（应用化学专业论文）近红外菁染料荧光探针的合成与性能研究.pdf

摘要 摘要 菁染料由于其独特的性能，已成为高新技术领域中非常重要的一类有 机功能分子。本文综述了菁染料在各个领域中的研究进展，尤其是作为荧 光探针的应用，并阐述了菁染料荧光探针的作用原理、分子结构特征、性 能等，同时总结概括了相关分子的量子化学计算方法。 本文以2 ，3 ，3 三甲基3 县吲哚啉5 磺酸钾盐为原料，首先合成了中间体 n 对羧基苄基2 ，3 ，3 三甲基3 肛吲哚啉5 磺酸钾，然后由中间体与不同的缩 合剂合成得到了新型菁染料三甲川3 肛吲哚菁染料( c y 3 ) 、七甲川3 社吲哚 菁染料( c y 7 ) 以及含氯六元桥环七甲川吲哚菁染料( c y 7 3 3 ) ；以c 1 8 反相 色谱柱对上述产品进行了分离提纯，并通过1 玎婚缸i 、e s i m s 对其结构进 行确认；设计了新的合成方法“分步法”，并以该方法合成染料c y 7 与弘 环糊精包合物，初步探讨了其工艺条件，高效液相色谱分析结果表明，在 所设定的分离条件下菁染料与环糊精包合物的保留时间为1 2 1 9 7r a i n 。 将菁染料c y 3 应用于d n a 电泳中，其实验结果初步表明：荧光检测效 果优于目前使用的毒性较大的溴乙锭。 紫外一可见光光谱分析结果表明，c y 3 、c y 7 3 3 、c y 7 的最大吸收波长分 别为5 4 5n l n 、7 7 3n l n 、7 3 9 咖；荧光光谱分析表明，其最大荧光发射波长 为5 6 4n i n 、7 9 4n m 、7 9 6n n l 。与在水溶液中相比，染料在“b 环糊精水溶 液、a 1 3 + 、z n 2 + 、s n 2 + 水溶液、耐b 环糊精的阳离子( a 1 3 + 、z n 2 + 、s n 2 + ) 水 溶液中的荧光强度增大。 光学显微镜观察结果表明，染料及其环糊精包合物的晶形主要为针状 或多边形。 在p e n t i u m1 v 计算机上应用量化软件包g a u s s i a n0 3 的密度泛函理论 ( d f t ) 在b 3 l y p 6 3 1 g * 水平下，计算得出c y 3 分子各种键的键长、键角 及二面角等空间结构数据及热力学参数、振动频率、分子轨道、静电势、 红外光谱、拉曼光谱等数据；并通过可视化软件o a u s s i v e 、h y p y c h e m 、 c h e r a 3 d 进行初步的模拟和分析，为进一步研究和预测c y 7 等同类染料的 燕山大学工学硕士学位论文 分子构型和性质奠定了基础。 关键词荧光探针；菁染料；环糊精包合物；阳离子溶液；密度泛函； 高斯0 3 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ec y a n i n ed y e sh a v eb e e nt h ei m p o r t a n tf u n c t i o n a lm o l e c u l e si nh i g h t e c h n i q u eb e c a u s e o ft l l e i r g o o dp r o p e r t i e s t h i sp a p e rs u m m a r i z e dt h e i r d e v e l o p m e n ti nv a r i o u sf i e l d s ，e s p e c i a l l yi nf l u o r e s c e n c el a b e l i n gt e c h n i q u e ，a n d s 咖em e t h o d sf o rc a l c u l a t i n gm o l e c u l ec o n f i g u r a t i o n t h i sp a p e rs y n t h e s i z e dt h en o v e lt r i m e t h i n ec y a n i n e ( c y 3 ) a n dh e p t m e t h i n e c y a n i n e ( c y 7 ) f r o mt h ei n t e r m e d i a t e0 n - p - c a r b o x y b e n z y l - 2 ，3 ，3 - t r i m e t h y l 一3 h - i n d o l e n i n i u m - 5 - s u l f o n a t e ) w h i c h w a s p r e p a r e d f r o m 2 ，3 ，3 - t r i m e t h y l 一3 - - i n d o l e n i n i u m - 5 - s u l f o n a t e ；t h ed y ep r o d u c t sw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e db yc 1 s c h r o m a t o g r a mc o l u m n , a n dc o n f i r m e db y1 h n m ra n de s i - m s t h i sp a p e rh a s d e s i g n e dan e wm e t h o d ，c a l l e d s e p a r a t e do p e r a t i o nm e t h o d ，t os y n t h e s i z et h e c y 7a n di t si n c l u s i o nc y c l o d e x t r i n ；t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h er e t e n t i o nt i m e o ft h ei n c l u s i o nw a s1 2 1 9 7m i l lu n d e rt h es e p a r a t i o nc o n d i t i o nb y h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y r e p l a c i n gt h en o x i o u se t h i d i u mb r o m i d eb yc y 3i nd n ae l e e t r o p h o r e s i s a n a l y s i s ，t h er e s u l to f d e t e c t i v ee f f e c ts h o w e dt h a tc y 3w a sb e t t e r u vs p e c t r u ms h o w e dt h a tt h em a x i n l u n la b s o r p t i o nw a v e l e n g t h so fc y 3 ， c y 7 3 3 ，a n dc y 7 w e r e5 4 5n m , 7 7 3n n la n d7 3 91 1 1 1 1s e p a r a t e l y ；t h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r u ms h o w e dt h a te m i s s i o nw a v e l e n g t ho ft h e mw e r e5 6 4n m 7 9 4 n n la n d 7 9 6r t m ；c o m p a r e dw i t ht h o s ei na q u e o u ss o l u t i o n s ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e u s i t ) ，o f t h ee y a n i n e si nt b e 邮c y c l o d e x t r i n , a 1 3 + ，z n 2 + ，s n 2 + o rt h e 邮c y c l o d e x t r i ni n t h ea q u e o u ss o l u t i o n so f c a t i o n sb e c a m e s t r o n g e r t h ec r y s t a l s h a p e s o ft h e e y a n i n e sa n dt h e i rc y c l o d c x t r i ni n c l u s i o n s d e t e c t e db ym i c r o s c o p e ，w e r em o s t l ya c i c u l a ro rp o l y g o n o np e n t i u mi v c o m p u t e r , t h eo p t i m i z e dg e o m e t r i c a ls t r u c t u r eo fc y 3 ( b o n d l e n g t h s ，b o n da n g l e sa n dd i h e d r a la n g l e s ) ，a n di t ss o m et h e r m a lp a r a m e t e r s ， e l e c t r o s t a t i cp o t e n t i a l ，r a m a ns p e c t r u m , m o l e c u l a ro r b i t s ，v i b r a t i o nf r e q u e n c y , i 燕山大学工学硕士学位论文 i n f r a r e ds p e c t r u mw e r eo b t a i n e da tl e v e lo fb 3 l y p 6 3 1 g + b yd f tm e t h o do f g a u s s i a n0 3 ，a n dt h er e s u l t sw e r ea n a l y s i z e db yv i s u a ls o f t w a r e ，g a u s s i v e ， h y p y c h e m ，c h e m 3 da n ds oo n t h er e s u l t sh a v eb e e nt h ef o u n d a t i o no f f u r t h e r r e s e a r c hf o rt h i st y p eo f c y a n i n e s k e y w o r df l u o r e s c e n c ep r o b e ；c y a n i n e ；c y c l o d e x t r i ni n c l u s i o n ；c a t i o n s o l u t i o n s ；d f t ；g a u s s i a n 0 3 i v 燕山大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：此处所提交的硕士学位论文近红外菁染 料荧光探针的合成与性能研究，是本人在导师指导下，在燕山大 学攻读硕士学位期间独立进行研究工作所取得的成果。据本人所 知，论文中除已注明部分外不包含他人已发表或撰写过的研究成 果。对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式注明。本声明的法律结果将完全由本人承担。 作者签字 互娃。专、 日期：朋占年，z 月伊日 燕山大学硕士学位论文使用授权书 近红外菁染料荧光探针的合成与性能研究系本人在燕山 大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的硕士学位论文。本论 文的研究成果归燕山大学所有，本人如需发表将署名燕山大学为 第一完成单位及相关人员。本人完全了解燕山大学关于保存、使 用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门送交论文的复印 件和电子版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权燕山大学，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文，可以公布论文的全 部或部分内容。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密回。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：为铿点 导师签名：互苏匆l 日期：伊年t 2 - ) jf 笋日 日期：布年- 乡月j 日 第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 目前，人们对生命现象的观察和研究已经深入到纳米尺度和单细胞、 单分子水平，如何在这样一个尺度范围内获取有用的生物化学信息对分析 化学的各个研究领域均提出了新的要求。单分子、单细胞检测、生物芯片 的开发以及纳米技术的应用逐渐成为目前现代分析化学研究的主流领域之 一【“。可进行实时、在线、原位、活体检测的分子探针技术成为人们研究的 热点。 在各种分子探针的研究中，荧光型分子探针由于背景较低、检测灵敏 度高而成为生物分子识别领域研究的重点【2 】。荧光探针技术也叫光化学探针 技术，几十年来，随着光化学和光物理的研究与发展及荧光探测技术水平 的提高，荧光探针技术得以迅速发展，并广泛应用于各个领域1 3 1 。 1 2 荧光及荧光探针技术 1 2 1 物质的荧光及其影响因素 1 2 1 1 荧光产生的原理荧光是自然界中的一种发光现象。它是在物质吸收 光以后，发射的一种特征光谱。不同物质的分子具有不同的化学结构，因 而具有不同的电子能级，吸收和发射光的能力也不同。在室温时物质的大 多数分子均处于基态的最低振动能级，当被光线照射时，该物质的分子吸 收了和它们所具有的特征频率相一致的光线，由原来的能级跃迁至第一电 子激发态或第二电子激发态中各个不同振动能级和转动能级。由第一电子 激发态的最低振动能级回落至基态的各个不同振动能级时，若以光的形式 释放能量，则所发出的光即是荧光，如图1 1 中所示，在这一过程中，若它 们和同类分子或其它分子撞击而消耗了相当于这些能级之间的能量，则不 发荧光。 物质吸收的能量被消耗，发射出的荧光能量要比吸收光能量小，因此， 燕山大学工学硕士学位论文 荧光的特征波长比吸收光的特征波长要长。由于在吸收光时，分子可由基 态跃迁至几个不同的电子激发态，而发射荧光时，仅由第一电子激发态的 最低振动能级回落至基态，所以荧光光谱通常呈现一个荧光带，与吸收光 谱根据不同的激发能有多个吸收带不同。根据不同的激发源，可将荧光分 为不同的类型，如由高速电子束激发后发射的称为电子荧光；由x 射线激 发而产生的称为x 荧光；由化学或电化学反应引起的称为化学或电化学荧 光。 i - 嗳收：f 荧光 n 光 k 内转化；h m 体系阃肤， v r 振动杜弛 图1 - 1 荧光产生的过程 f i g 1 1f l u o t e s e m e f o r m a t i o n o f s u b s t m m 荧光强度、荧光量子产率、荧光寿命和斯托克斯位移是描述荧光的重 要参数。 1 2 1 2 物质荧光的影响因素物质产生荧光的首要条件是该物质的分子中 必须具有吸收特征频率光能的基团，此时分子中应具有与照射光能量相同 的电子能级跃迁。其次，该物质应具有一定的量子产率和适宜的环境，如 温度、p h 值、所用溶液状态等。目前，已知的大量有机物和无机物中，仅 有小部分会发生强荧光，其激发光谱、发射光谱和荧光强度都与它们有密 切关系 a , s l 。 从物质的结构出发，强荧光物质应有如下特征： ( 1 ) 大的兀键共轭结构共轭体系分子能产生荧光。分子体系中兀电 子的共轭程度越大，非定域兀电子越易被激发，荧光就越容易产生，因此 第1 章绪论 能产生荧光的物质大多数含有芳环或杂环。 ( 2 ) 刚性平面结构具有强荧光的有机物质，大多数分子为刚性平面 结构，刚性及共平面性越大，其有效的兀电子离域性越高，则荧光越强。 立体异构现象也影响着有机化合物的荧光性质，如顺式和反式同分异构体 常具有不同的荧光性质。 ( 3 ) 取代基团为给电子取代基取代基性质( 尤其是发色基团) 对荧 光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。综合各个方面的因素，取代基大 致分为三类：第一类使荧光增强的基团，如：- o h 、- n h 2 、- n h r 、- n r 2 、 c n 、o c h 3 等；第二类使荧光减弱的基团，如：- c o o h 、一c = o ，- n 0 2 、 - n o 、f 、- c i 、b r 等；第三类影响不明显的基团，如：s 0 3 、o n h 3 + 等。 物质的结构影响着物质的荧光特性，但荧光的发射需要一个外部环境， 影响荧光产生的环境因素主要有以下几个方面： ( 1 ) 温度的影响温度对于溶液的荧光强度有显著的影响。一般荧光 物质的溶液随着温度的降低而荧光效率升高，荧光强度增大。而当温度上 升时荧光强度下降，其主要原因是分子内部能量的转换作用随温度升高而 加快，同时激发分子和溶剂分子之间发生某些可逆的光化学反应，这也是 荧光强度下降的原因之一。当溶液中有淬灭剂存在时，温度对于荧光强度 的影响将更为复杂。 ( 2 ) 溶剂的影响不同的溶剂会使物质的荧光谱带位置( 有时还有强 度) 发生改变。随着溶剂极性的增加，向波长较短方向( 或向蓝) 位移， 通常称为负向溶剂化显色；相应的向波长较长方向( 或向红) 位移称为正 向溶剂化显色。溶剂的极性改变对最大吸收位置产生的影响，主要是由于 溶剂的极性改变时，基态和激发态溶质分子的溶剂化能产生差异。即溶剂 对溶质分子基态和激发态的稳定化作用不同引起的。有些特殊的极性化合 物，受溶剂的影响很大。对于不具非键电子的共振耳体系，同样具有极性 激发态。因此，在极性愈强的溶剂中由偶极一偶极作用引起的溶剂化作用也 会导致激发态的稳定化作用加强，从而降低删c 跃迁的能差，使红移增强。 溶剂所产生的拉曼光，其波长常和溶液中荧光体所产生的荧光的波长靠近， 其强度常不及荧光强度的千分之一，但由于荧光谱带具有一定的波峰，而 燕山大学工学硕士学位论文 拉曼光的波长却随激发光的波长而变，因此，拉曼光对荧光分析的干扰应 予以注意。 ( 3 ) 氢键的影响溶剂也常通过氢键来影响物质的荧光。不同溶剂形 成氢键的能力为：水 甲醇 乙醇 氯仿 己烷。荧光物质与溶剂或其它溶质 分子之间发生氢键有两种情况：一是在激发之前，即荧光物质处在基态时 与溶剂或其它溶质分子形成的氢键；二是在激发之后，即荧光物质处在激 发态时与溶剂或其它溶质分子形成的氢键。显然，第一种情况下产生的氢 键将对物质的吸收光谱和荧光光谱都产生影响，而后一种情况只对物质的 荧光光谱产生作用。溶剂的氢键供体或受体能力及溶剂的极性都将影响到 荧光物质的实际光谱移动。 ( 4 ) p h 值的影响未解离的( 弱酸或弱碱) 分子和它们的离子常呈现 出不同的荧光性质。若分子中的酸性和碱性基团属于生色团的部分，或直 接连在生色团上，那么溶液中的p h 值的改变，会引起绝大多数含有这些基 团的化合物的基态和激发态的酸碱性或解离形态的变化，因此，荧光光谱 也不同。 此外，溶液的浓度对荧光强度也有影响。在较低范围内，荧光强度随 浓度的增大而增大。达到一定值后，增加浓度，荧光强度反而降低了，直 至荧光完全猝灭( 大约浓度为1g l ) 。溶液中的表面活性剂，溶剂性质等 因素，也对荧光有着不同程度的影响。 1 2 1 3 荧光猝灭广义地说，荧光猝灭是指任何可使某种给定荧光物质的荧 光强度下降的作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的 作用，或任何可使荧光量子产率降低的作用。狭义地说，荧光猝灭是指荧 光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理 或化学过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质， 称为荧光猝灭剂。猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光分 子激发态寿命的过程。 猝灭剂的存在，可使待测物质的荧光强度显著降低甚至完全猝灭，这 对荧光分析有严重影响。但另一方面，也可以利用某种物质对一荧光物质 的荧光猝灭作用，建立对该猝灭剂的荧光测定方法。一般来说，荧光猝灭 4 第1 章绪论 法比直接荧光测定法更为灵敏，并具有更高的选择性。分子氧是猝灭剂之 一，它几乎能引起所有的荧光物质产生不同程度的荧光猝灭。因此，在没 有驱除溶液中溶解氧的情况下进行的荧光测定，通常会降低测定的灵敏度。 根据猝灭的原因，可将猝灭分为：碰撞猝灭、组成化合物的猝灭、电 荷转移猝灭、能量转移猝灭、光化学反应猝灭、自猝灭、转入三重态的猝 灭及氧的猝灭等。 1 2 2 生物荧光探针技术及其应用 1 2 2 1 荧光探针荧光标示是指用一种或几种荧光试剂通过物理作用或化学 作用与待测组分结合，使待测组分转化为能发荧光的衍生物，通过对荧光 检测，从而获得被测化合物定性或定量信息的检测方法。所用的试剂称为 荧光标示试剂( f l u o r e s c e n tl a b e l i n gr e a g e n t ) 或荧光探针( f l u o r e s c e n t p r o b e ) 。 1 2 2 2 荧光探针技术原理利用物质的荧光特性进行定性、定量分析的方法 称为荧光分析法，其优点是灵敏度高、选择性好、用样量少等，特别是其 灵敏度，比吸光光度法高出2 - 4 个数量级，因此，它常被用来作为微量和痕 量物质分析的工具。由于大多数物质的荧光量子产率很低，或者根本就不 发荧光，如某些氨基酸、蛋白质、抗体、酶及药物等，不能采用荧光直接 对它们进行分析检测，可采用间接分析法，即荧光探针技术。 与放射性比，荧光的优点是快速得到结果( 小于或等于毫秒) 。另外， 荧光探针在不同条件下能发出不同波长、不同强度的荧光，可以用于测量被 标记的配体是否穿过细胞，也可用来检测细胞内部的流动性，分子进出细 胞等，这是放射标记所不能达到的。 荧光探针技术由于具有灵敏度高、选择性好等优点已成为当前生物分析 的重要手段之一，被广泛应用于d n a 测序、流式细胞测量、荧光免疫分析、 肿瘤细胞的早期诊断与治疗、导向药物研究等生命科学前沿领域。 1 2 2 3 荧光探针方法的分类按荧光标示试剂与被测组分的结合方式可将荧光 标示技术分为两大类：共价键合荧光标示和非共价键合荧光标示 6 4 1 。 ( 1 ) 非共价键合荧光标示( n o n - c o v a l e n tf l u o r e s c e n tl a b e l i n g ) 5 燕山大学工学硕士学位论文 非共价键合荧光标示通常是指荧光标示试剂与被标示分子通过物理作 用方式相结合的标示方法，如核酸探针与d n a 的嵌入作用、某些蛋白质探 针与蛋白质分子的择形镶嵌等。可用于在双链d n a 片断的电泳显色和毛细 管电泳点阵基因排布技术( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i sg e n o t y p i n g ) ，将 d n a 嵌入染料直接与d n a 片断复合。由于嵌入只需简单地将染液与d n a 样 品混合，而得到稳定的多位点标记的产物，这是共价键合标记法难以比拟 的。但这类标示一般只能用于定性检测或粗略定量，常用于核酸与蛋白质 等大分子的检测、免疫荧光分析等，较少应用于小分子的分析。 ( 2 ) 共价键合荧光防示( c o v a l e n tf l u o r e s c e n tl a b e l i n g ) 共价键合荧光标示是指荧光标示试剂与被标示分子通过共价化学键的 方式相结合的标示方法。通过化学反应而实现共价标记的，标示反应的发 生是因为荧光标示试剂和被标示的生物物质中含有彼此可共价反应的活性 基团，常见的反应活性基团有- n h 2 、o h 、s h 、- c o o h 和- n c s 等。活性 基团也可在无活性基团分子中引入，如在核苷酸和寡聚核苷酸的合成中引 入氨基等。根据所含反应基团及基团所在位置的不同，可有多种荧光标记 反应方式。该法具有很高的反应专一性、可重复性，易于定量检测。 1 2 2 4 生物荧光探针应满足的条件荧光探针是通过模拟天然化合物在分子 和细胞水平上“探测”结构和过程的荧光化合物，主要是用于观察位置和 进行定量测量。荧光探针也被用于电子学、聚合物化学、医学、法医学和 其它各种领域。荧光标记直接结合在配体上，而配体又直接、专一地结合 受体上，并且在测量前组织或细胞不去除，因此，可以直接用来测量配体一 受体的相互作用。通过测量一个或数个特定波长的荧光、比较强度和浓度 的变化，就能达到定量的目的。 总之，不同的应用对象，有着不同的标示要求，在生物领域中应用的荧光 标示剂，不仅在结构上应具有产生荧光的必要条件，而且还应具备一定的 外部环境。作为荧光标示剂应满足阳l o 】： ( 1 ) 摩尔消光系数大； ( 2 ) 良好的荧光性能，与被标示生物基质结合后荧光特性不减弱； ( 3 ) 可与被标示物通过物理或化学作用结合，未结合的标示剂及其降 6 第1 章绪论 解产物易于清除或分离： ( 4 ) 荧光与背景对比明显，以避开杂质光的干扰，提高检测灵敏度， 一般发射波长应在3 6 0a m 以上； ( 5 ) 标示反应条件温和，确保被标示物基质原有化学性质不被破坏； ( 6 ) 易于合成、保存，无毒。 1 2 2 5 生物荧光探针技术的应用进展生物荧光探针技术的引入，使荧光分 析法在各类脂肪族化合物、芳香族化合物、维生素、氨基酸、多肽、蛋白 质、核酸、生物碱、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等的测定中得到 了重要应用，尤其是在生物分析领域，荧光标示技术已成为免疫学、组织 化学和细胞生物学等方面有力的研究工具，并且应用范围越来越广。 ( 1 ) d n a 自动测序d n a 是生物体最基本的遗传物质，包含了生物体 最丰富的信息。d n a 的氧化损伤在衰老、慢性发炎、局部缺血、癌症、自 身免疫疾病、转录活化、h i v 表达等生命现象中起重要作用。许多已得到 广泛应用的抗癌药物、抗生素药物的作用靶标几乎都是核酸，其作用机制 大都涉及与d n a 的相互作用。d n a 序列的分析检测是研究生物遗传物质 结构和功能相互关系的重要手段，在生物、医药、农业等前沿领域有着越 来越重要的作用。自八十年代中期开始出现的荧光染料标记d n a 探针的荧 光标记法以其分辨率高、灵敏度好、结果清晰准确、操作简便安全等优点 在d n a 测序技术中得到充分的应用和迅速发展，是d n a 测序中的一大进 步，正在逐步取代传统的放射性同位素法。 ( 2 ) 生物分子的检测荧光标示技术可用于生物分子包括氨基酸、多肽、 蛋白质和核酸等的分析与检测。蛋白质的天然荧光主要来自三种芳香氨基 酸，其荧光强度和荧光波长限制了直接测定的灵敏度，使采用荧光探针进 行标示测定成为重要的研究方法。荧光标示剂与蛋白质相结合，形成可检 测的抗体、抗生素；与d n a 、r n a 结合，有序列识别作用；利用荧光标示 剂对生物微环境的敏感性，可用作p h 指示剂，也可以显示细胞的形态；荧 光化合物作为探针还可以检测细胞膜、细胞器等。 ( 3 ) 荧光免疫分析用荧光技术来研究配体一蛋白质相互作用行为是近 年来较为普遍的方法，如用荧光标示的基质和抗原检测基质一酶和抗体抗 7 燕山大学工学硕士学位论文 原的相互作用等。传统的免疫检测一直被认为是分析复杂媒体中微量成分 的强有力工具。在免疫检测分析中，抗体( a b ) 和抗原( a g ) 之间发生反 应得到a b - a g 复合物，并通过第二个a b 引入标示剂 1 1 , 1 2 】，早期使用最多 的是酶连接的免疫吸附法( e l i s a ) 。引入的标示剂是以一种酶的形式存在， 是间接地通过测定标示酶的活性，以发色基质的光吸收来进行检测。由于 荧光光谱分析法与紫外和可见吸收法相比，灵敏度要高2 - 3 个数量级，因 此，荧光标示法在免疫分析中得到了广泛应用。 1 3 菁染料荧光探针结构与性能 1 3 1 菁染料的结构及特点 荧光菁染料是一类非常重要的有机功能染料，具有摩尔吸收系数高， 光谱范围广，荧光量子产率较高等特性。一般的荧光菁染料都包含两个n 中心，其中一个显示正电荷，其通过一条有着奇数碳原子的共轭链与另一 个n 原子相连，这一显著特征被表述为“推拉”烯烃，这也构成了最基本 的发色基团一聚亚甲基菁，以聚亚甲基单元所带的电荷为基础，菁染料可以 分为：菁染料( 又称花菁染料或多次甲基染料) 、半菁染料( 又称苯乙烯菁 染料) 、份菁染料、苯乙烯型染料1 1 3 】。 一一# 、形2 一h 一宁明一， 一 f i g 1 - 2 t h es t f l g t l , l r o f c y a n i n e d y e s 其中；y ，y 钵。s c ，o ，n 等；z ，z 吣 c - c = c + 1 2 - 1 2 硎r ( p ) ( 1 - 1 ) 式( 1 - 1 ) 中v 是核排斥能，尸是密度矩阵， 是单电子能量( 动能 加势能) ，i 2 是电子的经典库仑排斥能，1 2 删r ( p ) 是由于 电子的量子性质产生的交换能。 在密度泛函理论中，把h f 总能量( e l - i v ) 中仅对具有准确交换项作为 单一限制的表达，用更具有普遍性的交换一相关泛函来代替。交换一相关泛 函同时包括交换能和在h f 理论中被略去的电子相关能。其总能量具有如下 表示形式： e d f = n 嘲胗+ l 2 + 酞旧“c 【尸】 ( 1 - 2 ) 式( 1 - 2 ) 中三k 【明是交换泛函，& 【p 是相关泛函。 在i - i f 理论中取【p 】= - 1 2 且艮 用= o ，故i - i f 理论可视为d f t 的特例。当然前者以波函数、后者以电子密度来表征体系的状态、进而求 得体系的能量和其它性质，这是基本的相异处。对e k 【p 】和风旷】的不同选 择构成用于实际计算的不同d f t 方法。 1 5 1 3 半经验( s e m i - e m p i r i c a l ) 方法半经验方法是在求解h f 方程中省略 了一些分子积分计算( 以经验参量替代之) ，并引进一些假设的价电子的近 似方法。现在较为流行的是a m l 和p m 3 方法。a m l 方法由d e w a r 仓l j 建，p m 3 方法是d e w a r 的学生s t e w a r t 提出的。他们都是在p o l p e 的半经验零微分重叠 ( 如c n d o 、i n d o 和m n d o ) 近似方法基础上进一步发展起来的。 但a m l 、p m 3 方法与p o l p e 的近似方法的根本不同在于它们的出发点 不同。p o l p e 参量化的目标是使半经验计算结果接近从头算结果；而d e w a r 1 9 燕山大学工学硕士学位论文 的近似方法( m 酣d 0 一m n i ) 0 一a ) 的参量化目标则是( 在分子几何、 生成热等方面) 超过从头算，即比从头算结果更符合实验事实。s t e w a r t 则 是企图通过重新参量化，使p m 3 方法比a m l 方法更能重现实验结果( 如 分子几何、偶极矩和生成热等) 。半经验m o 方法在比较系列计算结果、寻 求结构与性能递变规律性方面，仍然具有重要价值并被广泛使用。 1 5 2 量子化学计算软件 量子化学对分子结构与性质的解释与预测是任何其它工具所不能替代 的。但对大部分的化学工作者来说，不可能，也没有必要去弄清楚量子化 学计算的每一个细节，我们关心的只是其结果。与分子结构和性质的计算 有关的程序逐渐成为化学研究中一个必不可少的工具。 ( 1 ) w i n m o p a c 为著名的半经验分子轨道( a m l 、p m 3 、m n d o 、 m n d 0 3 等) 计算程序m o p a c 的商业版本，同共享版相比，界面更友好， 方法更多。计算出的分子轨道及电荷密度等可以用三维图形表示出来。 ( 2 ) p cs p a r t a n 为w a v e f u n e f i o n 公司的产品，分为标准版、p l u s 版及 p r o 版，功能依次增加，其计算方法包括：m m 2 、a m l 、a m lw i t hs o l v e n t 、 p m 3 、从头计算等，亦可将分子轨道及电荷密度等用三维图形表示。 ( 3 ) h y p e r c h e m 等功能比p cs p a r t a n 更强，包括常用的几乎所有分子 力学及半经验分子轨道方法及多种基集的从头计算等，并能计算振动光谱、 电子光谱、分子动态学等，所得结果可以非常漂亮的三维图形表示出来。 ( 4 ) g a r n e s s 为一免费的从头计算程序，其速度快，并提供源程序。 但其界面为d o s 界面，必须用手工输入分子结构及计算相关的命令，比较 繁琐另外，有一个专门为g a m e s s 设计的用户界面v i s u a l i z e ，使得结构与命 令的输入更简单，计算的结果可以三维图形方式表现出来。 ( 5 ) t i t a n 为设计p cs p a r t a n 的w a v e f u n c t i o n 公司与设计j a g u a r 的 s c h r o d i n g e r 公司合作的结晶，该产品支持半经验方法、从头计算法及密度 泛函计算，用户界面友好，但功能相对较薄弱。 ( 6 ) j a g u a r 为s c h r o d i n g e r 公司给使用工作站( 如s g i 、h p 、d e c ) 及l i n u x 操作系统的p c 所设计的从头计算及密度泛函计算程序，其速度 2 0 第1 章绪论 特快，用户界面一般。 ( 7 ) m a t e r i a l ss t u d i o 是专门为材料科学领域研究者开发的一款可运行 在p c 上的模拟软件。它使化学及材料科学的研究者们能更方便地建立三维 结构模型，并对各种晶体、无定型以及高分子材料的性质及相关过程进行 深入的研究。m a t e r i a l ss t u d i o 软件采用灵活的c l i e n t s e r v e r 结构，其核心模 块v i s u a l i z e r 运行于客户端p c ，支持的操作系统包括w i n d o w s9 8 、2 0 0 0 、 n t ；计算模块( 如d i s c o v e r ，a m o r p h o u s ，e q u i l i b r i a ，d m o l 3 ，c a s t e p 等) 运行于服务器端，支持的系统包括w i n d o w s2 0 0 0 、n t 、s g i i r i x 以及 r e dh a tl i n u x 。浮动许可( f l o a t i n gl i c e n s e ) 机制允许用户将计算作业提交 到网络上的任何一台服务器上，并将结果返回到客户端进行分析，从而最 大限度地利用了网络资源。m a t e r i a l ss t u d i o 软件模拟的内容包括了催化剂、 聚合物、固体及表面、晶体与衍射、化学反应等材料和化学研究领域的主 要课题。 ( 8 ) g a u s s i a n 在量子化学界非常有名，支持常用半经验方法、从头计 算法及密度泛函理论。在有机大分子计算过程中其运算机理、运算效率 以及输入文件的界面灵活性等方面，远远优于m a t e r i a l ss t u d i o 等类似软件， 本论文采用该软件进行量子计算。 1 6 论文研究内容与意义 菁染料以其摩尔吸光系数高、光谱范围广、荧光量子产率较高等有特 点，被人们广泛应用于光敏剂和无机大带隙半导体材料 3 9 - 4 9 1 、光盘存储材 料 4 9 - 5 1 1 、工业上吸收太阳能的油漆1 5 2 1 、激光材料 s 3 , s 4 l 、光折射材料【5 5 1 和抗 癌刘5 6 1 。其中，菁染料在生物大分子标记中的应用发展极为迅速。它作为 生物荧光探针染料 s y , s s 在科研、商业以及临床等方面也得到了极为广泛的 应用。 近红外七甲川菁染料具有许多突出的优点，但对光、热不太稳定。七 甲川菁染料应用领域的不断拓展，尤其是生命科学的发展对检测的灵敏度 有了更高要求，特别是作为荧光探针在生物分析领域的应用，因此，研究 燕山大学工学硕士学位论文 开发新型的七甲川菁染料成为当务之急。 环糊精分子具有与许多客体化合物形成包合物的能力，使被包合的物 质对光、热、氧化剂的稳定性得到增强，并使染料在水溶液中的溶解度和 吸光度增大。本论文拟设计合成新型菁染料c y 3 、c y 7 ，并探索其环糊精包 合物的合成工艺。 科学技术的进步，使精细化学品研究取得了长足进步，但对微观分子 的认识仍然受到现有科学仪器发展的限制。计算机的发展使量子化学计算 和模拟，发展成为化学与检测分析工程有力的研究工具。长期以来，各类 精细化学品的开发是根据经验，进行大量的实际操作来进行合成和筛选， 因此，效率低下，并且耗费大量物力、财力。大量的化学软件及程序包的 研发与应用，使量子化学计算、分子模拟技术成为化学品开发与研制非常 有效的辅助手段。本论文拟运用量子化学计算、分子模型的方法从理论上 预测线性菁染料的空间构型，模拟出它与其它分子的作用过程，从而对菁 染料及其材料或中间体的设计、合成方法、性能分析与评价奠定基础。 论文的主要内容为： ( 1 ) 染料中间体、缩合剂的合成； ( 2 ) 染料c y 3 、c y 7 3 3 、线性c y 7 的合成； ( 3 ) 线性染料c y 7 及其环糊精包合物的合成； ( 4 ) 采用柱色谱法对合成的产品进行分离与提纯； ( 5 ) 利用高效液相色谱仪，对产品进行分离与检测； ( 6 ) 通过紫外荧光光谱仪检测和分析产品光谱性能； ( 7 ) 借助量化软件g a u s s i a n 0 3 应用密度泛函理论对染料的分子结构、 电子结构、频率等进行计算； ( 8 ) 应用可视化软件g a u s s i v e 、h y p y c h e m 、c h e m 3 d 等对染料的最优 结构、静电势、分子成键轨道以及红外，拉曼等分子光谱进行模拟和分析。 第2 章菁染料荧光探针的合成与性能研究 第2 章菁染料荧光探针的合成与性能研究 2 1 引言 随着生命科学的发展，迫切需要迸一步提高分析检测的灵敏度和可靠 性。开发性能优异的生物分析用荧光染料成为新的研究热点。荧光素和罗 丹明类染料是最早被使用的荧光标示剂，但其结构可调节性差，不易合成 等缺点，限制了这类染料的广泛应用。 勺3 8 强影8 0 捧 c h 2e h 2 99 亡o o h七o o h 图2 - 1 三甲川吲哚菁染料( c y 3 ) 的结构 f i g 2 1t h es t r u c t u r eo f t r i m e t h i n ec y a n i n e w a g g o n e r 5 9 - 6 2 a s 等研究了系列荧光染料c y 3 ，c y 5 和c y 7 ，在吲哚环 5 位上引入磺酸基，使该染料具有良好的水溶性；姚祖光等1 9 , 6 3 1 发现，n 原 子上为苄基时，其稳定性高于相应的链烷基取代的染料；p a t o n a yg a b o d 6 5 删 发现含五元环、六元环、方酸环的菁染料光稳定性高于相应线性吲哚菁染 料。本文结合上述人的研究成果，对w a g g o n e r a s 开发的荧光染料( c y 3 、 c y 7 ) 重新进行分子设计( 如图2 1 ，2 - 2 ，2 - 3 所示) ，提高染料的光稳定性 能和水溶性。 图2 - 2 七甲川吲哚菁染料( c y 7 3 3 ) 的结构 f i g 2 - 2t h es t r u c t u r eo f h e p u n e t h i n ec y a n i n e 2 3 燕山大学工学硕士学位论文 s 0 3 k 图2 - 3 对称线性七甲川吲哚菁染料c y 7 的结构 f i g 2 3t h es t r u c t u r eo f s y m m e t r i c a ll i n e a rh e p t m e t h i n ec y a n i n e 2 2 实验部分 2 2 1 实验仪器 f a j a 系列电子天平 予华s h z d ( 1 1 1 ) 循环水式真空泵 予华d f 一1 0 1 s 集热式恒温磁力搅拌器 双五金1 0 1 a 一1 e 电热鼓风干燥箱 7 6 0 c r t 双光束紫外可见分光光度计 荧光光谱仪f l u o r o l o g - 3 旋转蒸发器r e 5 2 c k q 一型超声波清洗器 2 2 2 实验药品 无水乙醚 乙醚 乙醇( 9 5 ) 醋酐 吡啶 对氯甲基苯甲酸 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 上海民桥精密仪器有限公司 分析仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 上海实验仪器厂有限司 上海精密科学仪器有限公司 分析仪器厂 美国j y 公司 巩义市英峪予华仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市凯通化学试剂有限公司 广东汕头市西陇化工厂 天津市四通化工厂 秦皇岛试剂厂 第2 章菁染料荧光探针的合成与性能研究 邻二氯苯 异丙醇 丙酮 甲醇 乙醇 正丁醇 硅胶 原甲酸三乙酯 三氯氧磷 二氯甲烷 n ，n - 二甲基甲酰胺 环己酮 无水醋酸钠 氯化钠 2 3 实验方法 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 3 0 m _ 4 0 0 目 化学纯 化学纯 化学纯 化学纯 化学纯 化学纯 化学纯 天津市光复精细化工研究所 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 沈阳市新西试剂厂 天津市化学试剂一厂 天津市大茂化学试剂厂 青岛美高集团有限公司 天津市大茂化学试剂厂 天津市光复精细化工研究所 天津市化学试剂三厂 天津市化学试剂一厂 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市北辰骅跃化学试剂厂 天津市四通化工厂 2 3 1 染料中间体合成路线及合成方法 2 3 1 1 中间体的合成路线吲哚菁染料是由两端的吲哚环通过共轭甲川链 连接在一起的。一般是通过具有