 的 吸收峰低于5 3 5 n m 和5 6 5 n m 的吸收峰) 和三峰型ii 一型r p e ( 与i 一型r p e 类似，也有 三个完全的吸收峰，但4 9 8 n m 的吸收峰高于其它两个吸收峰) 。埔。 r p e 主要见于红藻和部分蓝藻中，是多亚基，超大分子量的蛋白色素复合物。 其蛋白分子量据报道从2 2 0 k d 一3 0 0 k d 不等，因种属来源而异。r p e 由脱辅基寡聚蛋 白与开链的四毗咯发色团共价结合而成，组成寡聚蛋白的亚基有a 、0 、y 等， 通常红藻中的r p e 以( qb ) 。y 形式存在，极少种类的r p e 有不同亚基数目。“。 结合在亚基的半胱氨酸残基上的色素分子有藻红胆素( p h y c o e r y t h r o b i l i n ， p e b ) ，吸收带在5 3 0 一5 7 0 n 瑚，和藻尿胆素( p h y c o u r o b i l i n ，跣b ) ，吸收带在 4 9 0 5 0 0 咖。由于色素分子的存在，r p e 在紫外可见光区4 8 0 5 7 0 n m 波段有非常强 的吸收，此波段的吸收弥补了藻类叶绿素a 在海中光能吸收不足的缺点，使海藻更 能适应特殊的生存环境。 藻红蛋白是一种水溶性蛋白，在一些类群中它可占藻体水溶性蛋白的一半左 右。卅j ，可以作为氮源的储备库，为细胞生长发育提供必需的成分。r p e 在藻体内 的生理功能主要体现在作为捕光色素参与光合作用。藻红蛋白、藻蓝蛋白及异藻 蓝蛋白构成藻类的藻胆体，r p e 主要出现于红藻和部分蓝藻的藻胆体中，位于藻 胆体的外端直接捕获光量子。r p e 将捕集的光量子依次传递给藻胆体中的藻蓝蛋 7 上淘海洋人学硕+ 学位论文 白、异藻蓝蛋白，最后到达叶绿素a ，藻红蛋自在能量传递体系中位于第一环节， 是阿级捕光色素油3 。p e 除参与光合作用外，还影响着藻胆体的结构、能量传递， 有重要的生理意义。出于r p e 处在藻胆体复合结构的外端，容易受环境因素的影 响，为了适应生态环境的生存竞争，藻胆体必须不断调整自身结构，包括r p e 的 结构，以保证光能的高效传递。在低氮环境下给予低光照，藻胆体的数量及大小 将增大，若给予高光照，藻胆体将变小，藻胆体量的变化伴随着能量传递效率的 变化，r p e 在藻胆体的聚合一解体过程中起了重要的作用，可见r p 可通过自身 结构及量的变化，影响藻胆体的形成及结构，使能量传递效率发生变化，影响光 合作用1 4 0 3 。 藻红蛋白作为一种光合色素，具有荧光性强度大，量子产率高，易于同生物 素、单克隆抗体等蛋白质产生结合的特点，所以作为荧光标记物，在临床诊断与 生物工程中已得到广泛的应用。迄今为止，已有文献报道从螺旋藻、蓝藻、坛紫 菜、紫球藻等藻类中分离出l o 多种藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和异藻蓝蛋 白，获得数十种单克隆抗体荧光探针和生物素或亲和素标记的荧光探针。 藻红蛋白还可以介导心肿瘤光动力学治疗。目前临床应用于肿瘤光动力学治 疗的光敏剂毒副作用很大，价格昂贵，如果广泛使用的从人血行蛋白中提取的血 卟啉衍生物光敏剂有较强的副作用，包括休克反应，皮肤光毒性( 患者进行治疗 须避光3 4 周) 等，因此有必要开发新型的光动力药物。藻红蛋自由于其优良的德 光学活性，已成为开发藻胆蛋白光敏剂的研究热点。 此外，研究还发现r 一藻红蛋白的些聚集态可以和胰岛素的抗体产生特异性 免疫反应，这说明r 一藻红蛋白构象或结构的某些部位与胰岛素有一定程度的相似， 因而它对糖尿病可能也有一定的疗效h 引。 1 4 紫菜 紫菜( 1 a v e r ) 是红藻门( r h o d o p h y t a ) 原红藻纲( p r o t o f l o r i d e o p h y c e a e ) 红毛 菜目( b a n g i a l e s ) 红毛菜科( b a n g i a c e a e ) 紫菜属( p o r p h y r a ) 的统称。紫菜含有高达 2 9 3 5 的蛋自质以及碘、多种维生素和无机盐类，味鲜美，除食用外还可用以 治疗甲状腺肿大和降低胆固醇，是一种重要的经济海藻。广泛玎布于世界各地， 但以温带为主。现已发现约7 0 余种。自然生长的紫菜数量有限，产量主要来自人 工养殖。坛紫菜( p o r p h y r ah a i t a n 仑n s i s ) 、条斑紫菜( p y e z o e n s i s ) 和甘紫菜 ( p t e n e r a ) 是主要的养殖种类。 8 上淘海洋大学硕士学位论文 其中，坛紫菜是我国特有的传统海水养殖大宗品种，主要分布在福建、浙江 两省，自然生长期从9 月至翌年4 月，生长最适宜温度是1 5 2 0 。经过半个世纪的 发展，我国坛紫菜已经形成苗种培育、海区栽培、加工、贸易配套齐全的的产业。 福建省坛紫菜栽种面积超过1 0 万亩，一般年份每亩养殖纯收入2 0 0 0 3 0 0 0 元，产量 3 万吨，从事坛紫菜的养殖、加工：销售人员达1 0 万人，年产值1 0 亿元以上。当今， 我国是世界第一紫菜养殖生产大国，也是第一紫菜出口贸易国。产品远销美国、 中国台湾、韩国、日本及东南亚等国家和地区，市场潜力很大h 3 3 。 1 5 研究目的及意义 我国海域辽阔，纵跨热带、亚热带和暖温带三个气候带，藻类资源十分丰富。 2 0 0 3 年，我国总的养殖海藻产量达到了1 4 l 万吨( 干重) ，保持着世界第一的地位。 但是，我国海藻资源基本上都是属于原料直接利用，出口产品也只限于粗制品， 还未应用高科技进行深层次的加工和利用。产品的附加值低、竞争力弱、经济效 益差，极大程度上影响了沿海地区经济的发展。而且，当今藻类的一些高科技深 加工产品主要依靠进口，作为药物使用价格十分昂贵。目前藻红蛋白的生产基本 由美国s i g m a 公司的垄断，因此，加快海藻资源的深度开发利用已经迫在眉睫。 藻红蛋白作为海藻藻胆体的一个重要组成部分，在其正常的生理代谢过程中 起着重要的作用，由于色素分子的存在，藻红蛋白在可见光区4 8 0 一5 7 0 n m 波段有较 强的吸收，且在激发状态下会发射强烈的荧光，故它可以作为天然的色素，还可 以可以作为荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究。除此之外，藻胆蛋白 还具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要生理功能，在功能食品、化妆品 和药品中有广泛的应用前景h 4 蚓。因此，藻胆蛋白的大规模丌发利用已成为当前 的研究热点，目前我国对藻类开发利用国内有以红毛菜、紫球澡利螺旋藻作为原 料提取藻胆蛋白的报导，但因其成本偏高以及得率偏低等原因仍处于研究阶段， 至今还未产业化，未有成品进入市场销售。紫菜是我国重要的经济栽培海藻之一， 我国是世界上最大的紫菜生产大国。且紫菜含有丰富的藻红蛋白，藻蓝蛋白，别 藻蓝蛋白，是获取藻胆蛋白的理想资源。紫菜市场价额是红毛菜的1 1 0 ，小球藻 和螺旋藻的1 3 。选用紫菜提取藻胆蛋白，具有成本低，得率高的优点m j 刖，具有 较好的利用价值。 本文以坛紫菜藻胆蛋白为研究对象，在系统研究坛紫菜藻胆蛋白的提取、分 离和纯化的基础上，对坛紫菜藻胆蛋白的光谱学性质、稳定性及其体外清除自由 9 上海海洋k 学硕士学位论文 基以及体内抗氧化能力方面的的药用价值进行研究探讨，旨在为坛紫菜藻胆蛋白 的开发与利用提供理论基础和科学依据。 本文的研究意义在于以下两个方面：理论研究方面，利用生物大分子研究的 理论与手段，研究坛紫菜藻胆蛋白的高效提取纯化、性质和功能，这有助于深入 了解坛紫菜藻红蛋白的理化性质和生物活性，从而为藻胆蛋白的基础研究提供重 要数据；实际应用方面，为紫菜尤其是坛紫菜的开发利用向纵深方面发展提供科 学依据，使我国的紫菜资源和原料优势转化为产品优势，资源优势转化为经济优 势，从而加快紫菜深加工产业的发展。 1 6 研究内容 本研究首先找出从坛紫菜中提取藻胆蛋白的最佳提取条件。并建立一种快速 高效分离紫菜藻胆蛋白的方法，然后研究其相关的性质，包括藻胆蛋白的稳定性， 光谱学性质，亚基组成，以及其在体外清除自由基和体内抗争，f j ，能力方面的活性 等。 1 0 上海海洋人学硕十一化论文 第二章紫菜中藻胆蛋白的分离纯化及性质研究 藻胆蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，主要存在于红藻、蓝绿藻和隐藻的藻 胆体中。具有抗氧化、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要生理功能，在功能食品、 化妆品和药品中有广泛的应用前景。由于紫菜藻胆蛋白是胞内蛋白，要提取分离 藻胆蛋白，首先要破碎细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白溶解释放出来，并保持其生 物活性。细胞破碎程度越高，藻胆蛋白的得率也越高，不同材料、不同条件、不 同目的的细胞破碎的方法也有所不同。目前用于藻胆蛋白提取分离过程中的细胞 破碎方法主要有反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法、超声波法和组织捣碎法， 实际操作过程中，上述几种方法经常混合使用，以最大限度地破碎藻体细胞，使 藻胆蛋白溶出。在比较并分析了传统的细胞破碎法后，最终选守溶胀法和组织捣 碎法来处理坛紫菜细胞，然后采用硫酸胺盐析法制得藻胆蛋白粗提液。 藻胆蛋白粗提液中杂蛋白含量较高，要达到商品应用标准，还必须进一步的 分离纯化，清除杂蛋白，使纯度( a 5 6 5 a 2 8 0 ) 大于4 0 以上，才具有实际应用价值。 藻红蛋白分离研究中常用的纯化方法有：羟基磷灰石法、离子交换层析法和凝胶层 析法。分析了这几种纯化方法后，最终采用二次羟基磷灰石法进行藻红蛋白的纯 化，该法操作简单，成本低廉，能批量制得纯度符合要求的藻红蛋白。 紫菜中的藻红蛋白( p e ) 具有鲜艳的颜色，可作为天然色素用于食品和化妆品 工业，是理想而安全的添加剂。p e 中含有较多的藻红胆素，其吸光系数极高，可 作为荧光