（应用化学专业论文）鱼皮胶原蛋白分离制取羟脯氨酸及其初步应用.pdf

i l 上海水产大学学位论文原创性声明缈嘲 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 叼磅 学位论文作者签名：字稳 日期：加叼7 年伊s 月万日 上海水产大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 彤，在乒年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 口 学位论文作者虢参胥指删币虢嘛暂肫 日期：渺产多月心日日期：加7 年r 月巧日 i 鱼皮胶原蛋白分离制取羟脯氨酸及其初步应用 李娟 ( 上海水产大学，2 0 0 0 9 0 ) 摘要 本课题旨在研究利用水产品加工废弃物( 鱼皮) 来提取胶原蛋 白，并从胶原蛋白中制取羟脯氨酸，并将提取物应用到植物生长方 向。 第一部分主要研究了用醋酸提取艘觫鱼鱼皮中的胶原蛋白并纯 化。主要通过确定胶原蛋白提取的最佳温度和时间范围为4 0 ，1 小 时：4 5 ，1 小时：5 0 ，0 5 小时：5 0 ，i 小时。就纯度而言，4 0 ， 4 5 。c ，5 0 的纯度依次降低，但均较高：就得率而言，4 0 。c ，4 5 。c ， 5 0 依次增高( 时间均为1 小时) 。在讨论了最佳提取纯化条件之后， 开始运用胶原蛋白的提取工艺对废弃物进行工艺操作，包括：非胶 原蛋白的去除；胶原蛋白的提取；滤液中蛋白质浓度和羟脯氨酸的 测定；胶原蛋白的纯化( 搅拌盐析，复溶，过滤，透析) 等。进而 最终得到较纯的胶原蛋白成品。 而第二部分主要以胶原蛋白为原料，进行盐酸水解，用亚硝酸 钠氧化，排除其他氨基酸的干扰，使得用7 3 2 阳离子交换树脂只提 取分离羟脯氨酸和脯氨酸。其中先确定两种氨基酸的分离点，羟脯 氨酸范围在p h5 5 7 ，脯氨酸范围在p h7 8 9 ；然后对离子交换柱 的分离条件进行探讨分析，包括离子交换柱的选择，由于7 3 2 阳离 子交换树脂分离效果更佳而被最终确定使用，水解液上柱时的浓度 ( 2 0 最佳) ，淋洗液及淋洗时间( 蒸馏水淋洗1 小时) ，然后对洗脱 剂的浓度，速度和试剂的选用进行了对比，比较得到o 1 n 氨水以 8 m l m i n 的流速洗脱交换柱能达到最佳洗脱效果，进而对羟脯氨酸和 脯氨酸的分离提纯提供了理论依据。最后再对胶原蛋白酸水解的条 件( 胶原蛋白和盐酸的比例，水解时间) 进行探讨，从而得到几种 不同的水解效果，具体选择哪个水解条件要依据不同目的进行选择。 最后得到胶原蛋白和盐酸体积比为1 ：3 ，并水解2 0 小时能得到最高 提取率的羟脯氨酸，因此通过水解分离提纯，我们得到较纯的羟脯 氨酸成品。 第三部分的羟脯氨酸应用部分，是整篇论文的创新点。我选择 用植物实验来验证羟脯氨酸对植物生长的作用，并且从两个方面对 选定的植株观音莲做培育实验。发现在验证根部是否能吸收羟脯氨 酸的实验中，通过分析实验结果的趋势，我们也能大胆猜想羟脯氨 酸对植物的生长有一定的贡献。在茎叶保鲜实验当中，我们也验证 了羟脯氨酸对离体植株有一定的保鲜作用，虽然只是简单的定性试 验，可是已经为其应用方面开辟了一片新的天地。 关键词：水产品加工废弃物，胶原蛋白，羟脯氨酸，脯氨酸，提取， 分离，离子交换，植物保鲜 s e p a r a t i o na n dp r e p a r a t i o no fh y d r o p r o l i n ef r o mt h ef i s h s k i nc o l l a ga n d p p l i c a t i i o fh y d r o p r o l i n e s h a nc o l l a g e na n dp r i m a r ya p p l i c a t i o no fh y d r op r o l i n e _ l ij u a n ( s h a n g h a i f i s h e r i e su n i v e r s i t y ，2 0 0 0 9 0 ) a b s t r a c t t h i st o p i ci sf o rt h ep u r p o s eo f e x t r a c t i n gc o l l a g e nu s i n gt h ea q u a t i c p r o d u c tp r o c e s s i n gr e m a i n s ( f i s hs k i n ) ，p r e p a r a t i n gh y d r o x y p r o l i n ef r o m c o l l o g e n ，a n da p p l i c a t i o no fh y d r o x y p r o l i n ei np l a n tg r o w t h p a r tih a ss t u d i e de x t r a c t i n ga n d p u r i f i c a t i o nc o l l a g e nb yu s i n g a c e t i ca c i d t h eo p t i m i z e d t e m p e r a t u r ea n dt i m ea r e4 0 ，1h o u r ；4 5 ， 1h o u r ；5 0 ，0 5h o u r ；5 0 ，1h o u r a sf a ra st h ep u r i t yb ec o n c e r n e d ， 4 0 ，4 5 ，5 0 sp u r i t i e sr e d u c ei np r o p e ro r d e r ，b u tt h e ya r ea l lh i g h a sf a ra st h ey i e l db ec o n c e r n e d ，4 0 ，4 5 ，5 0 i n c r e a s e si np r o p e r o r d e r ( t h et i m ei s1h o u rw i t h o u te x c e p t i o n ) b e h i n dt h ec o n d i t i o no f t h eb e s te x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nh a v i n gb e e nd i s c u s s e d ，t h ee x t r a c t i o n p r o c e s so fc o l l a g e ni sc a r d e do u tb yu s i n gf i s hs k i n i n c l u d i n gn o n c o l l a g e nt a k e o f f ；t h ec o l l a g e nd r a w i n g ；t h em e a s u r eo fp r o t e i nt h i c k n e s s a n dh y d r o x y lp r o l i n ei nf i l t r a t e ；t h ec o l l a g e np u r i f i c a t i o n ( s t i r r i n g ， d i s s o l v i n ga g m n ，f l i t e r a t i o n ，d i 由s i se t c ) u l t i m a t e l yp u r e rc o l l a g e n f i n i s h e dp r o d u c ts h o w e d u p b u tp a r ti iw i t h t a k i n gc o l l a g e na sr a wm a t e r i a lm a i n l y ，c h l o r h y d r i c a c i dh y d r o l y z a t i o n ，s o d i u m n i t r o u sa c i do x i d i z a t i o n ，7 3 2p o s i t i v ei o n e x c h a n g er e s i ne x t r a c t i n ga n dp r e p a r a t i o nh y d r o x y lp r o l i n ee x c l u d i n g o t h e ra m i n oa c i d t h es e p a r a t i o np o i n to ft w ok i n d so fa m i n oa c i dw a s a s c e r t a i n e d f i r s t l y ，a n dh y d r o x y lp r o l i n er a n g ei sp hi n5 5 - - 7 ，p r o l i n e r a n g ei sp hi n7 8 - - 9 ；a n dt h e ni td i s c u s s e da n da n a l y z e dt h ec o n d i t i o n o fi o ne x c h a n g ec o l u m n s e p a r a t i o n ，c o n t a i n i n gc h o i c eo fa ni o n e x c h a n g ec o l u m n f o rs e p e r a t i o ne f f e c t so f7 3 2p o s i t i v ei o ne x c h a n g e r e s i ni sb e t t e r ，i tw a sc h o s e na sa s c e r t a i n t h eh y d r o l y z a t em o u n t sf 2 0 t h i c k n e s si sb e s t ) ，t h el o t i o n ( 1h o u ro fd i s t i l l e dw a t e r e l u t i o n ) a n d e , u t i o nt i m ea r ee n s u r e d w a s h i n ge l u t i o n s p e e d ，m o u n t s ，t h e r e a g e n t s e l e c t i n gw e r ec o m p a r e da n dt h e n8m l m i n ，o 1na m m o n i ah a sb e e n e n s u r e df o rw a s h o u tt h eb e s te x c h a n g i n g r e s i n ，i ti sc o n s i d e r e dt ob e i n g a b l et or e a c hb e s te f f e c tr e s u l t s f i n a l l yp a p e rs t u d i e dc o n d i t i o n o fa c i d h y d r o l y z a t i o n ( p r o p o r t i o no fc o l l a g e na n dc h l o r h y d r i ca c i d ， h y d r o l y z a t i o nt i m e ) ，a n dc a r r i e do u ti n v e s t i g a t i o na n dd i s c u s s i o n ，f i n a l l y g o ts e v e r a ld i f f e r e n th y d r o l y z a t i o ne f f e c t s ，w h i c hh y d r o l y z a t i o nt ob e c h o o s ec o n c r e t e l yi sb a s e do nd i f f e r e n tp u r p o s e sf o ra no p t i o n p r o p o r t i o no fc o l l a g e na n dc h l o r h y d r i ca c i df i n a l l yw a sa s c e r t a i n e d 1 ：3 ，h y d r o l y z a t i o nt i m e2 0h o u r sc a ng e tt h em a x i m a ld r a wr a t eo f h y d r o x y lp r o l i n e ，a n dw eg e tp u r e rh y d r o x y lp r o l i n ef i n i s h e dp r o d u c t 4 t t 上海水产大学硕士学位论文 t h ep a r ti i ii sh y d r o x y l p r o l i n ea p p l i c a t i o n ，a n di st h ei n n o v a t i o no f e n t i r et h e s i s ic h o o s et ou s ep l a n t t e s t i n gt ov e r i f yt h ee f f e c to fh y d r o x y l p r o l i n e ，a n dd i de x p e r i m e n t sf r o mt w oa s p e c t so ns e l e c t e dp l a n t s a n di n t h ee x p e r i m e n tw eh a v ef o u n dt h a ti nv e r i f y i n gw h e t h e rr o o ts e g m e n tc a n a b s o r bt h eh y d r o x y lp r o l i n e ，b ya n a l y s i n gt h ee x p e r i m e n tr e s u l t s ，w e c a nb r a v e l yc o n j e c t u r eh y d r o x y lp r o l i n eh a sc e r t a i nc o n t r i b u t i o nt o p l a n t sg r o w t h i np l a n tr e t a i n i n gf r e s h n e s s ，w eh a v ea l s ov e r i f i e dt h e h y d r o x y lp r o l i n eh a st h ec e r t a i nf l e s h k e e p i n ge f f e c tt op l a n t i n gi nv i t r o t h o u g hb e i n go n l ys i m p l e ，i th a v ea l r e a d yo p e n e du pan e ws c o p eo f o p e r a t i o no nt h ee x p e r i m e n tr e t a i n i n gf r e s h n e s s 一 w o r d s ： 。 o ff i s hp r o c e s s i n g ，c o l l a g e n ，h y d r o x y lp rolinekey w o r d sr e m a i n s o r o c e s s l n gc o l l a g e nh v d r o x , 1 1o r o l i n e ， ， ， p r o l i n e ，e x t r a c t i o n ，p r e p a r a t i o n ，i o ne x c h a n g e ，p l a n tr e t a i nf r e s h n e s s 5 上海水产大学硕士学位论文 目录 引言2 第一章水产品加工废弃物提取胶原蛋白1 3 第一节前言1 3 弟一节 日u 舌1 3 第二节材料与方法1 4 1 1 实验原料1 4 1 2 仪器1 4 1 3 实验方法1 4 第三节结果与讨论1 7 第四节鱼体加工废弃物中胶原蛋白提取纯化流程图2 0 第二章胶原蛋白制取羟脯氨酸2 l 第一节前言2 l弟一节日u 舌2 l 第二节材料与方法2 2 1 1 材料2 2 1 2 实验方法2 2 第三节结果与讨论2 7 第四节胶原蛋白分离提取羟脯氨酸和脯氨酸流程图4 l 第三章胶原蛋白水解产物羟脯氨酸应用4 3 第一节前言4 3 第二节羟脯氨酸对根茎类植物的促生长作用4 5 第三节羟脯氨酸对离体培养植物幼苗保鲜功效的验证5l 结论5 3 参考文献5 4 谢辞5 5 6 t 上海水产大学硕士学位论文 穹i吉 jl口 胶原蛋白是高等脊椎动物中含量最丰富的一种蛋白质，大约占 体内蛋白质总量的三分之一，其特点是含有大约l2 的脯氨酸和 9 的羟脯氨酸，而羟脯氨酸在其他蛋白质中也是很少发现的，羟 脯氨酸不是以现成的形式参与胶原蛋白的生物合成，而是从已经合 成的胶原蛋白的肽链中的脯氨酸经由羟化酶作用转化而来的。羟脯 氨酸被证明是确保皮肤新生的胶原合成的最佳途径，它在化妆品领 域起着很重要的作用。羟脯氨酸的主要功能是维持皮肤以及组织器 官的形态和结构，能够使皮肤保持结实而且有富含有弹性，还能够 使得细胞变得丰满，从而使皮肤更加充盈，对于保持皮肤弹性与润 泽，维持皮肤的细腻光滑，皱纹的舒展有很大的帮助，最终能够呈 现皮肤的质感与透明感，更可以有效的防止肌肤老化。l 一羟脯氨酸 ( l - h y d r o x y p r o li n e ，l - h y p ) 是一种具有独特生理活性的氨基 酸，1 9 0 2 年由f i s c h e r ( 1 ) 首先自白明胶中获得，化学式c 5 h 9 n 0 3 ，分 子量1 3 1 1 3 ，白色粉末，无毒无臭略带甜味，易溶于水l 一羟脯氨酸是 人体胶原蛋白的组成成分，也是肝和胆囊的成分，具有多种重要的生 理功能与独特的生物活性l - h y p 可用作抗氧化、防腐和保鲜剂，用作 许多药物( 如抗生素、抗肿瘤、降压药及新型胃药等) 的合成原料，用 作饮料和化妆品添加剂等动物脂肪中羟脯氨酸含量和脂肪细胞的 上海水产大学硕士学位论文 分裂能力与生长能力有关，羟脯氨酸含量越高，脂肪细胞的分裂能力 越强l - h y p 还具有增进肝细胞生长和促进糖原合成的作用。 1 ) 研究的背景和意义 随着我国渔业的快速发展，渔业的加工也越来越受到人们的重 视。一般我们仅仅利用鱼虾类可食肉的部分，在家庭的调理或者加 工方面采用肉后留下头部、骨、壳、鳍、尾、内脏、皮、鳞，或蒸 煮其汁液等，都成为了非食用部分。鱼贝类采肉后所剩下的废弃物， 大约占全部鱼贝类的三分之一至二分之一。据估计，国内每年的水 产废弃物要达到4 0 万公吨，不但数量很多，而且是分散于家庭以及 加工厂。目前比较集中的是在水产加工厂，那里的水产废弃物大约 有4 5 万公吨，对于这些废弃物的处理，大多数的工厂是采用 了掩埋丢弃的方法，这种做法不仅造成了资源的极大浪费，而且， 更严重的是将直接导致环境的严重污染。而且鱼类如果仅仅一部分 供作低度利用，例如，搅碎后喂鸭或制成低品质的鱼粉及鱼溶浆等， 其余被浪费的部分是非常可惜的。然而，鱼的废弃物中重要有价值 的物质胶原蛋白，即使在低温下，也可以溶于中性盐溶液或者酸性 溶液，这样就能够比较容易调制得到可溶性胶原溶液，这就为其充 分利用提供了宝贵的资源。 而胶原( c o l l a g e n ) 蛋白c 。，是一种重要的功能性蛋白质，它与 细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合等密切相关。 由于胶原蛋白的特殊功能，其提取物已被广泛应用于医药、食品、 t 上海水产大学硕士学位论文 日用化工、生物合成等工业领域，如医用胶囊、外科手术材料、食 用明胶、照相明胶、化妆品等。目前生产的胶原蛋白制品的原料主 要来源是从猪、牛等陆生哺乳动物的皮、骨和肌腱，因近年来随着 全球生态环境恶化导致许多疯牛病、口蹄疫等流行病的发生，使得 从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大。欧美、日本等国 家相继出台了不少法规，限制从牛等哺乳动物皮骨中提取物用于食 品医药等对人体直接影响的产品中。由此，人们便开始寻求从水产 动物中提取胶原蛋白，因而，从水生动物鱼体废弃物中提取安全、 卫生、无害的胶原蛋白已成为当前国内外业内人士研发的一个热门 课题。 胶原蛋白和明胶的生产主要是以猪、牛等的皮为原料，由于世 界各国对于明胶用量的增加，以及制革业的发展，原料的来源都是 受到限制的。而用于食品、药品、化妆品中的这些胶原蛋白和明胶， 由于近年来受到哺乳动物疫病的爆发以及人、畜共患病的增加，特 别是疯牛病、口蹄疫等疾病的流行的影响，使得其安全性受到了人 们的怀疑。因此，全世界各个国家都在积极的寻找更安全的胶原蛋 白以及羟脯氨酸和脯氨酸的来源。同时，由于渔业养殖的大规模发 展使的水产胶原蛋白替代哺乳动物胶原蛋白成为可能，特别是我国 水产养殖业空前的发展。因而，在世界水产总量下降的情况下，我 国却保持了比较快速的增长。 t 上海水产大学硕士学位论文 因为，我国是世界上最大的淡水鱼养殖国，据不完全统计，每 年废弃鱼鳞约达5 万吨，鱼鳞资源相当丰富，目前海南省已有上百 家鱼鳞收购公司，将鱼鳞晒干作为一种资源出口。国外如曰本也十 分看好中国鱼鳞资源，设想将在中国筹建生产基地并开发鱼鳞胶原 蛋白产品，将其产品返销日本及出口欧美等国。 我国正在倡导节约型社会，而节约原料更是走可持续发展的一 条长远之路。合理利用鱼类加工剩余的废弃物，再把废弃物最高能 效、最合理、最广泛地从中提取和制备是非常有必要的。因此，从 鱼类的加工废弃物中提取胶原蛋白的研究是十分有必要的。另外， 羟脯氨酸被证明是确保皮肤新生的胶原合成的最佳途径，它在化妆 品领域，医药领域，化工领域等都被广泛的应用。对于水产品加工 废弃物的有效利用，不但可以充分利用国内有限的水产资源，而且 最重要的是，可以解决环境污染问题，这一点对于本论文的研究有 着极其深远的意义。 目前，现有不管国内还是国外技术已将胶原蛋白及其水解产物 广泛用于医药工业、食品工业、日用化学品工业、生物合成及胶原 修饰等领域，鱼皮、鱼鳞胶原蛋白作为极有发展潜力与应用价值的 高附加值产品而倍受人们的关注与青睐。 在医药工业领域里，因胶原蛋白具有良好的生物学特性，它可 作为组织的支持物，对细胞、组织乃至器官行使正常功能并对外伤 修复具有重要作用。鱼鳞胶原蛋白有利于上皮细胞的增生修复，促 上海水产大学硕士学位论文 进创面愈合，可广泛用于烧伤、创伤的治疗；在食品工业领域里， 鱼明胶己广泛用作罐头、饮料、乳品加工、肉制品加工、果酒酿造 中的增稠剂、乳化剂、稳定剂、澄清剂等；在化妆品领域里，鱼鳞 胶具有很安全的滋养性、保湿性、修复性等功能，可加入化妆品乳 液中增加营养保湿功效，或用于生产化妆品填充剂的原料，也可对 化妆品进行改性，如将鱼鳞胶进行水解，再与油酰氯缩合生产阴离 子表面活性剂改性，用于生产洗发香波、润肤膏等。 另一方面，胶原蛋白水解产物羟脯氨酸和脯氨酸的用途同样非 常广泛，农业上将其用作杀虫药剂和抗旱剂；在化妆品领域可以用 作添加剂，以滋润和美容肌肤；在医药领域上，用脯氨酸合成巯甲 丙脯酸是治疗顽固性高血压以及充血性心力衰竭的新药，每年( 不包 括用来合成巯甲丙脯酸) 国内的需求为2 6 tn 一乙酰羟脯氨酸可以 用作抗风湿治疗结缔组织疾病，羟脯氨酸和脯氨酸作为氨基酸注射 液的重要组份，对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效。 目前有关文献报导羟脯氨酸和脯氨酸是合成第三代抗菌素的重要原 料。脯氨酸是白血球的组成成分，起着调节脂肪乳化作用，羟脯氨 酸是肝和胆囊的组成成分也起着调节脂肪乳化的作用。 在国内化妆品市场中，羟脯氨酸与脯氨酸可以共同作用，对消 除疤痕有积极的作用。能够有效的预防和消除因烧伤、创伤、手术 刀口所形成的疤痕；预防和消除妊娠纹；预防和消除因痤疮、粉刺 造成的皮肤凹凸不平等各种伤疤。因此它不仅仅能够预防疤痕的形 t 上海水产大学硕士学位论文 成，而且对已经形成的疤痕组织有分解的作用，因此疤痕消消除疤 作用机理明确，使用效果显著。 然而，有关羟脯氨酸在植物生长应用方面的研究报道目前尚不 多见。一些相关资料显示c a ，氨基酸肥料已大面积用于花卉或果蔬 类培养。这种肥料既能保持大量元素的缓慢释放和充分利用，也能 保证微量元素的稳效和长效。具有增强植物呼吸作用，改善植物氧 化还原过程，促进植物的新陈代谢的良好作用。它能促进光合作用 和叶绿素的形成，对氧化物活性、酶类活性、种子发芽、营养物质 吸收，根系生长发育等生理生化过程均有明显的促进和激活作用。 尤其是它与植物的亲合性是其它任何一种物质所无法比的。因此， 在农业上具有增产提质，改土增收、综合调节、保花保果、膨大着 色、增强抗逆性、降低有害物质等多种功效。因此研究氨基酸在植 物生长方面的功效是具有深远的意义的。 另一方面，羟脯氨酸对离体培养的植株幼苗，茎尖和愈伤组织 也有可证实的生理效应( 5 ) 。植物细胞壁中最早被发现的蛋白质是伸展 蛋白，它是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白( h r g p ) ，大约由3 0 0 个氨基 酸残基组成，这种蛋白质最早是被l a m p o r t ( 1 1 ) 首先发现并命名的。 这类蛋白质中羟脯氨酸一般为蛋白质的3 0 - 4 0 。伸展蛋白是植物 ( 尤其是双子叶植物) 初生壁中广泛存在的结构成分，同时它还参 与植物营养生长，抗病性，抗不良环境等生理活动。而且，正如大 家所了解的，稀土元素对作物的营养生长有着明显的影响，已有研 上海水产大学硕士学位论文 究表明，稀土在植物体内主要积聚在细胞壁上，羟脯氨酸又是植物 细胞壁结构蛋白中大量存在的一种氨基酸，在离体或活体的条件下， 从细胞，亚细胞乃至分子水平上的研究成果启示人们，稀土可同蛋 白质，氨基酸等复杂生物大分子相互作用，其表现出的生物效应可 能影响细胞的生理，生化过程。 2 ) 国内外现状和发展趋势 据资料显示，日本是目前世界上鱼体胶原蛋白研究最多，技 术最先进的国家。长期以来，日本十分重视水产废弃物资源的有效 利用与合理开发，其研究鱼体胶原蛋白也有十几年历史了。如日本 酵研株式会社和日本y 于，守彳卜株式会社已成功研制出从废弃物鱼 磷鱼皮中提取的用于食品、化妆品和饮料作为添加剂的纯天然胶原 蛋白粉，该胶原蛋白粉中至少含有1 8 种氨基酸，含氮量高，蛋白质 含量在9 0 以上，含水量和灰分量低，重金属含量 c h 。c h c 0 0 h 。 n + 整个实验的关键步骤吸附和洗脱，都在阳离子交换树脂上进行。而我 们初步了解了阳离子交换树脂的基本运作原理，这也是整个实验的重点，这样 为设定出收集羟脯氨酸和脯氨酸的p h 值做了理论准备。 1 2 1 3 阳离子交换树脂的确定 将处理过的7 3 2 幂 1 d 6 1 两种阳离子交换树脂分别用0 1 m o l 1 盐酸浸泡卜2 个小时， 然后混合一并加入大小规格完全相同的离子交换柱内，并保持树脂的装柱长度 一致，平衡一小时。然后将a 溶液* h b 溶液分别上柱7 3 2 幂h d 61 ，两个交换柱的进 样速度保持一致；同样，保持相同的淋洗条件，洗脱收集条件。结果分析和洗 脱曲线图见3 2 。 2 r 上海水产大学硕士学位论文 1 2 1 4 淋洗剂种类( 蒸馏水5 f 1 3 n a o h ) 及不同淋洗液浓度的研究及确定。 为了提高分离效率又不影响分离实验结果，用先前确定的较好的阳离子交换树 脂同样分离羟脯氨酸和脯氨酸体积比为l ：1 的a 和b 溶液，保持相同的淋洗速度和 相同的洗脱液、洗脱速度等，而仅仅选用不同淋洗剂和同一淋洗剂的不同浓度 淋洗交换柱以比较淋洗效果，并用硝酸银溶液检测是否己完全洗去c l 离子止。 其中选用的不同淋洗液包括：蒸馏水，氢氧化钠。其中氢氧化钠选择两个浓度： 0 2 5 m o i i 和0 5 m o l l 。而每种淋洗剂都选择尝试两个淋洗平衡时间：0 5 小时 和1 小时。因此通过正交试验，选择一个最优淋洗液和最佳淋洗时间以得到最好 的淋洗效果。结果分析和洗脱曲线图见3 3 。 1 2 1 5 洗脱液的比较及确定 根据离子交换原理，洗脱液应选择碱性溶液，而使用什么碱性溶液，是否用缓 冲碱性溶液和用多大浓度的碱性液洗脱离子交换柱是这部分需要讨论的内容。 我选用了两种具有代表性的洗脱液，一种是强碱性溶液：n a o h 溶液；一种是缓 冲碱性溶液：氨水。而洗脱液浓度我们选择了三个浓度：0 0 5 m o l l ，0 i m o l l , n 0 2 m o l l 。 结果分析与洗脱曲线图见后面3 5 。 1 2 3 6 洗脱液确定之后，在其他条件相同的情况下，浓度为0 i m o l l 的 洗脱液最佳流速的确定 不同洗脱液流速对于两种氨基酸的分离效果可能有不同，选择一个最适当的流 速对于后面提高两种氨基酸的提取率有很大的帮助，因此选择三种洗脱液流速 进行分析，从而找到最大分离两种氨基酸的洗脱液流速作为后面大量分离两种 氨基酸的方法。实验选择洗脱液的流速包括：6 m l m i n ，8 m l m i n ，l o m l m i n 。 结果分析见后面讨论3 4 。 2 9 上海水产大学硕士学位论文 1 2 2 胶原蛋白水解条件的探索及摸定 1 2 2 1 水解 取胶原蛋白l g 置于三口烧瓶中，加入6m o l l 或的浓h c i 溶液( 体积比 l ：3 或1 ：4 ，) 充分搅拌后，置于可调控的恒温电炉中，进行加热，温度控制在 1 1 0 。c 1 1 3 。c 进行水解1 2 或2 0 小时。结果分析见后面3 7 。接着将水解进行 除酸脱色：将水解液进行真空浓缩除酸，温度为6 5 7 0 。c ，使之成为稠浆状，再 加水稀释至p h i 5 以上，加入活性碳进行脱色，活性炭的用量为胶原蛋白用量 的2 0 ，在9 0 。c 反应l h 小时，直至脱色滤液呈淡黄色透明液体。分析说明见 结果与讨论中的3 6 。 1 2 2 2 水解液上柱的前处理 亚硝酸处理： 把5 0 的n a n 0 二溶液( n a n 0 。的用量为胶原蛋白用量的1 2 倍) ，恒温4 5 0 c 在3 小时内滴加入脱色滤液中，完成后立即升温至7 0 。c ，反应1 4 , 时。加入等体积的 浓h c l ( 6 m o l 1 ) ，在7 0 0 c 时蒸馏浓缩至体积不足原来的五分之一，用滤纸过滤， 滤渣( 主要是n a c l ) 用9 5 的乙醇洗涤，重复三次，洗涤液加入滤液中。 氨基酸中l 一羟脯氨酸和l 一脯氨酸为亚氨基氨基酸是不能被亚硝酸 脱氨的，而是会形成亚硝基化合物。形成的l 一羟脯氨酸和l 一脯氨酸的 亚硝基化合物与浓h c l 共热时，又可分解成l 一羟脯氨酸和l 一脯氨酸， 其反应工程如下： h n o 。 一 c h 2 l c h c 0 0 r h r c h c 比 + h n o n a 一ll+ h 2 0 h c h ：c h c o o n a r c h c h ： i c h 2c h c o o n a h c l + h 。o 加热 3 0 n n o r c h c h 2 + n a c l + c h 。c h c 0 0 h 吼i咀 一 r 上海水产大学硕士学位论文 、n n o n h 式中r = h 为脯氨酸，r = o h 时为羟脯氨酸。其余q 一氨基酸都被破 坏了，与亚硝酸发生反应，生成有机酸和氨气及水。亚硝酸在酸性条件下极易 分解，生成二氧化氮、一氧化氮和水。 所以我们利用亚氨基氨基酸这一特性，可以确保我们在加入亚硝酸钠后充 分反应，再加入浓盐酸得到的只可能是l 一羟脯氨酸和l 一脯氨酸，而没有 混杂其他氨基酸。使之后的实验所收集到的液体中只有我们所需要收集的l 一 羟脯氨酸和l 一脯氨酸。 脱酸稀释： 将水解液真空浓缩除酸，温度为7 0 。c ，使之成稠浆状，加水稀释至p h i 5 以 上，稀释5 倍，待用。原因说明见3 6 。 1 2 3 羟脯氨酸和脯氨酸分别结晶 按照先前所有优化条件经过稀释液上柱、淋洗、洗脱，并根据两种氨基酸 各自的洗脱流出液的p h 范围分别收集得到羟脯氨酸和脯氨酸各自的纯组分溶 液，然后结晶。 羟脯氨酸结晶： 把羟脯氨酸收集液在真空下浓缩至干，加入一定量的无离子水溶解，如果 有颜色的话应该加入少量的活性碳( 2 0g l ) ，脱至无色，然后再浓缩至干， 加入冷的无水乙醇洗至无色，再浓缩近干，用冷的无水乙醇洗涤数次后，过滤， 沉淀物加入2 3 倍重量的冷的无水乙醇，搅拌均匀，过夜结晶抽滤，结晶物放 在6 0 - 7 0 条件烘干。 脯氨酸结晶： 把脯氨酸收集液在真空下浓缩至干，加入一定量的无离子水溶解，如有颜色 应加少量活性碳2 0 9 l 脱至无色，然后浓缩至干称量，每克加4 m l 热的无水乙 醇，用水浴加热溶解，趁热快速过滤，滤出液冷却至室温，置于冰箱过夜结晶， 结晶好后过滤，结晶用少量冷无水乙醇洗两次，抽滤至干，在6 0 一7 0 烘箱中烘 干，母液和洗涤液合并，浓缩同上操作。 上海水产大学硕士学位论文 第三节结果与讨论 3 1 羟脯氨酸和脯氨酸分离点的确定 当混合液( 羟：脯= l ：1 ) 以8 m l m i n 的速度上阳离子交换树脂时， 吸附 至流出液显茚三酮阳性，然后用无离子水洗柱至流出液与硝酸银无沉淀析出， 并于茚三酮显阴性，此时的p h 为5 。接着先用0 i m o l l 氨水以8 m l m i n 的流速洗 脱交换柱，至茚三酮显黄色，与吲哚醌显绿色，此时p h 值5 5 ，即羟脯氨酸被洗 脱下来的p h 初始点；然后开始分管收集，3 m l 一管，然后再在每管内加入2m l 的茚三酮。当流出液与茚三酮显橘红色，并仍然与吲哚醌显绿色时，此时的p h 值为7 ，此为开始出现羟脯氨酸和脯氨酸的混合部分，直到流出液与吲哚醌显蓝 色时，羟脯氨酸已经完全洗脱下来，而此时p h 为7 8 ，氨基酸为纯的脯氨酸部分， 当流出液显茚三酮阴性时，即脯氨酸已经完全被洗脱下来了，此时的p h 值为9 ， 即洗脱结束。 3 2 不同离子交换树脂洗脱混合液效果比较 表2 - i 不同树脂的离子交换效果的比较 t a b l e2 - ie l f e c to fd i f f e r e n tr o s i n 不同树脂对洗脱效果的影响，用所耗洗脱液体积计 考虑到不同的树脂对氨基酸分离的效果不一样，然而树脂的选择对于本次 试验的成败起到了至关重要的作用，因此我们在实验方法制定的初期，首先对 树脂的确定进行研究探索。我们查阅资料，发现就阳离子而言主要是以7 3 2 型 交换树脂和d 6 1 型交换树脂用于氨基酸的分离。我们的试验结果如图2 1 ，图 2 2 显示：7 3 2 型阳离子交换树脂与d 6 1 型阳离子交换树脂相比，其出现羟脯氨 酸峰的时间比d 6 1 型阳离子交换树脂要早，同时两种氨基酸的分离情况也明显 比d 6 1 型阳离子交换树脂要好，其中羟脯氨酸和脯氨酸各自被洗脱下来的范围比 3 2 上海水产大学硕士学位论文 较集中，这对后面两种氨基酸的分别收集提供了便利。另外，从经济价格来说， 7 3 2 型离子交换树脂的价格差不多只是d 6 1 型离子交换树脂的一半，综合上述实 验结果，我们确定使用7 3 2 型阳离子交换树脂分离羟脯氨酸和脯氨酸，既能够 提高效率，又可以节约成本，对于实验也更加有效。 图2 - 17 3 2 型离子交换树脂分离混合液曲线图 g r a p h2 17 3 2i o n - - e x c h a n g er e s i ne f f e c t 上海水产大学硕士学位论文 图2 - 2d 6 1 型离子交换树脂洗脱混合液曲线 g r a p h2 - 2d 6 1i o n - - e x c h a n g er e s i ne f f e c ts h o w 3 3 不同淋洗液和淋洗时间的探讨 表2 - 2 不同淋洗液的效果比较 t a b l e2 - 2d i f f e r e n tw a s h o u ts o l u t i o ne f f e c tc o m p a r i s o n 0 5 小时用硝酸银检查有白色沉淀用硝酸银检查有白色沉淀有沉淀且p h 远大于5 l 小时无沉淀且p h 约为5有沉淀且p h 大于5 有沉淀且p h 远远大于5 通过实验发现：用碱性溶液氢氧化钠来代替去离子水淋洗交换柱时，其中 0 2 5 nn a o h 时间太短如0 5 小时，用硝酸银检查仍然有白色沉淀产生，也就是 说流出液中还有盐酸，沉淀是a g c i ；而0 2 5 nn a o h 平衡1 小时，仍然有沉淀产 生，且留出液p h 大于5 ，已有部分羟脯氨酸被洗脱下来，因此可能会造成羟脯 氨酸的损失，而这时的沉淀可能是a 9 0 h 或a g o h 和a g e l 的混合物；同理，0 5 n n a o h 由于浓度太大，碱性太强，使得即使半小时的平衡时间已经损失很大部分 3 4 上海水产大学硕士学位论文 羟脯氨酸，仍然无法达到理想的效果，而如果仅仅靠减少平衡时间，由于氢氧 化钠是强碱液，容易使得交换柱内p h 改变太快，很难控制平衡点，因此仍然不 被选用；然而，使用蒸馏水却可以满足要求，在平衡l 小时这一点时，用硝酸 银检查无沉淀产生，并且p h 约为5 ，既是接近羟脯氨酸的洗脱初始点。 淋洗剂的选择及浓度的确定是离子交换法的关键之一。一般文献报道( 1 2 ) 的淋洗剂还有氨水及氨水与氯化铵的混合物，我们选择蒸馏水作为淋洗剂的最 大优点是分离结束后流出的液体可用于下次配淋洗液用，而用氨水则必须放掉， 造成环境污染。 3 4 不同洗脱流速的讨论 在洗脱液和浓度不变的情况下( 均选用0 1 n 氨水) ，改变洗脱速度讨论洗脱混 合液情况，从而选择一个最佳流速作为后面分离两种氨基酸的条件之一。如果 洗脱流速太快，离子交换柱内p h 值改变太快，两种氨基酸会被一并洗脱下来， 达不到很好的分离效果；如果流速太慢，离子交换柱内p h 值改变太慢，也许会 让两种氨基酸分离得很开，可是正是因为柱内p h 值改变太慢，导致氨基酸被洗 脱下来所需要的洗脱液量很大，这样就提高了工艺的成本。因此，我选择了三 种适中的洗脱液流速进行研究，通过洗脱曲线图的结果发现： 不同洗脱流速1 0 m l m i n ，6 m l m i n 与8 m l m i n 相比，虽然6 m l m i n 的洗脱液流 速也可以分离两种氨基酸，但通过洗脱曲线图2 3 得知6 m l m i n 和8 m l m i n 的 分离情况没有很明显的差异，而流速1 0 m l m i n 使柱内p h 值改变太快，分离效 果远远不如8 m l m i n ，所以联合考虑羟脯氨酸和脯氨酸分离效率的话，最终选择 8 m l m i n 适宜。 a b c 图2 - 36 m l m i n ，8 m l m i n 。 g r a p h2 - 36 m l m i n ，8 m l m i n ， 3 6 1 0m l m i n 氨水洗脱混合液曲线 1 0m l m i na m m o n i aw a s h o u te f f e c t 上海水产大学硕士学位论文 3 5 不同洗脱液洗脱混合液效果比较 3 5 1 不同浓度氨水洗脱混合液效果比较 表2 - 3 比较不同浓度氨水洗脱混合液结果 t a b l e2 - 3c o m p a r i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o na m m o n i aw a s h o u te f f e c t 0 1 o 2 0 0 5 8 0 0 1 9 8 1 5