（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥slo基因启动子区重要顺式调控元件的鉴定.pdf

摘要 糖作为信号分子可以与植物激素( 如乙烯、a b a 、细胞分裂素) 相互作用。近年来，在拟南芥 糖信号突变体的遗传学和分子生物学研究中发现了糖和植物激素信号传导途径之间存在复杂的相 互作用和联系，这些突变体除了对糖的应答反应发生了改变之外，其表型也与a b a 乙烯信号传导 突变体的表型非常相似。 本实验室获得了一个拟南芥隐性突变体m o ，该突变体在叶片伸展、开花和衰老等不同发育 阶段都表现为延迟：同时对乙烯具有部分抗性，而对a b a 和糖表现超敏感。利用图位克隆法分离 了s l o 基因，发现该基因编码一个功能未知的p p r ( p e n t a t r i c o p e p t i d er e p e a t ) 蛋白。多方面 的研究结果显示，s l o 基因同时参与了糖、a b a 以及乙烯的信号传导。 为了解皿口基因启动子的时空表达模式，以及鉴定该启动子区内部可能的重要顺式调控元件， 本实验通过对s z o 基因的启动子进行缺失分析( d e l e t j o na n a l y s i s ) ，获得一系列缺失启动子， 将缺失启动子与g u s 报告基因融合，通过农杆菌介导的遗传转化获得一系列转基因植株，然后用 包括糖在内的不同信号分子对转基因植物进行处理，通过g u s 染色，初步确定s l o 基因启动子区 一些重要顺式调控元件的位置：糖反应调控元件位于基因上游启动子区一5 4 9 b p - - 2 8 7 b p 这一区 段。定性和定量实验表明：在暗培养条件f 生长5 天的幼苗g i s 染色主要表现在胚轴和根尖分生 区部位，糖上调g u s 的表达，a c c 和a b a 下调其表达：a c c 和糖同时处理，g u s 的表达低于只用糖 处理，但高于只用a c c 处理。在正常条件下生长4 0 天的植株，g u s 基因在成熟花的花丝和叶柄中 表达强烈，在茎中也有比较高的表达，而在叶中表达微弱，在根中未发现其表达。 上述结果表明，s l o 基因启动子区糖反应调控元件位于启动子区一5 4 9 b p - - 2 8 7 b p ，对糖特 异诱导基因的表迭起关键作用。配口基冈的表达同时受到糖和乙烯的调控，而且乙烯可以拮抗糖 对s l o 基因的诱导表达。在成熟的拟南芥中，出口在茎、花( 成熟) 和叶柄中表达水平较高，与 幼苗期的表达模式明显不同，说明s l o 基因的表达受到植物生长发育的调控。 关键词：s l o 基因，启动子，激素信号传导，顺式调控元件，糖反应调控元件 a b s t r a c t a sas i g n a l i n gm o l e c u l e ，s u g a rc a nc o o p e r a t ew i t hp l a n th o r m o n e s ( e t h y l e n e ，a b s c i s i ca c i d ) r e c e n t l y , g e n e t i c sa n dm o l e c u l a rb i o l o g ys t u d i e so ns u g a rs i 弘a l i n gm u t a n ti na r a b i d o p s i sh a v er e v e a l e dt h a tt h e r e a r ci n t e r a c t i o n sa n dc o n n e c t i o n sb e t w e e ns u g a ra n dh o r m o n es i g n a l i n gp a t h w a y s b e s i d e st h ec h a n g e si n r e s p o n s et os u g a rs i g n a l i n g ，t h ep h e n o t y p e so ft h e s em u t a n t sa r es i m i l a rt oa b a e t h y l e n eb i o s y n t h e s i s m u t a n t s w ei d e n t i f i e da l la m b i d o p s i ar e c e s s i v em u t a n ts ow i t hd e l a yi nv a r i o u sd e v e l o p m e n t a ls t a g e s ，s u c h 雒l e a fe x p a n s i o n 。f l o w e r i n ga n ds a n e s e e n e e t h i sm u t a n ta l s oe x h i b i t sl e s ss e n s i t i v i t yt oa c c ，t h e e t h y l e n eb i o s y n t h e s i sp r e c u r s o r , a n de t h y l e n er e g a r d i n gt h e i ri n h i b i t o r ye f f e c t so nl e a fe x p a n s i o n ，p a r t i a l r e s i s t a n c et oe t h y l e n ea n dh y p e r s e n s i t i v i t yt oa b s c i s i ca c i d ( a b a ) a n ds u g a r 镕w e l l w ei s o l a t e ds l ob y m a p - b a s e dc l o n i n ga n dp r o v e dt h em u t a t e dg e n ee n c o d e sap e n t a t r i e o p e p t i d er e p e a t ( p p r ) p r o t e i n s e v e r a l l i n e so fe v i d e n c eh a v es h o w nt h a ts l oi si n v o l v e di ns u g a r , a b a a n de t h y l e n es i g n a l i n g t on h a m c t c r i z et h es p a t i a la n dt e m p o r a le x p r e s s i o np a t t e r n so fs l oa n di d e n 碰yt h ep o s s i b l e e i s - e l e m e n t si nt h ep r o m o t e rr e g i o nr e s p o n s i b l ef o rs u g a r h o r m o n er e s p o n s e s ，w eo b t a i n e das e r i e so f d e l e t e dp r o m o t e rf r a g m e n t s ，f u s e dw i t har e p o r t e rg e n ee n c o d i n g1 3 - # u e n r o n i d a s e ( g u s ) t h e ni n t r o d u c e d i n t oc o lw i l d - t y p ep l a n t st h r o u g ha g r o b a c t e r n o n m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n t h es 础呻o fm u l t i p l e i n d e p e n d e n tt r a n s g e n i cl i n e sw e r eg r o w no nh a l fm sm e d i as u p p l e m e n t e dw i t hd i f f e r e n ts i g n a l i n g c o m p o n e n t si n c l u d i n gs u g a r w ef o u n dg u s - a t a i n i n gw a sr e a d i l yv i s i b l ei nr o o tt i p sa n ds h o o ta p e x e so f 5 - d a y s - d a r kg r o w ns e e d i 略t r a n s f o r m e dw i t hf u l ll e n g t hp r o m o t e r - g u sf i j s i o ng a n e ；s u g a re n h a n c e d g u s e x p r e s s i o n ，w h e r e a sa c ca n da b aa t t e n u a t e dg u se x p r e s s i o n w h e nt h ee t i o l a t e ds e e d l i n g sw e r e t r e a t e dw i t hb e t ha c ca n ds u g a r , g u se x p r e s s i o nw a sl o w e rt h a nt h a tt r e a t e dw i t hs u g a ra l o n eb u th i g h e r t h a nt r e a t e dw i t ha c c a l o n e h o w e v e r , t h e4 0 d a y - o l da d u l tp l a n t ss h o w e ds t r o n gg u s - s t a i n i n gi ns t e m s a n df i l a m e n t sa n ds t a m e n so ff l o w e r s w e l l w i t he x c e p t i o no f f l o w e rb u d s , l e a v e sa n dr o o t s w ef o u n d t h es u g a r - r e s p o n s i v ec i s - e l e m e n t sr r el o c a t e di n 5 4 9 b p - - 2 8 7 b pr e g i o no fs wp r o m o t e rb y g u s - s t a i n i n g t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h es u g a r r e s p o n s i v ec i s - e l e m e n t so f s l oa t e l o c a t e d i n 一5 4 9 b p - - 2 8 7 b p o f t h ep r o m o t e r , a n dm a y p l a yi m p o r t a n tr o l e si ns u g a r - i n d u c e dg e n ee x p r e s s i o n t h es l oe x p r e s s i o ni s c o n t r o l l e db ys u g a ra n de t h y l e n e ，a n de t h y l e n ec a l lr e p r e s ss u g a r - i n d u c e ds l oe x p r e s s i o n t h es t r o n g g u s e x p r e s s i o ni ns t e m s , a n df i l a m e n t sa n ds t a m e n so f f l o w e r si na d u l tp l a n t si m p l i c a t e ss l oe x p r e s s i o n i sp r o b a b l yd e v e l o p m e n t a l l yr e g u l a t e d k e yw o r d s ：s l o ，p r o m o t e r , h o r m o n es i 印a l i n g c i s - e l e m e n t s ，s u g a rr e s p o n s i v ee l e m e n t s l i 评阅人和答辩委员会 论文评阅人： 华学军 马有志 研究员 研究员 中国科学院植物研究所 中国农科院作物科学所 答辩委员会主席： 林敏 研究员 中国农科院生物技术研究所 答辩委员会成员： 张根发教授 华学军研究员 黄荣峰研究员 赵军 研究员 答辩时间：2 0 0 5 年6 月2 9 日 北京师范大学 中国科学院植物研究所 中国农科院生物技术研究所 中国农科院生物技术研究所 主要缡略语表 a b a ：a b s e i s i ca c i d a b r e ：a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t a b l 4 ：a b s c i s i ea c i di n s e n s i t i v e4 a c c ：1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 - c a r b o x y l i ea c i d b h l h ：b a s i eh e l i x - l o o p - h e l i x b p ：b a s ep a i r b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n b z i p ：b a s i cl e n c i n ez i p p e r c a m v ：c a u l i f l o w e rl l l o s a i cv i r u s c e x ：c e f o t a x i m e c r r i ：c o n s t i t u t i v et r i p l er e s p o n s e1 c t k ：c y t o k i n i n d e p c ：d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e b ：e t h y l i eb r o m i z e e r e ：e t h y l e n e - r e s p o n s i v ed e m e n t e t r l ：e t h y l e n er e s i s t a n t1 g u s ：p 1 9 1 u c u r o n i d a s e g i n 2 ：g l u c o s ei n s e n s r i v e2 | 蕊k x o k i n a s e i a a ：i n d o l e 3 一a c e t i ca c i d k a n ：k a n s m y c i n k b ：k i l o - b a s ep a i r m e j a ：m e t h y lj a s m o n a t e m s ：m u r a s h i g ea n ds k o o g v b l ：v i t a m i n 熬l v b 6 ：v i t a m i n 战 4 w m u ：4 - m e t h y l u m b e d l i f e r o n e 4 - m u g ：4 - m e t h y i n m b e r l l l f e r y1 3 - d - # u r o n i d v i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：一f 吁 时间：驴j 年6 月弓口日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签轹t f 寸 时间：触s 年6 月如臼 导师签名：7 磊琢义 时间：珈r 年石月弓。日 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言 第一章引言 植物激素是一些在植物体内合成，对其生长发育产生调控作用的微量有机物。植物激素几乎 参与了植物生长发育过程中所有的生理过程；从细胞的生长、分裂和分化，到种子休眠、果实发 育、性别分化和衰老及抗逆性等。 植物的生长和发育调控是一个错综复杂的网络，不同信号途径对激素、新陈代谢和外界因素 胁迫刺激的应答具有高度协调性。大量的生理学和遗传学证据表明，在植物应答和不同信号刺激 之间存在相互影响，某一个基因突变可以同时影响植物对一种以上激素的应答。 糖也是一种信号分子可以与植物激索( 如：乙烯、a b a 、细胞分裂素) 相互作用。近年来， 在拟南芥糖信号突变体遗传学和分子生物学研究中出人意料地发现，糖和植物激素信号间存在对话 ( c r o s s t a l k ) 。这些突变体除对糖的应答发生改变之外，其表型与a b a 乙烯生物合成途径或信号传导 途径突变体的表型也非常相似。例如，拟南芥g i n l ( g l u c o s ei n s e n s i t i v ej ) 突变体中子叶和胚的发 育对葡萄糖不敏感，这与野生型植物被乙烯前体a c c 处理后的表型或者组成型乙烯突变c t r l - 1 ( c o n s t i t u t i v et r i p l er e s p o n s ej ) 表型相一致，然而，乙烯不敏感突变体e t r l j ( e t h y l e n er e s i s t a n tj ) 却表 现为葡萄糖超敏感性。种子特异的a b a 响应转录因子a b l 4 ( a b s c i s i ea c i di n s e n s i t w e4 ) 的葡萄糖 诱导表达在葡萄糖不敏感的突变体g n 6 ( g l u c o s ei n s e n s i t i v e6 ) 中被消除，表明a b l 4 可能与葡萄 糖和种子特异的a b a 信号传导都有关。a b l 4 、a b l 5 和c t r l 的表达都受到包括葡萄糖、渗透压、 a b a 在内的多种信号的调控( l a b y rj e t a l ，2 0 0 1 ) 。 1 糖信号感应和信号传导 糖是植物生长发育和基因表达的重要调节阕子，它不仅是能量来源和结构物质，而且在信号 传导中具有类似激素的初级信使作用( r o u d e t a l ，2 0 0 1 ) , 糖信号感应和糖信号传导在植物的整 个生命周期中调控其生长和发育。在种子萌发和幼苗发育早期，糖可抑制营养成分的转运、下胚 轴伸长、子叶变绿和子叶伸展( s m e e k e n s ，2 0 0 0 ；a r e n a s h u e r t e r oe t a l ，2 0 0 0 ) 。糖可调控植物 的开花周期，且对花形态建成等方面具有不同程度的影响，这依赖于糖的浓度、植物的营养生长 阶段和遗传背景( c o r b e s i e r e t a l 1 9 9 8 ；z h o u e t a l ，1 9 9 8 ；r o l d a ne t a l 。1 9 9 9 ；o h t oe t a l ，2 0 0 1 ) 。 此外，糖信号还可调控叶片的衰老及植株的防御反应( q u i r i n oe t 以，2 0 0 1 ；y o s h i d ae t a l , 。2 0 0 2 ) 。 1 1 糖信号分子 以往认为，糖对代谢、生长、发育、胁迫和基因表达的调节是糖代谢的结果。然而，用不能 代谢或部分代谢的己糖或己糖和蔗糖类似物来研究糖对基因表达的调控作用发现，特异的信号感 应和传导不需要通过糖的分解代谢来实现( g r a l l me t 以，1 9 9 4 ；l a n ga n ds h e e n ，1 9 9 4 ；l o r e t ie t a 1 ，2 0 0 1 ) ，也就是说，糖分子本身在植物的生长、发育、成熟和衰老等许多过程中具有调控作用 ( k o c h , 1 9 9 6 ；k o c he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 从理论上讲任何一种中性糖分子或糖酵解的中间代谢物都具有信号功能( k o c h e t a l ，2 0 0 0 ) ， 】 中国农业科学院硕士学位论文第一章引 言 然而事实并非如此。蔗糖是植物体碳水化合物运输的主要形式，并且常被用来研究糖对植物生长 发育和基因表达的调控作用( k o c h , 1 9 9 6 ) ，但是在大多数情况下，蔗糖的这种作用可完全被己糖( 例 如果糖和葡萄糖) 所替代。例如，蔗糖对光合基因表达的抑制作用可通过低浓度的己糖实现( j a 略 a n d s h e e n ，1 9 9 4 ；j a n ge t a l ，1 9 9 n ；在玉米原生质体中，葡萄糖和果糖比蔗糖作为信号分子能更有 效地抑制光合相关基因的表达( k o c h ，1 9 9 6 ) 。由此说明，许多情况下蔗糖并不是直接的信号分子。 故一些作者认为，葡萄糖和果糖可能是直接的信号分子，而蔗糖在行使信号功能前已经转化成己 糖( j a n ga n ds h e e n ，1 9 9 4 ；1 9 9 7 ) 。 1 2 植物的多重糖信号感应机制 为了激活信号传导途径，糖首先要作为信号分子被植物细胞识别和感应，然而，糖作为营养 成分和信号分子的双重功能使得相关研究变得非常困难。大量事实证明，植物存在多重糖信号感 应机制，在植物细胞中存在多个糖信号感应位点( i 虱1 - 1 ) ( j a n ga n d s h e e n , 1 9 9 7 ；s m e e k e n a n d r o o k , 1 9 9 7 ；s h e e ne ta l ，1 9 9 9 ；l a l o n d ee ta l ，1 9 9 9 ；g i b s o n ，2 0 0 0 ；s m e e k e n s ，2 0 0 0 ；l o r c t i e ta 1 ，2 0 0 1 ；s i n h a e ta l ，2 0 0 2 ) 。 图1 1 植物细胞中可能的糖信号感应位点 f i g p o s s i b l es u g a rs i g n a l sa n ds e n s i n gs i t e si np l a n tc e u s ( f i i i pr e ta ，2 0 0 2 t h ep l a n tc e | i ) 2 中国农北科学院硕士学位论文 第一章引畜 i i 1 2 。i 基壤馕号蕊废酾已耱激酶魏辖爰 融糖激酶( a x k ) 是糖酵解中的一个关键酶，其功能是催化己糖磷酸化。近来有证据表明h x k 可作为葡萄糖感受器( s 。n s o f ) 使细胞间糖信号被感应，从而触发糖信号传递。 k 是一个双功 能熬辫，鞠吴灌纯耱辘帮调节魂麓，显这嚣餮凄怒楚l 螽联豹搿 o 惴a n ds h e e n ，1 9 9 9 ；x i a o 样a ， 2 0 0 0 ；l o r c t ie t a l ，2 0 0 1 ) 。 擞持这一观点的证据主要来自两方面的实验结果：一是用糖类似物( 非生理性糖) 所做的实 验，二是h x k 的正义和反义转基因拟癍莽实 ( t d r e t ie t a l ，2 0 0 1 ) 。用糖类似物所做的实验表明，只 舂霹作为 d 医煞赢镶鹃糖类经物力对糖谣燕豹萋潮疑有翡节终蠲，铡露营露蕤耩2 麓氧蘩甍耱 ( 能被脚诹磷酸化) w 抑制光合基因的表达，而6 脱氧葡萄糖和3 - o 甲基葡萄糖( 不能被m 张磷 酸化) 或糖酵解的中问代谢物均无此效果0 a n ga n ds h e e n ，1 9 9 4 ) 。i i 百通过电渗法将6 _ 磷酸葡萄糖擞 接g 入原生质体也不戆产生上述效暴，说明启动糖傣号的是己穗磷酸证的过程藏j 磷酸他的糖本 身( l o r e t i 硝a ，2 0 0 1 ) 。藏辩，h 骚：律涛糖感受器豹观点避一步被下期观察涯朝，我婚磊率铺泰卜静一 甘露胰酮糖的使用阻断了2 脱氧葡萄糖介导的对光台基因表达的抑制作用o a n ga n ds h e e n ，1 9 9 4 ) 。 皮用转基因的方法为h x k 作植物感受器提供了更为直接的 正据。目前，己从拟南芥中克隆出 了嚣令l 隧基因：a 磁溉舔珏a 珐觎段。 珐麟f 或簇蹒瞄融基因的i 义或反义过畿袭这分别导致拟 南芬瓣糖盼超敏感釉不敏感，而酵母强黝摹困谯织南莽中的过鬣表达剥降低了对糖盼敏感性， 虽然该酶的催化活性有显著提高。由此说明， d 澈的催化功能和调节功能是非偶联f b j ( j a n g e t a l ， 1 9 9 7 ) 。目前已在酵母中分离得到l k 的催化功能和信号功能非偶联的突变体( 1 - i o h m a n ne ta ， 1 9 9 9 ；m a y o r d o m oa n ds a n z , 2 0 0 1 ) 。 穰物不仅存在依赖h x k 的糖储号传导途径，墩存在不依赖m 泓的糖信号传导途径0 a n g a n d s h e e n , 1 9 9 7 ；s m e e k e n s ，1 9 9 8 ；l a l o n d e 甜a ，1 9 9 9 ) 。x i a o 等( 2 0 0 0 ) 祭统研究了田泓糍糖信号感应中 的作用，认为植物体内存在3 种不同的葡萄糖信号传导途径：依赖h x k 的途径、依赖糖酵解的途 经窝不获藏 d 隘的途径。在渡海中袋逡转纯酶基因瓣转基因煺鼙熬系缝获褥羲健戆诱导耧毙合嫠 困表遮的抑制实验表明：己糖信号感应可能包括一蹙未知途径( m o o r ea n ds h e e n ，1 9 9 9 ) 。 l ，z 2 蔗糖信号感成 潮于植物中的麟糖易水解成葡萄糖和果糖，所以对蔗糖特异的信号传导途径的解析较幽难 ( c o r u z z ia n dz h o u , 2 0 0 1 ) 。然而最近的实验表明，因植物存在蔗糖特异的信号传导途径从而影 响基阪的转录和翻译。例如，蔗糖能蟛特异性地诱鼯p 鑫t a t i n 启动子扇动基因转录( s 触n s ，2 0 0 0 ) 。 c h i o u 帮b u s h ( 1 辨秘蓠次涯饔，蒸耱麓特异蘧薅蔗糖蕊囱转运体( s y m p o r t o r ) 静转录帮蘸译遥行 调节，而己糖等其他糖则不具备此调节作用。不仅如此，蔗糖述特异性地抑制拟南芥a t b 2 基因 m r n a 前导序列的翻译( r o o ke t a l 。1 9 9 8 ) 。又如马铃藉细胞中蔗糖合成酶基因的表达只能被蔗糖诱 导，掰不能枝蘩萄糖诱导棼la n d p a r k ，1 9 9 5 ) ，且逡拳辛诱导需要s n 驳k l ( s l f l 相美缀鑫激酶 活投， 因兔艇义翻艘基戮在马铃薯袭蔓中的表这寻致藏糖合戒酶基嗣匏表达显著下降伊u f c e j l 跗a l ， 1 9 9 s ) o 3 中国农业利学院硕上学位论文第一章引言 蔗糖在植物体中也具有信号功能。目前已在植物中发现特异的蔗糖感受器s u t 2 ( l a l o n d ce l a l 1 9 9 9 ；b a r k e r e l a l ，m o o ) ，但也有报道认为，a t s u t 2 只是一个低亲和性的蔗糖转运体( s h u l z e e l a l 2 0 0 0 ) 。因此需要更多的令人信服的证据来阐明植物蔗糖信号感应的本质。 使i f = | j 非生理性的二碳糖在大麦上的实验表明，植物存在独特的二碳糖信号感应机$ 1 j ( l o r e t i 甜 a 1 ，2 0 0 0 ) 。除蔗糖外，另外一些二碳糖( 例如乳糖等) 均可抑制g a b 秀导的口淀粉酶基因的表达。 它们的信号感应机制不同于葡萄糖，主要是影响m r n a 的稳定性。形态和生理分析发现它们在 大麦胚胎中不能参加代谢，因此否定了其代谢的下游成分参与信号感应的可能性( l o r c f l 甜a l 2 0 0 0 ；c o r u z z ia n d z h o l l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 糖信号传导的遗传分析 对模式植物拟南芥进行遗传分析，- 为植物糖信号感应和糖信号传导的研究提供了独特的分析 方法。根据种子萌发和幼苗形成期糖调控的基因表达模式，以及对糖敏感性的不同，已经从拟南 芥中分离出许多糖信号传导突变体，如糖不敏感突变体和糖敏感突变体( l a b y 盯a l 2 0 0 0 ；r o o k 甜 a l ，2 0 0 1 ；r o l l a n de f a l ，2 0 0 1 ；2 0 0 2 ) 。拟南芥葡萄糖不敏感突变体曲口( g l u c o s e i n s e n s i t i v e 2 ) 的分离 为h x k 与糖信号感应及信号传导之间的直接联系提供了遗传证据。同时，通过对该突变体的表型 及遗传分析揭示了糖信号和激素信号间的相互作用( r o m a ne t a l ，1 9 9 5 ) 。 许多独立分离的糖不敏感突变体都属于等位基因，说明植物糖响应具有保守性限o a n de l a 1 ，2 0 0 2 ) 。例如，葡萄糖不敏感突变体砌j 与s i o 4 ( s u g a r i n s e n s i t i v e 4 ) 和i s i 4 ( i m p a i r e d s u g a r i n d u c t i o n 田为等位基因，g i n 4 与s i s l 等位，g i n 6 与s u n 6 ( s u c r o s eu n c o u p l e d6 ) 、s i s s ( s u g a r i n s e n s i t i v e 却和s 3 等 位( s h c e ne la 1 ，1 9 9 9 ；g i b s o n ，2 0 0 0 ；s m e e k e n s ，2 0 0 0 ；r o o ke la l ，2 0 0 1 ) 。 总之，迄今关于植物糖信号传导的遗传分析主要集中在对模式植物拟南芥糖响应突变体的筛 选和分离上。主要方法是通过培养基中添加高浓度或低浓度的糖进行处理，观察种子在该培养基 上萌发及成苗状况，以此筛选出对糖敏感或不敏感的植株( r o o ka n db e v a n 。2 0 0 3 ) ，该方法的局 限性在于只有在这一阶段表达相关基因的植株才能被筛选，而其他在种子形成期或萌发早期的 糖响应突变体则不容易从野生型植株中筛选出来，由此推断一些重要的糖响应突变体可能未被发 现。而且到目前为止，除p r l l ( p l e i o t r o p i cr e g u l a t o r yl o c u sj ) 突变体# b ( n e m e t h 甜a 1 ，1 9 9 8 ) ，许 多对葡萄糖或蔗糖高度敏感的突变体还没有详细研究。对拟南芥糖不敏感和高度敏感突变体进一 步的表型分析及相关基因的分子克隆有望揭示新的糖调控机制。 2 乙烯信号传导系统 气态激素乙烯在植物的生理过程中起着重要作用，包括种子萌发、器官衰老、器官脱落、果实 成熟和形态建成的应答也包括对生物逆境的反应。乙烯是所有植物激素中结构最简单的一种它 对植物的代谢调节可贯串其整个生活周期。作为信号物质，它的生物合成主要由a c c 合成酶和 a c c 氧化酶调控。通过对拟南芥中一系歹0 乙烯反应突变体的分析，人们掌握了很多在乙烯信号转 导中发挥作用的基因。 4 中戮农业科学院硕士掌能论文第一章引言 一i i i i 2 1 乙烯信号传繇途径的模型 在分离投游芥突变俸过程中获褥的 两类乙烯突变体，既乙烯不敏感型和乙 烯诱导的组成袭迭型，它们都对植物生 禽周期中大范隧的乙烯作用其霄影响。 裘鞠，这些己爝接震拥有一个典嚣瓣秘 始信号传导途径。在这条逸径中有证据 表明，e t r l 基因编码一个乙烯受体，作 为己烯信号传导途径中的最初受体。速 夸受俸是一个媵结合蛋自，与绷莲熬两 缀分调节因子h i s 激酶具有阍源性。另 外，e t r l 基因位点的突变体对乙烯完全 不敏感。毅突变体分析表明，e t r l 的一 个下游基因是d 豫j 。c t r l 编褥一个与 r a f 激酶霹添豹溅彝霞，e 7 炎? 佼点煞突 变导致乙烯调节的途径组成型激活， c t r i 是乙烯储号传导途径的负调节因 子，其下游基隧髓e i n 2 。尉蕊因位点 戆突变俸夯对己燎完全不敏感。最近， 乙烯信号传导谂径中的一些灏成员也已 经发现，基于上述这些发现，e c k e r 等 ( 2 0 0 4 ) 提出了如下乙烯信号传导途径的 耨模型f 圈1 - - 2 ) ： 2 2 乙烯信号感威和传导的可能机制 2 2 。l 艺爆与e t r l 器蠡的相互 乍粥 图1 - - 2 赫因表达调控中的乙烯鹰簪途径模型 f i g1 - 2am o d e lf o rt h ee t h y l e n er e s p o n s ep a t h w a yl nt h e r e g u l a t i o n 时g a n ee x p r e s s i o n 。 ( e c k e r ，e f4 ，+ 2 0 0 4 c u r r a n t o p i n i o n t n p l a n t b t o l o g y ) 已有充分的证据说明e t r l 魁植物中的一个己烯受体。遗传分析提供的谜据表明，e t r l 作 用予对乙烯信号传爵有影响的其它熬因位点的上游。b l e e e k e r 等发现，e r r l ，突变体植株的饱年珏 结念己爝麴悲力只裙黔生整麴1 5 。e t r l 与鲴蓑中感应蛋自匏类豫性说臻e t r i 霹终鸯己爝壤母 感巍援鑫，但是其氮基酸序飘并没帮显示出任何可与乙烯结合的明屋特征。为辘定e t r i 是喾蠢 接与乙烯作用，科学家在酵母中表达了e t r l 蛋自，并使酵母细胞获得了乙烯商索和性结合位点。 对e t r i 蛋白的突变体分析表明，e r r l f 突变消除丁转基园酵母细胞的乙烯结合自力，这与e t r l * ， 突变俸攮撩缝台乙烯瞧力懿下辫燕一致耱，致纛孵释 突变髂攮撩巍馥么对乙烯不敏感。 2 2 2 乙烯受体向下游组分传导倍崂的可能机制 尽饕嚣蔫巍寒程囊接熬生秘纯举 蒌攘衰弱，e t r l 蛋鑫熬激辩嚣域簧导己惩壤号采蘑缁越嚣 组分鬟统同样的机制，但e t r l 与这些系统的序列同濂性完全袭明了采用同样机制的可能性。梭 s 中国农业科学院硕士学位论文第一蕈弓i肖 照细谪的乙烯信号传导系统推测，我们应当能发现一种应答调节礞自作为e t r i h i s 激酶的基质。 毽燕撵毒芬痿号传譬豹基因分辑表鹾，在e t r l 霹已鉴定鲞弱。f 游辍邻爨势c r r l 之淹毒发璇这 样的成答调节蛋白。w 能是进行突变体基爵筛选过襁中遗失了这种器臼；也可能榱本不存在这种摄 白，己烯受体通过其它机制传导其倍号。 3a b a 的功筑疑德号传导 脱落酸邮a ) 是调节植物生长发育的一种激索。起初人们认为a b a 是一种生长抑制物成t 现在发现它参与植物胚胎发育、种予体瞩、果实成熟以及逆境胁逡等许多方珏，蔟作用机制也逐 灏羰谖识。在辩子发育过程孛，a b a 负责贮存蛋囱豹积累与稚予髓隶赣组织熬存活。在静予爱 育期殿成熟后，a b a 负责种子萌发的调节作用，既可阻止种子稿发，也可诱导种子休眠。在种 予自身萌发过程中，a b a 可抵消赤霉索( g a ) 诱姆水解酶的作用。在种子发育越程中，a b a 可 诱导鞭子分化，健谶艇的发育。在摊子成熟过疆申，a b a 於作爝与胁追反应( 如对脱水作用的 缳护) 籀关。豫了辩这释内源秘追艇应中豹作增外，a b a 也参每褴耪对争 涿耱涟( 如干旱袋水 胁迫、低温胁迫及盐胁迫) 中的反应。此外，a b a 可促进叶、械、果的脱落，诱导芽和块墓的 休腻调节气孔的关闭以阻止过餐水分损失，也可诱导几个参与保护脱水损害( 如醛糖还原酶 a l d o s er e a u c t a s e ) 鏊闲鳃表这。 摇南芥a b a 不敏感突变体a b i 2 ( a b a i n s e n s f i “。i v e j ) ，a b i 2l 4 b a i n s e n s i t i v e 2 ) 帮a b i 3 ( a b a i n s e n s i t i v e 3 ) 的种子休眠程度均显蒋降低其中a b i 3 影响种子发育过程，但不影响蒸腾过程；i 丽 口6 “和a b i 2 除了降低种子休眠程度外并不影响种子发育但能够加强叶片蒸腾，导致植物萎蔫。 团怼扶隽，a b l 3 基戮产物主要在耱子发育验段笈揲掺蘧，露a b l l 释a b l 2 奁黪券生长蹬段发撵 乍丽。a b l 3 基因已通过图位克隆法得到分离，编码种子特异性的介导a b a 反嫩的转录因子。 在植物中，a b a 或干旱、冷冻、盐胁迫等环境胁迫能导致一系列高度保守的a b a 响应基因的 表达，这些基因产物的积累能保护槭物免受胁迫伤密。其中一些熬困也在胚胎形成和种子发育过 程孛表达，瞧霹g 与嵇子麓拳秘髂瑟程荚。发蠛7 ，b 令谴裂这楚耱追诱导基瓣瓣矮式反应嚣 孛 和菠试作用因子，艇控制胁迫信号传导的分子机制仍未阐明。摇撤测a b a 的信号传导系统也鼹 由缀白质激酶的磷酸化级联系统组成的。s h e c n 将大麦的a b a 响成基冈( h 吼j ) 的扁动子和绿色荧 光蛋内弼f p ) 融合，梅建成融合基隧 ( h v a l - s g f p ) ，甩电激法将带有该基阪的质聿焱d n a 导入玉米 豹l t 嚣藤生震髂。嚣耱e 壕簸蛋瓯睡激酶f p k l 释& 璎鸯熬代替鼹遥信弩，激活h v a l 襄凌 子，诱导绿色荧光鬣翻的表达。c d p k l 蛋白的激酶结构域韵突变能消除这种激活作用；组成型的 活化骚白磷酸化酶2 c 能抑制c d p k l 和c d p k l a 对胁迫诱导基因的活化。并能抑制激索a b a 的应激 反成。当受到逆境胁迫时，植物缀缀大量产生应激激素a b a ，削睦a 通过某种途径活他c d p k l 和 c d p k l a 善j ；蛋鑫激辩，诱导a b a 葳痰基因的表达。因i 毙c d p k l 帮c d p i r d a 被认为憝齄遥信号赣零 的正调节因子。 4 糖信号与激素信号闻的网络枧制 槭物糖信号传导途径并不是独崴存在的，而怒植物复杂的信号网络中的都分( s m e e k e n s 6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言 2 0 0 0 ) 。不同的信号传导系统间，尤其是糖信号和激素信号间存在广泛而真接的相互作用( 图1 - 2 ) 。 用乙烯合成前$ a c c 处理拟南芥野生苗可获得与砌突变体类似的表型，高浓度的葡萄糖对予 叶和胚发育的抑制作用可通过外源添! j i a c c 得到解除，说明乙烯拮抗葡萄糖对幼苗早期发育的抑 制作用( z h o u e t a l ，1 9 9 8 ) 。乙烯组成型“三重反应”突变体c t r l ( c o n s t i t u t i v e t r i p l er e s p o n s e j ) 和乙 烯过量产生突变体e t o l ( e t h y l e n eo v e r p r o & w i n gj ) 的子叶和胚的形成对高浓度葡萄糖的抑制不敏 感，而乙烯抗性突变体e t r l ( e t h y l e n er e s i s t a n t ) 则表现对葡萄糖的高度敏感( z h o u e t a l ，1 9 9 8 ；g i b s o n 甜a ，2 0 0 1 ) 。由此说明，乙烯浓度的增加可降低幼苗对葡萄糖的敏感性。然而，葡萄糖不敏感突 变俸咖与e t o l 和c t r l 不同，它在黑暗中不表现乙烯的“三重反应 ( r o m a ne t a l ，1 9 9 5 ) ，说明n 表型 不与乙烯“三重反应”偶联。许多乙烯不敏感突变体( e t h y l e n ei n s e n s i t i v e ) 包括e t h 、e m 2 、e t n 3 和e i n 6 对葡萄糖高度敏感。双突变体实验表明葡萄糖不敏感蛋白g i n l 在乙烯受体e 1 r 1 和h x k 下游起作用( z h o ue ta 1 1 9 9 8 1 。 h x k 介导的葡萄糖信号传导不仅与乙烯信号相联系，同时与a b a 信号有关。a b a 和糖在调 控拟南芥种子形成、种子萌发和幼苗发育中有类似的或相互拮抗的作用( f i n k e l s t e i na n d g i b s o n , 2 0 0 1 ) ，遗传分析进步揭示了它们的相互作用关系。近来发现，肋，与经