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广西大学硕士论文高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 高效液相色谱一质谱联用技术在农药残留 分析中的应用研究 摘要 高效液相色谱一大气压电离质谱( h p l c 。a p i ，m s ) 法是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种 分析技术，它是结合了h p l c 的高效分离能力与m s 的高灵敏度和极强的专属性的分离检 测技术。它具有应用范围广、分离能力强、灵敏度高、分析速度快和自动化程度高等特 点，目前已成为有机物分析的重要方法之一。 本论文综述了液相色谱一质谱联用技术的发展和应用，介绍了该技术的基本原理和 特点，主要从样品前处理和利用该技术建立实际样品分析方法方面进行了研究并取得了 以下成果： i 初步研究了固相萃取方法 对影响固相萃取回收率的因素进行了探讨。为后续的固相萃取分离富集试验的条件 优化提供实验依据。 i i 结合固相萃取( s p e ) 技术，建立了蔬菜、中药材及水中不同种农药残留的高效液相 色谱质谱分析方法，并利用多级质谱功能首次对有机磷农药、氨基甲酸酯类农药以及三 嗪类农药的裂解规律进行了探讨： 1 、建立了高效液相色谱一质谱联用法测定蔬菜中阔草清等8 种农药残留的方法，该法简 便快速，灵敏度高，分离效果好，适用于蔬菜及其它食品中这8 种农药残留的分析。 2 、建立了同时测定食品中甲胺磷等7 种农药高效液相色谱一质谱法，实际样品分析表明， 利用固相萃取技术可以排除食品中复杂成分的干扰同时利用电喷雾质谱质谱技术能提 供更多碎片的结构信息的特点，对有机磷杀虫剂裂解规律进行了初步研究。 3 、建立了高效液相色谱质谱法同时测定中药材中抗蚜威等8 种氨基甲酸酯类农药残留 的分析方法，并且结合二级质谱对该类农药的裂解规律进行了初步研究。该法具有简单， 快速、准确等特点，并成功用于实际样品的分析。 4 、研究了一种同时测定西草净等8 种三嗪类除草剂农药残留的高效液相色谱一质谱法， 并且结合多级质谱功能对三嗪类农药的裂解规律做了初步研究。 关键词：高效液相色谱一质谱联用法固相萃取农药残留食品中药材裂解规律 广西大学硕士论文高效液相色谱- 质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 s t u d yo ns o l i dp h a s ee x t r a c t i o n - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p c t r o m e t r i cm e t h o d s f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e s a b s t r a c t h i 曲p e r f o m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c m s ) h a sg m w n t ob e c o m eam a t u r ea 1 1 dr o u t i n e l yu s e dt e c l l i l i q u ei na n a l y t i c a lc h e m i s 时s i n c e1 9 8 0 h p l c m si sa no n l i n ec o u p l i n gs y s t e mo f 1 l c ，as e p a r a t i o nt e c h n i q u et h a tc a nb ea p p l i e dt om e e x t r e m e l yc o m p l e xm i x t i l r e s ，a n dm s ，t 1 1 em o s ts e n s i t i v em e t l l o do fm o l e c u l a ra n a l y s i st l l a t h a st | l ep o t c n t i a lt oy i e l di n f o m a t i o no ft 1 1 em 0 1 e c u l a rw e i g h ta sw e l la st h es t n l c t u r co ft h e a n a l y t e i tp r o v i d e sal o wl i m i to fd e t e c t i o na n da sa 1 1i d e m i f i e rf o rs t m c t u r a l i n f b 珊a t i o n h p l c - m sh a sb e c o m eap o w e r f u la n di m p o n a n tt e c l l l l i q u ea n dm e t h o di n a n a i y s i so f p e s t i c i d er e s i d u e si nt 1 1 ec o m p l e xm i x t u r e s i nt h i st h e s i s ，t h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o n so fh p l c m sw e r er e v i e w e d t h eb a s i c p r i n c i p l ea n dc h a r a c t e r i s t i c o fh p l c m sw e r ei n 仃o d u c e d t h ef 0 u o w i n ga s p e c t sw e r e i n v e s t i g a t e d ： i t h es a m p l ep r e p a 豫t i o nm e t h o d av a r i e t yo ff k t o r s ，w l l i c he f f b c t e do nt h er e c o v e r yo fm ep e s t i c i d e s ，h a v eb e e ni n v e s t i g a t e d s u c ha st h ed i 腩r e n ts o r b e n t so fs o l i dp h a s ee x t m c t i o n ( s p e ) c a n r i d g e ，e l u t i o ns o l v e n t s ， 。1 e i u t i o ns o i v e n tv o i u m e sa i l dt h ef l o wr a t eo fs a m p i em i x t u r e sa n de l u t i o ns o i v e n t t h er e s u i t s g i v eap r a c t i c a lg u i d ef o rt 1 1 ef 0 1 l o w i n gs a m p l ep r e p a r a t i o n s i i f o u rh i g hp e r f 0 唧a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym a s ss p e c t r o m e t i ym e t h o d sd e v e l o p e d b a s e do nt h es 0 1 i dp h a s ee x t r a c t i o ns a m p l ep r e p a r a t i o nt e c l l l l i q u e 1 as p e h p l c m sm e t h o d 、v a sd e v e l o p e dt oa n a l y z en u m e t s u l a m ，s i m a z i n e ，t 1 1 i o d i c a r d ， c 1 1 l o n o l u m ，p r o m e t r y n ，f e n o b u c a r b ，m a l a t l l i o na n dd i a z i n o ni nv e g e t a b l e s t h em e m o di s s i m p l e ，s e n s i t i v ea n dr e p e t i t i v e i ti ss u i t a b l ef o rf a s td e t e h n i n a t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e si n v e g e t a b l e sa n do t h e rf b o d 2 as p e h p l c m sm e t h o df o rm ed e t e 功1 i n a t i o no fm e t h a m i d 叩h o s ，m o n o c r o t o p h o s ， i i i 广西大学硕士论文 高效液相色谱- 质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 m c h i o r p h o n ，m a l a t h i o n ，p a r a t h i o n ，d i a z i o na n dp h o x i mi nv e g e t a b l e sh a sb e e nd e v e l o p e d t h er e s u l t sd e m o n s 仃a t e dt l l ep r e s e n t e dm e t h o di sp r a c t i c a lw i t l lg o o dl i n e a rr a n g e sa 1 1 dh i 曲 r e c o v e r i e s 3 am e t h o df o rs i m u l t a n e o u sd e t e n n i n a t i o no fp i r i m i c a r b ，m e t o l c a r b ，c a r b o f h a i l ，c a r b a r y l ， i s o p m c a r b ，p m p o x u r ，f e n o b u c a r b ，a n df c n o x y c a r be i 曲tc a r b a i i l a t ep e s t i c i d e si nc l i n e s e h e r b a lm e d i c i n eb ys p e - h p l c - m sw a se s t a b l i s h e d t h em e t l l o di ss i m p l e ，f a s t ，a i l da c c u r a t e i th a sb e e nu s e dt ot 1 1 ed e t e m l i n a t i o no fc a r b 锄a t ep e s t i c i d e si nm ed 1 i n e s eh e r b a lm e d i c i n e w i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 4 am e t h o dt oa n a l y z e 墨仃i a z i n e sp e s t i c i d e si nw a t e rb ys p e h p l c m s 、v a sd e v e l o p e d t h e m e t h o di s s i m p l e ，r a p i d ，a c c u r a t ea n ds u i t a b l ef o rt h es i m l l l t a n e o u sd e t e m l i n a t i o no ft h e s e p e s t i c i d e si nw a t e r i i i f r a g m e n t a t i o np a t t e mo f p e s t i c i d e s 1 1 1 e 舶g m e n t a t i o np a 骶mo ft 1 1 eo 唱a 1 1 0 p h o s p h o r o u sp e s t i c i d e s ，c a r b a m a t ep e s t i c i d e s ，a 1 1 dp t r i a z i n e sp e s t i c i d e sw a ss u m m a r i z e db y 丹a g m e n ti o no f m s “，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：h i 曲p e r f b m a n c el i q u i dc l l r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e 仃y ；s o l i dp h a s e e x t r a c t i o n ；p e s t i c i d er e s i d u e s ；f o o d ；c t l i n e s eh e r b a lm e d i c i n e ；丘a g m e n t a t i o np a n e m i v 广西大学硕：t 论文高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 第一章前言 1 9 5 7 年气相色谱质谱( g c m s ) 成功实现联用以来，该技术目前已成为最完善、应 用十分广泛的仪器分析技术之一。但g c m s 要求样品经过气化后才能进入色谱柱，且 对样品前处理要求比较严格。并且只适合分析小分子、易挥发和对热稳定的化合物。然 而在目前已知的化合物中，只有2 0 2 5 可以用g c m s 直接分析，绝大多数化合物由 于具有强极性、低挥发性、高分子量及对热不稳定等特点，从而限定了g c - m s 的应用。 采用高效液相色谱方法可以对这些物质的进行分析，因此2 0 世纪8 0 年代开始，液相色 谱一质谱( h p l c m s ) 的出现成功地解决了上述问题。 1 1 h p l c - m s 接口技术简介 h p l c m s 的联用首先要解决的问题是接口真空匹配的问题。质谱的工作真空一般 要求为1 0 sp a ，但要与在常压下工作的液质接口匹配并维持足够的真空，只能增加真空 泵的抽速，维持一个必要的动态真空。液质联用技术的发展可以说就是接口技术的发展。 液质联用是通过一个接口( 即离子源) 来实现的。接口的作用就是将被分析的样品分子电 离成带电离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，会聚成一定几何形状和一定能 量的离子束，然后进入质量分析器被分析。在接口研制方面，前后发展了直接导入界面 队传送带界面【2 】、渗透薄膜界面【3 】、热喷雾界面【4 】和粒子束界面【5 】等2 0 多种，新接口往 往是在老接口的基础上改进发展起来的，在技术上存在内在的联系。但这些技术都有不 同方面的限制和缺陷，直到大气压电离接口技术成熟后，液质联用才得以迅速发展，成 为科研和日常分析的有力工具【6 9 。早期的| ，l c m s 接口技术的发展侧重于解决在样品 进入质谱之前除去h p l c 流动相中的大量溶剂，样品的电离依旧通过真空环境中采用电 子电离( e i ) 、化学电离( c i ) 等方法来完成。从某种意义上来说，可以看作是g c m s 的一种延伸。近年发展起来的多种接口技术则将溶剂的去除和样品的电离结合在一起， 在大气压条件下同时完成，其电离技术与g c m s 具有本质的区别，这种接口技术的发 展极大地推动h p l c m s 的发展和扩展其应用范围。 广西大学硕士论文 高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 1 2h p l c m s 接口 大气压电离接口是现有商品化仪器中最为普遍的电离接口。大气压电离包括电喷雾 电离( e s i ) 和大气压化学电离( a p c i ) 。这两种电离方式都是在大气压下进行的。产生的分 析物离子依靠电场进入质谱仪，溶剂和分析物的分离是依靠它们挥发性、动量荷电性能 方面的差别来实现的。 1 2 1 电喷雾电离接口( e s i ) e s i 接口的主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷嘴，最内层是h p l c 流出物， 外层是喷射气。喷射气体常采用大流量的氮气，其作用是使喷出的液体容易分散成微滴。 此外还有辅助气，辅助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。在微滴蒸发过程中，这些微 滴由于表面电荷的不均匀分布和静电引力而被破碎成为更细小的液滴。在加热的干燥氮 气的作用下，微滴中的溶剂被快速蒸发，直至表面电荷增大到库仑排斥力大于表面张力 爆裂，产生带电的子微滴。子微滴中的溶剂继续蒸发引起再次爆裂。此过程循环往复直 至微滴表面形成很强的电场，而将离子由微滴表面排入气相中。离子产生后，在电场作 用下通过毛细管孔进入分析器。 电喷雾电离是最“软”的电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会 在电离过程中发生分解，因此一般给出的是准分子离子信息，很少给出碎片离子，这样 可以方便地确定出化合物分子量。电喷雾电离接口最大的特点是产生多电荷离子，使检 测化合物的分子量范围大大增加。目前采用电喷雾电离，可以测量分子量3 0 0 0 0 0 以上 的蛋白质。 1 2 2 大气压化学电离( a p c i ) 大气压化学电离接口结构与电喷雾大致相同。不同之处在于，在大气压化学电离喷 嘴的下游放置了一个针状电晕放电电极，通过它的高压放电，使空气中某些中性分子电 离，这些离子包括h ，0 + 、0 2 + 和0 。等，溶剂分子也会被电离。这些离子与分析物分子进 行离子一分子反应，使分析物分子离子化。这些反应过程包括质子转移和电荷转换产生 正离子、质子脱离和电子捕获等产生负离子。a p c i 主要用来分析中等极性以上的化合 物，可以认为是e s i 的补充手段。有些分析物由于结构和极性的特点，用e s i 不能产生 广西大学硕士论文 高效液相色谱质游联用技术在农药残留分析中的应用研究 足够的离子，可用a p c i 方式增加离子的产率。a p c i 主要产生的是单电荷离子，所分 析的化合物的分子量一般小于1 0 0 0 。 1 3h p l c m s 分析特点 h p l c m s 除了可以分析气相色谱质谱( g c m s ) 所不能分析的强极性、难挥发、热 不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点： 、分析范围广，m s 几乎可以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化 合物的难题； 、分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过m s 的特征离子 质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量： 、定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息； 、检测限低，m s 具备高灵敏度，通过选择离子( s i m ) 检测方式，其检测能力还可以提 高一个数量级以上； 、分析时间快，h p l c m s 使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分 离效果； 、自动化程度高，h p l c m s 具有高度的自动化。 1 4h p l c m s 技术的应用 随着联用技术的日趋完善，) l c m s 逐渐成为最热门的分析手段之一。特别是在 分子水平上可以进行蛋白质、多肽、核酸的分子量确认，氨基酸和碱基对的序列测定及 翻译后的修饰工作等，这在h p l c m s 联用之前都是难以实现的。h p l c m s 作为已经比 较成熟的技术，目前国内外已在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环 境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。 1 4 1 生化方面的分析中的应用 生物体内的蛋白质、肽和核酸，都以混合物状态出现，具有强极性，难挥发性，又 具有明显的热不稳定性，所以用g c m s 来分析生物大分子存在困难，需要经过深度降解， 并需对降解生物作各种复杂的衍生化处理。而 玎，l c 能分析强极性、不易挥发、高分子 广西大学硕士论文高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 量及对热不稳定的化合物；m s 具有高灵敏度，能在复杂基质中进行准确的化合物识别 的优点，所以卸? l c m s 作为生化分析的一个有力工具，正在得到日益的重视。目前国 内外研究人员利用瑚，l c m s 技术在生化方面已经有很多应用【m 1 9 】。国内郭寅龙等【2 0 】对 液相色谱一质谱( h p l c m s ) 在蛋白质分子量测定、一级结构的分析、蛋白质和多肽纯度 的鉴定、肽质量酶谱、蛋白质分子内二硫键的定量和定位、磷酰化位置的测定以及在蛋 白质组中的应用等方面进行了综述和讨论。c a r e r im 等【2 l 】综述了h p l c m s 技术在食品 中缩氨酸和蛋白质的分析应用。 r o l l e r u 等【2 2 】利用h p l c m s m s 对饲料、食品中的维生 素h 含量进行了测定，文章讨论了不同的萃取方式对维生素h 含量的影响，优化了样品 前处理方法。p r a k a s h b 等【2 3 建立了h p l c m s 测定人的视网膜内类胡罗h 素代谢物3 一羟 基一b 一胡萝h 素含量的方法，文中详细阐述了3 一羟基b 一胡萝h 素的形成机理，测定结果 将对发病机理提供可靠的数据。 1 4 2 天然产物分析中的应用 利用h p l c m s 分析混合样品，和其他方法相比具有高效快速，灵敏度高，只需对 样品进行简单预处理或衍生化，尤其适用于含量少、不易分离得到或在分离过程中易丢 失的组分。因此h p l c m s 技术为天然产物研究提供了一个高效、切实可行的分析途径。 国内利用该技术在天然产物研究中已经有很多报道【2 一埘】。如李丽等f 2 8 】利用高效液相色谱 一质谱联用技术研究了朝鲜淫羊藿中的黄酮类化合物。实验采用反相c 1 8 色谱柱，二元线 性梯度洗脱，分离并检测了朝鲜淫羊藿中的6 种黄酮类化合物；通过与质谱联用获得了 这几种化合物的分子量信息，利用质谱的源内碰撞诱导解离技术对这几种化合物进行了 结构鉴定。孔亮等f 2 9 】采用h p l c m s 系统地研究了中药川芎有效成分阿魏酸 ，c 玎c 御 和藁本内酯( ，4 到盯f ， 如) 的定量分析方法。利用制备色谱制备了藁本内酯对照品，并对其 进行了紫外光谱、质谱、红外光谱等结构鉴定。分别考察了水、甲醇、乙醇、9 5 乙醇 4 种溶剂以及提取时间对川芎中阿魏酸和藁本内酯提取量的影响。国外目前也有了很多 的应用性文献报道【m 3 8 】。h ex g 【3 9 对h p l c m s 技术在天然产物分析中的应用做了全面 的阐述。文中列举了 玎，l c m s 在酚类和类黄酮类物质、皂角苷类、生物碱类以及其他 植物提内提取的天然物质方面的应用。 广西大学硕士论文 高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 1 4 3 药物和保健食品分析中的应用 质谱作为液相色谱的检测器与紫外和二极管阵列检测器相比较，兼有鉴定功能和灵 敏度高的特点。所以近些年来m ，l c m s 已经成为药物分析方面的有利工具。近几年用 h p l c m s 对各种药物尤其是违禁药物及其代谢产物的研究国内外有大量的文献报道， 如尿中的河豚毒素【4 0 】、抗生素、舒喘宁【4 2 】和血液中的安非他明【4 3 】、奥美拉唑【4 4 】、罗 哌卡因【4 5 】、氨磺必利【删、前列腺素e 2 【4 7 】以及爱滋病病毒【4 8 】等痕量残留的分析。本实验 室【4 9 。o 憎利用，l c m s 分别建立了减肥保健品中氯噻嗪等和性保健品中的脱水吗啡等 违禁药品分析的方法，并成功地用于实际样品的测定。 作为一种高效分离技术，h p l c m s 在仪器分析中的应用已显示出很大的潜力。可 以预测，随着对h p l c m s 研究的深入和该技术应用的普及，h p l c m s 技术将成为药 物和保健食品中违禁成分分析中发挥更大的作用。 1 4 4 环境分析中的应用 h p l c m s 已经在环境分析中有很多的应用，如环境样品中的抗生素【5 7 】、多环芳 烃【5 8 “2 】、多氯联苯【6 3 嘲】、酚类化合物【6 5 巧8 】、农药残留【6 9 7 3 】等。尤其是近些年，农药残 留问题一直是个热门话题。由于农药正向高效和低毒方向发展，使农药的环境影响和残 留农药的检测方法发生了变化。由于目前低浓度( p g l ) 、难挥发、热不稳定和强极性农 药分析方法并不是十分理想，因此发展高灵敏度的多残留可靠分析方法已成为环境分析 化学及农业化学家的重要战略目标。高效液相色谱法弥补了气相色谱法不宜分析难挥 发，热稳定性差的物质的缺陷，可以直接测定那些难以用g c 分析的农药。但是常规检 测器如紫外( u v ) 及二极管阵列( d a d ) 等定性能力有限，因而在复杂环境样品痕量分析时 的化学干扰也常影响痕量测定时的准确性，从而限定了他们在多残留超痕量分析中的应 用。自从8 0 年代末大气压电离质谱( a p i m s ) 成功地与h p l c 联用以来，h p l c m s 已经 在农药残留分析中占了很重要的地位，成为农药残留分析最有力的工具。潘元海等【7 4 】 对水中有机磷农药的h p l c m s 测定进行了综述，金军等【7 5 】对h p l c m s 在农药残留分 析方面的发展做了综述，总结了1 9 8 4 年到1 9 9 6 年间h p l c m s 技术在有机磷、氨基甲 酸酯类、磺酰脲类、三嗪类除草剂残留分析中的应用情况。本实验室【7 6 一】己建立了蔬 菜中阔草清等8 种农药、食品中7 种有机磷农药、中药材中8 种氨基甲酸酯类农药以及 水中8 种三嗪类农药的h p l c m s 方法，并成功用于实际样品的分析，同时利用 广西大学硕士论文高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 m s n ( n = 2 1 0 ) 功能对有机磷、氨基甲酸酯类、三嗪类农药的裂解规律进行了总结。在国 外，h p l c m s 已经成为各种基质中微量农药的常规检测技术，对环境中有机毒物质的 测定也时有报道。如r e a dr w 等【8 0 】用h p l c m s 在正负离子电离两种模式下对化学武 器试剂的水解产物进行了快速筛选和定性鉴定。s 1 1 i l l e i 等【8 l 】用 ，l c m s 技术测定了 环境水样中残杀威，并对其在水体中的稳定性进行了研究。s a n t o st c r 等【8 2 】用固相萃 取液相色谱一质谱( s p e h p l c m s ) 技术鉴定和测定了农田废水中的c 1 0 6 b r i c 除草剂及其 代谢产物。g i m e n or a 等【8 3 】也用s p e 印，l c m s 技术做了废水中的抗污剂的测定。 d i i k m a n e 【8 4 】研究了h p l c m s m s 测定酸性农药时，基质对农药质谱信号的影响。 r e e m t s m at f 8 5 】对h p l c m s 技术在痕量极性有机污染物中的应用作了综述，l a t o r r e a 等比较了g c m s 和h p l c m s 在测定纸厂废水中脂肪酸和树脂酸的特点。h u ，j i a i l y i n g 等f 8 7 】介绍了h p l c m s 测定了水中3 1 种农药残留。l y a p c h e n k o n 等【8 8 】用h p l c - m s 技术将三嗪类除草剂阳离子化后进行了测定。j e 籼o t r 等【8 9 】用) l c - d a d m s m s 技 术测定了地表水中的农药残留。 本论文研究的目的： 高效液相色谱一大气压电离质谱联用( h p l c a p i m s ) 是基于) l c 的高分离能力与 m s 的高灵敏度和极强的专属性的分离检测技术。它具有分析范围广、分离能力强、检 测限低、分析时间快和自动化程度高等特点，已成为农药残留分析的重要方法之一。 本论文研究的内容分为两个方面：1 ，建立了样品前处理的固相萃取方法，并成功 用于实际样品分析中。2 ，分别建立了蔬菜中的阔草清等8 种农药、食品中7 种有机磷 农药、中药材中8 种氨基甲酸酯类农药以及水中8 种三嗪类农药残留量的高效液相色谱 一质谱联用方法，并同时利用m s n ( n _ 2 l o ) 功能初步总结了有机磷类、氨基甲酸酯类和 三嗪类农药的裂解规律，取得满意的结果。 广西大学硕士论文高效液相色i 替质讲联用技术在农药残留分析中的应用研究 第二章固相萃取方法的初步研究 样品前处理技术是环境分析化学的关键问题之一，由于环境样品具有形态多样，母 体背景成分复杂且待测组分含量低的特点，因此一般必须经过净化和富集前处理后才能 进行分析，特别是对一些超低含量组分。样品前处理技术己成为浓缩被测定的痕量组分， 提高分析方法的灵敏度及除去对分析系统有干扰的物质的重要手段，因此样品前处理在 分析化学中起着极为重要的作用。 目前，用于浓缩和净化环境样品的主要方法有液一液萃取( l l ) 、固相萃取( s p e ) 。l l 方法有许多局限性，例如需要大量不互溶溶剂：样品处理步骤复杂；样品回收率和精密 度不理想；处理过程中乳液的形成，和溶剂蒸发时产生的样品损失等等。而s p e 方法与 传统的l l 萃取法相比较，具有分析速度快，较高的精密度和准确度；分析物的高回收 率；有机溶剂的低消耗，减少对环境的污染：避免出现乳化现象，易获得较为纯净样品， 操作简单，易于自动化等优点【9 9 1 。在国内外农药残留分析检测中已得到广泛的应用 【9 2 圳o 。因此，自7 0 年代问世以来，其全球需求量迅速增长。 本章选择蔬菜中8 种农药残留作为固相萃取回收率的研究对象，研究了样品提取液 的过柱流速、提取液的p h 值、提取液中无机盐含量、洗脱溶剂以及固相萃取柱对样品回 收率的影响，并同时优化了各个条件。建立了样品前处理的s p e 方法，并成功应用于实 际样品分析中。 2 1 实验部分 2 1 1 仪器与试剂 a g i l e m1 l o ol c m s dn 认ps l 高效液相色谱一质谱联用仪( 德国) ；固相萃取装置： a g i l e n t 多管真空处理系统，w a t e r so a s i sh l b ( 1c c ，1 0 0 m g ) 和w i t e r s0 a s i s m a x ( 1c c ，l o o m g ) ( 美国) ；a g i l e n t a c c u b o n d0 d s c l8 ( 5 0 0m g ，6m l ) ，a g i l e n t a c c u b o n d o d s c 18 ( 1 0 0 0m g ，6m l ) 和a g i l e n t a c c u b o n do d s c 1 8 ( 2 0 0m g ，3m l ) 固相萃取柱( 德 国) ；o 唱a i l o m a t i o n n e v a p 氮吹仪( 美国) ；w a t e r s p r o p l u s 超纯水仪( 美国) ；s a n o r i u s m e 2 1 5 s 电子分析天平( 德国) 。 甲醇、乙腈、丙酮( 色谱纯，f i s h e r 公司) ；乙酸乙酯和二氯甲烷( 分析纯，上海试 广西大学硕士论文高效液相色谱- 质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 剂一厂) ；农药标准品：仲丁威、马拉硫磷、二嗪农、西玛津、扑草净和绿麦隆购于北 京化学试剂公司；硫双威和阔草清购于国家农药质检中心( 沈阳) 。 所有用水均为超纯水。 2 1 2 标准溶液的配制 仲丁威、马拉硫磷、二嗪农、西玛津、扑草净和绿麦隆的标准储备液为1 0 0m g l ； 准确称取硫双威和阔草清标准品各1 0 o m g ，用甲醇溶解并分别定容在1 0 m l 容量瓶中， 配制成1m g ，m l 的标准贮备液。标准贮备液置于4 冰箱中保存，使用时用乙腈水( 3 5 6 5 ) 稀释成所需浓度。 2 13 样品处理 样品的制备：取3 0 0g 蔬菜样品用剪刀剪成小片后在食品加工器中粗粉碎，备用。 萃取：准确称取5 0 og 粉碎好的样品置于1 0 0m l 锥形瓶中，加入3 0 m l 乙腈，超声波 振荡萃取3 0 m i n ，静放1 0m i n 后将提取液转移至5 0m l 容量瓶中，再用2 0 m l 乙腈分 两次萃取残渣，合并洗涤液于5 0m l 容量瓶中。 净化：在一定的真空度下，提取液以4 5m l m i l l 的流速通过固相萃取柱( 使用前用6m l 乙腈、6 m l 甲醇和1 0 m l 水平衡该固相萃取柱) ，先用5 甲醇水溶液6 m l 过柱，洗去 部分杂质，再用5m l 甲醇洗脱，洗脱液收集到1 0m l 离心管中，在氮吹仪上于室温下 蒸发至近干，用乙腈准确定容到1 0m l 。用0 4 5 m 的针头过滤器过滤后，待h p l c 分 析。 2 2 结果与讨论 2 2 1 过柱流速的影响 比较了不同样品提取液过柱流速对回收率的影响发现，流速慢时有利于被测组分的 吸附；流速太快容易使提取液中被测组分来不及被吸附而直接流过萃取小柱，导致回收 率降低。实验发现流速超过6m l ，m i n 被测组分添加回收率明显下降，见表2 1 ，本实 验选定在富集过程中流速大约为4 5m l m i n 。 广西大学硕： ：论文高效液相色i ! 质i ； 联用技术在农药残留分析中的应用研究 表2 1 不同流速对回收率的影响 t a b 2 - ie 毹c to f d i 行e r e n tv e l o c 时o f n o wo nr e c o v e r i e s 2 22 样品提取液中p h 影响 酸度对被测组分的富集有影响，在不同的p h 条件下，在样品提取液中进行添加回 收率实验时发现，在中性条件下小柱对样品提取液中农药的富集效果最好，见表2 2 ， 可能是因为在不同酸度条件下农药在样品提取液中的存在形式发生了变化，从而影响了 在流动相和固定相之间的分配系数。因此，本章保证样品提取液保持在中性条件下。 广西大学硕士论文高效液相色谱质潜联用技术在农药残留分析中的应用研究 p h 值 瓷器迭3 0 7 0 1 1 0 阔草清 n u m e t s u l 啪 西玛津 s l m a z i n e 硫双威 l h i o d i c a r d 绿麦隆 c h l o r t o l u m 扑草净 p m m e n _ y n 仲丁威 f 色n o b u c a r b 马拉硫磷 m a l a t h i o n 二嗪农 d i a z i n o n 6 0 18 6 1 5 5 48 2 6 7 0 28 5 4 7 5 19 2 5 6 9 48 6 2 7 9 81 0 2 1 8 0 21 0 5 i 7 0 4 9 1 2 7 0 1 6 4 8 6 9 1 7 0 5 7 3 4 8 0 4 8 7 2 6 7 9 2 2 3 样品提取液中无机盐含量的影响 曾有文献【1 0 l 】报道在进行水样的固相萃取前加入2 n a c l 溶液，但本文用氯化钠调 节样品提取液的离子强度，使样品提取液中氯化钠含量分别为0 l og l 进行试验，见图 2 1 ，结果发现8 种农药的萃取效率受离子强度的影响不大，因此本实验未对样品溶液 中的盐分进行控制。 1 0 广西大学硕士论文高效液相色i 质珊联用技术在农药残留分析中的应用研究 1 1 5 连1 0 5 b 兰9 5 8 星8 5 7 5 2 2 4 洗脱溶剂的影响 之：一- 。 k - -_ - l o c o n c e n 仃a t i o no f n a c v 班 + 阔草清( f l u m e t s u l a m ) t 硫双威( ( t h i o d i c a r d ) x 一扑草净( p r o m e t r y n ) + 马拉硫磷( m a l a t h i o n ) 一西玛津( s i m a z i n e ) + 绿麦隆( c h l o r t 0 1 u r n ) + 仲丁威( f e n o b u c a r b ) 一二嗪农( d i a z i n o n ) 图2 1n a c l 浓度对回收率的影响 f 嘻2 - 1e 雎c to f c o n c e n t 糟t i o no f n a c lo nt h er e c o v e r i e s 农药的极性一般是中等或较高，因此必须用中等或极性较高的洗脱剂才能将其洗脱 下来。本章选择了甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷这几种不同的洗脱溶剂及其 组合为研究对象，探讨了不同洗脱溶剂及其用量对固相萃取回收率的影响。从表2 3 中 可以看出，甲醇作为洗脱溶剂时，样品的添加回收率整体比其他三种较好，因此本章选 用甲醇作为研究对象的洗脱溶剂。以不同体积的甲醇洗脱同一样品，从2 1 0m l 每增加 1m l 洗脱液测定回收率，从图2 2 中可以看出当洗脱液的体积小于4m l 时，回收率随 洗脱液体积的增加而提高，当洗脱液的体积在4m l 以上时，随着洗脱液体积的增加回收 率基本不变，因此本实验选择用5m l 甲醇进行洗脱。洗脱速度不宜过快，洗脱速度以 1 5m l m i n 为最佳。 广西大学硕士论文高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 表2 3 不同洗脱剂对分析物的回收率( ) 比较 t 拍2 3t h er e c o v e r yo f a n a l ”e sw i t hd i f f e r e n te l u t i o ns o l v e n t 1 0 5 述9 0 7 5 耋6 0 4 5 3 0 234567891 0 v o h l i t l eo fm e t i l a n o v m l + 阔草清( f l u m e t s u l a m ) + 硫双威( t h i o d ic a r d ) 十扑草净( p r o m e t r y n ) + 马拉硫磷( m a l a t h i o n ) + 西玛津( s i m a z i n e ) * 一绿麦隆( c h l o r t 0 1 u r n ) + 仲丁威( f e n o b u c a r b ) + 二嗪农( d i a z i n o n ) 图2 2 甲醇洗脱体积对回收率的影响 广西大学硕士论文高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 2 2 5 固相萃取柱的选择 f 嘻2 2 e 髓c to f m e t h a n o le l u t i o nv o l u m eo nr e c o v e r i e s s p e 柱的选择是关系到固相萃取回收率的重要因素之一，它直接决定着分析组分能 否定量地吸附、保留在固相柱上和被一定量的洗脱溶剂洗脱。s p e 柱性能的主要差异是 柱填料的不同，常用的柱填料有反相填料，正相填料和离子交换填料。鉴于本章研究的 农药性质，因此选用反相填料的固相柱作为研究对象。反相填料包括硅胶键合填料和聚 合物填料。如c 1 8 、c 。和p h ，也有经过改性的功能型填料，在反相填料的基础上引入羧 酸、磺酸基团、季胺盐或一些极性基团，如0 a s i sh l b 和m a x 填料。本章分别选用 了w a t e r so a s i sh l b ( 1c c ，1 0 0 m g ) ；w a t e r so a s i sm a x ( 1c c ，1 0 0 m g ) ：a g i l e n t a c c u b o n do d s c 1 8 ( 5 0 0m g ，6m l ) ：a g i l e n t a c c i l b o n d0 d s c 1 8 ( 1 0 0 0m g ，6m l ) 和a g i l e m a c c u b o n d0 d s c 1 8 ( 2 0 0m g ，3m l ) 固相柱进行研究，各组分经过固相柱后的回收率见表 2 4 ，结果表明，研究的5 种固相萃取柱的回收率均能达到多级残留分析的标准。但从 使用过程中所耗时间以及萃取柱造价等方面考虑，本章采用了a g i l e m a c c u b o n do d s c l8 ( 5 0 0m g ，6m l ) 作为固相萃取柱。 广西大学硕士论文 高效液相色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用研究 表2 4 不同固相柱填料各分析物的回收率( ) 比较 t a b 2 41 1 1 er e c o v e r yo fa 1 1 a 1 ”e sw i t hd i 仃e r e n ts o r b e n t so f s p ec a r t r i d g e 2 3 小结 综上所述，对于蔬菜中8 种农药残留最佳固相萃取条件为选择a g i l e ma c c u b o n d 0 d s c 1 8 ( 5 0 0m 舀6m l ) 作为8 种农药的固相萃取柱。c 1 8 固相萃取柱的活化采用6m l 甲醇+ 6m l 乙腈+ 1 2m l 水，提取柱过柱流速为4 5m l m i n ，先用5 甲醇水溶液6m l 过柱，洗去部分杂质，再用5m l 甲醇