（生物化学与分子生物学专业论文）小鼠印记snorna及其宿主基因的研究.pdf

肖裕中山大学博士学位论文2 0 0 6 年6 月 小鼠印记s n o r n a 及其宿主基因的研究 博士生：肖裕 指导教师：屈良鹄教授 专业：生物化学和分子生物学 摘要 核仁小分子r n a ( s m a l ln u c l e o l a rr n a ，s n o r n a ) 是一类代谢稳定、富集于核 仁区的小分子r n a 。s n o r n a 不仅指导r r n a 和s n r n a 的甲基化和假尿嘧啶化， 参与r r n a 的剪接成熟，而且还参与一些m r n a 转录后的化学修饰和选择性剪 接。在小鼠中大多数都是内含子编码的。根据早期的估算哺乳动物中会存在2 0 0 余种的s n o r n a ，主要是b o xc d 和b o xh a c a 两类s n o r n a 。但目前在哺乳动 物中有将近4 0 0 种s n o r n a 被鉴定出来，虽然有些分子的序列有些相似。这4 0 0 余种的s n o r n a 中有相当一部分的s n o r n a 的功能是未知的，被称为o r p h a n s n o r n a 。o r p h a ns n o r n a 中有- - d 类是印记表达( i m p r i m e d ) 的，即根据父母 来源来决定表达与沉默的s n o r n a 。这些特殊的s n o r n a 被发现与很多疾病相关 联，它们的结构，组织及其表达也是非常有趣的，现在已经证实其功能也对发育 特别是神经发育相当重要。发现新的s n o r n a ，特别是具有特殊性质的s n o r n a ， 比如印记s n o r n a ，并研究它们的功能具有重要的意义。也是陔领域当前国际竞 争十分激烈的前沿。 s n o r n a 分子因为功能的不同，拷贝数的差别可能以千倍计，简单地从总 r n a 出发构建小分子e d n a 文库必然会非常频繁地出现高拷贝的分子。如果想 寻找到并且研究新的s n o r n a ，即拷贝数相对较少的s n o r n a ，必然以大规模精 细筛选或者大规模的测序为代价。随着在小鼠中的r n o m i c s 计划的完成，通过小 分子文库的方法寻找新的s n o r n a 是件非常困难的事情，由于r n o m i e s 测序规模 相当庞大，以r r n a 和s n r n a 为靶分子的相对高丰度的s n o r n a 绝大多数已经 被找到。大规模测序后仍旧隐藏的s n o r n a 一定是丰度极低的s n o r n a ，印记表 达的s n o r n a 就是这类低丰度表达的小分子r n a 。寻找新的印记s n o r n a 对于 s n o r n a 的研究具有重要的意义，已经有结果表明它们与某些疾病密切相关。为 小鼠印记s n o r n a 及其宿主基因的研究 了找到新的印记表达的s n o r n a ，本研究采用从d n a ，即基因组数据出发的策 略，通过计算机模式识别和e s t 比对结合实验分析的方法寻找新的s n o r n a 。 印记是只存在与哺乳动物和开花植物中的一种遗传现象。对双倍体的生物来 浣，每个基因位点的两个等位基因一般来说是同时表达的，并没有差别，尽管两 个基因可能有显隐性的差别，印记基因是子代的等位基因根据其父母来源来决定 表达与否的一类基因。印记基因大多数都是成簇的，这可能与簇里的几个基因公 用一个i c ( i m p r i n t i n gc e n t e r ) 有关。据估算印记基因的数量可能占到人类蛋白编码 基因总数目的l ，在小鼠中也是如此。目前研究得比较清楚的大约6 5 个印记 基因( 反义重叠转录物未计入) ，它们大部分在几个簇中，很容易对它们进行位 点分析，也使得获取基因问隔区序列变得有意义，也容易得到。通过文献和 g e n b a n k 的注释，对小鼠所有的印记基因进行了定位。 通过程序( 小部分通过手工) 分别获取注释完善的和新的印记基因的内含子 以及它们之间的基因间隔区，之后对这些序列数据进行s n o r n a 扫描分析。结果 显示这些序列中有许多s n o r n a 特征序列，并且结构也非常好，其中出自内含子 的序列一定是随着宿主基因一起转录的。这些s n o r n a 候选分子的分布并不是 随机的，它们具有一定的偏好，这是s n o r n a 进化的一个结果，从一个侧面也反 映它们并不完全是基因组的随机序列。本论文首先着重研究了位于小鼠1 2 号染 色体f l 代的r m 基因的结构，r m 基因被认为与人类的一种神经紊乱有关联。 它的十个内含子中，含有8 个b o xc ds n o r n a l i k e 的序列。有趣的是，有些内 含子含有3 个s n o r n a 1 i k e 序列，而到目前为止哺乳动物中尚未有成簇的s n o r n a 报道。i r m 中编码的m b i i - 4 2 6 和m b i i - 3 4 3 以前被报道是大脑号一表达的，本研 究的结果显示，这些s n o r n a 在大脑和睾丸中的表达量相对很高，除了肾脏外， 其它的组织都有表达。这一结果也得到了u n i g e n e 数据的支持。r m 跟u h g 基 因很相似，外显子不具备编码功能，也有相对小的内含子( 与蛋白编码基因相比) ， 但与u h g 不同的是，它不具有5 t o p 结构，而目内含子比u h g 明显偏大。本 研究还发现在r m 的下游有一个非常稀有的m r n a ，它从未被报道过，它的结构， 功能和表达有待近一步地研究。 目前为止在人类和小鼠中发现的印记表达的b o xc ds n o r n a 已经超过十 个，经过比较发现，这些印记的b o xc ds n o r n a 具有很严谨的结构，这可能跟 它们的成熟加工有密切的关系。所有的反义s n o r n a 都是内含子编码的，这暗示 着s n o r n a 和它的宿主基因在表达调控和功能上有某这联系。1 9 9 8 年的时候， s m i t h 等人发现s n o r n a 的宿主基因的m r n a 都具有5 t o p 结构，那个时候的 s n o r n a 都是以r r n a 作为靶分子的。目前哺乳动物中功能未知的b o xc d s n o r n a ，即o r p h a ns n o r n a 有2 0 多个，通过比较发现小鼠o r p h a ns n o r n a 的宿 肖裕中山大学博士学位论文 2 0 0 6 年6 月 主基因都不具有5 t o p 结构，这一发现是对s n o r n a 宿主基因的一个新的认识， 也为o r p h a ns n o r n a 功能的预测提出了一些线索。 本研究初期还采用小分子库的方法大规模地克隆筛选核仁小分子r n a 。由 于哺乳动物细胞中r r n a 和t r n a 占了r n a 总量的绝大多数，任何e d n a 的构 建都不能忽略它们的存在。为了避免它们的干扰，本研究设想用细胞核里的r n a 构建高效小分子c d n a 文库。利用改良的柠檬酸蔗糖梯度离心法获得了高纯度 的细胞核，并提取了核仁。随后利用细胞核r n a 构建了小分子c d n a 文库，经 过筛选测序，获得3 个新的b o x c ds n o r n a 候选基因，经过试验分析确证了它 们的表达。 哺乳动物具有非常大的基因组，也有非常大的表达组( t r a n s c r i p t o m e ) ，细胞组 分相当复杂，例如脑中，脂类非常多，肝脏中糖原非常多。低丰度的s n o r n a 的 n o r h t e m 分析碰到的一个最大的问题就是上样量不能太多，否则因为杂质浓度也 增大，样品变得非常粘稠，无法正常电泳。本研究实验过程中采用了富集小分子 r n a 的方法，很好地解决了哺乳动物低丰度小分子r n a 的杂交和逆转录问题。 关键词：小鼠；b o xc d ；核仁小分子r n a ：内含子：印已：n 研：5 t o p 结构 i i 小鼠印记s n o r n a 及其宿主基因的研究 s t u d y o nt h ei m p r i n t e ds m a l ln u c l e o l a rr n a sa n dt h e i rh o s t s p ms t u d e n t ：x i a oy u s u p e r v i s o r ：q ul i a n g - h u s p e c i a l i t y ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y a b s t r a c t s n o r n a 乜m a l l n u c l e o l a r 幽i sak i n do fs m a l l m o l e c u l a r w e i g h tr n a st h a ta r e m e t e b o l i c l y s t a b l ea n dl o c t e da tn u c l e o l u s s n o r n ah a v ev a r i o u sf u n c t i o n si n e u k a r y o t e se s p e c i a l l yi nm a m m a l ss u c ha s2 - o m e t h y l a t i o na n dp s e u d o u r i d y l a t i o no n r r n aa n ds n r n a ，r r n a s p l i c i n ga n dm a t u r a t i o na n dm r n aa l t e r n a t i v es p l i c i n g i n m o u s em o s to fs n o r n a sa r ee n c o d e di ni n t r o n s a c c o r d i n gt oar o u g he s t i m a t et h e r e a r ea b o u tl i t t l em o r et h a n2 0 0s n o r n a sm o s to fw h i c ha r eb o xc da n db o xh a c a h o w e v e r ，t h ec u r r e n tn u m b e ro fs n o r n a si nm a m m a l s ，m a i n l yi nh u m a na n dm o u s e ， c a ne v e nr e a c h4 0 0 ，a l t h o u g hs o m eo fw h i c ha r es o m e w h a ts i m i l a ri ns e q u e n c e t h e r e i sas m a l lf r a t i o no fs n o r n a sw h o s ef u n c t i o n sa r es t i l le l u s i v ea n dt h e r e f o r et h e ya r e c a l l e do r p h a ns n o r n a a m o n gt h e mt h e r ea r ea b o u tt e ni m p r i n t e do n e si e t h e i r e x p r e s s i o n sa r ed e p e n d e n tt h eo r g i no fp a r e n t s ( e i t h e rf a t h e ro rm o t h e r ) t h i sf r a c t i o n o fs n o r n a si sr e l a t e dw i t hn e u r a ld e v e l o p m e n t t os e a r c hn e wm e m b e r so fi m p r i n t e d s n o r n a sa n dd e s c r i b et h e i rf u n c t i o n si s b i o l o g i c a l l ys i g n i f i c a n t t h i sf i e l di sa i n t e n s i v ef r o n t a lo fm o l e c u l a rb i o l o g yr e s e a r c h t h ec o p i e so fs n o r n a sc a nb eo v e rt h o u s a n d so ft i m e sd i f f e r e n t a n dt h u st h e e d n al i b r a r yw i l lp r i m a r i l yr e l e c tt h ec o p yd i s t r i b u t i o no fd i f f e r e n ts n o r n a t h i s m e a n sh i g h - c o p i e ds n o r n a sw i l la l s oh i g hc o p i e di nae d n al i b r a r y t og e tn e w m e m b e r so fs n o r n aa n di n v e s t i g a t et h e mf u r t h e r , w h i c ha r em u s tb el o w c o p i e d ， r e q u i r e s r e f i n e ds c r e e n i n ga n dl a r g e - s c a l es e q u e n c i n g i n2 0 0 0r n o m i c sp l a ni n m o u s ew a sc o m p l e t e da n do v e r1 0 0n e ws n o r n a sw e r ef o u n di nt h i sl a r g e s c a l e s e q u e n c i n gp r o g r a m a l lr r n a m o d i f i e ds n o r n a sm i g h tb ef o u n dd u et ot h eh i g h a b u n d a n c e i ft h e r ea r es t i l l - h i d d e ns n o r n a si nm o u s ea n dt h e ya r em u s tb ev e r y 肖裕中山大学博士学位论文2 0 0 6 年6 月 l o w c o p i e d a n dt h ei m p r i n t e ds n o r n a sa r ev e r yl o w - c o p i e d t o f i n dn o v e l i m p r i n t e ds n o r n a si sv e r ys i g n i f i c a n tt ot h es n o r n ar e s e a r c h w es t a r t e dw i t ht h e m o u s eg e n o m i ed n ad a t at o g e tn e ws n o r n ac a n d i d a t e sa n di d e n t i f i e dt h e m a c c o r d i n gt oe s t d a t aa n de x p e r i m e n t g e n o m i ci m p r i n t i n gi sag e n e t i cp h e n o m e n o ni nm a m m a l sa n df l o w e r i n gp l a n t s f o rt h ed i p l o i do r g n i s mt h e r ea r et w oa l l e l e sa tag e n el o c u sa n dn o r m a l l yb o t ha l l e l e s a r ee x p r e s s e ds i m u l t a n e o u s l ya l t h o u g ht h e yc a nb ed o m i n a n to rr e c e s s i v e b u ta n i m p r i n t e dg e n ea c t si nad i f f e r e n tw a y t h e y a r ee x p r e s s e do rs i l e n ta c c o r d i n gt ot h e i r o w no r i g i no fp a r e n t i nm o s to fc a s e si m p r i n t e dg e n e se x i s ti nc l u s t e ra n dt h e ym i g h t s h a r et h es a m ei cr i m p r i n t i n gc e n t e r ) a c c o r d i n gt ot h ee s t i m a t et h en u m b e ro f i m p r i n t e dg e n e sc a na c c o u n tf o rl o ft o t a lh u m a np r o t e i nc o d i n gg e n e sa n di ti sa l s o t h es a m ei nm o u s e t i l ln o wt h e r ea r ea b o u t6 5i m p r i n t e dg e n e s ( a n t i s e n s ea n d o v e r l a p p i n gt r a n s c r i p t sa r en o ti n c l u d e d ) i nm o u s e a n dm o s to ft h e mb e l o n gt os e v e r a l c l u s t e r s i ti se a s yt o g e tt h ei n t e r g e n i cs e q u e n c eb e t w e e nt h e m a c c o r d i n gt o t h e r e s e a r c ha r t i c l e sa n dn o t a t i o nf r o mg e n b a n kw el o c a t e da l lm o u s ei m p r i n t e dg e n e so n c h r o m o s o m e s t h ei n t r o n so fi m p r i n t e dg e n e sa n di n t e r g e n i cs e q u e n c e sb e t w e e nt h e mw e r e e x t r a c t e db yap e r l s c r i p t o rb yh a n df o rs o m eg e n e s t h e ns c a nt h es e q u e n c e c o l l e c t i o nf o rb o xc ds n o r n ac a n d i d a t e s t h e r ea r em a n ys n o r n a l i k es e q u e n c e s w i t hp e r f e c ts t r u c t u r ei n t h i sd a t a b a s e t h es e q u e n c e sf r o mi n t o n e sw i l lt r a n s c r i b e a s s o c i a t e dw i t ht h ee x p r e s s i o no ft h e i rh o s t s t h ed i s t r i b u t i o no ft h e s ec a n d i d a t e s s h o w sb i a st os o m ei o c i i ti st h er e s u l to fs n o r n ae v o l u t i o na n dt h e s ec a n d i d a t e s m u s tn o tb er a n d o ms e q u e n c e s w ef o c u s e do nt h e r mg e n el o c a t e da tc h r o m o s o m e 1 2 ，f ib a n d ，w h i c hm i g h tb er e l a t e dt oh u m a nn e u r a ld i s o r d e r r mw i t ht e ni n t r o n s c o n t a i n se i g h tb o xc ds n o r n ac a n d i d a t e s i n t e r e s t i n g l yt h e r ea r et h r e ec a n d i d a t e si n as i n g l ei n t r o n tb u tt i l ln o wi nm o u s et h e r ei sn o ta n ys n o r n ac l u s t e r m b i i - 4 2 6a n d m b i - 3 4 3w e r er e p o r t e dt oe x p r e s si nab r a i ns p e c i f i cm a n n e rb u to u rr e s u l t ss h o w t h a tt h e s ei m p r i n t e ds n o r n a sa r ee x p r e s s e di nm a n yt i s s u e se x c e p t k i d n e y t h i s c o n c l u s i o ni ss t r o n g l ys u p p o r t e db yu n i g e n ed a t a e x o n so f r mc a n te n c o d ea n y p r o t e i nl i k eu h g sa n d r m si n t r o n sa r ev e r ys m a l l ( i nc o n t r a s tw i t hp r o t e i n ) b u t m r n ao f r md o e s n th a v e5 t o pa n di n t r o n sa r ee v i d e n t l yl a r g e rt h a nt h o s eo f u h g s f u r t h e r m o r ew ef o u n dag e n ew i t hv e r yl o wc o p y , i t ss t r u c t u r ea n df u n c t i o n a r ei n v e s t i g a t e d u p t on o wt h e r em o r et h a n10i m p r i n t e db o xc ds n o r n a si nh u m a na n dm o u s e v 小鼠印记s n o r n a 及其宿主基因的研究 t h e s ei m p r i n t e db o xc ds n o r n a sh a v es t r i n g e n ts t r u c t u r ea n dt h i sm i g h tb ec r i t i c a l t ot h e i rp r o c e s s i n ga n dm a t u r a t i o n a l lt h ea n t i s e n s es n o r n a sa r ei n t r o n e n c o d e da n d t h i si m p l i e st h er e l a t i o n so f e x p r e s s i o na n df u n c t i o nb e t w e e ns n o r n a sa n dt h e i rh o s t s i n1 9 9 8s m i t he ta lf o a n dt h a ta l ls n o r n ah o s tm r n a sh a d5 t o ps t r u c t u r e a tt h a t t i m ea l ls n o r n a sw e r er r n a m o d i f i e d b u tn o wt h e r ea r ea b o u tt w e n t yo r p h a n s n o r n a sa n dw ef i n dt h eh o s t so ft h e s eo r p h a n sa r ea l l5 t o p l e s s t h i sf i n d i n g p r o v i d e sac l u et op r e d i c tt h ef u n c t i o no f o r p h a ns n o r n a s a tt h eb e g i n n i n gw ee s t a b l i s h e das m a l lr n ae d n al i b r a r yt os c r e e nn o v e l s n o r n a s i nm a m m a l sr r n aa n dt r n aa c c o u n tf o rm o s to ft o t a lr n a sa n dt h u s t h e ya n dt h e i rf r a g m e n t sw i l la c c o u n tf o rm o s to fe d n a i nae d n al i b r a r y t oa v o i d t h er r n aa n dt r n ac o n t a m i n a n t sw ep r o p o s e dt oe s t a b l i s has m a l lr n ae d n a l i b r a r yw i t ht o t a lr n af r o mm o u s el i v e rc e l l n u c l e u sc o n s i d e r i n gt h a tr r n aa n d t r n aa r ec e l l u l a rr n a s w eg o t h i g h l yp u r i f i e d n u c l e u sw i t ha ni m p r o v e d c i t r i c - a c i d - s u c r o s eg r a d sm e t h o d t h e nw ee s t a b l i s h e dae d n al i b r a r yf r o mt o t a l r n a sf r o mp u r en u c l e u s t h ee d n al i b r a r yw a sh i g h l yq u a l i f i e da n dr a t i oo f s n o r n a sc a nr e a c h8 0 a n ds e v e r a ln e ws n o r n a sh a v eb e e ni d e n t i f i e d m a m m a l sh a v ev e r yh u g eg e n o m e sa n dt r a n s r i p t o m e s t h ec o m p o n e n t so fa m a m m a l i a nc e l la r ev e r yc o m p l e xs u c ha sa b u n d a n c eo fg r e a s ei nb r a i na n dh e p a t i ni n l i v e r r e s p e c t i v e l y t h eh i g hc o n c e n t r a t i o no fr n as a m p l e si sr e q u i r e dw h e nt h e n o r t h e r nb l o to fal o w - c o p i e ds n o r n ai sc a r d e do u t b u tt h ec o n c e n t r a t i o ni sl i m i t e d b yt h ea l lk i n d so fc o n t a m i a n t st h a tc a nm a k er n as a m p l e sv e r ys t i c k ya tac e r t a i n c o n c e n t r a t i o n w ea d o p t e dam e t h o dt os e p a r a t et h es m a l l m o l e c u l a r - w e i g h tr n ao u t f r o mt o t a lc e l l u l a rr n a t h ep u r i f i e ds m a l lr n ai sv e r yg o o df o rl o a d i n gi nav e r y h i g hc o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：m o u s e ：b o xc ds n o r n a ；i n t r o n ：i m p r i n t e dg e n e ：五研：5 t o p i m p r i n t i n g ； v 【 肖裕中山大学博士学位论文2 0 0 6 年6 月 引言 人们很久前就认识到，生物的代代相传，性状总体上是遗传的不变的，正所 谓种瓜得瓜，种豆得豆，子代和亲代可能会略有差异。直到十九世纪，孟德尔才 发现了遗传学的基本规律，这些规律为遗传物质所承载但遗传物质本身仍然不 为人所知。脱氧核糖核酸( d n a ) 作为细胞核的重要组分，在1 8 6 8 年就被年轻 的瑞士化学家j o h a n nf r i e d r i c hm i e s c h e r 所分离。但长久以来人们并不知道它们 的生物学功能。直到二十世纪三四十年代，艾弗瑞( a v e r y ) 等利用肺炎球菌( s p n e u m o n i a e ) 【2 l 设计巧妙的感染实验证明了d n a 就是遗传物质，但这个说法在 当时还是受到了很多的质疑。克里克和沃森在1 9 5 3 年成功地解读了d n a 的双 螺旋结构，结果发表在 n a t u r e ) 【3 】，这标志着分子生物学的到来，并且引发了 生物学在分子水平上的蓬勃发展，后续的一些发现使人们深信不疑一一d n a 就 是遗传物质。在此之后的几十年，与此相关的的技术，也得以长足的发展一一桑 格测序法，p c r 技术，测序的自动化。这些技术都极大地推动了分子生物学的 进步。到2 l 世纪初，人类已经完成了许多模式生物的基因组计划，还有许多模 式生物的基因组计划正在进行当中。供分子生物学研究的d n a 序列数据越来越 多，已经远远超出了科学家们全面地研究这些序列的能力，也由此越来越多的问 题呈现出来，提供了更广阔的研究的领域和空间。 人类基因组完成后，随之完成的还有多种植物和其它脊椎动物的基因组，随 后也对它们进行了粗略的注释和比较。在比较了各种基因组之后，有些发现是令 人震惊的一一较低等的植物( 如水稻os a t i v a ，拟莆芥a t h a l i a n a ) 的基因数目 比人类hs a p i e n s 、小鼠mm u s c u l u s 还要多很多；人类和小鼠的区别是不言而喻 的，然而他们的蛋白质编码基因的总体序列相似性达到了9 9 ，令世人大为惊 讶。各种生物间基因组的差异给人们带来的疑惑和惊讶远远不止于此。 人们越来越认识到，生命的复杂度，不仅在于蛋白基因的数目，还在于调控 方式。人类基因数的预测数目跟基因组完成后计算机分析得到的基因数目，大相 径庭。这让科学家们思考，基因到底是什么? 他们的关系又是怎样的? 为何植物 的基因比人类还多，为什么小鼠的基因跟人类的如此相似，尽管他们的外部特征 是那么的不同。随着研究的深入，答案慢慢地浮现出来一一基因调控的区别和非 编码基因( r n a 基因，n c r n a s ) 的区别可能主要地造成了这些现象。很久以来， 人们就认识到，在细胞中无论高等生物还是低等生物，普遍存在着非编码的 r n a 。从早期的t r n a ，r r n a 到s n r n a ，s n o r n a ，直到近期的s i r n a 和 m i c r o r n a ，这些不编码蛋白质的r n a ，逐步地挑战并改变了人们对基因的传统 小鼠印记s n o r n a 及其宿主基因的研究 认识，即一个基因一个酶；也拓宽了人们对基因凋控的认识，即r n a 广泛地 参与了基因表达的精细调控。现在国际上对非编码r n a 的研究也是日新月异， 竞争也异常地激烈。不仅如此，大部分的s n o r n a 的以及一部分的m i c r o r n a 在 内含子中编码，促使人们对真核生物的内含子进行重新认识一一真核生物中的内 含子并不是垃圾d n a 序列，它们有丰富的功能，甚至不可缺少。这些寄生在内 含子中的有趣的小分子也成为了进化生物学家研究的对象。 核仁小分子r n a ( s n o r n a ，s m a l l n u l e o l a r 墅坠) 是目前己知的非编码r n a ( n c r n a ，一n o n - c o d i n gr n a ) 中数目最为众多的一种。核仁小分子r n a 广泛存 在于真核生物和古细菌中。核仁小分子序列的一级结构和二级结构能结合特定的 蛋白，让它们定位于细胞核中的核仁。尽管它们定位于核仁，功能却是相当多 样一一r r n a 、s n r n a 的修饰，r r n a 剪接，t r n a ( 古细菌中) 的修饰，以及新 近报道的m r n a 的选择性剪接【4j 。由此可见s n o r n a 在细胞中起着非常重要的 作用。 仅仅通过基因组并不能直接地解读生命现象，反而它提出了更多的问题。人 们越来越意识到，基因组只是一种生物的遗传信息载体。而这些信息的表达过程， 就是基因的表达过程。基因的区域性表达精确地控制了特定的器官特定的组织的 生成；基因表达的时序性操控着发育现象；某些基因表达的失凋导致了癌症：等 位基因按亲本来源选择性地表达造成了基因组印汜( g e n o m i ci m p r i n t i n g ) 现象， 等等。以上这些现象都是都是基因组不能涉及的，它们是表观遗传学研究的范畴。 表观遗传是指在生物的减数分裂和有丝分裂中可以遗传的基因表达改变，但这种 改变不是由基因的d n a 序列本身来决定的遗传方式。意识到表观遗传学的重要 性，英国和德国于2 0 0 3 年底，启动了人类表观遗传学计划( h e p ， _ h u m a n 助i g e n t i c sp r o j e c t ) ，旨在快速地，全面地了解人类基因组中的与表观遗传密切相 关的d n a 修饰状况，这对理解人类基因的表达调控以及许多的疾病起着重要的 作用。目前而言，有三个系统来启动和保持表观遗传沉默：l 、d n a 甲基化；2 、 r n a 相关的沉默；3 、组蛋白修饰。 印记现象与d n a 甲基化有密切的关系，也有大量的反义r n a 参与印记的 形成和维持。印记基因除了几个被称为m i c r o i m p r i n t i n gd o m a i n 口j 的区域外一股都 是成簇的。近年来，不断地有印记( i m p r i n t e d ) n c r n a 被报道，许多有趣的生 物学和病理现象与之密切相关，其中就有s n o r n a 和m i c r o r n a l 6j 。m b l i - 5 2 是 研究得相对比较清楚得一种印记s n o r n a ，最近被证明直接跟m r n a 的选择性 剪接相关，而这个m r n a 对神经发育相当重要l 。本研究通过生物信息学方法， 通过实验，寻找到了几个新的s n o r n a 和n c r n a ，有趣的是，这些s n o r n a 的 宿主基因本身也是不编码蛋白质的。越来越多的报道表明，r n a 分子广泛地参 肖裕中山大学博士学位论文2 0 0 6 年6 月 与了表观遗传的控制过程。可以预料，会有越来越多的非编码r n a 分子及其功 能会被阐述。r n a 为中心的调控网络在生物中特别是高等生物中己露端倪2 i 。 小鼠印记s n o r n a 及其宿主基因的研究 1 1s n o r n a 的概况 第一章综述 第一节s n o r n a 的概况 按成熟后的定位，细胞中有三大类小分子r n a t ”1 ：一种是位于细胞质中的 胞质小分子r n a ( s c r n a ，s m a l lc y t o p l a s m i c sr n a ) ，比如t r n a ，转运氨基酸， 在蛋白质合成中起重要作用；s r p ( s i g n a lr e c o g n i t i o np a r t i c l e ) 中的r n a 组分， 它帮助蛋白质翻译后的定位，穿膜：另一种是位于细胞核中的核小分子r n a ( s n r n a ，s m a l ln u c l e a rr n a ) ，如u ，、明、晒和w ，它们与m r n a 的前体 ( p r e m r n a ) 的内含子剪切有密切的关系，是s p l i c e o s o m e 的r n a 组分；第三种 就是核仁小分子r n a ( s n o r n a ，s m a l l _ n u c l e o l a r 斟a ，) 。因为这类小分子r n a 代 谢稳定，且富集于核仁中，所以被称为核仁小分子r n a 。s n o r n a 大小约在 7 0 3 0 0 n t 范围之内，典型的s n o r n a 具有以下四个主要特征1 1 4 i ：1 ) 主要富集于 核仁区域；2 ) 具有类似核仁提取物的性质( 抗盐性) ：3 ) 与核仁纤维蛋白 ( f i b r i l l a r i n ) 相关，能够与抗f i b r i l l a r i n 的抗体共沉淀；4 ) r n a 分子中具有特定 的一级序列元件和二级稳定结构。和m r n a 不同，s n o r n a 没有3 端的“p o l ya ” 尾巴，但在5 端有各种修饰【1 4 ”j 。s n o r n a 与在m r n a 的加工中起作用的s n r n a 相比，具有明显的不同。它们在细胞定位、结构特征等方面都有显著的差异，而 目执行完全不同的生物学功能l l “。不同种类的非编码r n a 在生物的三个界 ( k i n g d o m ) 的分布如图1 1 i i 。 和其它种类的小分子r n a 一样，s n o r n a 不是以自由的r n a 的形式存在， 而是需要与特定的蛋白质结合并以核糖核蛋白体( s n o r n p s ，r i b o n u c i e o p r o t e i n p a r t i c l e s ，) 的形式存在和行使功能【l “。用免疫荧光标汜的方法通常可以在核仁中发 现特异性的抗原【1 7 1 。绝大多数以核仁为目标的抗体都可以直接和f i b r i l l a r i n 作 用。f i b r i l l a r i n 是一种在进化上保守的蛋白质，位于核仁中的致密纤维区( d e n s e f i b r i l l a rc o m p a r t m e n t l 。这里也是r r n a 早期加工和核糖体装配的地点。f i b r i l l a r i n 的抗体可以和许多脊椎动物的s n o r n a 共沉淀，这些s n o r n a 既包括具有2 ，2 ，7 三甲基鸟苷帽子( t m gc a p ) 的、明，也包括由结构基因内含子编码的叫4 、 肖裕中山大学博士学位论文2 0 0 6 年6 月 u 2 4 等 m i 。绝大多数鉴定自酿酒酵母( c e r e v i s i a e ) 基因组中的s n o r n a 也可以 被人类f i b r i l l a r i n 的抗体沉淀下来。这表明了f i b r i l l a r i n 的保守性，也显示了它 和s n o r n a 之间的关系 e u k a r v o t e b a c t 图l - ir f a r o 收录的非编码m a 在生物的三个界的分布 f