（农业工程专业论文）玉米蛋白粉中叶黄素提取工艺参数及纯化方法的试验研究.pdf

摘要本文以玉米蛋白粉为原料，研究了叶黄素的高效液相( h p l c ) 定量方法、优化了玉米蛋白粉中 黄素的提取及皂化工艺参数，并利用高速逆流色谱进行了叶黄素纯化的初步研究。得到具体结论如下：( 1 ) 以乙腈和乙酸乙酯组成的流动相系统进行梯度洗脱，在填充料颗粒直径为5 “m 的分析型c ，8 硅胶柱上较好的实现了叶黄素和其他类胡萝b 素的分离，紫外检测波长为4 4 7 n m ，柱温2 6。利用外标法制作标准曲线，当叶黄素质量浓度为1 3 9 2 1 7 4 o o p g ，m l 时，有同归方程y = 0 0 6 2 2 x - 0 0 2 9 4 ，r 2 = o 9 9 9 5 。该方法精密度为0 6 8 ，平均回收率为9 7 6 1 。( 2 ) 通过单因素和正交试验，确定了优化的叶黄素提取工艺参数为：提取溶剂9 5 ( 质最分数) 的乙醇。液同比5 m l g ，提取时间0 5 h ，提取温度2 5 ，该工艺1 次和2 次提取的粗提取率分别为6 7 6 3 和6 9 6 8 ；对试验选取的玉米蛋白粉，皂化能显著提高叶黄素质量浓度，提高率为3 7 7 4 ，优化的皂化工艺为：温度2 5 ，时间3 h ，k o h 浓度5 ( m v ) ，该t 艺的叶黄素得率为4 5 6 7 ( 1 次提取) 。( 3 ) 利用h p l c 方法对叶黄素在3 种溶剂系统中的分配系数进行测定，并选择正己烷乙醇水( 6 ：5 ：1 | 3 ) 为口 黄素纯化的溶剂系统；在流动相流速为1 2 m l m j n ，转速为8 0 0 r i n i n 的条件下进行高速逆流色谱( h s c c c ) 纯化，收集产物经h p l c 检测，叶黄素纯度最高可达9 1 5 7 ，因此h s c c c 是一种分离制各高纯度叶黄素的有效方法。关键词：叶黄素，玉米蛋白粉，优化，提取，高速逆流色谱a b s t r a c ti nt h i ss t u d yt h eh p l cm e t h o df o rl u t e i na n a l y s i sw a sd e t e r m i n e d ，t h ep r o c e s s e so fe x t r a c t i o na n ds a p o n i f i c a t i o nw e r eo p t i m i z e da n dd e t e r m i n a t i o na n dt h em e t h o df o ri s o l a t i o no fl u t e i nf r o mc r u d ee x t r a c t so fc o mg l u t e nm e a lb yh i g h s p e e dc o u n t e r - c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h yw e r ee x p e r i m e n t e d ( 1 ) c h r o m a t o g r a p h ya n a l y s e sw e r ep e r f o r m e do na na n a l y t i c a lc l sc o l u m no fw h i c ht h es t a t i o n a r ys u p p o r ti ss i l i c aa n dt h ep a r t i c l es i z ei s5 u 1 1 1a t2 6 cw i t l la l lu vd e t e c t o ra t4 4 7 n m f o rt h es e p a r a t i o no fl u t e i na n do t h e rc a l o t e n o i d s ，al i n e a rg r a d i e n te l u e n tm o d eu s i n ge t h y la c e t a t e ( e l u e n ta )a n da c e t o n i t r i l e ( e l u e n tb ) w e r ea p p l i e d as t a n d a r dc u r v ea n dt h er e l a t i v er e c u r s i v ee q u a t i o no fw h i c hr 2w a s0 9 9 9 5w e r er e a c h e dw i t hl u t e i nc o n c e n t r a t e df r o m1 3 9 2 9 m m lt o1 7 4 0 0 v s n m l i ti n d i c a t e dt h a tt h eh p l cm e 山o dw i t ht h er s do f0 6 8 a n da v e r a g er e c o v e r yo f9 7 6 1 w a sr e l i a b l e ( 2 ) o nt h eb a s i so fs i n g l e t - e l e m e n tt e s t sa n do r t h o g o n a lt e s t s ，t h ep r o c e s s e so fe x t r a c t i o na n ds a p o n i f i c a t i o nw e r eo p t i m i z e db yu s i n gt h e9 5 e t h a n o l ( i n a s sr a t i o ) a se x t r a c t i n gs o l v e n t t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rl u t e i ne x t r a c t i o nw e r et h a tl i q u i d s o l i d ( i j s ) ：5 m l j g ，t i m e ：0 5 h ，t e m p e r a t u r e ：2 5 c ，o fw h i c hr o u i g he x t r a c t i o nr a t i oo f1a n d2t i m e sw e r e6 7 6 3 a n d6 9 6 8 r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rs a p o n i f i c a t i o nw e r et h a tt e m p e r a t u r e ：2 5 。c ，t i m e ：3 hw i t h5 ( m v ) e t h a n o l i ck o h s a p o n i f i c a t i o nc o u l dr e m a r k b l e l yr a i s e dt h ey i e l do fl u t e i nl e v e lb y3 7 7 4 ( 3 ) t h ed i s t r i b u t i v ec o e f f i c i e n to fl u t e i ni n3d i f f e r e n ts o l v e n ts y s t e m sw a sd e t e r m i n e db yh p l ca n dt h eh e x a n e e t h a n o l w a t e r ( 6 ：5 ：1 3 ) w a sf i n a l l yc h o s e nf o rt h eh s c c c w i t hm o b i l ep h a s ef l o wr a t ea t1 2 m l t m i na n da p p a r a t u sr o t a t es p e e da t8 0 0 r r a i n t h eo u t c o m ec h a r a c t e r i z e db yh p l cs h o w e dt h a tt h ep e a ka r e ao fl u t e i nc o m p r i s e d9 1 5 7 o ft h et o t a lp e a ka r e aa t4 4 7 n r r li ti n d i c a t e dt h a th s c c ci sav a l i dm e t h o df o rp r e p a r a t i o no fh i g hp u r i t yl u t e i n k e yw o r d s ：l u t e i n ，c o i ng l u t e nm e a l ，o p t i m i z a t i o n ，e x t r a c t i o n ，h s c c ci i独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：多致时间：沙6年6 月，胭关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：曼薇时间：妒6 年3 月伽导师签名：辨隹时间：，年6 月，2 日中国农业大学硕上学位论文第一章绪论第一章绪论1 1 课题提出的背景与研究意义1 1 1 叶黄素概述1 理化特征类胡萝h 素( c a r o t e n o i d ) 是自然界中广泛存在的天然色素，到目前为止，已经有6 0 0 多种被发现并分离纯化出来。类削萝h 素是一大类分子中含有异戊二烯基本结构单位的化合物的总称。根据化学结构，类胡萝p 素可分为胡萝b 素类( c a r o t e n e s ) 和叶黄素类( x a n t h o p h y u s ) ，前者是不含氧的类胡萝h 素总称包括：n 一胡萝h 素( a - c a r o t e n e ) 、b 胡萝h 素( = l - c a r o t e n e ) 、7 - 胡萝h 素( y - c a r o t e n e ) 和番茄红索( 1 y c o p e n e ) 等：后者是含氧类胡萝h 素的总称，包括叶黄素( 1 u t e i n ) 、玉米黄质( z e a x a n t h i n ) 和隐黄质( c r y t o x a n t h i n ) 等。根据生物特性，类胡萝h 素可分为三类：具有维生素a ( v a ) 功能的非色素类胡萝h 素，如n 胡萝h 素、b 胡萝h 素；无v a 功能的非色素类胡萝h 素，如紫黄质( v i o l a x a n t h i n ) 、番茄红素；色素类胡萝h 素，如叶黄素、玉米黄质、辣椒红索( c a p s a n t h i n ) 、辣椒玉红素( c a p s o r u b i n ) 等8 1 。叶黄素( 1 u t e i n ) 中文系统命名为3 ，3 - 二羟基一b 。- 胡萝h 素，分子式：c 4 0 1 5 6 0 2 ，相对分子量：5 6 8 8 1 。1 8 3 1 年，w a c h e n r o d e r 从胡萝h 根中首次提取出了叶黄素；1 9 4 4 年，z e c h m e i s t e r提出了叶黄素的立体化学结构：1 9 5 1 年，k a r r e r 确定了叶黄素的化学结构9 】。叶黄素有三个手性分子，理论上有8 种立体异构体，实际存在的主要是两种，即( 3 r ，3 r ，6 r ) 叶黄素和( 3 r ，3 s ，6 r ) 叶黄素，其他构型异构体只在深海鱼肠道中存在【4 j 。由于烯键的存在，叶黄素可以发生顺反异构，如1 5 顺式叶黄索、1 3 _ j 峨式叶黄素、】3 - 顺式叶黄素等，但大部分存在于自然界的叶黄素都是全反式结构，以万寿菊油树脂为例，其中反式和顺式叶黄素比例经h p l c 测定为7 5 ：2 5 t 4 】。此外，叶黄索还有同分异构体玉米黄质( 3 ，3 - 二羟基一b ，1 3 - 胡萝h 素) ，两者的不同在于一个双键的位置，在叶黄素中这个双键形成烯丙基羟基末端，在玉米黄质中相应双键则与相邻直链双键形成共轭体系，因此叶黄素具有比玉米黄质更强的化学活性。叶黄素和玉米黄质的结构式见图1 - 1 和图1 - 2 所示：图1 - 1 全反式叶黄素f i g1 - l c h e n f i e a ls t r u c t u r eo fr a l l 日- l u t e i n中国农业大学硕士学位论文第一章绪论图】一2 全反式玉米黄质f i g 1 - 2 c h e m i c a ls t f i l c t i l r e o f o f l 目z e a x a n t h i n叶黄素是脂溶性色素，不溶于水，易溶于有机溶剂如正己烷、乙醇、乙醚等。由于含有氧，它比多数类胡萝| 素极性强，可溶于强极性有机溶剂，如氯仿、二氯化碳等。叶黄素在偏酸性溶液、弱光和低温下比较稳定；在弱酸、弱碱条件下，颜色发生可逆变化；在强碱、强光或高温条件下结构被破坏”】，分子中共轭不饱和结构的存在，使得叶黄素在紫外可见光区有独特吸收，它的结晶和溶液在可见光f 可呈现绚丽的橘红色或黄色“2 。2 自然分布叶黄素有两种存在形式：游离态和叶黄素酯，后者如月桂酸酯、豆蔻酸酯、棕榈酸酯等。图1 - 3 和表1 - 1 分别为叶黄素酯的一般形式和常见的酯基基团m 。r 1 0图1 - 3 叶黄素酯的一般形式f i g l 一3c h e m i c a ls t r u c t u r eo f l u t e i nd i e s t e r表1 l 万寿菊中叶黄素及其常见醑：! 竺! ! ! ：! 望! 竺竺竺! ! ! ：竺型：尘竺型尘! ：坚! 1 2 型量：竺：2 ：竺!叶黄索类型r 1r 2游离态的叶黄素可被人体直接吸收利用，而叶黄素酯则必须在体内水解成游离态后才能被吸收。自然界中，万寿菊是叶黄素晟丰富的来源，总类胡萝h 素含量可超过2 耻妇鲜重，其中8 8 为叶黄素及其酯；其次是甘蓝和羽衷甘蓝；南瓜、桃子、辣椒、芒果和柑桔中则含有丰富的叶黄素酯嘲。表1 - 2 是部分天然饲料原料中叶黄素的含量( g k g ) 和生物效价( 以着色效果为标准) 9 1 。2中国农业大学硕士学位论文第一章绪论表1 - 2 部分天然饲料原料中叶黄素含量及生物效价t a b l e1 - 2r e l a t i v el u t e i nl e v e la n db i o l o g i c a lv a l u ei ns o m en a t u r a lf e e d s t u f f3 生理功能( 1 ) 抗氧化特性早在3 0 多年前，研究者就发现b 一胡萝h 素具有淬灭单线态氧的能力。随着研究的不断进行，人们发现，不仅b 胡萝h 素具有抗氧化能力，人多数类胡萝h 索都具有抗氧化能力，能够保护生物系统免受过氧化反应带来的潜在危害作用。大多数类胡萝h 素的分子结构中存在9 个或以上共轭双键，共同构成一个共轭双键链，使得类胡萝h 素成为阻断自由基链式传递的抗氧化剂，它们的抗氧化活性大小取决于共轭双键的数目和尾端基团的结构。叶黄素和玉米黄质分别有1 0 个和11 个共轭双键且尾端基团上连有羟基，因此在防止自由基对生物膜损害、淬灭单线态氧和捕获氧自由基方面具有独特效果。新的研究又显示，类胡萝h 素的作用方式与其在细胞膜中的位置有关闭，d 胡萝h 素和番茄红素只对膜内侧的自由基有效，而叶黄素和玉米黄质的疏水性较弱，能与膜内自由基反应，在清除膜内自由基、维持生物膜的完整性方面比8 胡萝h 素和番茄红素更有效，同时还能改善膜对氧和其他分子的通透性。( 2 ) 视觉保护老年黄斑变性( a g e - r e l a t e dm a c u l a rd e g e n e r a t i o n ，a m d )1 9 8 5 年。b o n e 等人首次证明人体视网膜黄斑色素是叶黄素和玉米黄质的混合物。黄斑色素可滤过损害光感受器和视网膜上皮细胞的蓝光( 对视网膜最具损伤力的光波) ”“，清除自由基和游离氧，从而限制由丁新陈代谢和光线所致的组织氧张力”“。随着年龄的增长，黄斑色素的浓度降低，甚至引起变性，即老年黄斑变性( a m d ) ，它是西方发达国家主要的不可逆致盲原因，是6 0 岁蚍上老年人常见的眼部疾病，近年来在东方国家也有增加趋势。1 9 8 8 年，g o l d b e r g 等人报道，a m d 发病率与摄入富含叶黄素的蔬菜、水果之间存在明显的负相关m 】；1 9 9 4 年，s e d d o n等人的研究发现，增加富含叶黄素和玉米黄质的水果和蔬菜的摄入最，可使湿性a m d 的患病率降低4 3 “”；营养和流行病学的研究也表明，当膳食或血液中类胡萝b 素浓度特别是叶黄素和玉米黄质的浓度较高时，a m d 的发病率明显降低限1 ”。白内障白内障是由于晶状体透明度卜降、混浊而导致视力障碍的一种疾病。导致白内障的原因很多，中国农业大学硕士学位论文第一章绪论老化、外伤、遗传、慢性眼病以及其他疾病如糖尿病产生的并发症都可能引起，其中自然老化过程是晟主要、最普遍的致病原因。统计资料显示，我国6 0 岁以上老年人的致残眼病中自内障占6 0 1 1 ，全球6 0 岁以上老年人因白内障而造成视力障碍的超过5 0 t 9 。紫外线、自由基和氧化剂都与老年性白内障的形成有芙。目前，还没有可以使晶状体恢复透明度的药物，唯一的治疗方式就是通过手术切除，全球每年因白内障而接受手术的病人人数在1 0 0 万以上1 。1 9 8 8 年，j a c q e s 等“5 1 研究发现，通过摄入类胡萝h 索含量高的饮食可降低患白内障的危险性。2 0 世纪8 0 年代，美国的一项涉及5 0 8 2 8 人的调查“5 惶示，一些营养素的摄入与白内障的形成存在负相关，其中以叶黄素与自内障危险性降低的相关性最强。它能猝灭单线态氧，间接地减少晶状体蛋白的氧胁强，从而防止自内障的形成。( 3 ) 癌症预防1 9 8 1 年，p e t o 等人首次报道了类胡萝h 素可能在减少人类癌症发生方面起作用“”。此后，大量流行病学研究表明，一种或多种果蔬类胡萝h 素能降低一些主要的慢性病如肺癌、乳腺癌、前列腺癌的发病率。s n o d d e r l y 和c h e w 分别在1 9 9 5 年和1 9 9 6 年提出，叶黄素和玉米黄质在减少癌症发生、发展，增强免疫功能方面有独特功能1 7 , 1 8 ，可能的原因是叶黄素和玉米黄质可以防止细胞腊质过氧化，而后者与肿瘤的生长有关”m 。最新研究成果表明，叶黄素对多种癌症有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、直肠癌、结肠癌和皮肤癌等“4 删。j e a n 等研究了万寿菊提取物对小鼠乳腺癌的抑制作用，发现低水平的膳食叶黄素( 0 0 0 2 0 0 2 ) 就能够降低乳腺癌发病率和增长癌症潜伏期o ”。纽约大学药物学院的调查也发现，叶黄素低摄入量实验组乳腺癌发病率是高摄入量组的2 0 8 2 2 1 倍b 。另据对前列腺癌细胞增殖的一项研究表明，叶黄素单独作用可降低癌细胞增长速度的2 5 ，若与番茄红素协同作用可降低3 2 2 2 o2 0 0 0 年，s l a t t e r y 等研究发现叶黄素能够降低结肠癌的发病率，而其他几种常见类胡萝h 素的抗结肠癌效果不明显o 。t 9 9 8 年和2 0 0 1 年，t a y l o r 和f a n l h a b e r 分别通过动物试验证明了每日5 1 x g 的n l 黄素摄入量可以显著减少由u v b 引起的皮肤细胞癌变增殖和过敏反应【2 4 2 5 】( 4 ) 心血管疾病的防治心血管疾病也是造成人类死亡的主要原因之一，流行病学家早就在探索类胡萝t - 素与冠心病，动脉粥样硬化等之间的关系”j 。1 9 9 2 年，s t a h e l i n 等证实血液类胡萝h 素水平与局部缺血心脏病之间存在反比关系，1 9 9 4 年，m o r r i s 等研究发现血液中总类胡萝h 素水平与冠心病的发病率成反比。同年，s t r e e t 等发现，叶黄素和玉米黄质均可显著降低心肌梗塞的发病率。1 9 9 5 年，s t e i n b e r g 发现膳食中叶黄索和玉米黄质水平低时，患动脉粥样硬化的可能性就大。h o w a r d 研究表明叶黄素可以通过防止低密度脂蛋白的氧化降低动脉粥样硬化和冠心病的发生，j a m e s 等人的流行病学研究、体外实验和动物模型研究都证明增加叶黄素的摄入能防止动脉粥样硬化的发生。1 9 9 7 年和1 9 9 9 年，i r i b a r r e n 和s t e p h e n 等人研究了m 液中各种类胡萝i - 素对颈总动脉内膜血管中层增厚的影响，发现叶黄素和玉米黄质降低颈总动脉内膜血管中层增厚的能力最强。4 应用现状4中国农业大学硕士学位论文第一章绪论( 1 ) 饲料添加剂在世界许多国家和地区，特别是美国和许多亚洲国家，蛋黄的色泽、家禽皮肤和肉品的颜色往往对人们的消费行为有直接的影响。由丁习惯和心理作用，多数人偏爱金黄色或橙红色的蛋黄，并倾向于将黄色的皮肤视为肉质和风味较好的标志。研究发现，不同品种家禽皮肤的着色能力不同，但沉积在其皮下脂肪的呈色物质都是相同的，即叶黄素类。事实上，大多数动物，包括家禽在内，自身都不能合成叶黄素，必须从饲料中摄取。叶黄素经过体内消化、吸收、转移和酯化后，最终沉积在禽蛋蛋黄和家禽皮肤上。有报道认为，每吨饲料只要含有7 8 m g 的叶黄素，就可以得到需要的蛋黄色泽，而且当禽蛋煮熟后其着色效果并无变化” 。尽管大部分饲料中预添加有玉米蛋白粉或苜蓿粉，但由于天然类胡萝h 素的不稳定性，在收获和储存期间损失迅速，因此适量的色素添加剂是必不可少的。有的公司为了迎合市场需要，在饲料中添加超常量的合成商品着色剂，虽然也能达到同等的着色效果，但对人体健康不利。生物来源的天然着色剂则没有这种安全性问题。天然色素添加剂一般以植物、微生物和甲壳纲动物为原料提取后，经明胶和碳水化合物等包裹得到，并加入抗氧化剂，降低温度、水、光及矿物质对色素的影响。如美国建明( k e m i n ) 公司的“金闪闪”，西班牙科恩公司的“康乐黄”和美国富基企业公司的“金露菲”都是含叶黄素的万寿菊提取物，其中不乏添加抗氧化剂、界面活性剂、酵素等，可使叶黄素很快被吸收，更具生物活性 2 7 j 。( 2 ) 保健食品和药品上世纪9 0 年代，欧洲和美国就已经批准了万寿菊花提取物成为允许的食品添加剂。在这方面，美国的建明( k e m i n ) 公司、胡兹制造公司、瑞士的罗氏( r o c h e ) 公司一直处于研究前沿。k e m i n 公司率先发明了从万寿菊中提取叶黄素的工艺，使得叶黄素作为食品和保健品的营养补充剂成为可能，以他们生产的f l o r a g l o 结晶叶黄素为例，其中含7 6 的叶黄素、7 的玉米黄质和1 4 的其他类胡萝h 素“”。南美的h e n k l e 公司也从南瓜和榨汁后的橘渣中提出“叶黄素酯”，人人拓展了叶黄素的来源阱1 。目前，多家公司正在致力丁一研究叶黄素的药用价值，并且开发了添加叶黄素和玉米黄素的用于治疗眼病的药膏和有益眼睛健康的“超视力”饮料。2 0 0 1 年，瑞士罗氏公司开发了一种由多种维生素和叶黄素配制的护眼口嚼片，最近又推出两种新型叶黄素剂型，分别是含5 叶黄素的冷水扩散性干粉和药用片剂，均可作为食品添加剂冽。( 3 ) 其他应用叶黄素用于人造奶油、硬糖、软糖的着色，当添加量分别为o 5 、o 2 6 和0 4 时，能产生稳定的自然黄色。比用其他着色剂效果更好。叶黄素的化学降解产物还可提供烟草中的香味物质。气相色谱分析表明，叶黄素降解后产生的3 戊烯一2 ，庚酮、氢化异氟尔酮、环氧紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和茶香螺酮，对卷烟的品质有很大影响啪l ，使吸味变得醇厚、香气变得优雅并带有清甜的果香。由于叶黄素具有独特的生物活性，在食品、化妆品、医药、烟草、禽类饲料等领域将会受到越来越多的应用。中国农业大学硕士学位论文第一章绪论1 1 2 玉米蛋白粉的应用玉米蛋白粉( c r o ng l u t e nm e a l ，简称c g m ) 是由玉米湿法生产淀粉的副产物黄浆水经浓缩干燥制得，颜色深黄，因此又叫玉米黄粉。玉米籽粒含有0 0 1 n 0 9 m g 1 0 0 9 的类胡萝h 素，通常在淀粉生产的过程中，随蛋白质一起被分离出来，进入黄浆水。因此，玉米蛋白粉含有较丰富的类胡萝h 素，含量通常为2 0 0 m g k g3 7 0 m g k g ，约合o 0 2 0 0 4 3 1 。以粗蛋白质量分数为6 4 的玉米蛋白粉为例，其中叶黄素含量从1 6 0 m g k g 到3 6 0 m g k g 不等，占总类胡萝h 素含量的5 4 以上4 1 。但是黄浆水除了部分制成c g m 作为饲料廉价出售外，大部分作为废水处理或自然排放了，不仅浪费资源，而且造成环境污染。仅2 0 0 1 年，我国玉米湿法淀粉生产消费玉米就达5 3 0 万吨，分离出玉米蛋白粉4 0 多万吨”目，以此为原料提取叶黄素不仅可以提高农产品附加值，深化农副产品综合利用，还可以解决环境污染的问题。玉米蛋白粉中的类胡萝h 素成分复杂，但主要是叶黄素、玉米黄质、p 一隐黄质、p - 胡萝h 素，习惯上将玉米和玉米蛋白粉中提取的天然色素总称为玉米黄色素。我国1 9 9 6 年制定的食品添加剂使用卫生标准g b 2 7 6 0 - - 1 9 9 6 将玉米黄色素列为可食用天然色素，与柠檬黄、日落黄等合成色素相比，玉米黄色素更安全，与其他天然色素如姜黄、红花黄等相比，具有来源丰富，不受季节限制和成本低廉的优点田】。玉米黄色素有较强清除脂质过氧化自由基的能力，被食用后可部分转化成维生素a ，具有保护视力，促进人体生长发育和提高免疫力的作用，利用价值和应用前景良好。目前玉米黄色素的制备方法主要有溶剂萃取和超临界c 0 2 萃取两种。有机溶剂萃取一般以石油醚、四氢呋喃、正己烷、乙醇等为提取剂，常见的工艺流程为：原料一萃取一分离一浸提液一浓缩一液体玉米黄色素一喷雾干燥一粉末状玉米黄色素。一般液体产品的得率为蛋白粉干基的8 1 5 ，常温f 为血红色油状液体，具有玉米油的固有气味”o ”。超临界流体萃取是使用高于临界温度、临界压力的流体为萃取剂的萃取过程，这种流体不仅对物质有很高的溶解力，而且通过调节体系的压力和温度可以选择性的分离不同物质。目前用的最多的是c 0 2 ，它的极性和正己烷相似，适合萃取油溶性成分，具有性质稳定，低毒不易燃，可循环使用的优点。国外有人做过研究，以乙醇为助溶剂，在较低的压力下，获得的主要是b 胡萝h 素，而在较高压力f ，主要是玉米黄质和少量b 胡萝h 素。国内也有人探讨萃取压力、温度、分离压力、分离温度、操作时间以及c 0 2 流量对玉米黄色素萃取率的影响o 3 ”。1 1 3 课题的研究意义正是由于我国每年作为副产物生产出大量玉米蛋白粉，而其中又较丰富的叶黄素( 类胡萝h素) 资源，所以，以玉米蛋白粉为原料提取叶黄素具有可行性。超临界c 0 2 萃取玉米黄色素虽然具有无溶剂残留，安全的特点，但由下一次性投资和操作费用的巨大，使得该技术难以广泛应用丁- 工业生产，目前主要停留在适用领域的开发和探讨。6传统溶剂法处理玉米蛋白粉时，往往以提取玉米黄色素为目标产物，以其得率为考察指标【3 “。这主要是因为以有机溶剂萃取玉米蛋白粉时，得到的色素成分复杂，除了主要的几种类胡萝h 素外，还有蛋白，多糖，蜡质等成分，而且由丁叶黄素和玉米黄质属同分异构体很难实现分离。本文在前人研究基础上，以h p l c 法对叶黄素进行准确定量分析，在确定工艺时以皂化后提取液中n | 黄素质量浓度为考察指标，避免了过去仅以浸提液吸光度对叶黄素定最造成的不准确性，并在普通工艺流程中引入皂化步骤，尽可能的提高叶黄素得率。同时利用高速逆流色谱这一国际国内领先的技术手段，对玉米蛋白粉中叶黄素的纯化方法进行了初探，使得以此为原料，制各高纯度的叶黄素，乃至叶黄素标准品成为可能。1 2 国内外相关研究现状1 2 1 国外相关研究现状从1 8 3 1 年首次分离类胡萝h 素到2 0 世纪5 0 年代，人们对类胡萝h 素的研究主要集中在p 一胡萝h 索上。1 9 6 7 年，v a l a d o n 和m u n m e r y 研究认为万寿菊花中单独存在的叶黄素和玉米黄质仪为1 0 ，主要的色素是环氧类胡萝h 素，而1 9 7 2 年，q u a c k e n b u s h 和m i l l e r 则认为分离出的几种色素中，8 8 9 2 是叶黄素和玉米黄质m 】。1 9 7 7 年，p h i l i p 开始了分离纯化叶黄素的研究，最终得到的产品是以叶黄素酯的形式存在，总叶黄素酯的质量分数为5 1 左右。随后，其他实验室相继分离出游离叶黄素，一般质量分数在7 0 左右 4 5 - 拍】。他们采取的方法都是用有机溶剂( 1 e己烷) 从万寿菊花瓣中萃取得到叶黄素酯，然后爿jk o h 溶液皂化后得到叶黄素粗品。1 9 8 8 年，意大利f a b i o 等人采用浓缩富集、离心分离和冷冻干燥等工艺，从苜蓿中分离得到了富含胡萝素和叶黄素的浓缩物，而后联用s g c 0 2 萃取技术，在不同条件r ，分别得到胡萝h 素和叶黄素。1 9 9 2 年，c r a f t 总结了叶黄素和b 胡萝h 素在1 8 种常见有机溶剂中的溶解性和稳定性mj ，为后人在选择溶剂和流动相提取分离叶黄素方面提供了宝贵经验。同年，台北f u j e n 大学的c h e n和y a n g 用a o a c 的方法测定了一些干植物原料和种子中的类胡萝h 素m 】。他们的试验发现提取和皂化过程中加氮气和抗氧化剂r 基羟基甲苯( b h t ) 可以使叶黄素得率从1 9 升至3 0 。当提取和皂化时间共为6 小时时，叶黄素得率上升2 3 ，而且冷皂化比热皂化效果好；1 ：l 的氧化镁和硅藻士比硅胶更适合作为柱层析分离叶黄素的固定相。h a r t 和s c o t t 【4 ”建立了从蔬菜和水果中提取类胡萝h 素的方法，并分析了数种英国常见的蔬菜水果以及一系列影响出峰的因素，他们发现在流动相中加了三乙胺后类胡萝h 素的得率从6 0 提高到了9 0 ，所采用的萃取剂四氢呋哺乙醇( 1 ：1 ) ( 体积比，下同) 日后被许多文献引用。1 9 9 7 年，p a r k 、f l o r e s 等人”以玉米蛋白粉为原料，比较了乙醇和丌尊作为提取溶剂时的效果，并试验了用豆粉中的脂酶水解蛋白质一色素复合物，得到结论是丁醇提取效果更好但是固形物损失更大。1 9 9 7 年，美国明尼苏达州的m u l a l i t a r y等人”改进了由玉米麸粉中回收叶黄素的方法，将较干的玉米麸粉用乙醇萃取，然后皂化使叶黄素酯转化为叶黄素。该法比当时的其他方法在产品的得率、效率和纯度等方面均优异。2 0 0 1 年，g r a n a d o 和o l m e d i l l a 等人0 4 改进了原有的皂化步骤，采用2 0 的k o h 进行皂化，正己烷二氯甲烷的混合物萃取粗提取液，大大减少了皂化时间和溶剂消耗。7中国农业大学硕士学位论文第一章绪论目前分析叶黄素的方法最常用的是r p i - p l c 。文献中已有1 7 种流动相系统和6 种不同颗粒尺寸和孔径的r p h p l c 柱来鉴定分析叶黄素9 。有学者认为c 3 0 柱的选择性优于c ，8 柱，建议用前者取代后者”o ”。m a r k u sd a c h d e r 、k o n r a dk o h l e r 等人o ”用c 3 0 反相柱，以丙酮水( 8 5 ：1 5 )从小牛血清蛋白中同时分离出叶黄素和玉米黄质及其酯共计9 种，证明了c 3 0 的柱子在分离类胡萝h 素方面确实优于c 1 8 0c u r t e m e n h i s e r 等人”“在c 3 0 上实现了叶黄素、玉米黄质、隐黄质、一胡萝h 素、b - 胡萝b 素和番茄红素及其顺反异构体共2 7 种类胡萝h 素的分离。也有入采_ jh p l c m s 和h p l c n m r 来分离植物中叶黄素和玉米黄质”w 。1 9 9 0 年，g r a n a d o 提出一种快速分离植物和血清中各种类胡萝h 素的方法，采用两种流动相体系，在2 5 分钟内可以分离叶黄素和玉米黄质o 。1 9 9 5 年，b r e m e n 等人用快速原子轰击质谱分析研究1 7 种不同类胡萝p 素，采用这种方法可以减少由于类胡萝h 素本身热不稳定而导致的降解和重排j 。1 9 9 7 年，y u a nj p 等改进了一种h p l c 方法并用它分析了绿藻中叶黄素，在此之前由于藻类色素的复杂性，走次色谱很难将其完全分开”j 。1 9 9 9 年，k w o kw a i l a m 采用正己烷萃取枸杞中类胡萝b 素，然后用硅色谱分离旧。同年，k u r i l i c h 等人研究一种同时分析玉米中类胡萝h 素和生育酚的h p l c 方法，运行时间少于2 2 分钟”。2 0 0 0 年，h u c k 研究一种新的流动相( 乙腈甲醇氯仿正庚烷) 分离包括玉米黄质和隐黄质在内的多种类胡萝b 素删。高速逆流色谱( h s c c c ) 是一种新的分离制备色谱技术，由于制各量大，分离能力强，近年来被广泛应用于生物科学、医药合化上行业。很多学者研究了利用h s c c c 分离纯化叶黄素，如香港大学的l i 和c h e n 等人利用h s c c c ，选择正己烷乙醇水( 4 ：3 ：1 ) 进行了小球藻中叶黄素的提取和纯化研究，一次性从2 0 0 m g 粗提取物中获得了纯度为9 8 的叶黄素嘲。r o b e r t a m a n 等人用分析型的h s c c c 研究了植物原料和日常膳食补充剂中叶黄素的分离纯化，当以正己烷乙醇水( 6 ：5 ：1 3 ) 时，从2 0 0 r a g 菠菜粗提取物中得到了纯度为9 3 的叶黄素，从甜玉米中用两次h s c c c得到9 5 的玉米黄质j 。1 2 2 国内相关研究现状我国对叶黄素的研究和生产起步较晚。2 0 世纪8 0 年代，最初由山东诸城莲春天然色素提纯有限公司引进美国的万寿菊花种子开始在山东等地种植，并引进墨西哥技术进行提取加t 生产叶黄素树脂o j 。2 0 世纪9 0 年代中期，一些外国公司在东北、华北、两北地区，投资种植万寿菊，近年在吉林、黑龙江、内蒙、山东、甘肃、四川等地种植已经超过万顷，产鲜花约1 5 万吨”。目前已有青岛赛特香料香精有限公司、青岛天然色素厂、青岛同鑫天然色素公司、邯郸中进天然色素有限公司等多个厂家生产叶黄索产品，主要品种有叶黄素树脂、叶黄素粉束( 深棕色) ，质量分数多在l 5 口】。2 0 0 2 年全国叶黄素产品产量达1 5 0 0 吨，超过当年全球产量的一半 5 , 2 9 j 。青岛大学天然产物研究所在叶黄素的产研结合工作上走在全国的前列，他们工业化生产h | | 黄素的工艺为：万寿菊鲜花一发酵一干燥一造粒一正己烷萃取一负压蒸发分离一叶黄素树脂o ，还y - 1 9 9 8年应用超临界二氧化碳流体萃取技术( s f e c 0 2 ) 以叶黄素树脂为原料精制高纯度叶黄素获得成功【“。国内关于不同来源的叶黄素提取和分析方法的主要结论如下：2 0 0 4 年，青岛大学天然色素研究所的杜 幸彩、滕大为等人制备了质量分数为9 8 的高纯度的叶黄素结晶，并对产品的稳定性进8中屋农业大学硬士学位论文第一章绪论行了试验研究”7 。2 0 0 2 年，江南大学的卢艳杰等人以玉米蛋白粉为原料，对玉米黄色素的最佳提取剂进行了筛选，首次采用中性蛋白酶水解玉米蛋白粉，结果表明，9 5 的乙醇对玉米黄色素的提取效果最好，而酶水解的最佳工艺条件为，底物浓度5 ，酶浓度1 2 ，温度3 5 。c ，水解时间6 h t ”】；2 0 0 3 年，卢艳杰等人比较了玉米黄色素的超临界c o ：和溶剂萃取_ 【艺的提取率，并再次对水解玉米蛋白粉的干燥方式及萃取条件进行了筛选和相应面分析。由于省掉了传统工艺中湿粉干燥的工序，直接对黄浆水板框过滤然后酶处理，使得玉米黄色素的提取率高达9 5 。3 9 。同年，他们用氧化镁薄层层析使玉米黄质和叶黄素得到较好分离”。国内其他学者认为使用四号溶剂油9 ，六号溶剂油或混合溶剂，如正己烷丙酮甲醇为8 ：1 ：1t 6 9 1 有更好的效果。华北上学院的李永祥等人”“研究了从蚕沙中提取粗品叶黄素的工艺，天津科技大学的杨丽飞、邓宇”研究了以茶叶为原料，六号溶剂油为介质，用微波法提取叶黄素的新工艺。通过改变溶剂浓度、微波功率和提取时间对产品提取率的影响进行探讨，获得了晟佳参数。新原料和新上艺的出现拓展了叶黄素来源，大大提高了提取效率。叶黄素定最方法的研究也有不少。广东农科院畜牧研究所的郭吉余等人在a o a c 颁布的柱层析结合分光光度计分析叶黄素方法上进行了改进，经过实践证明是一种简易可靠、重复性好的方法口2 1 。2 0 0 1 年杜桂彩等m 1 改进了h a g e nce t a ( 1 9 9 3 ) 和y u a njpe t a ( 1 9 9 7 ) 分析叶黄素所用的方法，确定了万寿菊中叶黄素的液相色谱测定方法，流动相为二氯甲烷甲醇乙腈水( 3 2 ：3 8 ：2 9 ：1 ) ，得到的叶黄素的保留时间为3 6 8 1 m i n ，叶黄素酯的保留时间分别为4 5 1 2 m i n 。中国农业大学的王强等人0 1 研究了牛奶中类胡萝h 素的h p l c 分析方法，采用i t - b o n d a p a k c l 8 色谱柱和乙腈二氯甲烷甲醇( 8 5 ：1 0 ：5 ) 为流动相，实现了a 胡萝h 素、p 胡萝b 素、t 胡萝h 素、叶黄索、番茄红素和斑蝥黄素的分离。韩蕾、宋曙辉”“研究了几种植物和蔬菜中叶黄素的h p l c定量方法，试验了不同的前处理方法，发现最佳测定方法为利用植物冻干样，以丙酮为溶剂提取，流动相为乙腈氯仿( 9 2 ：8 ) 。云南民族大学的张莉、董学畅等人”“研究了用固相萃取和h p l c 测定烟草样品中的叶黄素和b 一胡萝h 素，以w a t e r - n o v a p a k 色谱柱为固定相，甲醇异丙醇( 1 ：1 )为流动相洗脱，二极管阵列检测器检测。郑州人学的李艳杰、赵文恩等人”1 在v y d a e 2 0 1 t p 5 4 c 1 8色谱柱上对西瓜中的类胡萝h 素进行h p l c 了分析，比较两种不同流动相的检测结果，发现乙腈甲醇氯仿( 7 5 ：2 0 ：5 ) 效果更好，初步确定了西瓜中7 种以上的类胡萝h 素。中国农业大学的朱蕾1 7 ”研究了玉米黄色素的分离提取和四种类胡萝p 素的h p l c 测定方法，以石油醚丙酮( 1 ：1 )为溶剂，中性蛋白酶水解的方法获得了较高的玉米黄色素得率，h p l c 色谱条件为d i a m o n s i l 。”c 。柱，乙腈和乙酸乙酯梯度洗脱，使叶黄素、玉米黄质、番茄红素和b 胡萝h 素得到了较好分离。浙江大学的汪廷彩”进行了南瓜黄色素中叶黄素的提取和纯化试验研究，采用c 1 8 色谱柱和甲醇二氯甲烷乙腈水( 3 8 ：3 2 ：2 9 ：1 ) 为流动相，检测到叶黄素、* 胡萝h 素和b 一胡萝h 素。叶黄素纯化后得率为8 0 5 8 6 | 3 ，纯度为9 0 5 9 4 6 。虽然近年来我国叶黄素产量逐年上升，但大都为粗晶，主要用于动物饲料添加剂或粗品出口，游离态叶黄素含量一般在l o g ，l c g m l 。制取高纯度的叶黄素用于食品和医药，技术上还有一定难度。目前，仅有广卅范乐医药科技公司，采用罗氏公司叶黄素加丁“维视保”软胶囊，用于改善视力。张天佑教授是国内的较早利爿jh s c c c 分离纯化叶黄素的学者，2 0 0 3 年他运用分析型h s c c c 进9中国农业大学硕上学位论文第一章绪论行溶剂系统的选择，获得最佳的两相溶剂系统，用制备型h s c c c 从万寿菊花瓣粗提物中分离出叶黄素，采用的两相为正庚烷氯仿乙腈( 1 0 ：3 ：7 ) ，经h p l c 分析叶黄素( 1 u t e i n ) 纯度 9 8 5 【帅】。叶黄素应用研究尚未引起食品业及保健品行业足够重视，叶黄素作为一种功能网子，必定成为今后研究和应用的重点、热点，开发前景将十分光明。1 3 本课题主要研究内容与研究思路针对目前国内外同类研究的现状，本课题拟以玉米蛋白粉为研究对象从以下三个方面进行研究：1 叶黄素的定量方法研究及比较找出一种适用于本实验室色谱设各的h p l c 分析方法，实现叶黄素和其他色素成分的基本分离；分别用分光光度计法和h p l c 法制作叶黄素标准曲线，并以此对样品中叶黄素质量浓度进行定量分析，分j 0 考察两种方法的准确性。2 玉米蛋白粉中叶黄素提取及皂化工艺参数的研究( 1 ) 确定合适的提取溶剂和提取次数。( 2 ) 用单因素试验考察不同的提取条件( 包括质量浓度、提取时间、提取温度) 对叶黄素质量浓度的影响，选取结果较优的试验水平进行三因素三水平正交试验。( 3 ) 用单因素试验考察不同皂化条件( 包括皂化时间、皂化温度、碱浓度) 对叶黄素质虽浓度的影响，选取较优的试验水平进行三因素三水平正交试验，优化工艺参数。3 高速逆流色谱纯化叶黄素的试验研究( 1 ) 利用h p l c 确定较优的溶剂系统。( 2 ) 对高速逆流色谱的结果进行分析测定，确定该方法的可行性。本论文的研究思路框图如图1 _ 4 所示。1 0中国农业大学硕士学位论文第一章绪论i -囱1 - 4 课题的研究思路框图f i g 1 4f l o wc h a r to fr e s e a r c h中国农业大学硕士学位论文第二章玉米蛋白粉中叶黄素的定量方法研究第二章玉米蛋白粉中叶黄素的定量方法研究摘要：为了找出适合于玉米蛋白粉中叶黄素的h p l c 定量方法，检验分光光度法对叶黄索定量的可靠性，进行r 色谱条件筛选、标准曲线制各和叶黄素定量的试验研究