（应用化学专业论文）谷胱甘肽二茂铁的合成及其与金属硫蛋白的相互作用.pdf

艺i i 工 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名：芝障 日期：丝年d 盟日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中困科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 日期：址年月卫日 硕十学位论文摘要 摘要 电化学方法具有快速灵敏、操作简单等优点，应用于研究多肽与 蛋白质相互作用，能获取某些相互作用机理的相关信息。但是由于大 多数多肽或蛋白质不具有电化学活性，从而阻碍了这一方法的应用。 本论文的主要工作有： 以二茂铁甲酸为起始原料，采用液相合成法得到具有电活性的还 原型嵛胱甘肽二茂铁( 化合物7 ，f c g s h ，f c ：f e r r o c e n e ，二茂铁) ， 总收率为1 2 5 和氧化型谷胱甘肽二茂铁( 化合物l o ，f c g s s g f c ) ， 总收率为4 6 o 。并用红外光谱( i r ) 、紫外可见吸收光谱( u v - v i s ) 、 核磁共振氢谱( 1 h n m r ) 和质谱( m s ) 对产物进行了表征。 采用电化学方法研究了f c g s h 与金属硫蛋白( z n 7 一m t ) 的相互 作用。实验结果表明f c g s h 在z n 7 m t 修饰金电极上有一对很好的 氧化还原峰，e p a = 0 2 1 8v ，廓。= o 1 5 4v ，码= 6 4m v ，伽1 0 3 。 而f c g s h 在裸金电极上的氧化还原电位分别为尾口k o 2 0 5v 和 易c ，_ o 1 4 7v 么易- 5 8m y , f p 口 i p c ，- 1 0 2 。说明z n 7 m t 与f c g s h 之间 具有特殊相互作用，且电极过程均为可逆反应过程，并测得z n 7 m t 与f c g s h 的结合比和结合常数分别为1 7 84 - 0 1 5 和5 5 4 + 0 4 3 x1 0 8 。 同时研究表明单独的f c g s h 不能从z n 7 m t 中释放出z n 2 + 。 采用电化学方法研究了f c g s s g f c 的电化学性质及其与 z n 7 一m t 的相互作用。实验结果表明f c g s s g f c 在z n 7 一m t 修饰金电 极上有一对很好的氧化还原峰，2 = o 4 2 8v ，= o 3 5 1v ，世力= 7 7 m v ，f 砌w 2 = 1 1 3 电极过程为准可逆反应过程。而f c g s s g f c 在裸 金电极上的氧化还原电位分别为岛口尸o 4 2 5v 和k ，_ o 3 5 3v 码，= 7 2m v , 锄，力k ，= o 9 6 ；同时研究表明f c g s s g f c 能促使z n 2 + 从 z n 7 一m t 中释放出来，证明了f c g s s g f c 与z n 7 m t 之间存在相互作 用。通过研究f c g s s g f c 与z n 7 m t 和脱金属硫蛋l 兰l ( a p o m t ) 的溶 液电化学行为，讨论了f c g s s g f c 与z n 7 m t 发生z n s 一s s 键交换 可能生成两分子的f c g s h 。此外还研究了f c g s s g f c 与z n 2 + 的配 位作用，结果表明z n 2 + 与f c g s s g f c 能形成l ：1 的配合物，与文献 报道的未标记g s s g 与z n 2 + 的配位数一致。 关键词二茂铁，谷胱甘肽，金属硫蛋白，电化学 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np e p t i d ea n dp r o t e i nw a si n v e s t i g a t e db y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d h o w e v e r , m o s to fp e p t i d e so rp r o t e i n sa r e e l e c t r o i n a c t i v e s oi ti sd i f f e r e n tt oa p p l ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o dt o s t u d yt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e np e p t i d e sa n dp r o t e i n s i n t h i ss t u d y , a n e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o dw a se m p l o y e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h e i n t e r a t i o nb e t w e e nr e d o x i n a c t i v eg l u t a t h i o n ea n dm e t a l l o t h i o n e i n t h e m a i nw o r k so ft h et h e s i sa r ea sf o l l o w s ： r e d u c e dg l u t a t h i o n y lf e r r o c e n e ( f c - g s h ，f c ：f e r r o c e n o y l ) a n d o x i d i z e dg l u t a t h i o n y lf e r r o c e n e ( f c g s s g f c ) w e r es y n t h e s i z e df r o m f e r r o c e n em o n o c a r b o x y l i ca c i d ，r e d u c e dg l u t a t h i o n e ( g s h ) ，a n do x i d i z e d g l u t a t h i o n e ( g s s g ) b yl i q u i d p h a s es y n t h e s i sm e t h o dw i t ht h ey i e l d so f 12 5 a n d4 6 o ，r e s p e c t i v e l y t h e s ec o m p o u n d sw e r ec h a r a c t e r i z e db y i rs p e c t r u m ，u v - v i ss p e c t r u m ，h n m ra n dm a s ss p e c t r u m t h ei n t e r a t i o nb e t w e e nf c g s ha n dz n 7 - m tw a ss t u d i e db y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d ap a i ro fw e l l d e f i n e dv o l t a m m e t r i cp e a k s ，w i t h t h ea n o d i cp e a kp o t e n t i a l ( = o 2 18v ) a n dc a t h o d i cp e a kp o t e n t i a l ( 鼯o 15 4v ) w e r eo b s e r v e df o rf c g s ha tz n 7 - m tm o d i f i e de l e c t r o d e ( 钙= 7 7m v ，易以，1 13 ) h o w e v e r , t h ea n o d i c a n dc a t h o d i cp e a k p o t e n t i a l sw e r e0 2 0 5va n d0 14 7vr e s p e c t i v e l y , w e r eo b s e r v e df o r f c g s ha tb a r eg o l de l e c t r o d e ( 每 - - 5 8m v ，k - 1 0 2 ) i ti n d i c a t e s t h a tf c g s hu n d e r g o e sar e v e r s i b l ee l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o na n da s p e c i f i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nf c g s ha n dz n 7 - m t , t h eb i n d i n gc o n s t a n t a n dt h eb i n d i n gr a t i ow e r e5 5 4 士0 4 3 x1 0 0a n d1 7 8 士0 15 ，r e s p e c t i v e l y t h ei n t e r a t i o nb e t w e e nf c g s s g f ca n dz n 7 - m tw a ss t u d i e db y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o sa sw e l l ap a i ro fw e l l d e f i n e dv o l t a m m e t r i c p e a k s ，w i t ht h ea n o d i cp e a kp o t e n t i a l ( 1 = 0 4 2 8v ) a n dc a t h o d i cp e a k p o t e n t i a l ( e k 广o 3 5 1v ) w e r ea p p e a r e df o rf c g s ha tz n 7 - m tm o d i f i e d e l e c t r o d em p l = 6 4m v ，i p n | i p c = 1 0 3 ) t t h ea n o d i ca n dc a t h o d i cp e a k p o t e n t i a l sw e r e0 4 2 5v a n d0 3 5 3vr e s p e c t i v e l y , w e r eo b s e r v e df o r f c g s ha tb a r eg o l de l e c t r o d e0 缸p 2 = 7 2m v ，i 吣2 i p c f 0 9 6 ) i ti n d i c a t e s t h a tf c g s s g f cu n d e r g o e saq u a s i r e v e r s i b l ee l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n a n da s p e c i a l i n t e r a c t i o nb e t w e e nf c g s s g f ca n dz n 7 一m t a n d 硕士学位论文 a b s t r a c r f c g s s g f cc a nr e l e a s ez i n cf r o mz n 7 一m t i ta l s od e m o n s t r a t e st h a t t h e r ei s a ni n t e r a c t i o nb e t w e e nf c - g s s g - f ca n dz n 7 一m t - t h e i n t e r a c t i o n so ff c g s s g - - f cw i t hz n 7 - m ta n da p o - m tw e r ei n v e s t i g a t e d t o o i n a d d i t i o n ，z n 2 + f o r m sa1 ：1c o m p l e xw i t hf c g s s g f c ，t h i sr e s u l ti s i ng o o da g r e e m e n tw i t hl i t e r a t u r e k e yw o r d sf e r r o c e n e ，g l u t a t h i o n e ，m e t a l l o t h i o n e i n ，e l e c t r o c h e m i s t r y 1 1 1 硕士学位论文 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章文献综述一1 1 1 二茂铁及其衍生物简介1 1 1 1 二茂铁的结构及性质l 1 1 2 二茂铁衍生物的生物( 理) 活性2 1 1 3 二茂铁及其衍生物的电化学研究一3 1 2 谷胱甘肽一4 1 2 1 谷胱甘肽的结构4 1 2 2 谷胱甘肽的生理医学功能5 1 3 金属硫蛋白7 1 3 1 金属硫蛋白的结构7 1 3 2 金属硫蛋白的功能。8 1 3 3 谷胱甘肽与金属硫蛋白的相互作用研究进展l o 1 4 电化学研究分子之间的相互作用l o 1 5 本论文的选题思路1 2 第二章f c g s h 的合成及其与m t 的相互作用1 3 2 1 引。言。1 3 2 2 主要试剂及仪器设备1 3 2 3 实验部分1 4 2 3 1 薄层色谱法检测反应进程1 4 2 3 2 柱色谱法分离提纯产物1 5 2 3 3f c g s h 的合成1 5 2 3 4 化合物的表征方法一1 7 2 3 5 金电极预处理17 2 3 6m t 修饰金电极的制备一17 2 3 7 电化学实验1 7 2 4 结果与讨论1 8 2 4 2 化合物f c g s h 的表征一18 2 4 3 化合物f c g s h 的电化学性能研究2 0 2 4 4 表面电化学检测f c - g s h 与z n 7 m t 相互作用的原理2 2 2 4 5 表面电化学检测f c g s h 与z n 7 m t 相互作用2 2 硕士学位论文 目录 2 4 6 溶液电化学测定f c g s h 与z n 7 一m t 的结合常数2 4 2 5 小结。2 7 第三章f c g s s g f c 的合成及其与m t 的相互作用2 8 3 1 引言一2 8 3 2 主要试剂及仪器设备2 8 3 3 实验部分2 8 3 3 1f c 。g s s g f c 的合成2 9 3 3 2a p o m t 溶液的制备3 0 3 4 结果与讨论3l 3 4 1 合成方法优化3l 3 4 2 化合物f c g s s g f c 的表征31 3 4 3 化合物f c g s s g f c 的电化学性能研究3 3 3 4 4 表面电化学检测f c g s s g f c 与z n 7 m t 相互作用。3 5 3 4 5f c g s s g f c 与z n 7 m t 在溶液中的电化学行为3 7 3 4 6f c g s s g f c 与z n 2 + 的配位作用3 9 第四章总结4 1 参考文献4 2 致谢5 l 攻读硕士学位期间主要的研究成果5 2 第一章文献综述 1 1 二茂铁及其衍生物简介 1 1 1 二茂铁的结构及性质 二茂铁( f e r r o c e n e ，简写为f c ) ，或称环戊二烯基铁，基于它稀奇的化学和电 子性能，自从1 9 5 1 年被k e a l y 等【1 1 发现以来，人们对它的研究是如火如荼，并 由此丌创了金属有机化学这一科学领域。二茂铁是一种具有兀键型夹心结构 ( s a n d w i c h ) 的反磁性会属有机配合物【羽。两个平行的环戊二烯负离子，中间镶嵌 着一个f e 2 + ，f e 2 + 对称的夹在两个茂环平面之间，其结构如图1 1 所示。茂坏上 所有的碳原子都与铁原子成键，且碳碳键( c c0 1 4 0 3n m ) 和碳铁键( c f e0 2 0 4 5 n m ) 的键长均分别相等【3 】。二茂铁是具有高度的稳定性和芳香性的富电子体系， 在二茂铁的结构中，两个环戊二烯负离子提供2 x 6 = 1 2 个电子，中心离子f e 2 + 的 d 轨道提供6 个电子【，它的结构符合1 8 e 规则。 f e 图1 - 1 二茂铁的结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo ff e r r o c e n e 二茂铁，分子式为f e ( c 5 h 5 ) 2 ，是一种橙色棱柱状晶体，具有类似樟脑的气 味，熔点为1 7 3o c ，沸点为2 4 9 0 c ，1 0 0 0 c 以上易于升华，不溶于水，可溶于大 多数有机溶剂，如乙醇、乙醚、二氯甲烷、苯等。二茂铁是对空气稳定的固体， 4 0 0 0 c 以下不分解。它在碱性介质中极稳定，但在酸性介质中易被氧化为蓝色顺 磁性的二茂铁筠离子( f c + 1 。f c + 溶于水，还可以被还原为f c ，此反应为可逆反应。 二茂铁新奇的央心结构，使其呈现出特殊的化学性质，不适于催化加氢，也不作 为双烯体发生d i e l s a l d e r 反应，但它可发生傅一克酰基化及烷基化反应，与苯环 相似，具有突出的芳香性。例如：l ，l 二甲基二茂铁与乙酸酐和三氯化铝在二氯 甲烷中发生傅一克酰基化反应生成两种异构体产物：2 乙酰基一1 ，l 二甲基二茂铁 和3 乙酰基一1 ，1 ，一二甲基二茂铁【4 1 。二茂铁与o c 芳醇发生烷基化反应，得到一系列 烷基化产物，如与三苯基甲醇或三苯基氯甲烷在三氯化铝存在下生成三苯甲基二 茂铁和l ，1 二三苯甲基二茂铁【5 1 。此外，二茂铁还能发生锂化反应，如用丁基锂 可以很快夺取二茂铁中的质子，产物为1 ，l 一二锂代二茂铁，是很强的亲核试剂。 它与二乙基二硫代氨基甲酸硒反应，生成的产物具有位阻，两个环戊二烯基配体 靠硒原子连接【6 l 。该产物可通过加热开环聚合反应( r o p ) 生成聚硒化二茂铁 硕十学位论文第一章文献综述 【p o l y ( f e r r o c e n y ls e l e n i d e ) ，硅和磷的类似反应也可合成相应的聚合物：聚硅化二 茂铁【p 0 1 y ( 硒t o c e n y l s i l a n e ) 和聚磷化二茂铁【p o l y ( f e n - o c e n y l p h o s p h i n e ) 】7 8 1 。正是 由于二茂铁能够发生各种不同类型的取代反应，数千种二茂铁衍生物不断地被合 成出来了，同时二茂铁及其衍生物的应用范围也大大延伸了。 1 1 2 二茂铁衍生物的生物( 理) 活性 由于二茂铁具有独特的电子结构，能够发生单电子转移。当失去电子时，使 其从中性、反磁性的f c 转变成正电性、顺磁性的f c + ，相反又可得到电子变回 f c 。该氧化还原可逆性，使得二茂铁及其衍生物在生物酶的作用下，能够参与各 种代谢作用，如图l 一2 所示【9 1 。在辣根过氧化物酶的作用下，h 2 0 2 将f c 氧化成 f c + ( 途径a ) ，生成的f c + 可以与蛋白质中的供体基团( 比如色氨酸) 反应形成电荷转 移配合物。而f c + 还原成f c 可以归纳为以下四种方式：( 1 ) 通过p h 控制光解所产 生的超氧阴离子自由基( 0 2 - ) 在转变成氧分子( 0 2 ) 的过程中被还原( 途径b ) ；( 2 ) 通过f c + 氧化金属蛋白( 如菠菜质体蓝素或者细胞色素c ) 从而转变为f c ( 途径c ) ； ( 3 ) 通过f c + 将还原态辅酶( n a d h ) 氧化成氧化态辅酶( n a d + ) ，自身转变为f c ( 途 径d ) ；( 4 ) 通过f c + 与还原型谷胱甘肽( g s h ) 作用产生羟自由基( o h ) 而被还原为 f c ( 途径e ) 。 ( a ) ( d ) ( c ) 一暑 一0 2 ( e ) 、q 蔓坚：蔓2 9 图1 2f c f c + 参与的生物相互作用 f i g 1 - 2b i o l o g i c a li n t e r a c t i o n si n v o l v i n gt h ef e r r o c e n e - - f e r r i c e n i u ms y s t e m 基于以上二茂铁及其衍生物在生物系统中特殊的生物( 理) 活性，越来越多的 研究向生物医学、药学等领域发展。p i n t o 等【l0 1 通过测定二茂铁衍生物在血脑屏 障模型中的渗透系数以及辛醇水中的分配系数，研究了二茂铁的亲脂性和克服 血脑屏障的特性，从而为设计治疗脑部疾病( 如老年痴呆症、帕金森病) 的药物提 供理论依据。另外由于二茂铁的亲脂性使其能顺利通过细胞膜，且稳定性好、毒 性较低，与细胞内的各种酶、d n a 、r n a 等物质起作用，因此二茂铁及其衍生 物可以作为某些疾病的药物，如抗肿瘤、杀菌、杀虫、治贫血、抗炎、调节植物 生长、抗溃疡、酶抑制剂等】。例如，在抗肿瘤方面，n e u s e i 眨1 和c a l d w e l l t l 3 】报 2 甲占窜占 硕士学位论文 第一章文献综述 道了一系列水溶性的聚天冬酰胺二茂铁共轭物的合成及其对l n c a p 人类转移性 前列腺癌细胞的抗增殖活性的研究。随后j o h n s o n 等【1 4 】也合成了类似的聚合二茂 铁共轭物，研究了其抗人结肠癌细胞的细胞毒素活性。 1 1 3 二茂铁及其衍生物的电化学研究 近年来，随着电化学技术的发展，以及对二茂铁及其衍生物的合成与研究的 不断深入，二茂铁及其衍生物的基本电化学行为、分子间的电子传递、电催化、 分子识别等方面的应用研究获得了较大的进展。 ( 1 ) 基本电化学行为二茂铁具有独特的电子结构，f c f c + 之间的单电子氧 化还原反应被选作电化学动力学研究的模型。s h a r p 等【l5 】采用电位阶跃计时库伦 法测定二茂铁在铂电极和玻碳电极上的电荷转移动力学，结果表明二茂铁的标准 速率常数与电极材料以及电解质无关，并通过考虑双电层结构的影响，实验测得 的电子转移活化能g ( e x p ) = 0 3 0 - a ：0 0 1 ( e v 分子) ，与利用波恩方程计算得到的理 i u 直a g 4 ( t h e o r ) = 0 2 6 ( e w 分子) 将近一致。另外有报道在乙氰和二氯甲烷中，不同 温度下二茂铁在超微铂电极上有很好的电化学可逆响应以及快速的电子传递过 程，其电子转移速率常数大于6c r l l s 一，因此二茂铁被认为作为有机溶剂电化学 内标【1 6 】。由于二茂铁比较理想的电化学可逆性，二茂铁的氧化作为参比电极电 位校准的方式而被广泛应用于高阻抗有机溶剂中的循环伏安研究【1 7 ot s i e r k e z o s 等【1 8 】采用循环伏安法研究了二茂铁于乙氰( a c n ) 、丙酮( a c e ) 、n 一甲基甲酰胺 ( n m f ) 、n ，n 二甲基甲酰胺( d m f ) 、n ，n 一二甲基乙酰胺( d m a ) 、3 一戊酮( p e n ) 、 二甲基亚砜( d m s o ) 、二氯甲烷中( d c m ) 在2 4 8 1 5 ，2 7 3 1 5 和2 9 8 1 5k 下的电化 学性质。结果表明在二氯甲烷中不同温度下电子传递的可逆性有所偏差。而在其 它溶剂中均是单电子可逆过程，且没有副反应。随着温度的升高，二茂铁在各溶 剂中的半波电位均逐渐诈移。但在温度不变的情况下，二茂铁的半波电位取决于 溶剂介质。在电子给体溶剂中( 如d m s o ) ，半波电位负移；在电子受体溶剂中( 如 d c m ) ，半波电位正移。最近l e w a n d o w s k i 等【l9 】研究了二茂铁在一系列室温离子 液体中的电化学行为，均是准可逆过程。二茂铁在不同非质子性离子液体中的标 准电势为0 5 2 7 + 0 0 1 8v ( v s a g a g + 2 2 2 ，乙氰) ，此值相对变化非常小，且扩散系 数在1 0 一c m 2 s j 数量级范围内变化。因此作者认为f c f c + 可以作为离子液体中的 氧化还原对参比。由于取代基对二茂铁及其衍生物的电化学性质有影响，有人 对二茂铁及其衍生物的取代基效应与电化学性质进行了研究。z a n e l l o 等【2 0 】研究 了一系列不同电子特性取代基的二茂铁衍生物的电化学行为。结果表明，取代基 给电子能力越强，相应的f c + 存在时间越长。b a s q u e 等【2 i 】研究二茂铁s c h i f f 碱和 金属配合物中取代基对二茂铁电化学行为的影响，揭示了f e 2 + 被氧化的难易程度 取决于取代基的性质。 3 硕十学位论文 第一章文献综述 ( 2 ) 电化学标记近年来，用二茂铁标记氨基酸、多肽、核酸等作为生物探 针田j ，成为生物电化学的研究热点。基因工程同益受到重视，核酸的结构分析 和测试是基因工程中首要解决的问题之一。l u o 2 3 】等用二茂铁标记肽核酸在溶液 中电化学检测互补d n a ，通过二茂铁的电信号变化来判断匹配与错配的d n a 。 此方法并不需要将探针固定在电极表面，而且操作时间短，有望成为d n a 特定 序列检测及定量的有力工具。对于某些疾病相关的治疗和诊断，二茂铁的电化学 标记也有其独到的用处。比如许多科学家致力于设计抑制剂来阻止与h i v 病毒 相关酶的活性，从而控制h i v 病毒的恶化，对于这些酶的检测，k e r m a n 掣2 4 】 用二茂铁标记与h i v 病毒相关酶的多肽配体固定于微金电极表面，实现了这一 目标，并且为筛选治疗艾滋病的抑制剂提供一种方法。 ( 3 ) 电子转移介体一般情况下，酶的氧化还原活性中心深埋于蛋白质中， 与电极直接的电子转移非常慢，于是需要设计一个小分子能进入蛋白起到电子介 体的作用。o k a w a 等【2 5 j 设计了一个灵活的长链二茂铁栓，将其固定在s n 0 2 电极 表面应用于对辣根过氧化物酶的电子转移调解。近些年来，出现了采用电子传递 体的葡萄糖传感器。电子传递体对葡萄传感器的性能影响很大。一般选择符合下 列条件的物质作为电子传递体：电化可逆性好( 电子传递速度快) ，氧化还原电位 低( 电活性物质造成的干扰小) ，稳定好，在水中溶解度小及不受氧的影响。因此， 二茂铁衍生物作为优良的电子传递体广泛用在葡萄糖传感器中1 2 6 。2 9 】。 1 2 谷胱甘肽 1 2 1 谷胱甘肽的结构 谷胱甘肽，是由l 一谷氨酸、l 一半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同 时具有丫_ 谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物f 3 0 1 。作为生物体内广泛存在的小 分子非蛋白锍基化合物，谷胱甘肽主要有还原型( g s h ) 乘i 氧化型( g s s g ) n 种形态 ( 如图1 3 ) 。 h o o p 2 ；吖h s h o o h 2 n o o o 村p 科v h s o i r ，s o n 村儿h h o g s h g s s g 图1 3g s h 和g s s g 的结构 f i g 1 - 3s t r u c t u r e so fg s ha n dg s s g 4 硕十学位论文 第一章文献综述 g s h 广泛存在于自然界中，动物肝脏、酵母和小麦胚芽中都含有丰富的 g s h ，其含量为1 1 0m g g - 1 ，人和动物的血液中也含有较多的g s h ，而植物组 织中的g s h 含量则较侧3 l 】。在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘 肽，两种形态可以通过谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶互相转化，正常人 体内还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比例为1 0 0 ：l 【3 2 1 。如图为酵母细胞中氧 化型和还原型谷胱甘肽之间的相互转化过程【3 3 羽l 。 f r e e r a d i c a l s c e l l u l a r e n e 曙y 图1 4 酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程 f i g 1 - 4c o n v e r s i o n so fg l u t a t h i o n ei ny e a s tc e l l s 1 2 2 谷胱甘肽的生理医学功能 谷胱甘肽一种广泛分布存在于动植物和微生物细胞中具有多种重要生理功 能的三肽。谷肽甘肽能够作为多种酶反应的辅酶，对生物分子蛋白质的琉基有保 护作用，可维持某些酶的活性。此外还有防止脂质氧化，解毒，防止白内障发展 和保护皮肤等作用。临床上用于肝脏疾病，药物和重会属中毒的治疗，并可与抗 癌药合用。科学家们一直在研究它在各种生物体内的生理作用。目前，谷胱甘肽 在食品、医药等领域的应用门益受到人们的重视。g s h 的生理功能主要表现在以 下几个方面： ( 1 ) 参与氨基酸的吸收和转运小肠吸收氨基酸以及氨基酸从细胞外转运 到细胞内的过程，除了借助与质膜中特异蛋白质载体系统外，谷胱甘肽也参与了 氨基酸的吸收，即所谓的丫一谷氨酰基循环【3 5 粕】。该循环的大致过程为：质膜中的 y 一谷氨酰基催化谷胱甘肽和被吸收的氨基酸生成y 谷氨酰基酸和半胱酰甘氨酸， 然后转运到细胞内，在细胞内分解成氨基酸和谷胱甘肽，这样就完成了氨基酸的 转运和吸收过程。反应过程有a t p 循环提供能量。 ( 2 ) 维持红细胞膜的完整性、清除体内自由基在代谢过程中经常产生少量 的h 2 0 2 ，如不及时清除，可使细胞膜的巯基失活。h 2 0 2 还使细胞膜上的磷脂分 子中不饱和脂肪酸发生氧化反应，产生脂质过氧化物，而脂质过氧化物进一步分 5 硕1 ：学位论文第一章文献综述 解形成胶联剂。这些胶联剂迅速使红细胞膜遭受损伤而发生溶血。而以谷胱甘肽 为底物的谷胱甘肽过氧化物酶能催化h 2 0 2 生成h 2 0 ，催化脂质过氧化物生成相 应的醇，从而避免了对红细胞膜的损伤。谷胱甘肽通过自身巯基与自由基结合， 从而清除体内的自由基，维持细胞的正常生长，保护细胞内含毓基酶的活性( 如 a t p 酶) ，防止由于毓基的氧化而导致蛋白质的变性。谷胱甘肽有效地清除了自 由基，防止皮肤老化及色素沉淀，增强皮肤光泽。同时又可减少自由基对d n a 的 攻击，有效地减少了d n a 的损伤和突变。谷胱甘肽又是一种射线防护剂，可有 效清除通过射线的直接或间接作用而在生物体内产生的高活性的各种自由基 【3 7 - 3 8 】 o ( 3 ) 参与血红蛋白的还原作用以及维持细胞内正常的氧化还原状态j 下常 人血红蛋白分子含二价铁( f e 2 + ) ，可与氧结合成为氧合血红蛋白。如果血红蛋白 中的二价铁被氧化成f e 3 + ，即成为高铁血红蛋i 刍( m h b ) ，丧失运氧功能。但在正 常情况下，红细胞内的谷胱甘肽与其它还原性物质( 如抗坏血酸、n a d h 、n a d p h ) 共同组成m h b 的还原系统，能有效地防止二价铁的氧化【3 9 1 。细胞内的氧化还原 状态是由体内还原性物质与氧化性物质之间的平衡决定的。般情况下，正常的 细胞均处于还原态。谷胱甘肽氧化还原系统对来自细胞内外的氧化刺激做出响 应，调节细胞内的氧化还原状态【4 2 1 。 除此之外，g s h 可以保护并恢复需要巯基的酶的活性，以及作为多种酶的 辅酶或辅基。同时也有一些临床应用，比如g s h 具有抑制艾滋病病毒 4 3 州】，改 善性功能的功效。另外如果g s h 在体内的含量降低于正常水平，将导致像糖尿 病【4 5 。4 6 1 、酒精肝中掣4 7 4 8 1 、自内障f 4 9 - 5 们、帕金森综合症【5 1 5 3 1 、老年痴呆症肿瘤f 5 4 j 等一系列病症在人体的发生。 对于g s s g ，尽管一般情况只是把它作为g s h 参与氧化应激的一种产物， 但它在某些生理作用方面起着举足轻重的作用。n o v 0 0 2 ，一种以g s s g 与p t 1 0 0 0 ：1 的比例复合形成的新的抗肿瘤药物【5 5 1 ，并已经在俄罗斯和美国进行了临 床试验。t o w n s e n d 掣珀】对其药理学进行了研究，实验表明n o v 一0 0 2 是一种很好 的癌症治疗佐剂，它能够加强脊髓增殖，导致细胞内外发生氧化还原诱导的变化， 比如引发一些蛋白质的s 谷胱甘肽化，影响激酶和磷酸酶调节信号路径。最近， u y s 等【57 】对其进行了前临床药代动力学研究，实验结果表明g s s g 是n o v 0 0 2 主要的药理成分，对老鼠有明显的动力学和热力学影响。同时致使血浆中自由巯 基的量持续下降，破坏氧化还原平衡。在一些病态中，g s s g 的浓度升高，导致 蛋白质s 谷胱甘肽化，改变了其功能，而可逆的s 一谷胱甘肽化是某些选择性毓 基蛋白质氧化还原信号转换和调节的特征【5 8 1 。b r e n n a n 等【5 9 1 用生物素标记的 g s s g 研究蛋白质的s 一谷胱甘肽化，建立了一种研究细胞内外氧化还原信号的方 6 硕十学位论文第一章文献综述 法。0 t 突触核蛋白是帕金森病中路易氏体的纤维组成部分，成为帕金森病的主要 病理因素。p a i k 等唧1 报道了g s h g s s g 与0 【一突触核蛋白的相互作用，结果表明 g s s g 能刺激0 【一突触核蛋白淀粉体的形成。 1 3 金属硫蛋白 1 9 5 7 年，美国科学家m a r g o s h o e s 在研究会属生物学作用时，从马的肾皮质 中分离出镉的金属蛋白质【6 1 1 。由于它是一种低分子量( 6 7 k d ) ，高巯基含量，能 大量结合重金属离子，因此称为金属硫蛋i 兰1 ( m e t a l l o t h i o n e i n ，简称m t ) 。它在自 然界广泛存在，人体、动物、植物以及微生物体内均含m t t 6 2 】，在体内它参与必 需金属的平衡代谢和重金属的解毒过程。作为一种多功能蛋白质，m t 在抗氧化、 清除自由基、驱除重金属毒物和平衡体内微量元素分布等方面具有重要的作用。 1 3 1 金属硫蛋白的结构 多种生物物理和生物化学技术如原子吸收光谱分析( a a s ) 、圆二色谱( c d ) 、 电子自旋共振技术( e s r ) 、扫描隧道显微镜( s t m ) 和核磁共振技术洲m r ) 的应用， 为m t 的结构研究提供了很好的手段。哺乳动类m t 含有6 1 6 2 个氨基酸残基， 2 0 个半胱氨酸，分为o c 、d 两个结构域( d o m a i n ) ，其一级结构如图1 5 所示【6 3 1 ， 从n 端起，氨基酸残基1 3 0 为d 结构域，有3 个会属簇；氨基酸残基3 1 6 2 为0 c 结构域，其木端为c 端，0 【结构域有4 个金属簇。m t 分子中不含带有苯环的氨 基酸，因此没有芳香性。在所有形式中，除了半胱氨酸含量占氨基酸总量的l 3 左右以外，还有一个最显著的特征是m t 中半胱氨酸残基的分布极有特点，以 c y s x c y s 、c y s c y s 和c y s xxc y s 序列反复出现，其中x 代表除半胱氨酸 外的其它氨基酸，这种氨基酸排布与m t 的金属结合有着密切的关系。 图1 - 5 兔肝m t - 2 a 的氨基酸序列 f i g 1 - 5p r i m a r ya m i n oa c i ds e q u e n c eo fr a b b i tl i v e rm t - 2 a 7 硕+ 学位论文第一章文献综述 圆二色谱和晶体结构的研究发现，m t 分子与一般的蛋白质分子不同，它不 螺旋和d 折叠，m t 的构型较坚固，而且蛋白质氨基酸排列有重复性，在氨酸链 断掉一部分后仍会有活性，因此它具有较强的耐热性和生物学稳定性，同还可以 抗酶解。哺乳动物m t 的每一个蛋白分子可以结合7 个二价金属离子( z n 2 + 或 c d 2 + ) ，金属离子以四面体构形与巯基配合，分别在两个结构域中形成m 4 s l i 和 m 3 s 9 的金属簇。如图1 - 6 所示为兔肝z n 7 一m t - 2 a 的结构模型【6 4 1 ，z n 3 s 9 ( p 结构 域) 和z n 4 s l l ( o t 结构域) 金属簇已得到x 射线晶体衍射研究的证实【6 5 j 。0 【和d 结构 域具有相似的结构特征，彼此都单独呈球状，直径在1 5 2 0a 之间，两者通过第 3 0 和3 1 位氨基酸残基连接使整个分子呈哑铃状。在低等动物如甲壳类的蟹中， m t 仅具有2 个d 结构域，而0 【结构域则出现于较高等的动物；果蝇是动物m t 基 因家族唯一与其他成员没有同源性的例子，只有一个结构域；迄今为至，发现的 真核微生物中的m t 只含有单一的金属结合的结构域。 图1 6 兔肝z n 7 m t - 2 a 的空间填充模型( 左) 和球棍模型( 右) 。绿色z l l ，黄色s ，灰色c ， 蓝色- n ，红色o 。箭头代表z n ( i i ) 巯基簇易结合位点。 f i g 1 - 6s p a c e f i l l i n g ( 1 e f t ) a n dt u b e ，b a l la n ds t i c k ( f i g h t ) r e p r e s e n t a t i o no ft h er a b b i tl i v e rz n 7 - m t - 2 am o d e l a t o ml e g e n d ：g r e e n = z n ；y e l l o w = s ；g r e y = c ；b l u e = n ；r e d = o t h ea n 0 wd e n o t e st h e a c c e s s i b l es i t e so ft h ez n ( i i ) - c y s t e i n et h i o l a t ec l u s t e r s 1 3 2 金属硫蛋白的功能 金属硫蛋白结构的保守性、分布的广泛性以及在再生和发育过程中的程序化 合成，都表明它在细胞的基木活动中起着十分重要的作用。到目前为止，人们发 现的金属硫蛋白的功能主要有： ( 1 ) 参与微量元素的存储，运输和代谢会属硫蛋白可能参与生物体内z n ， c u 等元素的吸收、存储、运输、排泄和体内平衡等多种代谢过程【6 6 1 ，m t 能调 硕十学位论文第一章文献综述 节小肠对z n ，c a 等金属的吸收，小肠m t 的水平与z n ，c