（生态学专业论文）no诱导植物抗性及调节氮代谢的信号传导机理.pdf

原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行 研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成 果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：塾童! 丝日期：2 q q 至生且 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰 州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学 校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被 查阅和借阅：本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本 人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：魏小红导师签名：王根轩日期：2 q q 5 生5 旦 摘要 兰州大学博士毕业论文 n o 诱导植物抗性及调节氮代谢的信号传导机理 摘要 本研究以细胞信号转导学原理为依据，结合植物生理学与分子生物学、生物 化学及植物病理学有关最新研究进展和方法，从一氧化氮( n o ) 及相关信号分子 诱导植物信号传导功能为切入点，探讨了n o 及相关信号分子诱导植物抗病、抗寒 性及调节氮代谢的信号传导机理。取得如下主要成果： 1 三种信号分子n o 、s a 和h 2 0 2 及n o s 押制剂n m m a 对烟草抗逆信号传导 调控基因表达具诱导作用 将8 l o 叶期三生烟草( n i c o t i a n at a b a c u mc v x a n t h i n c ) 分别用o 2m m 的n o 释放剂一硝普钠( s o d i u m n i t r o p r u s s i d e ，s n p ) 、o 5m m 的水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 和0 1m m 的过氧化氢( h y d r o g e np e r o x i d e ，h 2 0 2 ) 进行喷雾处理；用1 0m m 的一 氧化氮酶( n o s ) 抑制剂n m l a ( n o m e t h t l l a r g i n i n e ) 涂抹于烟草叶 片的正反面，同时以蒸馏水喷雾处理作对照( c k ) 。各处理于0 、6 、1 2 、2 4 、3 6 和7 2h 取样，研究n o 、s a 和h 2 0 2 三种信号分子和n o s 抑制剂( n m l a ) 对烟 草抗逆信号传导调控基因的诱导表达。 为此，通过筛选和条件优化，首先建立了从烟草中克隆抗逆信号传导调控基 因m r n a 积累表达的r t - p c r 检测方法，以准确地检测不同基因表达的相对水平。 从烟草中扩增了6 个抗逆信号传导调控基因的c d n a 序列。其分别为抗病基 因p r l a 和p r l b ，渗透调节基因o s m o t i n 、顺乌头酸基因n t a c 0 1 、抗氧化基因 g s t 和伤诱导基因愀。经n o 、s a 、h 2 0 2 信号物质和n o s 抑制剂( n m l v ) 处理烟草试验发现：n o 和s a 能诱导抗病基因p r l a 和p r l b 基因的表达，但n o 对p r l a 基因的诱导为瞬间事件，n o 在s a 的上游起作用；h 2 0 2 不能诱导p r l a 基因的表达；作为n o s 抑制剂的n m l a ，对烟草相关信号通道中基因的调节作用 并不一定与n o 完全相反，因为n m l a 不能抑制烟草p r i a p r l b 和n t a c 0 1 基因 1 摘要兰州大学博士毕业论文 的表达，可能的原因是n m l a 抑制了由n o s 催化的n o 生成途径，但并不能排除 其具有诱导n o 其它生成途径之可能性或诱发烟草中具调控p r l a 、p r l b 和n t a c 0 1 基因表达物质的产生，使得烟草p r l a 和n t a c 0 1 基因被诱导表达，而p r l b 基因 的表达量不变。 o s m 基因为n o 、s a 和h 2 0 2 信号物质的负反馈调节基因，是n m m a 的正反 馈调节基因；n o 、s a 、h 2 0 2 和n m l a 都能加强烟草n t a c 0 1 基因的表达；n o 、 s a 、和n m m a 不能诱导g s t 基因的表达，但h 2 0 2 能加强g s t 基因的表达，进 一步说明了3 种信号分子作用独立性的一面；n o 诱导了肛尸k 基因的表达，s a 、 h 2 0 2 和n m m a 不能诱导烟草w i p k 基因的表达。 2 三种信号分子n o 、s a 和h 2 0 2 具有调节小麦株体氮代谢的功能 以小麦( t r i t i c u ma e s t i v u m l c v g a n c h u n2 0 ) 为材料，用0 2m m 、0 5m m 和 1 0m m 三个浓度梯度的n o ( s n p ) 、s a 和h 2 0 2 喷雾处理植株。每2d 喷雾一次， 第三次喷雾后的2 4h 首次取样( 处理1 ) ，第四次喷雾后2 4 h 取第二次样( 处理2 ) 。 同时取第二片完全展开的叶片制样研究氮代谢相关指标：硝酸还原酶、粗蛋白、可 溶性蛋白质、游离氨基酸和衡量植物抗逆性的细胞渗透调节物质脯氨酸。结果 表职：n o ，s a 、h 2 0 2 参与了小麦植株的氮代谢；适宜浓度的n o ( s n p ) o 5 m m ) 、 s a ( o 2 m m ) 、h 2 0 2 ( o 2 m m ) 处理的小麦脯氨基酸含量增加( p 0 0 1 ) ；不同浓 度的n o ( s n p ) 、s a 、h 2 0 2 处理，不仅提高了小麦游离氨基酸( p o 0 1 ) 和粗蛋 白质( p o 0 1 ) 含量，且导致了可溶性蛋白质显著下降，其幅度随处理次数的增 加和时间的延长而增大。不同浓度的s n p 处理均引起小麦植株硝酸还原酶活性下 降；s a 和h 2 0 2 处理初期，小麦植株硝酸还原酶活性增加( p o 0 1 ) ，但随处理次 数和时间的延长其活性也下降。 3 初步明晰了n o 及相关信号分子对提高植物抗病性的信号传导机理 以小麦和三生烟草为供试材料，处理和取样方法分别于第一和第二章相同， 研究n o 、s a 、h 2 0 2 对作为衡量植物抗病性强弱指标的c a 2 + 和s a 含量的影响。 用o 2 m m 、o 5 m m 和1 0 m m 三个浓度梯度的n o ( s n p ) 、s a 和h 2 0 2 喷雾处理 2 摘要兰州火学博士毕业论文 植株，1 6h 后，磨擦接种活化的t m v 病毒观察发病情况，研究n o 、s a 、h 2 0 2 诱 导植物抗t m v 的能力。结果显示：不同浓度和处理次数的n o 、s a 和h 2 0 2 对c a 2 + 均有调节作用，但幅度不同，说明钙位于n o 、s a 和h 2 0 2 的信号通路上；之所以 n o 和s a 的作用强于h 2 0 2 ，可能原于h 2 0 2 与钙传导途径的距离远于n o 、s a 。 用n o 处理的烟草7 2h 内叶片中s a 呈直线上升趋势( p o 0 1 ) ；n m l a 在6h 内 能使烟草中s a 的含量大幅度下降( p o 0 1 ) ；进一步证明了n o 诱导了烟草中s a 积累，且s a 处于n o 信号通路的下游。n m l a 使n o s 催化的n o 生成途径受阻， 影响到体内s a 的代谢，导致烟草叶片内s a 下降。从烟草对抗花叶病毒( t m v ) 的表型反映上，也证明了n o 、s a 和h 2 0 2 在烟草抗病信号传导中的作用。 4 。n o 信号分子通过信号传导，能诱发一年生黑麦草抵御环境胁迫及提高小麦光 合效率 将生长至2 3 叶期的一年生四倍体多花黑麦草( l o f i o u mm u l t i f l o r u m ) 和小麦，用 浓度分别为0 2 、0 5 和1 0 m m o l l 的n o ( s n p ) 连续喷施3d ，第4 d 将其在0 下进 行低温胁迫1 3d 后。取出置光照培养箱中，在2 0 常温下恢复生长。试验分5 种处 理：a ：常温对照( 2 0 ) ；b ：低温对照( 0 ) ；c ：0 2 m m o l l s n p + 低温处理( 0 ) ； d ：0 5 m m o l ls n p + 低温处理( 0 ) ；e ：1 0 m m o l l s n p + 低温处理( 0 ) 。各处理 取生长一致的幼苗，于冷胁迫前( 0 d ) 、冷胁迫期间( 1d 、2d 、3d ) 及恢复生长第3d 取样，研究在低温胁迫下n o 对植物抗冷性和光合作用的影响。结果表明：外源 n o 处理降低了低温胁迫下黑麦草细胞膜的电解质渗透率，说明外源n o 对细胞膜 具有良好的保护或修复作用，可减轻或防止细胞膜系统的伤害。n o 可通过提高植 物中渗透调节物质脯氨酸含量来提高植物的抗逆性。n o 可以提高低温胁迫下黑麦 草幼苗s o d 、c a t 和p o d 的活性，并能维持在较高的水平上，尤其能显著诱导 p o d 活性的增高。经n o 处理的黑麦草恢复常温生长以后，其细胞膜透性和膜保 护酶活性恢复较低温对照快，说明外源n o 处理的黑麦草，受低温胁迫损伤较轻， 细胞膜的修复较快，从而提高植物的抗冷性。n o 提高了小麦中叶绿素和小麦净光 合速率，并能缓解低温胁迫所造成的小麦叶绿素和净光合速率的下降；n o 参与调 摘要兰州大学博士毕业论文 节植物的光合作用，并可通过提高植物的光合作用来增强植物抗逆性。经低温胁 迫的小麦恢复常温生长后，其叶绿素和净光合速率也比其c k 恢复得快。n o 能通 过提高小麦渗透陆调节物质( 可溶性糖) 的含量来提高植物抗低温胁迫的能力。 综上所述，n o 、s a 和h 2 0 2 能诱导植物抗逆信号传导调控基因的表达；参与植物 的氮代谢调控；增强了植物的抗病能力；n o 提高了非生物胁迫( 低温) 下植物的抗性 和光合作用。进一步证明了n o 、s a 和h 2 0 2 信号分子在信号传导上的“c r o s st a l k ”关 系，同时也证明了它们在调节基因表达作用上的独立性。 关键词：一氧化氪；氮代谢；信号传导；水杨酸；过氧化氢；一氧化氮酶：环境 胁迫；烟草；小麦；黑麦草 4 摘要兰州大学博士毕业论文 t h e s i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m o ft h ep l a n tr e s i s t a n c ea n dn i t r i cm e t a b o l i s m i n d u c e db ye x o g e n o u sn i t r i co x i d e a b s t r a c t t h es i g n a lt r a n s d u e t i o nm e c h a n i s mo ft h ee x o g e n o u sn i t i co x i d e ( n o ) a n di t s r e l a v a n ts i g n a lm o l e c u l ei ni n d u c i n gt h ep l a n td i s e a s er e s i s t a n c e ，c h i l l i n gt o l e r a n c ea s w e l la sn i t r i cm e t a b o l i s mw e r ee x a m i n e di nt h i sr e s e a r c h b a s e do nt h ep r i n c i p l e sa b o u t s i g n a lt r a n s d u c t i o ni np l a n ta n dc o m b i n e d w i t ht h ep r e v a i l i n gm e t h o d o l o g i e sc u r r e n t l y a p p l i e di n t h er e s e a r c hf i e l d so fm o l e c u l a rb i o l o g y , p l a n tp h y s i o l o g y , b i o c h e m i s t r y a n dp l a n tp a t h o l o g y t h ee f f e c t so f s a l i c y l i ca c i d ( s a ) a n dh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) o nt o b a c c o ，w h e a t ，l o l i o u m m u l t i f l o r u m w e r ee x a m i n e d t h er e s u l t sv a r i e da s f o l l o w i n g ： 1 t h ee x p r e s s i o no ft h er e s i s t a n tr e g u l a t o r yg e n e so ft h et o b a c c oc o u l db ei n d u c e d b y t h et h r e es i g n a lm o l e c u l e s s n p , s a ，h 2 0 2a n dn m l a ( t h en o s i n h i b i t i o n ) t h e s a m p l el e a v e sf r o mt h en i c o t i a n at a b a c u m c vx a n t h i n co f8 - 10l e a f p e r i o d ( w i t h 8 - 10l e a v e sf u l l ye x p a n d e d ) w e r ed i v i d e di n t o5g r o u p s t h e1 ，2a n d3g r o u pw e r e t r e a t e db ys p r a y i n gt h e0 2m ms o d i u mn i t r o p r u s s i d e ( s n p ) ，o 5m m s a l i c y l i ca c i d ( s a ) a n d 0 1m m h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) r e s p e c t i v e l ya n d t h eg r o u p4w e r et r e a t e d b ys p r e a d i n gt h e1 0m mn m l a ( n 。一m e t h t l _ 一l a r g i n i n e ) o n t h eg r o u p5 w a sk e p ta st h ec o n t r o lg r o u p ( c k ) s p r a y e db yd i s t i l l e dw a t e r t h es a m p l e so fe a c h g r o u p w e r et e s t e da t 0 ，6 ，1 2 ，2 4 ，3 6h o u r st oc l a r i f yt h ee f f e c t so nt h er e s i s t a n t r e g u l a t o r yg e n e s e x p r e s s i o n t h er t - p c rm e t h o do ft h ec o l o no ft h er e s i s t a n tr e g u l a t o r yg e n e st oa c c u m u l a t et h e m r n aw e r eb a s i c a l l ys e l e c t e da n de s t a b l i s h e df o ra c c u r a t e l ym e a s u r i n gt h eg e n e s e x p r e s s i o nl e v e l s 6 e d n as e q u e n c e so ft h er e s i s t a n tr e g u l a t o r yg e n e sw e r ec o p i e d f r o mt h es a m p l e dl e a v e so ft h en i c o t i a n at a b a c u mc yx a n t h i n c t h e yw e r ed i s e a s e 5 摘要兰州大学博士毕业论文 r e s i s t a n tg e n e s p r l aa n d p r l b ，o s m o s i sr e g u l a t o r yg e n e o s m o t i n ，n t a c 0 1 、a n t i o x i d e g e n e sg s t ，w o u n di n d u c e dp r o t e i nk i n a s eg e n e ( w i p k ) i th a sb e e nf o u n dt h a tn o a n ds ac o u l di n d u c et h eg e n ee x p r e s s i o no fp r l aa n dp r lb b u tt h ep r i ae x p r e s s i o n p e r i o dw a sv e r ys h o r t ( w i t h i n3 6h o u r s ) n ow e r er e s p o n d e da t t h eb e g i n n i n go ft h e s i g n a lp a t h w a y h 2 0 2 c o u l dn o ti n d u c et h ep r l ag e n ee x p r e s s i o n a so n eo ft h en o s i n h i b i t o r sn m l ad i dn o ta c ti nt h ea n t i c i p a t e dw a yc o m p a r et on od o n o rs n pi n r e g u l a t i n gt h eg e n e se x p r e s s i o ni nt h es i g n a l i n gd u e t ot h eo c c u r r e n c et h ep r l a ，p r l b a n dn t a c 0 1 t h ep o s s i b l er e a s o nw o u l db et h a tt h o u g hn m l ah a di n h i b i t e dt h en o f o r m a t i o nc a t a l y z e db yn o s ( n i t r i co x i d es y n t h a s e ) ，t h ep o s s i b i l i t yt h a tt h en m l a m i g h ts t i m u l a t et h en os o u r c et h r o u g ho t h e rw a y so r l e a dt ot h e a p p e a r a n c e so f s o m e t h i n ge l s ew h i c hc o u l dr e g u l a t et h eg e n e se x p r e s s i o no fp r l a ，p r l ba n dn t a c 0 1 a l s om i g h tn o tb ee x c l u d e d i nr e s u l tp r l aa n dn t a c 0 1w e r ei n d u c e dt ob ee x p r e s s e d w h i l et h ea c c u m u l a t i o no fp r i bk e p tc o n s t a n t g e n eo s mw a st h en e g a t i v er e s p o n d i n g r e g u l a t o r yg e n ef o rn o ，s a a n dh 2 0 2a n dw a st h ep o s i t i v eo n ef o rn m m a i tw a s s h o w nt h a ta l lt h es i g n a lm o l e c u l ei nt e r m so fn o ，s a ，h 2 0 2a n dn m l aw e r ea b l et o e n h a n c et h en t a c 0 1g e n ee x p r e s s i o ni nn i c o t i a n at a b a c u mc vx a n t h i n c g s tg e n e c o u l dn o tb ei n d u c e db yn o s aa n dn m m a b u th 2 0 2i n c r e a s e dt h el e v e lo ft h eg s t g e n ee x p r e s s i o n t h i s w o u l dp r o v i d et h ee v i d e n c e st h a ts o m e t i m e st h e s e s i g n a l m o l e c u l e sf u n c t i o n e di nac o m m o n w a y w h i l es o m e t i m e s t h e yp e r f o r m e d i n d e p e n d e n t l y i nt h e i ro w n u n i q u ew a y s n o i n d u c e dt h ew i p k g e n ee x p r e s s i o nw h i l e s a ，h 2 0 2 a n dn m m aw e r en o ta b l et od oi t 2 t h et h r e es i g n a lm o l e c u l e sf u n c t i o n e di nr e g u l a t i n gt h ew h e a tn i t r i cm e t a b o l i s m t h es a m p l e dw h e a tl e a v e s ( t r i t i c u ma e s t i v u ml c v g a n c h u n2 0 ) w e r eu s e di nt h i s e x p e r i m e n t t h e yw e r ed i v i d e di n t o 4g r o u p s g r o u pl ，2a n d3w e r es p r a y e dw i t h s o l u t i o no fs n p , s aa n dh 2 0 2r e s p e c t i v e l ya td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fo 2 o 5a n d 1 0 m m o l l g r o u p4 w a sk e p ta st h ec o n t r o l l e do n e t h e s p r a yt r e a t m e n t sw e r e c o n d u c t e do n c ee v e r yt w od a y sf o rf o u rt i m e si nt o t a l 2 4h o u r sa f t e rt h et h i r ds p r a y i n g 6 摘要兰州大学博士毕业论文 ( t r e a t m e n t1 ) t h es a m p l e sw e r eu s e di nt h et e s t 2 4h o u r sa f t e rt h ef o u r t hs p r a y i n g ( t r e a t m e n t2 ) t h es a m p l e sw e r eu s e df o rt h ef u r t h e rd e t e r m i n a t i o n i nt h em e a nw h i l e t h es e c o n df u l l ye x p a n d e dn o r m a ll e a v e sw e r es e l e c t e da st h es a m p l e sf o rd e t e r m i n i n g t h el e v e l so fp a r a m e t e r sr e l e v a n tt on i t r i cm e t a b o l i s m ：n r ，c r u d ep r o t e i n ，s o l u b l e p r o t e i n ，d i s s o c i a t i v ea m i n oa c i da n dp r o l i n ec o n t e n t ， t h er e s u l t ss h o w e d ：n o ，s aa n dh 2 0 2c o u l dm o d u l a t en i t r i cm e t a b o l i s mi np l a n t ； t h e a p tc o n t e n t n o ( s n p ) ( o 5m m ) ，s a ( o 2r a m ) a n dh 2 0 2 ( o 2r a m ) t r e a t m e n tc o u l d i n c r e a s et h ep r o l i n ec o n t e n t ( p o 0 1 ) ；t h ed i f f e r e n tc o n t e n t so fn o ( s n p ) ，s aa n d h 2 0 2c o u l dn o to n l yi n c r e a s et h ec o n t e n t so fd i s s o c i a t i v ea m i n oa c i da n dc r u d e p r o t e i n ( p o 0 1 ) ，b u ta l s oi n d u c et h ed r a m a t i cd e c r e a s e so fs o l u b l ep r o t e i nl e v e l s ( p o 0 1 ) i nw h e a t ，a n dt h er e d u c t i o ns c o p e p o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h et i m e so ft r e a t m e n ta n d t h et i m ee x t e n d e d ；t h ed i f f e r e n tc o n t e n t so fs n pt r e a t m e n tc o u l d1 e a dt ot h ei n h i b i t i n g o fn r e x p r e s s i o n ；a tt h eb e g i n n i n go f t h es aa n dh 2 0 2t r e a t m e n t s ，n re x p r e s s i o nw a s a c t i v a t e d ( p 0 。0 1 ) i nw h e a t 。b u tt h en r a c t i v i t yd e c r e a s e da st h et i m e so ft r e a t m e n t i n c r e a s e da n dt h et i m ee x t e n d e d 3 b a s i c a l l yc l a r i f i e dt h es i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s mt h a tt h er e l e v a n ts i g n a l m o l e c u l e sc o u l de n h a n c et h ep l a n td i s e a s er e s i s t a n c e w h e a ta n dt o b a c c ow e r eu s e da st h et e s ts a m p l e sa n dt h es i m i l a rt r e a t m e n tm e t h o d a s t h ef i r s tt w oc h a p t e r sw e r e e m p l o y e d t h ee f f e c t so fn o ，s a a n dh 2 0 2o nt h ec o n t e n t s o fc a ”a n ds aw h i c hw o u l di n d i c a t et h ed i s e a s e sr e s i s t a n c ei n d e x e sw e r ea n a l y z e d 16 h o u r sa f t e r s p r a y i n gt h e l e a v e sw i t hs o l u t i o no fs n p , s aa n d h 2 0 2a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f 0 2 ，0 5a n d1 0m m o l l ，t h ea c t i v a t e dt m vv i r u sw e r eo b s e r v e d a n d t h ei n d u c e m e n ta b i l i t i e so fs n p , s aa n dh 2 0 2t ot m vv i r u sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec a 2 + c o n t e n tw e r ea d j u s t e dc o r r e s p o n d i n gt oa n yc o n c e n t r a t i o n s a n dt r e a t m e n te a c ht i m ei nav a r i e ds c o p e s ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tc a 2 + m i g h ts i t u a t e do n t h es i g n a lp a t h w a yf o rn o ，s aa n dh 2 0 2t h er e a s o nw h yn o a n ds aa f f e c t e dm o r e p o w e r f u lt h a th 2 0 2m i g h tb et h a tt h ed i s t a n c eb e t w e e nh 2 0 2a n dc a 2 + w a sf a r t h e rt h a n t h ed i s t a n c ef r o mn o ，s at oc a ”i ts h o w e dt h a tw i t h i n7 2h o u r sa f t e rt h et o b a c c o 7 摘要兰州大学博士毕业论文 s a m p l e s t r e a t e db yn o s ac o n t e n ti n c r e a s e dl i n e a r l y ( p o 01 ) n m l ac o u l di n d u c e t h es u d d e nd e c r e a s eo fs ac o n t e n t ( p o 0 1 ) w i t h i n6h o u r s ，w h i c hp r o v e df u r t h e rt h a t i tw a sn ow h i c hi n d u c e dt h ea c c u m u l a t i o no fs a ，a n ds a m i g h tl i e a tt h ee n d i n g p a r t o ft h e s i g n a l i n gp a t h w a yo fn o n m l ac o u l d i n h i b i tt h en os y n t h e t i c p a t h w a y c a t a l y z e db yn o s t h a ti n f l u e n c e dt h es am e t a b o l i s mi np l a n t ，t h u sc a u s e dt h ed e c r e a s e o fs ai nt o b a c c ol e a v e s t h es u p e r f i c i a lc h a r a c t e r so ft m vi nt o b a c c oa l s op r o v e dt h a t s n p , s a a n dh 2 0 2f u n c t i o n e di nt h ep r o c e s so ft h es i g n a lt r a n s d u c t i o no ft h ed i s e a s e r e s i s t a n c e 4 t h ea d v e r s i t yr e s i s t a n c eo ft h ea n n u a lr y e g r a s sw e r ee n h a n c e da n dt h ew h e a t s e f f i c i e n c yo fp h o t o s y n t h e s i sw e r ei m p r o v e db y n o t h r o u g ht h es i g n a lt r a n s d u e t i o n w h e nt h es e c o n do rt h ef o u r t hl e a v e so ft h ea n n u a lr y e g r a s s ( l o l i o u mm u l t i f l o r u m ) f u l l ye x p a n d e di t sn o r m a ll e a v e sw e r es a m p l e d w h e nt h ef i r s tl e a v e sf u l l ye x p a n d e d ( 3 - 4c ml o n g ) t h es e e d l i n g sw e r eg r o u p e da n ds p r a y e dw i t hs o l u t i o no fs n pa td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f0 ，0 2 ，0 5a n d1 0m m o l l t h es p r a yt r e a t m e n t sw e r ec o n d u c t e d o n c ead a yf o rt h r e ec o n s e c u t i v ed a y s a ss o o na st h et r e a t m e n tw a sf i n i s h e d ，s o m eo f r y e g r a s s l e a v e sw e r ek e p ti n g r o w t hc h a m b e ra t 0 1 2 t os u f f e rf r o mc h i l l i n gs t r e s s t h e r e f o r et h et r e a t m e n t sw e r e d e s i g n e da sf o l l o w s ：a n o r m a lc o n t r o l ；b 0 一c h i l l i n g s t r e s sc o n t r o l ；c 0 2m m o l l s n p + 0 。c c h i l l i n gs t r e s s ；d o 5 m m o l l s n p + 0 c c h i l l i n g s t r e s sa n de1 0m m o l ls n p + 0 一c h i l l i n gs t r e s s t h ea b o v e c h i l l i n gs t r e s st r e a t m e n t s l a s t e df o ro n eo rt h r e ed a y si nt h eg r o w t hc h a m b e r t h e nt h eg r o w t hc h a m b e rw a sr e s e t a t2 0 。c ，t h e r e b yg e t t i n gt h er y e g r a s sb a c kt oan o r m a lg r o w t hf o rt h r e ed a y s d u r i n g c h i l l i n g s t r e s sp e r i o da n da f t e ra3 - d a yr e c o v e r i n gg r o w t h ，t h el e a v e sw e r es a m p l e d w i t h t r i p l i c a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es n pt r e a t m e n tw a sa b l et oa l l e v i a t et h er i s eo f m e m b r a n e p e r m e a b i l i t ya n da c c e l e r a t et h ea c c u m u l a t i o no fp r o l i n ei nr y e g r a s su n d e rc h i l l i n g s t r e s s m o r e o v e r ，t h ea c t i v i t i e sr e d u c t i o nt r e 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