（生物化学与分子生物学专业论文）小鼠β酪蛋白基因重组体构建、表达及其产物的纯化和酶解液的免疫功能研究.pdf

安徽医科大学硕士学位论文英文缩写a 口b s ac o n ae p mb - c nd d 哐m d m s 0d 1 th p l cf b st gp b sp c rp h ap m s fr p m i - 1 6 4 0r t p c rs e cs d ss d s 队g et e m 匣d英文缩略词a b b r e v i a t i o n英文全名a m p i c i l l i nb o v i n es e r u ma l b u m i ne o n e a n v a l i n ae o u t n t sp e rm i n u t el j - e a s e i nd u l b e e e i sm o d i f i e de a e j sm e d i md i m e t h y ls u l f o x i d ed i t h i o t h r e i t o lh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yf e t a lb o v e i n es e r u mi s o p r o p y l - p d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i dp h o s p h a t eb u f f e rs a l i n ep o l y m e r a s ec h a i l lr e a c t i o np h y t o h e m a g g l u t i n i np h e n y m e t h y ls u l f o n y l f l u o r i d er o s w e l lp a r km e n o r i a li n s t i t u t e1 6 4 0r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c rs e c o n dd o d e e y l s u l f a t e , n a - s a l ts d s - p o l y a e r y l a m i d eg e ld e e t r o p h o r e s i sn n n , n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e中文全名氨苄青霉素牛血清白蛋白刀豆蛋白a每分钟计数弘酪蛋白二甲基亚砜二硫苏糖醇高效液相色谱胎牛血清异丙基- 争d - 硫代半乳糖磷酸盐缓冲液聚合酶链反应植物血凝素苯甲基磺酰氟化物1 6 4 0 培养液逆转录p c r秒十二烷基硫酸钠s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳n ，n ，n n 四甲基乙二胺学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意学位论文作者签名：日期：丝! ：三：! z学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留使用学位论文的规定学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利日的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在解密后适用本规定学位论文作者张髫西n 爹日期：一，、 i导师馘：锨魄扣7 小7 7安徽医科大学硕士学位论文小鼠b 酪蛋白基因重组体构建、表达及其产物的纯化和酶解液的免疫功能研究中文摘要研究背景乳源性的b - 酪蛋白( 1 3 - c n ) 含有丰富的生物活性肽，这些生物活性肽在体内发挥着各式各样的生理功能，因此，b 酪蛋白被誉为乳蛋白中的战略活性蛋白。制备和提取b 酪蛋白为研究b 酪蛋白及其中包含的生物活性肽具有重要的意义，也为开发乳品奠定一定基础。传统方法获得b - 酪蛋白主要是从乳中分离纯化，但获得的b _ 酪蛋白产量较低，且分离纯化难度较大，为b 酪蛋白的研究和开发带来不便。随着生物技术飞速发展，利用基因工程手段直接获得b 酪蛋白为人们提供了新的思路和方法。各种哺乳动物和人b _ 酪蛋白高度保守，尤其小鼠雎酪蛋白与人的b _ 酪蛋白又有很高的同源性，本研究以小鼠b 酪蛋白作为研究对象。目的构建小鼠b 一酪蛋白基因重组体，在大肠杆菌内诱导其表达，纯化肚酪蛋白并研究其酶解液的部分功能。方法从哺乳期小鼠乳腺组织提取总r n a ，通过r p c r 获得髓酪蛋白基因编码序列，再与融合蛋白表达载体p g e x - k g 连接，构建原核表达质粒p g e x - k g b c n ，将其转化到e e o l id h 5 c t 宿主内，在2 0 c ，用低浓度的i p t g 进行长时间的诱导，超声破碎细菌后s d s - p a g e 分析。利用b 一酪蛋白基因重组体表达的融合蛋白氨基端带有g s t 标签，用商品化的g s t b e a d s ( g l u t a t h i o n e s e p h a r o s e 4 b ) ，亲和层析的方法纯化b c n 融合蛋白。以纯化的p - o n 融合蛋白为底物，用胰蛋白酶、糜蛋白酶作用底物6 0 r a i n 、9 0 m i n 、1 2 0 m i n 、1 5 0 m i n ，得到不同时间段的酶解液。通过体内和体外两系列实验，观察了争c n 融合蛋白酶解液对大鼠和小鼠淋巴细胞转化的影响。结果经限制内切酶酶切图谱分析和d n a 序列测定证实所构建的质粒p g e x - k g p - c n ，s d s p a g e 证实诱导表达后所获得的融合蛋白分子量为5 2 k d ，表达量占菌体蛋白的1 2 4 且主要存在于上清液中。纯化后产物经胰蛋白酶、糜蛋白酶作用9 0 m i n 、1 2 0 m i n ，2安徽医科大学硕士学位论文其对大鼠和小鼠淋巴细胞转化有明显的促进作用。结论成功构建重组表达质粒p o e x k g b c n ，并在大肠杆菌中获得了可溶性表达。成功纯化了融合蛋白，其酶解液对大鼠和小鼠体内外淋巴细胞转化有促进作用。关键词：肌酪蛋白重组体构建表达纯化酶解液淋巴细胞转化3安徽医科大学硕士学位论文c o n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no fm o u s eb - c a s e i ng e n er e c o m b i n a n t ，a n dp u r i f i c a t i o no fe x p r e s s i v ep r o t e i na n di m m u n i t yr e s e a r c ho fi t sh y d r o l y s a t ea b s t r a c tr e s e a r c hb a c k g r o u dt h e r ea r em a n yb i o a c t i v ep e p t i d e si nb e t a - c a s e i n ( p - c n ) ，w h i c hp l a ym a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s nv i v o ，s ob e t a - c a s e i ni sc a l l e ds t m t e # ca n da c t i v ep r o t e i n t op r e p a r ea n dp u r i f yb e t a c a s e i ni t i si m p o r t a n tt or e s e a r c hb e t a - c a s e i na n db i o a c d v ep e p t i d e s t r a d i t i o n a lm e t h o dt oo b t a i nb e t a - c a s e i nw a si s o l a t i n ga n dp u r i f y i n gf r o mm i l k b yt r a d i t i o n a lm e t h o d , t h e r ea r el o wo u t p u ta n dc o m p l i c a t e dp r o g r a mi np r e p a r i n ga n di s o l a t i n gb e t a - c a s e i n w i t ht h ed e v e l o p m e n to fb i o t e c h n o l o g y , g e n ee n g i n e e r i n gi su s e dt op r e p a r eb e t a - c a s e i n t h e r ei sv e r yc o n s i s t e n tc h a r a c t e ra m o n ga n i m a l sa n dh u m a nb e t a - c a s e i ng e n e s ，e s p e c i a l l yb e t w e e n m o u s e a n d h u m a n , s o t h e m o u s e b e t a - g a s e i n g e n e w a s c h o s e d i n o u r r e s e a r c h o b j e c tt oc o t l c f f u f tt h er e c o m b i n a t ep l a s m i dp g e x - k g - p - c n , t r a n s f e ri n t oh o s te c o l id h 5 at oe x p r e s s , p u f f yt h ee x p r e s s i v ep r o t e i na n ds t u d ys o m ei m m u n ef u n c t i o no fi t sh y d r o l y s a t eb ye n z y n l e s m e t h o d st h et o t a lr n aw a se x t r a c t e di nt h em o u s em a m m a r yg l a i i di nl a c t a t i o n t h ee x o no fb e t a - c a s e i nw a so b t a i n e db yt h em e t h o do fr t - p c r t h e ne x o na r ec o n n e c t e dw i t ht h ee x p r e s s i o nv e c t o rt of o r mt h ee x p r e s s i o np l a s m i d , w h i c hw a st r a n s f e r r e di n t ot h ee x p r e s s i o nh o s te c o l id h 5 a t h e ne c o l id h 5 aw a si n d u c e dw i t ht h el o wc o n c e n t r a t i o no fi p t gf o ro v e r n i g h ti n2 0 c t h eb a c t e r i aw e r eb r o k e nu pb yu l t r a s o n i cw a v e ，a n di t sp r o t e i n sw e r ea n a l y z e db ys d s p a g e i nb a c t e r i u mh y d r o l y s a t e ，g s t - b e t a - c a s e i np r o t e i nw a sp u r e f i e db yg s tb e a d sa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h eb e t a - c a s e i np r o d u c e db yg e n ee n g i n e e r i n gw a sh y d r o l y z e db yt r y s i na n dc h y o m t r yt o g e t h e rf o r6 0 m i n , 9 0 m i n , 1 2 0 r a i n , 1 5 0 m i _ n r e s p e c t i v e l y 4安徽医科大学硕士学位论文b yt w os e r i e so fe x p e r i m e n t sb o m nv v oa n d nv i t r o , i nr a ta n dm i c e ，t h ee f f e c t o ft h eh y 击0 l y s a t e so f b e t a - c a s e i no nl y m p h o c y t ew a n s f o r m a t i o n ( l t ) w e l ei n v e s t i g a t e d r e s u l t st h es e q u e n c eo f8 - c ng e n ew a ss u c c e s s f u l l yc l o n e da n dt h et a r g e tg e n ew a sc o r r e c t l yi n s e r t e di n t op g e x - k gt h eb e t a - c a s e i nw i t hg s t - t a gi ni t snt e r m i n a lw a se x p r e s s e di ne e o l id h 5 a , i t sm o l e c u l a rw e i g h tb e i n g5 2k d ，a n dt h eo u t p u ta c c o u n t e db y1 2 ：4 o ft h ew h o kp r o t e i no ft h eb a c t e t i a t h ef u s s i o np r o t e i no fb e t a - c a s e i nw a sd i s m l v e di ns u p e m a t a n to fb a c t e r i u mh y d r o l y s a t e s t h ef u s s i o np r o t e i nv c a ss u c c e s s f u l l yp u r e f i e db yg s tb e a d sa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h eh y d r o l y s a t e so fb e t a - c a s e i nf o r9 0 m i na n d1 2 0 m i nc a np r o m o t el y m p h o c y t et r a n s f o r m a t i o n c o u e l u s s i o nt h ee x p r e s s e dp l a s m i do fj j - c n ( p g e x - k g - i b - c n ) w a ss u c c e s s f u l l yc o n s l 玎“：t c d t h es o l u b l ef u s s i o np r o t e i no fb e t a - c a s e i nw i t hg s t - t a gi ni t snt e r m i n a lw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di ne c o l ia n dp u r i f i e db yg s tb e a d sa f f m i t yc h r o m a t o g r a p h y t h eh y d r o l y s a t e so fb e t a - c a s e i nh a v ei m l n u n cf u n c t i o n k e y w o r d s ：b e t a - c a s e i n ( 3 一c n ) r e e o m b i n a n t e o n s m l c t i o n e x p r e s s i o n p u d f i c a t i o n h y d r o l y s a t e l y m p h o c y t et r a n s f o r m a t i o n ( 5安徽医科大学硕士学位论文前言乳汁是幼小哺乳动物赖以生存的主要食物来源，b - 酪蛋白作为乳汁中一种重要成分。母乳不仅为幼仔或新生婴儿提供充足的氮源和氨基酸，而且还含有丰富的生物活性肽。刚出生的婴儿，它的许多生理功能都还不健全，需要从母体获缛一些活性物质才能完成其生理功能的调节作用，而这些活性物质，除了乳汁中本身含有的各种生长因子、调节因子和免疫球蛋白之外，8 酪蛋白源的多种生物活性肽也是其完成生理功能所必不可少的重要成分。所以研究b 酪蛋白以及b - 酪蛋白中包含的生物活性肽为我们进一步开发乳产品奠定基础。b 酪蛋白中富含多种生物活性肽序列，从胃凝乳酶的b 酪蛋白酶解物中分离纯化得到一个短肽，它位于b 酪蛋白c 末端1 9 3 2 0 9 残基，该肽在分裂原和抗体均不存在的情况下，也可明显的直接刺激鼠淋巴细胞增殖1 1 1 。研究还发现，b _ 酪蛋1 刍( 1 9 3 2 0 9 残基) 可刺激巨噬细胞增强对绵羊红细胞( s r b c ) 吞噬功能，注射2 4 d , 时后，能增强小鼠对k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 的抗感染能力，还可促进主要的促炎和免疫调节细胞因子( 如i l 一1 ，t n f - n 和i l 6 等) 产生1 2 1 具有免疫活性的六肽p r 0 g l y - p r o i l e - p r o - a s n ( 6 3 6 8 ) 和三肽l e u - l e u - t y r ( 1 9 1 1 9 3 ) 都具有多方面的生理功能，它不仅能够刺激机体外周血t 细胞增殖d i 、明显促进抗体形成、增强鼠巨噬细胞吞噬作用，增强小鼠对k l e b s i e l l a p n e u m o n i a 的抵抗能力 4 1 ，而且，近年来的研究结果表明，免疫活性肽还能够抑制肿瘤的生长，但是免疫活性肽发挥其功能的生理机制目前还不是很清楚，有待于进一步的研究。还有一类具有类吗啡活性肽，能够作为激素和神经递质与体内的p 、6 和7 受体相互作用，具有镇痛和调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温等功能i s ) 。研究较多的是b - 酪啡肽( 1 3 - c a s o m o r p h i n e s ) 类，如1 3 一c a s o m o r p h i n e s 1 1 、l k c a s o m o r p h i n e s 一7 和f l - e a s o m o r p h i n e s 5 ，它们是人或牛b _ 酪蛋白经胰蛋白酶酶解处理的产物，其氨基酸组成与b - 酪蛋白6 0 7 0( t y r - p r o p h e - p r o - g l y - p r o - i l e p r o - a s n - s e r - l e u ) 、6 0 6 6 、6 0 - 6 4 片断的残基序列相同，该类肽具有类吗啡活性，也具有调节免疫系统的功能1 6 , 7 , s 1 。这些肽被认为可能直接作用6安徽医科大学硕士学位论文于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的运动，也可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽，穿过肠粘膜进入外周血液再透过血脑屏障与脑中的阿片肽受体结合，即使是成年人在大量饮用牛奶后，在其小肠中也能检测到显著量的该类阿片肽的免疫反应物 9 1 。牛f l - c a s o m o r p h i n e s l l 在低于l o i | t m 剂量情况下，就具有明显抑制人淋巴细胞增殖的作用【刀。另外还发现，该肽具有增强鼠抵抗k l c b s i e l l ap n e u m o n i a 感染的能力i 刀i 瑚。b - 酪蛋白也具有c e i 片断，这些短肽具有刺激增强鼠巨噬细胞吞噬功能，对静脉注射k l e b s i e u ap n e u m o n i a 的小鼠产生保护作用。b - 酪啡肽1 0 ，相当于1 9 3 2 0 2 氨基酸残基序列和七肽( a l a - v a l - p r o - t y r - p r o - g l n - a r g ) 相当于1 7 7 1 8 3 氨基酸残基序列，也具有抑制a c e 的功能【儿】。此外，b 酪蛋白中还具有磷酸肽、糖肽和调节胃肠活动的生物活性肽。因此p 酪蛋白被誉为乳蛋白中的战略活性蛋白【1 2 ，”】。b 酪蛋白中包含有多种生物活性序列，而这些生物活性肽均以无活性的形式存在于b 酪蛋白前体物中。只有用适当的蛋白酶水解并从雎酪蛋白中释放出来之后，才成为具有生理活性的肽段。近年来的研究结果表明，b - 酪蛋白不仅能够在体内水解释放出生物活性肽，在体外，调节适当的p h 值、温度和酶解时间，也能够产生大量的生物活性肽并能够在体内发挥正常的生理功能。因此，可以在体外条件下酶解b 酪蛋白生产生物活性肽，并将之应用于食品和医药行业。同时这些生物活性肽，由于其分子量较小，在小肠内可以以完整肽段的形式被人体吸收，不会引起人体的免疫排斥反应，加之其生理功能强，用量少的独特优势，已越来越多地引起人们的重视，其工业化生产也成为当前食品和医药行业发展的大趋势。所以研究8 一酪蛋白及其中的生物活性肽，对于开发母乳具有不可估量的意义。研究p 一酪蛋白及其中的生物活性肽，首先要获得b 酪蛋白，传统方法获得的b 一酪蛋自主要是从乳中分离纯化，但获得的b 酪蛋白纯产量较低，且分离纯化难度较大，为b 酪蛋白的研究带来不便。随着生物技术飞速发展，利用基因工程手段为直接获得b 酪蛋白提供了新的思路和方法。虽然小鼠、大鼠、兔，山羊、绵羊、牛等动物的b - 酪蛋白基因已经被克隆1 1 4 ，1 卅，但目前国内对b - 酪蛋白的研究仅限于从基因组文库中克隆出b 酪蛋白基因编码序列u ”，不仅增加了研究成本，而且限制了其广泛运用。基于此，我们想从乳腺中提7安徽医科大学硕士学位论文取总r n a ，通过r t - p c r 获得b - 酪蛋白编码基因。但是，人或牛的乳腺组织材料较难获取。考虑小鼠b - 酪蛋白与人b 酪蛋具有很高的同源性。所以本研究直接以小鼠作为替代材料，制备b - 酪蛋白，然后研究其酶解液的免疫功篚。安徽医科大学硕士学位论文1 前言第一部分小鼠b 酪蛋白基因重组体构建、表达和产物纯化在这一部分研究中，设计特异引物，从哺乳期小鼠乳腺组织中提取总r n a ，通过r t o p c r 方法扩增出编码该蛋白的基因，将其直接克隆至原核表达载体p g e x - k g 中测序，测定序列与g e n b a n k 标准序列校对无误后，菌液加i p t g 进行诱导表达，超声破碎细菌后离心，取上清与g s t b e a d s 结合，利用g s t b e a d s 能特异性结合g s t ，从而纯化出g s t 融合蛋白。2 材料和方法2 i 实验材料2 l 1 主要试剂1 ) 实验动物：哺乳期昆明小鼠购于安徽医科大学实验动物中心。2 ) 表达载体：融合表达载体p g e x - k g 由军事医学科学院袁斌惠赠。该载体含谷胱苷肽一s 转移酶( g s t ) 的氨基末端基因，能编码约2 6k d a 的g s t 蛋白的氨基末端。若在其下游的多克隆位点中插入外源基因或基因片段，并且在合适的阅读框架内，此基因也会被连带表达出来成为g s t 融合蛋白。而且所表达的融合蛋白大部分是可溶的。载体质粒具有氨苄青霉素抗性，并含p 半乳糖苷酶( l a c z ) 的调控序列，能应用于a 互补筛选插入目的基因的重组质粒。3 ) 菌株：e c o i ld h 5 a 由安徽医科大学分子生物学实验室汪渊教授惠赠。基因型：s u p e 4 4 a l a c u l 6 9 ( ( p s 0 1 a c z a m l 5 ) h s d r l 7 r e e a le n d a lg y r a 9 6t h i - r d a l 。4 ) r n a 提取相关试剂：d e p c ( s i g m a , 美国) 、t r i z o l 试剂( 上海生7 - ) 、氯仿( a r ) 、异丙醇( a r ) 、7 5 乙醇( d e p c 水配制) 、无r n a s e 水ci - 海生工) 。9安徽医科大学硕士学位论文5 ) r t - p c r 相关试剂ii m p r o m i i n ar e v e r s et r a n s c r i p t i o ns y s t e r m ( p r o m e g a ，美国)l x l 0 0 p li m p r o n l i i t mr e v e r s et r a n s c f i p t a s ei x 4 0 0 p ! l m p r o m - h “1 0 xr e v e r s eb a r f e rl x l 2m lm g c h1 x 3 2 0 0 1m 叮pm i xi x5 0 p go l i g o ( d t ) 1 5p r i m e ri x5 0 t t gr a n d o mp r i m e ri x5 p g1 2 k bk a n a m y e i mp o s i t i v ec o n t r o lr n ai x l o o g lu p s t r e a mc o n t r o lp 而血e rl x l 0 0 1 t f ld o w n s r e a mc o n t r o lp r i m e r2 1 2 5m ln u c l c a s e - f r c cw a t e rl x 2 5 0 0 ur e c o m b i n a n tr n a s i nr i b o n u d e a s ei n h i b i t o rp c r 扩增试剂盒( 上海生工生物公司)t a qd n a p o l y m e r a s e ( 5 u i x l )d n t pm i x ( 2 5 h m )1 0 xb u f f e r m 孑+ 6 ) 琼脂糖凝胶电泳及胶回收相关试剂：琼脂糖凝胶( o x o i d ，英国) 、d n a m a r k e r ( 大连宝生物公司) 、溴化乙锭o o m g n a ) ( s i g m a , 美国)d n a 上样缓冲液溴酚蓝o 2 5 l i l l甘油3 0 i i l l5 0 x t a e 电泳缓冲液1 0n l l加去离子水至1 0 0m l 。t a e 电泳缓冲液( 5 0 x 储备液) i r i sn a 2 e 【) t a 2 h 2 0l o1 0 0 0 m l2 4 2 95 5 9安徽医科大学硕士学位论文冰乙酸5 7 i m le z 1 0s p i nc o l u m nd n ag e le x t r a c t i o nk i t ( b i ob a s i ci n c )d n al a d d e r ( d n af r a g m e n t sl e n g t hc o p ) ：2 5 0 ，5 0 0 x2 ，7 5 0 ，1 0 0 0 4 ，1 5 0 0 , 2 0 0 0 ,2 5 0 0 ，3 0 0 0 x3 ，4 0 0 0 ，5 0 0 0 ，6 0 0 0 ，8 0 0 0 ，1 0 0 0 0 )7 ) 重组质粒构建相关试剂a x y p r e pp l a s m i dm i n i p r c pk i ta x y p r e pc o l u m n5 02m lm i c r u o f u g et u b e5 01 5m lm i c r u o f u g et u b e5 0r n a s e a3 0 山b u f f e r s l1 5 m lb u f f e r s 21 5 m lb u f f e r s 32 5 m lb u f f e r w l2 8 i n lb u 位rw 2c o n c e n t r a t e2 4 m le l u e n t5 m l限制性内切酶( 根据酶切位点选择：e c o ri ，s a ld 、t 4d n a 连接酶( f e r m e n t a s ) 、胰蛋白胨、酵母提取物( 上海生工) 、i p t g 、牛血清白蛋白( s i g m a ，美国) 。8 1s d s p a g e( 1 ) p o l y a c r y l a m i d eg e lp r e p a r a t i o na c r y l a m i d es t o c k ( 3 0 a c r y l a m i d e )a c r y l a m i d e2 9 2 9b i s - a c r y l a m i d e0 8 9混匀后加d dh 2 0 ，3 7 ( 2 溶解，定容至1 0 0m l ，过滤贮存于棕色试剂瓶中。 l o w e rg e lb u f f e r ( 1 5 mt r i sb a s e , 0 4 s d s ，p h8 8 )嘶sb a s e4 5 4 1 3 9安徽医科大学硕士学位论文( 2 )( 3 )( 4 )l o s d ss t o c k1 0 0m ld d h e 0t 0 2 5 0 m ls t a c k i n gg e lb u f f e r ( 0 5 mt r i sb a s e , 0 4 s d s ，p h6 8 )t r i sb a s e6 0 5 5 91 0 s d ss t o c k4 0 m ld d h 2 0t o1 0 0 m lr u n n i n gb u f f e r ( 0 0 2 5 mt r i sb a s e ，o 1 9 2 mg l y c i n e ，0 i s d s ，p h8 3 )t r sb a s e3 0 2 7 5 9o l y e i n e1 4 4 1 3 91 0 s d ss t o c k1 0 0m l混匀后加d dh 2 0 ，3 7 ( 2 溶解，定容至1 0 0 0m l 。s a m p l eb u f f e rb - m e r e a p t o e t h a n o ls d ss t a c k i n gg e lb u f f e rd d h 2 0 d y e m i x1 2 m l7 2 93 0 m lt 01 0 0 m l0 4 b r o m p h e n o lb l u e3m lg l y c e r o l7m l1 0 s d s电泳级s d s1 0 0g 加d d a 2 06 8 助溶，浓盐酸调至p h7 2 ，定容至1 0 0 m l 。1 0 过硫酸按( 1 9 a p 加d d i - - 1 2 0 至l o m ls a m p l ep r e p a r a t i o n5p a r t ss a m p l e ：lp a r t sd y e ：1p a r t ss a m p l eb u f f e r ( 5 ：l ：1 )用9 0 水浴加热5 m i n 。安徽医科大学硕士学位论文( 5 ) 考马斯亮兰染色液考马斯亮兰0 2 5g甲醇2 2 5 m l冰醋酸46mld dh 2 02 2 5 m l( 6 ) 脱色液甲醇1 5 0 m l冰醋酸5 0 m ld dh 2 03 0 0 m l9 ) 纯化用试剂g s tb e a d s ( g l u t a t h i o n es e p h a r o s e t m4 b ) ( a m e r s h a mb i o s e i e n e e s 公司产品)p m s f ( 溶于异丙醇中)b e n z a m i d i n e ( 溶于水中)溶菌酶母液：2 0 0 m g m l 溶于2 0 m mt r i s - h c l p h8 02 x p r e - t g e m4 0 m mt r i s 8 08 m l x l m4 0 甘油8 0 m l2 m me d t a0 8 n l l x 0 5 m1 0 m mm g c l 22 m l x l m0 2 n p - 4 00 4 m l加水定容至2 0 0m l ，高压后备用。a 液配方2 x p r e t g e m5 0 m ln p - 4 00 9 m l5 m n a c i3 m li md t i 1 0 0 1 d圭丝垦翌垄兰塑主兰堡笙查0 2 mp m s f5 0 0 m0 3 mb e n z a m i d i n e1 0 0 1 ad d h 2 04 6 h d lg s t - e l u t i o nb u f f e r 配方1 0 m m 还原型谷胱苷肽5 0 m mt r i s h c lp h8 0t o m m 三乙胺i o ) w e s t e r n - - b l o t 试剂( 1 )1 0 t b s称取2 4 2 9 t f i s ，8 0 9 n a c l ，加8 0 0 m l d d 吼0 溶解，用h c l 调母1 7 5 ，再加d d h 2 0定容至1 0 0 0m l ，过滤。( 2 ) t b s t1 0 x t b s1 0 0 m l ，加d dh 2 0 至8 0 0m l ，再加5 0 0 9 lt w e e - 2 0 ，再加d dh 2 0 定容至1 0 0 0m l 。( 3 ) 转移电泳缓冲液( 3 9m mg l y c i n e ，4 8m m i r i s ，0 0 3 7 s d s ，2 0 甲醇)幽c i n e2 9gt r i s5 8gs d s0 0 3 7 9甲醇2 0 0 m ld d h 2 0t o1 0 0 0 m l( 4 ) 封闭液( 5 脱脂奶粉r b s a 3l x t b s t1 0 0 m l 加5 9 脱脂奶粉溶解。( 5 ) 1 x 丽春红s 染液丽春红so 5 9冰醋酸lmld dh 2 0t o1 0 0 m l1 4安徽医科大学硕士学位论文( 6 ) p r i m a r ya n t i b o d y ( 小鼠抗g s t 单克隆抗体) t i a n g e n 生物公司( 7 ) s e c o n d a r ya n t i b o d y ( 羊抗鼠i g o - h r p ) t i a n g e n 生物公司( 8 ) e c l ( e 7 _ e c l ) b i o l o g i c a li n d u s t r i e si s r a e l ，b e l th a e m e kl t d ( 9 ) 显影液、定影液11 ) 缓冲液和溶液等的配制( 1 ) l b 培养基( 1 l )胰蛋白胨1 0g酵母提取物5 9n a c il o g溶解于1 0 0 0 m l 去离子水中，用i m n a o h 调节p h 至7 4 。高压灭菌，4 c 保存备用。( 2 ) l b 琼脂平板：l b 培养液中加a 1 5 9 l 的琼脂粉。高压灭菌，待冷却至5 0 左右，加或不加相应的抗生素，无菌条件下将3 0 m l 液体铺制于9 0 r a m 直径的平皿中，冷却后自然凝固，置4 冰箱中备用( 3 ) 异丙基硫代p - d 半乳糖苷( i s o p r o p y l p - d - t h i o g a l a c t o s i d e ，r r g ) ：储存浓度为2 0 0r a g m 1 ，2 2 岬滤膜过滤除菌，- 2 0 c 保存。( 4 ) f o l i n - 酚试剂甲：将1 9 碳酸钠溶- 于5 0 m lo i m o l l g 氧化钠中，再把o 5 9 硫酸铜( c u s o a 5 h 2 0 ) 溶于1 0 0 m l1 酒石酸钾溶液，然后将前者5 0 m l 与后者i m l 混合。混合后1 日内使用有效。( 5 ) f o l i n - 酚试剂乙：在1 1 5 l 容积的磨口回流瓶中加入1 0 0 9 钨酸钠( n a 2 w 0 4 2 h 2 0 ) 、2 5 9 铝酸钠( n a 2 m 0 0 4 h 2 0 ) 、7 0 0 m i 蒸馏水、5 0 m i8 5 磷酸及1 0 0 r n l 浓硫酸，充分混匀后回流l o b 。回流完毕再加1 5 0 9 硫酸锂、5 0 m l 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 m i n ，以便取处驱除过量的溴，冷却后加蒸馏水至1 0 0 m l ，过滤。置于棕色瓶中，暗处保存。2 2 ，2 主要仪器设备p c r 仪( 珠海黑马医学科学仪器公司)d y y - 6 b 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂)安徽医科大学硕士学位论文d y c p 3 l c 型电泳槽( 北京六一仪器厂)a f l 0 0 制冰机( s c o t s m a n )电热三用水箱( 北京医疗设备厂)l d z 5 - 2 型离心机( 黑马仪器公司)t g l - 1 8 r 冷冻离心机( 黑马仪器公司)t g l - 1 6 h 离心机( 黑马仪器公司)s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器( i - 海强生生化仪器厂)精密p h 计p h s 一3 c 型( 上海雷磁仪器厂)电子天平：j y 2 0 0 2 ，f a 2 0 0 4 ( i - 海精密科学仪器有限公司天平仪器厂)u v - 7 5 4 紫外可见分光光度计( 山东高密彩虹分析仪器有限公司)- 2 0 i v i e d i c a l f r e e z e r ( s a n y 0 ，日本)紫外观察灯u v 型( 珠海黑马医学仪器有限公司)国华s k - 1 快速混匀器( 常州国华仪器有限公司)国华s h z 8 z 恒温振荡器( 常州国华仪器有限公司)g s m 凝胶图像分析管理系统( 3 o 版) ( 黑马仪器公司)组织匀浆器烤箱无菌操作台s w - c j - 1 f ( 苏州净化设备厂、细菌培养箱( 上海跃进医疗器械厂)2 2 实验方法2 2 1 乳腺组织总r n a 的提取1 ) 特殊处理：所用玻璃器皿经1 6 0 3 2 1 8 0 高温干烤6 h 以上，非耐高温器皿经o 1 d e p c 液浸泡后，经高压( 2 0 磅1 5 r a i n ) 处理灭活r n a 酶。所用试剂均用0 1 d e p c 水配置后高压处理。2 ) 取一只昆明种哺乳期小鼠( 由安徽医科大学动物实验中心提供) ，颈椎脱臼法处死小鼠，取其新鲜乳腺组织约5 0 - 1 0 0 m g 于玻璃匀浆器，每1 0 0 m g 组织加安徽医科大学硕士学位论文1 0 m l 的t d z o l 机械匀浆至悬液状。3 ) 用l m l 针筒，2 6 - g 号( 酣) 针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组d n a 直接从针筒中将样品转移到无菌1 s m l e p p e n d o f 管中。4 ) 每1 0 m l t r i z o l 加入2 0 0 1 _ 1 1 氯仿，异戊醇( 2 4 ：1 ) ，剧烈震荡混匀3 0 秒。4 c ，1 2 0 0 0转份，离心5 分钟。5 ) 将最上层的上清液小心转移到r n a s e - f l e e1 5 m le p p e n d o f 管里，勿吸入中间层和下层液体，加入等体积的异丙醇，室温下放置5 分钟。回4 ，1 2 0 0 0 转分，离心5 分钟。小心移去上清液，防止r n a 沉淀丢失。7 ) 用7 0 0 酒精洗涤两次，每次7 0 0 i _ t l ，4 1 2 ，8 0 0 0 转分，离心2 分钟。8 ) 将e p p e n d o f 管放在室温下使酒精完全挥发。最后沉淀用3 0 - 5 0 i _ t ld e p c - h 2 0 溶解。1 0 ) r n a 的分析和定量：测定样品在2 6 0 n m 和2 8 0 n m 的吸收值确定r n a 质量。o d 2 s g 瑚在1 8 - 2 0 即符合要求。按1 0 d 2 6 0 = 4 0 , g n 1 1 计算r n a 的浓度。2 2 2r t p c r1 ) 逆转录( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ) 扩增b - - c a s e i ne d n a取l p g 总r n a 于7 0 1 2 变性1 0 分钟，短暂离心后置冰上。在冰上按如下顺序加入下列逆转录组分m g c h4 0 m1 0 xr e v e r s eb u f f e r2 0 p 1d n t pm i 】【2 0 p lr e c o m b i n a n tr n a s i nr i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r0 5 p lr e v e r s et r a n s c r i p t a s e0 6 mo l i g o ( d t ) 1 jp r i m e r1 0 1 dt e m p l a t et o t a lr n a1 0 p gn u c l e a s e f r e ew a t e ru pt o2 0i i l混匀后，短暂离心后置p c r 仪上。1 7安徽医科大学硕士学位论文4 2 3 0 m i n9 5 5 m i n4 5m i l l2