（应用化学专业论文）键合型高效液相色谱手性固定相的制备及其拆分性能研究.pdf

摘要 随着科学技术的发展，人们对不同旋光性药物所表现出来的不同的生理活性这一现 象的认u 更加深入。在生物化学、药物化学及有机化学中的不对称合成和催化技术中， 旋光异构体的分离与分析显得越来越重要。在众多的旋光异构体的分离与分析方法中， 高效液相色谱手性固定相( h p l c c s p ) 直接拆分是一种快速、便捷且有发展潜力的方 法之一。由于键合型固定相的稳定性优于涂敷型固定相，因此，本文所研究的c s p s 都 是键合型的。在查阅、分析和总结国内外大量的高效液相色谱手性分离文献的基础上， 我们制备了匕种新的c s p s ；根掘所键合 性选择剂的种类，大致可将它们分为以下三 类，即环糊精类c s p s 、大环抗生素类c s p s 和生物碱类c s p ( 刷型c s p ) 。具体的工作 如下： ( 1 ) 合成了三种( l ) d n p 氨基酸修饰的p c dc s p s ，即( l ) 一d n p 丙氨酰化d c d c s p 、( l ) d n p 苯丙氨酰化p c dc s p 和( l ) d n p 塌氨酰化p c dc s p ，并以尼莫地平、 氯胺酮、扑尔敏等9 种于性化合物为测试样品对它们的手性拆分性能进行了系统的研究。 结果表明，( l ) 一d n p 缬氨酰化d c dc s p 的分离能力最强，而( l ) d n p 丙氨酰化b c dc s p 的分离能力最差。在( l ) d n p 丙氨酰化b c dc s p 上分离了尼莫地平和维拉帕米，它们 的分离因子c 【分别是5 7 7 和21 1 ，相应的分离度r ；分别是o 7 9 和0 3 7 ；在( l ) 一d n p - 苯 丙氨酰化b c d c s p 上分离了苯丙醇胺、l ，1 联2 萘酚、阿替洛尔、扑尔敏和维拉帕米， 它们的分离因子分别是1 6 9 8 、1 3 4 、3 4 7 、2 5 3 和2 3 8 ，相应的分离度r 。分别是o 5 0 、 0 4 3 、0 2 0 、o 2 6 和0 1 7 ：在( l ) d n p 缬氨酰化b c dc s p 上分离了异丙嗪、扑而敏、苯 丙醇胺、普萘洛尔、氯胺酮和l ，l 联2 萘酚，它们的分离因子旺分别是1 ，3 6 、1 7 5 、2 9 6 、 17 5 、3 _ 8 1 和1 8 4 ，相应的分离度风分别是o6 6 、o 5 9 、0 9 0 、0 5 2 、o 8 2 和0 1 4 。最 后，我们对拆分机理进行了分析，得到了可能的结果，即包合作用仍然是该类c s p s 拆 分外消旋体的寸：导力f f ；l 是，有数据显示，f l ) d n p 氨幕酸部分也参与了拆分过程。 ( 2 ) 合成了利福平一红霉素混合型c s p ，同时制备了利福平c s p 和红霉素c s p ， 并以普萘洛尔等9 种手性化合物为测试样品对其手性拆分性能进行了系统研究。在最佳 分离条件下，尼莫地平、异丙嗪、扑尔敏、普萘洛尔、阿替洛尔和l ，1 联- 2 - 萘酚在混合 型c s p 上实现了分离，它们的的分离因予a 分别是2 1 4 、1 9 0 、1 8 7 、1 6 9 、1 3 8 和1 5 9 ， 相应的分离度艮分别是o ，1 0 、0 _ 3 3 、o 1 2 、o 7 0 、0 6 6 和o 1 4 。结果表明，协同效应在 混合型c s p 拆分外消旋体的过程中扮演了重要的角色。 ( 3 ) 合成了键合偶联双奎宁c s p ，并以扑尔敏等5 种手性化合物为测试样品对其 手性拆分性能进行了系统研究。在最佳分离条件下，扑尔敏、1 ，1 联2 萘酚、异丙嗪和 普萘洛尔的分离因子旺分别是3 0 8 、3 0 9 、1 4 3 和1 1 6 ，相应的分离度r 。分别是1 8 7 、 o7 3 、0 5 4 和o 2 9 。另外，通过分析偶联双奎宁的结构，并结合分离数据，我们发现并 且证明，手性选择剂结构的刚性能够增加对对映体的选择性。 关键词：高效液相色谱；手性固定相；外消旋体：拆分：b 环糊精：红霉素：利福 平；奎宁 a b s t r a c t w 弛t h ed e v e l o p m e n to fs c i e n c ea n dt e c h n o i o g y p e o p l eh a v eh a dad e e pi n s i g h ti m om e p h e n o m e n o nt h a td r u g sw i t hd i f i e r e n ta b i l j t i e st or o t a t et h ep l a n eo fp 0 1 a r i z a t i o no fp o l a r i z c d i i g h th a v ed i s t i n c tp h y s i o i o g i c a la c t i v i t i e s t h e r e f o r e ，i ti sb e c o m i n gm o r ea n dm o r ei m p o r t a n t t oa n a l y z ea n ds e p a r a t eo p t i c a le n a n t i o m e r si nb i o c h e m i s t r y ，m e d i c i n a lc h e m i s t r y ，a 1 1 do r g a n i c c h e m i s l r ya sw e j 】a sa s y m m e t “cs y 力t h e s i sa n dc a t a 】y s i s a m o n gm e s em e t h o d st 1 1 a tc a n s e p a r a t ea n da n a l y z eo p t i c a l l ya c t i v ec o m p o u n d s ，t h ed i r e c tr e s 0 1 u t i o nb ym e a n so fh i 曲 p e r f o r r r l a n c el i q u i dc h r o m a t o 伊a p h yc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s ( h p l c c s p s ) i so n eo f t h er a p i d ， c o n v e n i e n t ，a n dp m s p e c t l v eo n e s b e c a u s ec s p sp r e p a r e db yc h e m i c a lb o n d i n ga r eu s u a l l y m o r es t a b l et h a nt h o s ep r e p a r e db yp h y s i c a lc o a t i n g ，a l lo ft h ec s p ss t u d i e di nt h i sp a p e ra r e c h e m i c a l l yb o n d e do n e s i no r d e rt oc o m p r e h e n dt h ed e v e l o p m e n to fh p l c - c s p s ，w e c o l l e c t e de n o u g hl i t e r a t u r ea th o m ea n da b r o a d b a s e do nt l c s ed o c u m e n t s ，s e v e nn o v e lc s p s w e r ep r e p a r e da c c o r d i n gt ot h ek i n d so fc h i r a is e i e c t o r s ，t h e s es e v e nc s p sc o u i db e c i a s s i 厅e di n t ot h e f o l l o w i n g t h r e e t y p e s ： c y c l o d e x t r i n b o n d e dc s p s ，m a c r o c y c l i c a n t i b i o t j c b o n d e dc s p s 。a n da l k a l o i d b o n d e dc s p ( b n j s h t y p ec s p ) ，t h ew o r kd o n ew a sa s f o l l o w s ： ( 1 ) t h r e e ( l ) d n p a m i n oa c i dm o d i 丘e dp - c dc s p s ，i e ，( l ) 一d n p - a l a n y l a t e dd c dc s p ， ( l ) d n p p h e n y l a l a n y l a t e dc s p a n d ( l ) - d n p - v a l y l a t e dp c dc s pw e r es y n t h e s i z e d n i n e c h i r a ld r u g ss u c ha sn i m o d i p i n e ，k e t a m i n e 、a n dc h ! o r p h e n i r a m i n ew e 诧u s e dt oi n v e s l 噜a t et h e c h i r a ls e d a r a i i o na k l i t i e so ft h e s et h r e ec s p s t h er e s u l t so b t a i n e di n d i c a t e dt h a t ( l ) - d n p - v a l y l a t e d 母- c dc s ph a dt h eb e s t 陀s o l u t i o na b i l i t y w h i l e ( l ) 一d n p a l a n y l a t e dp c dc s p w a s t h e 、v o r s to n ea m o n gt h et h r e e 0 n ( l ) 一d n p - a j a n y l a t e dp c dc sp t w oc h i r a ld r u g s ，i e ， n i m o d i p i n e 锄dv e r a p a r n i lw e r es e p a r a t e di n t ot h e i re n a n t i o m e r s t h e i rs e p a r a t i o nf a c t o r s ( 毡) w e r e5 7 7a n d2 11 ，a n dt h er e s o l u t i o nf a c t o r s ( r s ) w e r eo 7 9a n do 3 7 ，r e s p e c t i v e l y o n ( l ) - d n p p h e n y l a l a n y l a t e dp c dc s 只p h e n y l p m p a n o l a m i n e ，l ，1 - b i 一2 一n a p h t h 0 1 ，a t e l o l ， c h l o r p h e n i m m i n e ，a n dv e r a p a m “w e r es e p a r a t e di n t ot h e i re n a n t i o m e r s t h e i rs 印a r a t i o n f a c t o r s ( 0 1 1w e r e16 9 8 ，1 3 4 ，3 4 7 ，2 5 3 ，a n d2 3 8 ，a n dt h er e s o i u t i o nf a c t o r s ( r s ) w e r eo 5 0 ， 0 4 3 ，0 2 0 ，o 2 6 ，a n d 0 17 ，r e s p e c t i v e l y o n ( l ) 一d n p v a l y l a t e dd c dc s p p r o m e t h a z i n e ， c h l o r p h e n j r a m i n e p h e n y l p r o p a n o i a m i n e ，p r o p r a n o l 0 1 ，k e t a m i n ea n d1 ，1 - b i - 2 n a p h t h o lw e r e r e s o l v e d t h e i rs e p a r a t i o nf h c t o r s ( a ) w e r e1 3 6 ，1 7 5 ，2 9 6 ，1 7 5 ，3 8 l ，a n d1 8 4 ，a n dt h e r e s o l u t i o nf a c t o r s ( r s ) w e r e0 6 6 ，o 5 9 ，o ，9 0 o ，5 2 ，08 2 ，a n do 14 ，r e s p e c t i v e l y m e a i l w h i l e ， t h ep o s s i b i er e s o l u t i o nm e c h a n i s mw a sp r o p o s e d 、t h ee x p e r i m e md e m o n s t r a t e dt h a ti n c l u s i v e e 矗e c t sd o m i n a t e dt h er e s o l u t i o np r o c e s s e so nt h e s et h r e ec s p s ，h o w e v e r ，i tw a ss h o w nt h a t ( l ) 一d n p a m i n o a c i dm o j e t j e s1 i n k e dt ot 1 1 e p e r i p h e r y o fp c d 、v e r ec o n d u c i v et ot h e r e s o l u t i o np m c e s s e s ( 2 ) r i f a m p i n e r ”h r o m y c i nm i x t u r eb o n d e dc sp ，a sw e i la sr i f h m p i n _ b o n d e dc s pa n d e r y t h r o m y c i n - b o n d e dc sp w a sp r e p a r e d p r o p r a n 0 1 0 1e ta lw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h ec h i r a l r e s o l u t i o na b 1 j t i e so ft h e s ec s p su n d e rt h eo p t i m i z e dc h r o m a t o g m p h i cc o n d i t i o n s ， n i m o d i p i n e ，p r o m e t h a z i n e ，c h l o r p h e n i r a m i n e 、p r o p r a n 0 1 0 l ，a t e n o l o l ，a n dl ，1 b i 一2 一n 印h t h o l w e r es e p a r a t e di n t ot h e i re n a n t i o m e r so nr i f h m p i n e r y t l l m m y c i nm i x t u r eb o n d e dc sp - t h e i r s e 口a m t j o nf 犯t o r s ( a ) w e r e2 14 ，1 9 0 ，1 ，8 7 ，l ，6 9 ，1 3 8 ，a n d1 5 9 ，a i l dt h er e s 0 1 u t i o nf a c t o r s ( r s ) w e r e0 10 ，0 3 3 ，o 12 ，o 7 0 ，0 ，6 6 ，a n d o 14 ，r s p e c t i v e i yf u r t h e 硼o r e ，i t 、v a si n d i c a t e d t h a ts y n e r g i s t i ce f f b c t sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h er e s o l u t i o np r o c e s s e s ( 3 ) b i s - q u i n i n eb o n d e dc s pw a ss y n t h e s i z e d f i v ec h i m ld m g ss u c ha sc h l o r p h e n i r a m i n e w e r eu s e da st e s t e ds a m p l e st oi n v e s t i g a t et h ec h i r a lr e s o l u t i o na b i l i t yo ft h i sc s pu n d e rt h e o p t i m i z e dc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ， m es e p a r a t i o nf a c t o r s( a )o fc h l o r p h e n i r 锄i n e ， 1 ，1 - b i - 2 - n 印h t h o l ，p r o m e t h a z i n e ，a i l dp m p r a i l o l o lw e r e3 0 8 ，3 0 9 ，1 4 3 ，a n d1 1 6 ，a i l dt h e r e s o i u t i o nf 如t o r s ( r s ) w e r e1 8 7 ，o 7 3 ，0 ，5 4 ，a n do 2 9 ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e m o r e b a s e do nt h e 肌a l y s i so ft h es t 兀l c t u r eo fb i s - q u i n i n ea sw e l la st h ec 上1 r o m a t o g r a p h i cd a t a ，ac o n c l u s i o nw a s d r a w nt h a ts t r u c t u r a lr 西d i t yo ft h ech r i a ls e l e c t o rc o u l di m p r o v et h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yt o c e r t a i nr a c e m a t e s k e y w o r d s ：h i g h p e r f o m l a n c e1 i q u j dc h r o m a t o g r 印h y ；c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ；r a c e m a t e r e s o l u t i o n ；d c y c i o d e x t r i n ；e r y t h r o m y c i n ；r i f 豳p i n ；q u j n i n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得 的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼堡王太堂 或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：签字日期：秒f 年月占日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全_ 解丞洼理王太堂有关保留、使用学位论文的 规定。特授权天洼理工大堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编，以供查 阅和借阅。同意学校向国家有关部j 或机构送交论文的复本和电子文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：斧租银 导师签名： 日珈了 tk一嚼 签字日期：形年f 月5 日签字日期：口6 年f 月r 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 手性分离的重要意义 1 1 1 手性的定义 物质互为镜像关系且不能重叠的性质称为手性( c h i r a l i t y ) 。两种互为镜像关系而又 不能重叠的分子称为对映异构体( e n a i l t i o m e r ) 【l | 。在自然界中，手性现象无处不在，据 认为是生命体的本质属性之一，可以说“生命是不对称的”。化合物分子如果含有某些 不对称因素，如没有对称面、对称中心或交替对称轴，那么该分子就不能与其镜像叠 合，这种分子称为手性分子，这两种可能的形态被称为对映体。这就好比人的左右手， 互成镜像对称但不能叠合；这便是词语“手性”的来源。饱和碳原子具有四面体结构， 如果连接了四个不同的原子或基团，那么形成的分子就具有手性性质，这个碳原子就称 为手性碳原子或手性中心。此外，分子中的硫原子、磷原子等也可能成为手性原子。 1 1 2 手性拆分的现实意义 随着医学工程和生命科学的发展，科学家已经认识到，手性化合物的对映异构体尽 管它们的物理和化学性质几乎完全相同，只有旋光性不同，但它们在生物体内的生理作 用和药理作用却存在很大的差异。众所周知，人体内的d n a 和r n a 都是d 型的，构 成蛋白质的2 0 多种天然氨基酸( 甘氨酸除外) 都是l 型的。具有生物活性的手性化合 物，例如药物，与它的受体以手性方式相互作用，药物的两个对映体以不同的方式参与 作用并导致不同的结果。生物体内的酶与受体都是手性的。酶是生物体内的催化剂。生 物体内许多重要的生理生化反应都是由酶催化的，酶决定着各种各样生化反应的方向和 速度，而酶对底物具有极强的手性识别能力，药物对映体在生物体内常常表现出不同的 药理和药代特性因而具有不同的生理作用。外消旋药物的两个对映体以不同的途径被 吸收、活化和降解。对映体在生物体的手性环境中，本质上是两种不同的分子，因而具 有不同的功效。 在生物体系中，立体异构识别是非常明显的。就手性药物分子而言，可能有四种不 同的行为【2 】：( 1 ) 只有一种异构体具有所希望的活性，另一一种没有显著活性：( 2 ) 两种 对映体具有相同或近乎等同的定性和定量的生物活性：( 3 ) 两种对映体具有等量上等同 的但定性上不同的活性：( 4 ) 两种对映体具有等量上不同的活性，例如用于治疗帕金 森病的l 多巴。活性的成分是由l 多巴通过体内脱羧作用形成的非手性化合物多巴胺。 由于多巴胺不能通过血脑屏障到达作用部位，必须服用前药l - 多巴，再由酶作用将l - 多巴脱羧，释放如药物的活性形态多巴胺。然而，多巴脱羧酶具有专一性，只对l 多巴 作用。因此，必须服用纯的l 多巴，否则，d 多巴可能会危险地积累在体内。其他许多 药物也有类似的性质，例如( s ) 一天冬酰胺味苦，而( r ) 天冬酰胺则味甜：( s ) - 香芹酮为芫 荽味，而( r ) 香芹酮则为留兰味；( s ) 普萘洛尔比( r ) 普萘洛尔的活性高9 8 倍p j ；对于 非f 体类解热镇痛药，s 构型有尘理活性，r 构型无生理活性或活性很低等等。使用外 消旋药物可能导致错误的药代行为和作用模式。在美国医药药物名称词典所列出的2 0 5 0 种药物中，大约有一半药物分子至少包含一个手性中心，其中有4 0 0 多种药物以外消体 或菲对映异构体的形式服用。限于分离测试技术上的困难，其大部分对映体的疗效及对 第一章绪论 哺乳动物的毒性、体内的吸收、代谢等方面的差别还未被深入研究。另外一个典型的例 子就是发生在上个世纪六十年代引起整个欧洲恐慌的“沙立度胺( 1 1 1 a l i d o m i d e ) 悲剧”。 沙立度胺又称“反应停”，是外消旋的酰胺哌啶酮，用于治疗孕妇呕吐，它的使用导致 了上万名畸形婴儿的出生。研究发现，其( r ) - 构型具有良好的镇静作用而( s ) 构型却导致 胎儿畸型 4 】0 反应停对映体的结构如图1 1 所示。 ( s ) t h a l i d o m i d e( r ) 一t h a l i d o m i d e 图卜l 反应停对映体的结构式 f 嘻1 - 1s t r u c t u r e so f e n a n t i o m e r so f t h a l i d o m i d e 鉴于有机分子的构型与其生物活性的特殊关系，有必要对手性化合物的各个异构体 分别进行考察。了解它们各自的的生理活性，以便达到高效、安全、无污染的用药目的。 为此，许多国家都先后规定。在申报手性药物时，必须对不同光学异构体的生理活性叙 述清楚。1 9 9 2 年3 月，美国食品药物管理局作出手性药物指导原则：个含手性因素的 化学药物，必须说明其两个对映体在体内不同的生理活性、药理作用和代谢过程，以及 考虑单一对映体的问题l 、j 。 近年来，世界市场上手性药物的增长速度很快据统计，目前所用的各类药物中， 5 2 3 种天然及半合成药中手性药有5 1 7 种，1 3 2 7 种全合成药中手性药有5 2 8 种，而这些 手性药物中的7 5 一9 0 是以外消旋体的形式在市场上销售【6 】。正在开发的1 2 0 0 种药物 中，有8 2 0 种是手性的，其中6 1 2 种是以单一对映体在丌发，占总数的5 1 。处于i i i i i 期临床试验的药物中，8 0 是单一对映体产品。据预测，到2 0 0 6 年世界上市的化学合 成新药中约有6 0 为单一对映体药物【7j 。然而，到目前为止，大部分对映体的疗效及药 代动力学的差别还远未被认识和深入研究，这迫使科研人员不断地丌发出更多的单一对 映体的手性药物以满足临床试验及市场的需求。 综上所述，建立高专属性、高灵敏度、高分离度的对映体拆分和测定方法具有重要 的理论和实际意义，并且已成为当今科学领域中的研究前沿。 1 2 获得手性化合物的常用方法 1 2 1 手性源合成法 手性源途径是指利用手性化合物作为原料合成目标分子的方法与途径。常用的手性 源有天然的糖类化合物、氨基酸等等。例如d 苯甘氨酸，d 对羟基苯甘氨酸是氨苄青 霉素、头孢霉素、头孢拉定等抗生素类药物合成常用的中间体；以天然糖为原料可以合 成一系列的生物活性脂链化合物等等【8 j 。除抗生素的合成外，此方法在其他类型的药物 合成中的应用很少，一方面是由于手性源的种类有限，另一方面是因为在合成过程中会 第一章绪论 有外消旋的倾向存在。 1 2 2 不对称合成法 2 0 0 1 年诺贝尔化学奖授予了三位不对称合成的丌刨者：美国科学家诺尔斯、夏普 莱斯和同本科学家野依良治。诺尔斯首先在这方面取得了突破性进展，他利用过渡金属 元素制造出含有手性配体的络合物，将其作为催化剂，就可以在与非手性的底物作用时 实现手性的传递，得到手性产物。经过许多科学家的努力，己经实现了手性催化加氢、 氧化等多种反应。例如现在利用不对称合成可以生产解热镇痛药( s ) 奈普生、手性抗癌 药物t 叙o j 等多种手性药物。但在整个手性药物之中通过不对称合成法得到的手性药 物所占的比例还很小，寻找合适的催化剂是一个十分漫长的过程1 9 】。 1 2 3 外消旋药物拆分法 通过合成反应得到外消旋药物，然后再通过各种方法进行拆分，从而得到光学纯度 的手性药物，是一种较为便利的方法，所需的周期较短，是目前手性药物工业化生产的 主要方法。一般所用的拆分方法有以下几种。 1 2 3 1 结晶法 结晶法包括直接结晶拆分法和晶体接种拆分法，其中直接结晶法是最早应用于手性 拆分的方法。p 船t e u r l 4 j 首次分离酒石酸对映体就是利用外消旋的酒石酸铵钠盐在2 7 以 下结晶时形成的晶体是“外消旋混合物”，由于两个对映体的半面晶外观不一样f 成实物 镜像关系) ，故可借助放大镜，用镊子将两种晶体分开。实际应用中这种情况很少，于 是又出现了一个改良方法，即“晶体接种拆分法”：在一个外消旋混合物的热饱和溶液 中加入纯对映体之一的晶种，然后冷却，则同种的对映体将附在晶体上析出。滤去晶体 后，母液重新加热，并补加外消旋体使之达到饱和，然后加入另一种对映体的晶种，冷 却使另一对映体析出这样交替进行，可方便地获得大量纯对映体结晶。这种方法虽然 应用有限但工艺简单。效果好，对某些消旋体是一种很理想的大规模拆分方法。在没 有纯对映体品种的情况下有时使用结构相似的其它手性化合物( 有时甚至是非手性化 合物) 作晶种，也能获得成功。 结晶法耗时费力，仅能应用于实验室研究。晶体接种拆分法虽然工艺简单、成本低， 但应用面有限。 1 2 3 2 化学拆分法 如果外消旋分子含有活性官能团，可与某种纯手性物质( 手性试剂) 反应，形成非 对映异构体，从热力学的观点来看，可利用非对映异构体之阳j 的化学、物理性质的差异 进行分离，再将衍生物还原为纯对映体，从而实现外消旋体的拆分，这就是化学拆分法。 大部分化学拆分法过程冗长，产率通常不高，对映体光学纯度不高，适用的化合物类型 不多。尽管近年来，包结拆分和组合拆分等新的化学拆分方法在一定程度上拓展了该方 法的应用范围，但是从整体上看来，该法的应用还很有限l l 。 1 2 3 3 生物( 酶) 拆分法1 生物拆分法是利用酶对光学活性异构体有选择性的酶解作用，使外消旋体中一种光 学异构体酶解较快，而另一种酶解较慢，或者不发生酶解，劳在适当的条件下被保留而 达到分离。酶催化拆分的主要途径有主体选择性水解、酶化和转酶作用，近年来发展的 第一章绪论 有外消旋的倾向存在。 1 2 2 不对称台成法 2 0 0 1 年诺贝尔化学奖授予了二位不对称合成的丌刨者：美国科学家诺尔斯、夏普 莱斯和同本科学家野依良治。诺尔斯首先在这方面取得了突破性进展，他利用过渡金属 元素制造出含有手性配体的络合物将其作为催化齐j ，就口j 以在与非手性的底物作用时 实现手性的传递，得到手性产物。经过许多科学家的努力，已经实现了手性催化加氢、 氧化等多种反应。例如现在利用不对称合成可以生产解热镇痛药( s ) 奈普生、手性抗癌 药物t a x o l 等多种手性药物。但在整个手性药物之中，通过小对称合成法得到的手性药 物所占的比例还很小，寻找合适的催化剂是个十分漫长的过程1 9 】。 1 2 3 外消旋药物拆分法 通过合成反应得到外消旋药物，然后再通过各种方法进行拆分，从而得到光学纯度 的手性药物，是种较为便利的方法，所需的周期较短，是目前手性药物工业化生产的 主要方法。一般所用的拆分方法有以f 几种。 1 2 31 结晶法 结晶法包括直接结晶拆分法和晶体接种拆分法，其中直接结晶法是最早应_ 1 1 ；j 于手性 拆分的方法。p t e “4 7 首次分离酒石酸对映体就是利用外消旋的酒石酸铵钠盐在2 7 以 下结晶时形成的晶体是“外消旋混合物”，由于两个对映体的半面晶外观不_ 样( 成实物 镜像关系) ，故。】借助放大镜，用镊子将两种晶体分丌。实际应用中这种情况很少于 是又出现了一个改良方法，即“晶体接种拆分法”：在一个外消旋混合物的热饱和溶液 中加入纯对映体之一的晶种，然后冷却，则同种的对映体将附在晶体卜析出。滤去晶体 后，母液重新加热，并补加外消旋体使之达到饱和，然后加入另一种对映体的晶种，冷 却使另一对映体析出这样交替进行，可方便地获得大量纯对映体结晶。这种方法虽然 应用有限，但工艺简单，效果好，对某些消旋体是一种很理想的大规模拆分方法。在没 有纯对映体晶种的情况下，有时使用结构相似的其它手性化台物( 有时甚至是非手性化 合物) 作晶种，也能获得成功。 结晶法耗时费力，仅能应用于实验室研究。晶体接种拆分法虽然工艺简单、成本低， 但应用面有限。 1 2 + 3 ，2 化学拆分法 如果外消旋分子台有活性官能团，可与某种纯手性物质( 手性试剂) 反应，形成非 对映异构体，从热力学的观点来看可利用非对映异构体之间的化学、物理性质的差异 进行分离，再将衍生物还原为纯对映体，从而实现外消旋体的拆分，这就是化学拆分法。 大部分化学拆分法过程冗长，产率通常不高，对映体光学纯度不高适用的化合物类型 不多。尽管近年来，包结拆分和组台拆分等新的化学拆分方法在一定程度b 拓展了该方 法的应用范围，但是从整体上看柬，该法的应用还很有限。 1 2 3 3 生物( 酶) 拆分法 生物拆分法是利用酶对光学活性异构体有选择性的酶解作用，使外消旋体中一种光 学异构体酶解较快，而另一种酶解较慢，或者不发生酶解，并在适当的条件下被保留而 达到分离。酶催化拆分的主要途径有 体选择性水解、酶化和转酶作用，近年束发展的 达到分离。酶催化拆分的主要途径有丰体选择性水解、酶化和转酶作用，近年来发展的 第一章绪论 有外消旋的倾向存在。 1 2 2 不对称合成法 2 0 0 1 年诺贝尔化学奖授予了三位不对称合成的丌刨者：美国科学家诺尔斯、夏普 莱斯和同本科学家野依良治。诺尔斯首先在这方面取得了突破性进展，他利用过渡金属 元素制造出含有手性配体的络合物，将其作为催化剂，就可以在与非手性的底物作用时 实现手性的传递，得到手性产物。经过许多科学家的努力，己经实现了手性催化加氢、 氧化等多种反应。例如现在利用不对称合成可以生产解热镇痛药( s ) 奈普生、手性抗癌 药物t 叙o j 等多种手性药物。但在整个手性药物之中通过不对称合成法得到的手性药 物所占的比例还很小，寻找合适的催化剂是一个十分漫长的过程1 9 】。 1 2 3 外消旋药物拆分法 通过合成反应得到外消旋药物，然后再通过各种方法进行拆分，从而得到光学纯度 的手性药物，是一种较为便利的方法，所需的周期较短，是目前手性药物工业化生产的 主要方法。一般所用的拆分方法有以下几种。 1 2 3 1 结晶法 结晶法包括直接结晶拆分法和晶体接种拆分法，其中直接结晶法是最早应用于手性 拆分的方法。p 船t e u r l 4 j 首次分离酒石酸对映体就是利用外消旋的酒石酸铵钠盐在2 7 以 下结晶时形成的晶体是“外消旋混合物”，由于两个对映体的半面晶外观不一样f 成实物 镜像关系) ，故可借助放大镜，用镊子将两种晶体分开。实际应用中这种情况很少，于 是又出现了一个改良方法，即“晶体接种拆分法”：在一个外消旋混合物的热饱和溶液 中加入纯对映体之一的晶种，然后冷却，则同种的对映体将附在晶体上析出。滤去晶体 后，母液重新加热，并补加外消旋体使之达到饱和，然后加入另一种对映体的晶种，冷 却使另一对映体析出这样交替进行，可方便地获得大量纯对映体结晶。这种方法虽然 应用有限但工艺简单。效果好，对某些消旋体是一种很理想的大规模拆分方法。在没 有纯对映体品种的情况下有时使用结构相似的其它手性化合物( 有时甚至是非手性化 合物) 作晶种，也能获得成功。 结晶法耗时费力，仅能应用于实验室研究。晶体接种拆分法虽然工艺简单、成本低， 但应用面有限。 1 2 3 2 化学拆分法 如果外消旋分子含有活性官能团，可与某种纯手性物质( 手性试剂) 反应，形成非 对映异构体，从热力学的观点来看，可利用非对映异构体之阳j 的化学、物理性质的差异 进行分离，再将衍生物还原为纯对映体，从而实现外消旋体的拆分，这就是化学拆分法。 大部分化学拆分法过程冗长，产率通常不高，对映体光学纯度不高，适用的化合物类型 不多。尽管近年来，包结拆分和组合拆分等新的化学拆分方法在一定程度上拓展了该方 法的应用范围，但是从整体上看来，该法的应用还很有限l l 。 1 2 3 3 生物( 酶) 拆分法1 生物拆分法是利用酶对光学活性异构体有选择性的酶解作用，使外消旋体中一种光 学异构体酶解较快，而另一种酶解较慢，或者不发生酶解，劳在适当的条件下被保留而 达到分离。酶催化拆分的主要途径有主体选择性水解、酶化和转酶作用，近年来发展的 第一章绪论 非水相酶催化技术用于许多疏水化合物的拆分，使该技术得到了更大的应用。迄今为止， 绝大多数天然氨基酸都己成功地用酶法拆分得到了高纯度的对映体。但该法仅适用于酶 促反应体系，另外酶不稳定、制剂的价格较高也阻碍了它们的应用。 1 2 3 4 色谱法 色谱法是指利用手性对映体与固定相之间不同的相互作用力，在流动相沈脱时具有 不同的保留时间这一原理达到分离的目的。利用色谱法分离物质的装置有许多种，例如 薄层层析、气相色谱、高效液相色谱、制备色谱、模拟移动床、毛细管电泳等，它们的 基本原理大致相同，只是实现的途径、分离能力、分离精度和使用范围等方面有所不同。 这罩以高效液相色谱( h i 曲一p e r f o h n a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，简称h p l c ) 为代表， 介绍色谱法中几种主要的分离技术。 h p l c 拆分的主要方法一般分为两类：间接法和直接法。间接法采用非手性固定相， 用单一对映体试剂将药物对映体衍生化，生成非对映异构体，从而用常规固定相达到拆 分的目的。例如以( r ) - 氯化酸薄荷醇酯作为手性衍生化试剂，对( r ) 麻黄碱和( s ) 一麻黄碱 衍生化后生成一对非对映异构体，可用c 1 8 固定相，在反相流动相条件下实现分离【1 2 】。 直接法则采用手性固定相( c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，简称c s p ) ，或者将手性选择剂加入 到色谱流动相中，使用常规的固定相。手性固定相法发展较快，应用范围更广，研究者 也较多，一般来说优于后一种方法。以下主要介绍手性固定相的发展。 】3 常见c s p s 的分类 c s p s 是手性h p l c 的关键部件，它直接决定了拆分的效果，目前的c s p s 已有1 0 0 多种，以固定化的手性选择剂的结构特征和手性分离的机制这两项特征为依据，可将它 们分为以下几类：蛋白质型c s p s ，环糊精型c s p s ，聚糖型c s p s ，刷型( 又称p i r k l e 型) c s p s ，大环抗生素类c s p s ，以及其它类型的c s p s 。 接下来对主要几类c s p s 分别予以介绍，并重点介绍本论文所涉及的三类固定相， 即大环抗生素类c s p s 、环糊精型c s p s 和刷型c s p s 。 1 3 1 大环抗生素类c s p s 目前报道的用于对映体分离的大环抗生素按其结构特点可以分为以下三类：糖肽 类、柄状霉菌素类、多肽与氨基糖苷类【l ”。a n n m o n g 研究小组首先实现了用大环糖肽 类抗生素作c s p s 的设想。依据目前的文献报道，万古霉素( v m c o m v c i n ) 和替考拉宁 ( t e i c o p l a n i n ) 被研究的最多。万古霉素分子包含1 8 个手性中心，由五个芳环桥组成三 个大的孔穴环。在环结构的周围强极性基团的存在，提供了与溶质对映体问强的偶极作 用。万古霉素结构稳定，分离样品容量较大，与硅胶表面可多点键合。万古霉素分子孔 穴深度不及环糊精，异构体在固定相与流动相问的交换快，柱效率高。万古霉素c s p 现 己商品化，其商品名为c h i r o b i o t i cv 。万古霉素c s p 在有机溶剂含量0 一1 0 0 时都很稳 定，f 反相均可使用。通过调节流动相的组成，万古霉素c s p 能广泛地用于分离能提供 疏水作用或偶极一偶极作用的异构体。 替考拉宁是另一个研究较多的大环抗生素，由它所制得的c s p 也已经商业化，商品 名为c h i r o b i o t j ct 。替考拉宁分子中含有2 0 个手性中心，4 个分子孔穴，通过多元共 价键键合到硅胶上。这种c s p 的分子量仅为1 1 8 5 ，手性中心就有2 0 个，这就提供了相 第一章绪论 对较高的异构体与c s p 手性中心接触的机会。这种c s p 被认为是万古霉素的补充，它 们可以使用相同的流动相，在一种c s p 上没有手性选择性的异构体，往往在另一种c s p 上能得到分离【l “。c h i r o b i o t i ct 可以在反相条件下使用强极性流动相，如乙腈缓冲液等； 也可用于f 相以f 己烷和乙醇混合液作流动相。b e r t h o d 等以水溶液作流动相，用 c h i r o b i o t i c t 分离了5 4 种化合物( 包括所有未衍q 三化的天然氨基酸) ，可以不用缓冲溶液 m j 。迄今为止，在分离氨基酸对映体的效果上还没有一种c s p 可与c h i r o b i o t i ct 相比。 此外，瑞斯西丁素a ( r i s t o c e t i n a ) 于近年也被用作手性选择剂，它和上述两种大 环抗生素有着相似的结构，具有4 个大环，3 8 个手性中心1 1 。 对于h p l c 而言，这3 个大环抗生素都是多模式的c s p s ，它们不仅可用于j 下相模 式和反相模式，还可以用于极性有机相( 它可以是与乙腈混溶的有极性的弱氢键溶剂， 也可以是含有少量冰醋酸和( 或) 三乙胺