（生物化学与分子生物学专业论文）杂合肽moricincecropin的分子设计、克隆与表达.pdf

中山大学硕士学位论文 杂合肽m o r i c i n - c e c r o p i n 的分子设计、克隆与表达 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：李丽 导师：庞义教授 摘要 抗菌肽由于其特殊的作用机理和功效，使其在解决传统抗生素的药物残留和菌 株耐药性问题方面显示了巨大潜力但与传统抗生素相比，某些抗菌肽的抗菌活性 还不够理想，这就需要结合抗菌肽活性与结构的关系有目的地对其进行改造和设计。 本文应用抗菌肽分子设计的一些理论与方法将本实验室保有的m o r i c i n ，c e c r o p i n 昆虫抗菌肽基因进行了人工设计与改造，合成了新的m o r i c i n c e c r o p i n 杂合肽基因 序列，以期获得抗菌谱更广，活性更强的重组抗菌肽分子。为了获得小分子杂合肽 的高效可溶性表达，本实验将杂合肽基因与泛素基因序列融合分别克隆到大肠杆菌 表达载体p q f 3 0 ，p e t 2 1 a 和p e t 3 2 a 中进行重组抗菌肽基因的融合表达研究。为 了不影响成熟肽的结构与功能分析，杂合肽基因序列的合成及其与泛素基因的融合 都是通过重叠延伸p c r 法合成的。同时对泛素羧基端水解酶y u h l 成功克隆、表 达与纯化，解决了泛素融合蛋白的酶切问题，为以后泛素融合表达外源基因的去泛 素化提供了很好的工具酶。 关键词：抗菌肽，c e c r o p i n ，m o r i c i n ，杂合肽，泛素，y u h l ，融合表达 中山大学硕士学位论文 d e s i g n ，c l o n g i n ga n de x p r e s s i o no f m o r i c i n - c e c r o p i nh y b r i dp r o t e i n s p e c i a l i t y ：b i o c h e m i s t r y m o l e c u l a rb i o l o g y m a s t e rc a n d i d a t e ：uu s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rp a n gy i a b s t r a c t a n t i m i c r o b i a lp e p t i d oh a sg r e a tp o t e n t i a li n r e s o l v i n gt h et r a d i t i o n a la n t i b i o t i c s p r o b l e mo fr e m n a n to fa n t i b i o t i ca n da n t i b i o t i c - r e s i s t a n ts t r a i n sd u et oi t sa d v a n t a g eo f p o s s e s s i n gm o r ee f f e c t i v ea c t i v i t y a sw e l la se x h i b i t i n gu n i q u em e c h a n i s ma g a i n s t b a c t e r i a b u tc o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a la n t i b i o t i c sa n t i m i c r o b i a lp e p 删ed o e sn o th a v e i d e a la n t i b a c t e r i a la c t i v i t y s oi ti sn e c e s s a r yt od e s i g na n dm o d i f ya n t i m i c r o b i a lp e p t i d e g e n es e q u e n c ea c c o r d i n gt ot h er e l a t i o nb e t w e e na n t i m i c r o b i a lp e p t i d ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t ya n ds t r u c t u r e t oo b t a i nan e wk i n do fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d ew i t hb r o a d - s p e c t r u m a c t i v i t ya g a i n s tb a c t e r i a la n dm o r ee f f e c t i v ea n t i b a c t e r i a la b i l i t y , ah y b r i dp r o t e i nb a s e d o nt h ec e c r o p i na n dm o r i c i ng e n es e q u e n c e sw a sd e s i g n e de m p l o y i n gs o m et h e o r ya n d m e t h o d so fm o l e c u l a rd e s i g n i no r d e rt oa c h i e v ee f f i c i e n ta n ds o l u b l ee x p r e s s i o no ft h e h y b r i dg e n e ，w ef u s e dt h eh y b r i dg e n ew i t hu b i q u i t i ng e n es e q u e n c ea n dc l o n e di n t ot h e e x p r e s s i o nv e c t o r s ，p q e 3 0 ，p e t 2 1 aa n dp e t 3 2 ar e s p e c t i v e l y , f o rt h es t u d yo ft h ef u s i o n p r o t e i ne x p r e s s i o n m e a n w h i l e ，t h es n c c 七, s so fc l o n i n g , e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fa u b i q u i t i n - p r o t e i nh y d r o l a s ey u h ip r o v i d e dam e n l o dt or e n l o v eu b i q u i t i nf r o mu b i q u i t i n f u s i o np r o t e i n k e yw o r d s ：a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，c e e r o p i n ，m o r i c i n , h y b f i dp e p 删e ，u b i q u i t i n , y u h l ， f u s i o ne x p r e s s i o n 中山大学硕士学位论文 刖昂 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) 是一类免疫效应因子，是生物细胞特定基因编 码产生的一类小分子多肽，由2 0 - 6 0 个氨基酸残基组成，其生成和释放是机体炎症 反应的组成部分，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障0 3 0 m a n , 1 9 9 4 ) 。 抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性较高，广谱抗菌的特点( 赵东红等，1 9 9 9 ) 并能选择性地杀伤癌细胞，而对正常的真核细胞不起作用( j a c o b & z a s l o f f , 1 9 9 4 ) 。 改造过的抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性和阴性细胞，也作用于真菌、原虫、某些病 毒和肿瘤细胞。同时，还能加速免疫和伤口愈合的过程。在目前抗生素的发现极其 困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗菌肽、抗病毒素和肿瘤制剂开辟了广阔的前景。 但由于抗菌肽的分子量小，直接从动植物组织中提取天然抗菌肽时，分离提纯存在 一定的困难，故化学合成和基因工程法成为获得抗菌肽的主要手段但化学合成抗 菌肽成本高，而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因时，由于抗菌肽分子 量小，抗蛋白酶降解的能力差，表达产物可能对宿主有害，从而影响了基因的高水 平表达。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题之 一( 杨星剑等，2 0 0 5 ) 。目前不管是在微生物中的表达还是在植物细胞、昆虫细胞 中表达，都存在着表达量偏低的问题。最近，通过融合表达的方法使抗菌肽在大肠 杆菌中表达量有所提高( 谢维等，1 9 9 6 ) 。另外。与传统抗生素相比，某些抗菌肽 的抗菌活性还不够理想，改造已有抗菌肽和设计新抗茵肽分子是提高其活性的有效 途径( 刘建涛等，2 0 0 6 ) 。目前抗菌肽结构和功能的关系的研究，为设计新的多肽类 型抗生素提供了理论依据，并且有了一些实质性进展，美国费城马普宁制药公司于 1 9 9 0 年开始对青蛙皮肽抗菌肽( m a g a i n i n ) 结构分子设计，筛选出一种对病毒和肿瘤 细胞均有较好杀伤作用的多肽分子，目前已经进入临床期试验。同时，抗菌肽转 化植物的研究，为植物的抗性育种提供了一条有效途径。 泛素( u b i q u i t i n ) 是广泛存在于真核生物中的保守性极强的小蛋白，由7 6 + 氨基 中山大学硕士学位论文 酸组成，分子量约为8 6 k d a 。目前所知，泛素主要通过a 皿依赖的泛素蛋白酶体通 路( u b i q u i d n p r o t e a s o m ep a t h w a y , u p p ) 高效并高度选择性地对胞质和胞核内蛋白 进行降解( g l i c k m a n c i e c h a n o v e r , 2 0 0 2 ) 。此外，泛素作为分子伴侣参与核糖体的 生物发生、细胞内吞等多种生理功能( v a r s h a v a s k y , 1 9 9 7 ) 。泛素以分子内伴侣的形 式能起到提高翻译水平和稳定蛋白的作用，通过泛素融合技术( u b i q u i t i n - f u s i o n t e c h n o l o g y ) 将泛素基因和其他外源蛋白的基因进行融合表达，可以有效地提高外源 基因的表达。避免小分子蛋白在宿主菌中被降解( b a k e re ta 1 ，1 9 9 4 ；h o n d r e d 甜a l ， 1 9 9 9 ) 。此外，由于能将泛素与融合蛋白完全切割分离的去泛素化酶( d e u b i q u i t i n a t i n g e n z y m e s ，d u b s ) 广泛存在于真核生物细胞内( c h u n g b a e k , 1 9 9 9 ) ，因此利用该泛 素融合技术表达的多欣或蛋白，不需要进行融合蛋白分离处理，这在一定程度上简 化了表达产物的后处理工艺。 本实验室保有王丽博士和杜创硕士分别从棉铃虫幼虫与甜菜夜蛾幼虫体内分 离出的c c c r o p i n 八d 和m o r i c i n 抗菌肽。m o r i c i n 和c e c r o p i n 类抗菌肽都主要作用 于细菌，对许多种革兰氏阴性和阳性菌都有很强的抗菌活性。但m o r i c i n 的抗革兰 氏阳性菌的活性要高一些。相反c c c r o p i n s 的抗革兰氏阴性菌的活性要高一些。因 此如果m o r i c i n 和c e c r o p i n 同时被细菌诱导产生，它们将有效的杀死广谱的入侵细 菌( s e i i c h i & y a m a k a w a g1 9 9 5 ) 。基于此将它们的最有效片段重新排列组合得到 c a ( 1 1 1 ) m ( 5 2 2 ) ，c a ( i 1 1 ) 一m ( 2 3 4 3 ) ，m ( 5 - 2 2 ) 一c d ( 1 2 - 3 7 ) 这三种新的重组杂合肽， 以使c c c m p i nc 端更加碱性、螺旋化，而m o r i c i nc - 端更加螺旋化、疏水，以期获 得活性更高抗菌谱更广的重组抗菌肽。虽然本实验采取了拥有高效、成本低廉、培 养方便等诸多优点的e c o l i 表达系统，而且应用了泛素融合技术，但是也不能保证 小肽分子的高效表达和纯化，甚至是大规模生产。而且进行分子设计的过程从了解 改造对象的结构和功能；然后通过理论的方法提出抗菌肽改造或全新设计的方案； 再到通过化学合成或分子生物学手段利用载体进行表达；最后，测定其改造后的活 性。这个程序不是一次就能实现的，往往要经过多次循环、不断改进设计方案才能 发现一个理想的改造抗菌肽( 郑珩、壬非，2 0 0 4 ) 因此本研究从三种杂合肽中选 取了其中一种杂合肽m c d 作为泛素融合小分子杂合肽的原核表达的初步探索，为 以后系列性、大规模进行杂合肽的表达、纯化提供一些可靠的理论与实践支持。 2 中山大学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 1 抗菌肽的研究进展 1 1 2 抗菌肽的理化性质。分子结构 上世纪七十年代中期，瑞典科学家b o m a n 首次用大肠杆菌从惜古比天蚕中诱 导出1 5 种杀菌蛋白，随后在不同种类的昆虫中发现了各种抗菌肽( b o m a n , 1 9 9 7 ) 。 从而掀起了人们对抗菌活性小肽的研究。到2 0 0 1 年为止，已发现抗菌肽7 5 0 余种，而 且自上世纪9 0 年代以来每年新发现的抗菌肽数量在5 0 种左右。通过大量研究我们已 经知道抗菌肽作为机体的防御效应因子在自然界，包括无脊椎动物，脊椎动物甚至 在一些细菌本身都是广泛存在的。抗菌肽的这种广泛存在不是偶然的，有人推测其 在迸化意义上最早可能参与了早期真核细胞的噬菌作用，这种作用既是细胞自身防 御功能的需要，还有可能通过对微生物的降解提供自身生长需要的营养，并且在进 化过程中最终以一种防御分子被保留了下来，就好像在人体中演变为中性粒细胞和 巨噬细胞中氧依赖型防御系统的效应分子以及皮肤中的天然免疫分子一样( l e h r e r g a n z , 1 9 9 9 ) 。由于其具有小分子的特点，使其可以快速合成且易于大量存储，与 特异性免疫反应相比可以更加迅速的对病原菌作出反应，使其成为生物机体中不可 或缺的重要成分 抗菌肽一般由1 2 5 0 个氨基酸残基组成，分子量在4 0 0 0u 左右。抗菌肽的一级 结构具有典型特征，即由3 0 多个氨基酸残基组成的肽链，其n - 端富含赖氨酸和精 氨酸等阳离子型氨基酸，其g 端富含丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸等非极性氨基酸。而 其中闻部分则富含脯氨酸。这一结构特征使抗菌肽具有表面活性剂的作用。一些天 然的抗菌肽的c - 端往往是酰胺化的，可能与抗菌肽的广谱抗菌活性有关。它们的二 级结构分为4 种类型，即8 折叠、两亲性a 螺旋、扩展片层和环状结构；三维构 中山大学硕士学位论文 象可归纳为2 种，即由疏水面和极性阳离子面相对而成的两性结构和由正电荷区支托 疏水核心组成的翅状结构( h a n c o c k l e h r e r , 1 9 9 8 ) 。大部分抗菌肽具有热稳定性， 1 0 0 加热1 0 1 5m i n 仍能保持其活性。抗菌肽对较大的离子强度或较高的p h 都有 较强的抗性。另外，部分抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力( 于健等， 2 0 0 4 ) 。另外，大多数抗菌肽的等电点都大于7 ，因而抗菌肽在本质上几乎都是阳离 子型的。抗菌肽存在于所有的物种中，如植物、昆虫、甲壳动物、两栖动物、鸟类、 哺乳动物。它们具有多种生物学功能，如广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、刺激单核细 胞和嗜中性白细胞的趋化作用以及促进创伤愈合等。抗菌肽的生物学活性通常取决 于它们的浓度，如d e f e n s i n s 在低浓度时具有刺激黏附分子表达及细胞因子产生的 作用，而在高浓度时则可促进肿瘤细胞与微生物的溶解。另外，抗菌肽的杀菌机理 与抗生素完全不同，很难出现耐药菌株。基于以上特点，抗菌肽有望成为新一代的 抗菌、抗癌药物。然而，天然抗菌肽的来源十分困难。不能满足研究和临床应用的 需要。因此，通过基因工程技术来生产抗菌肤便成为人们普遍关注的焦点。同时， 抗菌肽转基因动、植物的研究也在不断的深入，从而显示了其在医学、兽医学等相 关领域的巨大研究潜力 1 1 2 抗菌肽的作用机制 根据目前研究认为抗菌肤可能主要是通过以下几种机制杀伤微生物和肿瘤细 胞： ( 1 ) 胞膜攻击作用 大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜 结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，从而最终导致肿瘤细胞和细菌的死亡( d e k k e r e ta 1 。2 0 0 1 ) ，而抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。昆虫 天蚕素抗菌肽分子是通过其两亲性a 螺旋上正电荷与细菌细胞膜磷脂分子上负电 荷之间的静电吸引而结合聚集在质膜上，然后抗菌肽分子中的疏水段c - 端( 酰胺基) a 螺旋插入到疏水的细菌细胞膜中央，双亲的a 螺旋留在质膜表面，打乱了质膜 上蛋白质和脂质原有的排列秩序，使得膜外正电荷增多，超过阈值时导致膜去极化。 由于抗菌肽分子的d 螺旋是亲水、琉水两亲性的，所以当抗菌肽分子相互聚集在一 4 中山大学硕士学位论文 起时可形成离子通道，导致阳离子外流，最后细菌失去保护，不能保持正常的渗透 压而死亡。从猪小肠中分离得到的抗菌肽c e c p 与天蚕素的作用机制类似，也是通 过膜攻击来完成对细菌的杀伤，但其g 端为羧基而非酰胺基，其抗菌谱也有所不同， 其作用机制主要是通过碱性氨基酸与细菌外膜表面的磷脂酰头部结合，由于分子的 旋转导致c e c p 的疏水残基与膜的疏水区结合，超过阈值时，则在质膜上形成瞬时 小孔，导致菌体内容物溢出，菌体裂解死亡( p a r ke t 以，2 0 0 3 ) 。防御素作用于细胞 膜，可增加生物膜的通透性而发挥作用。在人工脂质膜的实验显示，防御素作用于 膜上形成稳定的通道，且具依赖电压的传导特性( 1 b r a h i m e t a l ，2 0 0 0 ) ，因为防御素 分子很小，不能以单聚体的形式造成膜穿孔，但防御素分子能以多聚体的形式作用 于胞膜。有学者就基于抗菌肽i - d 4 p 2 与生物膜疏水区和极性区的作用方式以及形成 膜孔的大小等，提出由6 个防御素分子的同源二聚体组成一个穿孔环的模型 ( b e c h i n g e r , 1 9 9 7 ) ( 2 ) 诱导细胞凋亡m a i 等( 2 0 0 1 ) 以融合抗菌肽d p i 局部注射到小鼠实体瘤内， 并研究d p i 对肿瘤细胞株m c a 2 0 凋亡的影响，结果发现d p i 可迅速诱导凋亡， 并使肿瘤体积缩小。c h e n 等( 2 0 0 1 ) 以抗菌肽r g d - t a c h y p e s i n 作用于前列腺癌细胞 株t s u ，以荧光免疫法和w e s t e r n 印迹杂交法检测，结果发现凋亡相关蛋白 c a s p a s e 9 ，c a s p a s e 8 , c a s p a s e 3 以及f a s 配体表达均升高，提示抗菌肽 r g d t a c h y p l e s i n 可以诱导与f a s 相关的凋亡，因此推测诱导凋亡可能是某些抗菌 肽的作用机制之一。 ( 3 ) 线粒体攻击作用b o b e k 等( 2 0 0 3 ) 以人唾液中提取的抗菌肽m u c 7 作用于临 床常见的真菌、杆菌和球菌，发现m u c 7 对真菌和细菌都有很强的杀伤作用。在 超微结构中发现线粒体出现肿胀，空泡化、嵴脱落和排列不规则，核膜界限不清， 有的核破裂，内容物溢出。这提示抗菌肽m u c 7 的作用机制可能与抑制肿瘤细胞 呼吸有关。c h e n 等也发现抗菌肽t a c h y p l e s i n 的作用机制与抑制线粒体相关的 c a s p a s e 7 和c a s p a s e 6 蛋白有关。f e h l a u m 等( 1 9 9 6 ) 发现t h a n a t i n 在0 3 - 0 6 z m o l l 时，就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度提高到7 0 m o l l 时，仍然检 测不到细胞内k + 的泄漏，提示t h a n a t i n 不是通过形成离子通道来杀灭细菌。当 利用4 0 4 m o l l 的t h a n a t i n 处理细菌时，1h 后可检测到细胞的呼吸作用变弱，6h 5 中山大学硕士学位论文 后完全停止。因此认为t h a n a t i n 是通过抑制细胞呼吸作用来杀菌的。 ( 4 ) 对细胞核染色体的影响 以往的研究多集中于抗菌肽对细胞膜的破坏作用， 但h a r i t o n 等( 2 0 0 2 ) 以具有同源性的两种抗菌肽d e r m a s e p t i n s 4 ，d e r m a s e p t i n s 4 1 3 作用于h e l a 肿瘤细胞株，荧光免疫染色发现s 4 不能进入到肿瘤细胞内部； s 4 1 3 m r 较小，可以进入到细胞内部，但不能结合到细胞核上。对其进行氨基酸序 列加工改造后获得的新型抗菌肽p v s 4 - 1 3 和r r s 4 。1 3 却具有更强的穿透性，同时 也可以结合到肿瘤的细胞核上。研究发现，经这两种改造后的抗菌肽作用后的肿瘤 细胞d n a 出现断裂，并最终导致死亡，由此推测抗菌肽可以通过直接作用于肿瘤 细胞的染色质发挥杀伤作用。 ( 5 ) 对癌细胞骨架的断裂作用c h e n 等( 2 0 0 3 ) 研究了天蚕素b 、b 1 和b 3 的抗肿瘤 作用机制，这3 种抗菌肽在空间结构和氨基酸序列上存在着一定差异，但又有一定的 同源性。通过作用于体外培养的肿瘤细胞发现，3 种抗菌肽都可以使细胞的双分子层 发生溶解，微管崩解，肿瘤细胞皱缩、死亡。并且发现这种杀伤作用的效率与3 种抗 菌肽的空间结构和成分密切相关，证实了抗菌肽不仅可以使细胞膜发生穿孔，而且 还可以破坏微管的正常功能，影响细胞骨架的完整性，阻止纺锤丝形成和有丝分裂， 进而破坏细胞器，杀伤肿瘤细胞。虽然抗菌歇对肿瘤细胞和正常人体细胞的细胞骨 架均有一定损伤，但后者骨架系统完整，修复快，不会造成不可逆损伤。而肿瘤细 胞骨架不完整，经抗菌肽作用后，得不到及时修复。最终导致死亡。 ( 酌抑制蛋白质及细胞壁合成h a r d e r 等( 2 0 0 1 ) 发现入的抗菌肽b - d e f e n s i n 3 能够 抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻，并使细胞壁 穿孔，最终导致细菌死亡。目前在发现抗菌肽的多种作用机制中，膜攻击理论被认 为是抗菌肤的最主要作用途径，然而同一种抗菌肽也可能通过多种途径发挥作用。 1 1 3 抗菌肽的应用 随着对抗菌肽的研究日益深入，其独特的抗菌作用已引起人们的高度重视。尤 其它不会像抗生素一样产生耐药性，并且作用具有高效性，这样就使抗菌肽在开 发一种薪的抗生素极其困难的情况下倍受人们的青睬。当然由于抗菌肽几乎存在于 6 中山大学硕士学位论文 每一种生物中，所以它的应用也绝不仅仅局限于某一领域。 ( 1 ) 药用领域自青霉素发明以来，人类第一次可以同细菌展开斗争。但是随着抗 生素的广泛使用，却产生了令人头疼的耐药问题。针对严重的耐药现象，医学界企 图找到一种新的抗生索。而抗菌肽无致畸变作用，无毒性蓄积作用，也不容易产生 耐药性( 卢晓风等，1 9 9 9 ) ，这就意味着在新型抗生素的发现上有着广泛的前景。 目前已经有多种抗菌肽在进行实验室的研究，并且有一些抗菌肽抗生素如m a g i n i n 已经进入期临床实验阶段。p 1 3 3 ，一种起源于h i s t a t i n 的人类唾液抗菌肽， 现已进入l 临床l l 期实验，用于治疗念珠菌病感染的病人羊毛硫抗生素 l a n t i b i o t i c - n i s i n 现已开发成商业抗生素，用疗胃幽门螺旋杆菌感染和胃溃疡；而 n i s i n 的另一种形式，n i s i n - a 已经在临床试验中对于耐万古霉素的治疗中证明有 效。抗菌肽对病毒、肿瘤细胞也有作用。例如，榨蚕蛹中分离到的抗菌肽，经过冻 干制成千粉，在乙型肝炎的临床实验中，效果明显，证明抗菌肽对病毒有作用。对 于h i v 长期感染过程中，由c d 8 t 细胞分泌的c d 8 抗病毒因子，其抗h i v 病 毒的作用就是因为人类防御素a d e f c n s i n s1 - 3 具有抗h i v 病毒的作用( i j n q ie t a i 。2 0 0 2 ) 。由于抗菌肽对正常的淋巴细胞无任何不良反应，而这正是目前肿瘤化疗 药物所不具备的特色，因此抗菌肽还可以应用在癌症肿瘤上这些研究都证明了抗 菌肤可以成为一种新的抗肿瘤药物的来源。抗菌肽除了有抗细菌、病毒、肿瘤作用 外，还有较强的抗真菌作用。针对临床上抗真菌药物疗效差，副作用大的现象，抗 菌肽还有可能成为新型的抗真菌药物 ( 2 ) 畜牧业领域仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等 一直是棘手的疾病，不利于畜牧业的发展。我们借鉴已成功的抗菌肽转基因工程， 如转基因对虾、转基因马铃薯、转基因水稻等，可以把特异的抗菌肽基因转入畜禽 特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种。温刘发等曾利用蚕类抗菌肽制剂饲喂断 奶仔猪的实验结果表明，蚕抗茵肽可在一定程度上减轻断奶仔猪的腹泻程度。另有 研究表明，抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生物平衡，并易在动物体 内残留，严重影响了畜产品的品质和人类的健康。用基因工程方法生产的环保型抗 菌肽饲料添加剂，或者通过日粮因素调控抗菌肽基因的表达而达到畜产品无抗生素 化很好的解决了上述问题，这也是抗菌肽在畜牧业上最直接的应用。 7 中山大学硕士学位论文 ( 3 ) 农业领域抗菌肽在农业上的应用主要有两个方面，一是取代或部分取代目前 喂养动物所用的抗生素，减少动物喂养之中对抗生素的依赖，减少抗生素通过食物 链的传播，减少对人类的威胁；二是通过转基因技术将广谱抗菌肤基因导入动植物 体内，增加动植物对各种病原菌的抵抗能力。目前这些研究大都在植物中进行，并 且已经取得了很大的成果。 ( 4 ) 抗菌肽在水产养殖业上的应用 随着养殖业的发展，养殖中所产生的排泄物和 残饵超过了水环境的降解自净能力，造成水资源的严重污染。如果用抗生素来迸行 治理，则会引起水环境的为生态平衡，也会引起耐药性的产生。因此，可以利用既 有稳定高效抗菌活性又同时对宿主无害的抗菌肽，来对付水产中病原微生物，从而 对水资源进行有效的治理( 叶星、白俊杰，2 0 0 0 ) 。 ( 5 ) 抗菌肽在食品中的应用细菌抗菌肽乳链菌素发现后的2 0 年，发现 n i s i n 是乳制品中的天然产物，食用后很快在食道被蛋白酶水解成氨基酸，而不会 改变肠道的正常菌群，是一种安全的防腐剂。目前，英、美、法等5 0 多个国家已经 批准n i s i n 作为食品防腐剂来开发产品并已经投资( 郭新竹、宁正祥，2 0 0 0 ) 。 1 1 4 闯题与展望 从上面抗菌肽的各个方面尤其在药用方面可以看出，抗菌肽有很广阔的发展前 景，具有作为一类新药开发的潜力，但是要使这一愿望得以实现，还有很多的困难 需要克服。首先是抗菌肽的提纯问题，由于天然抗菌肽的含量一般比较小，它的提 取和纯化都比较困难，虽然现在可以用化学合成和基因工程的方法获得抗菌肽，但 这势必增加药物的成本。因此，如何提高抗菌肽的生产效率、降低成本是应用抗菌 肽必须解决的问题；其次是基因工程生产中的表达载体问题，由于大部分抗菌肽对 表达载体有害，这样只能使抗菌肽以融合蛋白的形式表达，但这又无疑增加了后续 工作的难度；再次是抗菌肽的稳定性和免疫反应问题，由于耳前有关抗菌肽药动学、 药效学方面的研究还比较少，大多数的实验只适用于局部治疗，要使抗菌肽真正的 应用于i 临床，还要解决好它的毒性、稳定性、免疫原性、应用方法、药物制剂等方 面的问题。最后是与传统抗生素相比，某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想，这就需 8 中山大学硕士学位论文 要结合抗菌肽活性与结构的关系有目的地对其进行改造和设计。另外对于抗菌肽的 作用机制还需要进一步的研究与探索，这样可以使我们更好的利用和改造抗菌肽， 使之能尽快的应用于临床。综上所述，虽然抗菌肽还存在很多的不足之处以及没有 解决的问题，但我们有理由相信，抗菌肽依其与众不同的各种性质和独特的杀菌机 制一定能在生物药用领域发挥其应有的作用，也必将为人类的健康产生深远的影响。 1 2 抗茵肽的分子设计理论与实践 人们对抗菌肽结构、抗菌机制及其基因表达调控机理的认识，不仅极大丰富了 生物免疫学和生物化学相关领域的知识，也为新药设计、基因工程改造及设计合成 新的抗菌分子提供了全新的思路和手段。虽然抗菌肽对细菌有杀菌作用，对部分真 菌有一定效果，而且对原虫，病毒、肿瘤细胞及癌实体瘤有杀伤作用，但与传统抗 生素相比，抗菌肽的抗菌活性还是不够理想，因此在不断深入了解抗菌肽的同时， 人们开始着手对抗菌肽进行分子改造，以期找到更理想的抗菌肽( o t v o s ，2 0 0 0 ) 蛋 白质的结构和功能是密切相关的，许多来自于不同物种的抗菌肽，其一级结构有不 少相似之处。而且，在抗菌肽的许多特定位置有一些较保守的氨基酸残基，有些位 置尽管残基不同，但仍是保守性替换( y a m a n o ，1 9 9 4 ) 。来自同一目不同种昆虫的抗 菌肽，其一级结构更是极为相似，构成分子的氨基酸序列高度同源。提示不同抗菌 肽在结构与活性的关系上可能有共同之处。同时研究中也明确了一些重要的特征结 构，如手性、疏水性、两亲性、螺旋性，糖基化、酰胺化、及细胞膜中的胆固醇和 磷脂等与生物活性的关系。为抗菌肽的分子设计及分子改造提供了一定的理论依据。 当然，要阐明结构与功能的关系，还需进一步研究其高级结构。例如通过对c e c r o p i n s 类抗菌肽十二种以上的一级结构的分析，发现它们的结构( 氨基酸组成和序列) 具 有8 0 - 9 0 相似性，n 端由较多带正电荷的氨基酸组成，g 端由较多的疏水性氨基 酸构成，并且在肽的许多特定位置有一些较保守的残基，如二位的色氨酸、5 位、8 位、9 位的赖氨酸、1 1 位的天冬氨酸等( 贾士荣等，1 9 9 6 ) 。而对其高级结构的研究 表明，抗菌肽n 端半分子在疏水环境中易形成带电荷的亲水性a 螺旋，g 端则易形 成疏水a 螺旋，这两段a 螺旋通过。转角连接。由此，提出了c e c r o p i n s 类抗菌 9 中山大学硕士学位论文 肽作用的机理，即两种假说和两种模型。两种假说( h l o a k e t a l 。1 9 8 8 ) ：对抗菌肽作 用于膜表面的形态有两种可能，一种可能是抗菌肽结合至膜上时，肽链自身会受膜 表面诱导，形成整个分子长度上的两亲螺旋，另一种可能是肷链会形成由一个转角 连接的两段螺旋。n 端的两亲螺旋结构在膜表面，而c 端的疏水螺旋则插入膜中。 两种模型( f i n ke ta ，1 9 8 9 ) ：一种认为抗菌肽部分嵌入膜内造成膜的脂双层的有序 结构的破坏，使膜崩溃，即抗菌肽起了表面活性剂或去垢剂的作用，这种模型要求 抗菌肽有一段两亲的a 螺旋接近膜表面和一个疏水尾巴能插入膜内。一种认为抗菌 肽结构结合到膜上只是反应的第一步，然后n - 端再插入膜内，两个或多个分子聚 在一起形成孔道，使膜内外环境相通，造成物质泄漏的电化学势丧失。 科学研究者根据以上的抗菌肽的结构基础和假说，设计了许多新型的抗菌 肽。其方法有：( 1 ) 保持原来的抗菌肽的完整结构，对某些氨基酸进行突变，从而 增加n 端a 螺旋或增加d 端a 螺旋及疏水性。a n d r e u 等( 1 9 9 2 ) 首先采用化学 合成的方法对天然抗菌肽进行修饰，在c c c m p i n 末端增加或减少一个氨基酸，或 改变肽链中氨基酸残基。b o m a n ( 1 9 8 9 ) 曾经设计了4 个新的抗菌肽类似物，分别强化 n 端或d 端的某种结构倾向，以期为抗菌肽结构和作用机理确定提供依据，其中 m pi 体现第一种假说，m p i i i 反映第二种瑕说，结果m pi 尽管有较强的螺旋成 分却只有很弱的活性，而m p i h 的活力接近天然c e c r o p i n a ；j a y n s e 等( 1 9 8 9 ) 以天 然抗菌肽中活力最强的c e c r o p i nb 为蓝本合成了与抗菌肽一级结构相差甚远的 s h i v a l ，在c e c r o p i nb 的l y s , v a l ，g l u ，a r g , a s h ，l e u 的位置上分别以a r g , l e u ， a s p ，l y s ，g i n ，v a l 取代，只是保持了这些位置上原有的极性。结果发现s h i v a1 的 抗菌肽活力强于c e c r o p i nb ，并且它可以杀死疟原虫，而对未受侵染的及己受侵染 的寄主细胞没有伤害；王禾等( 1 9 9 3 ) 以c e 搿o p i nb 为蓝本，将其n - 端两亲性a 螺 旋上的疏水性氨基酸v a l ，i l e 和m c t 均用l e u 代替，合成了w h d ，它和 c e c r o p i nb 的氨基酸同源性为8 3 ，结果表明w h d 对c e c r o p i nb 不能作用的枯 草芽胞杆菌( b a c i l l a ss u b t i l i s ) 以及绿脓杆菌( p s e a d o m o n a so n a $ a e r u g i n o s a ) 也有 抗菌活性，对青枯假单胞菌( p s e a d o m o n a ss o l a n a c e a r u m ) 的抗菌活性比c e c r o p i nb 更高；王三山等( 1 9 9 3 ) 使用g a m i e r 方法，以c = e c r o p i nb 为蓝本，设计与c e c r o p i nb 同源性只有8 3 的近似体a b p 3 ，发现其在保持c e c r o p i nb 本身的抗菌能力外，对 1 0 中山大学硕士学位论文 软腐菌的杀伤作用明显提高，而且对某些肿瘤细胞具有抑制作用；谢维等( 1 9 9 6 ) 根 据己知家蚕c m i v 的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，合成了该基因； 李秀兰( 1 9 9 9 ) 等有在家蚕c m i v 的氨基酸序列的基础上，进行了近5 0 的氨基酸替 换，设计并合成了新的抗菌肽基因序列。( 2 ) 设计杂合肽。b o m a n 等( 1 9 8 9 ) 设计的 c e c r o p i n a 与蜂毒素( m e l i t t i n ) 的杂交肽，即由c e c r o p i na n 末端作“头”，蜂毒素 的c 末端作杂交肽的“尾杂合成c a ( 1 1 3 ) m ( 1 1 3 k 黄自然教授等( 1 9 9 8 ) 领导实验 室设计合成的a d 基因；即由c e c r o p i na 的n 端和c e c r o p i nd 的g 端杂合并 成，证明其具有较高的活性。很有意义的是发现杂合肽可以缩短至1 5 肽而其生物学 功能不变；a n d r e u 等( 1 9 9 2 ) 报道：缩短的c e c r o p i na 与m e l i t t i n 杂合肽( 1 5 ，1 8 ， 及2 0m e t ) 具有与原来( 3 5 ，3 7m e r ) 杂合肽相似的生物学活性，保留c e c r o p i nan - 端的7 个氨基酸残基( c a l - 7 ) 是保持肽理想的活力所必需的。( 3 ) 抗菌肽与其它蛋白 质的融合吴映雅等( 1 9 9 8 ) 报导，抗菌肽与碱性纤维细胞生长因子融合，仍然具有 抗菌活性这说明，抗菌肽的活性在保持n 端完整的情况下，c 端的结构可做较大 的调整，这为抗菌肽的设计提供了一条新的线索。因此利用基因工程技术来生产抗 菌肽具有广阔的发展前景，它为抗菌肽的制各提供了新的途径。 1 3 抗菌肽基因表达的研究 由于抗菌肽天然资源有限，有望廉价获得的化学合成和基因工程手段成为熟点， 化学合成肽类成本高，而基因工程方法大量表达抗菌肽使之成为新一代肽类抗菌药 物的途径更为现实，并显示出良好前景。目前人们在利用大肠杆菌、酵母、杆状病 毒等表达系统制备抗菌肽的过程中进行了种种尝试，取得了许多进展，现分述如下： ( 1 ) 在酿酒酵母中表达。r e i c h h a r t ( 1 9 9 2 ) 首先报导抗菌肽基因在酵母中表达；叶玉坤 ( 1 9 9 4 ) 将人工合成的抗菌肽d 与含九因子以及前导肽序列的穿梭质粒p c l w a z 重 组，克隆了酵母a b1 0 3 ，发酵分离并测到活性；马礼金、庄楚雄和黄自然等( 1 9 9 5 1 报导，把抗菌肽d 基因通过表达载体转入酵母获得表达，并进行表达产物的分析， 刘飞鹏等( 1 9 9 6 ) 合成了天蚕素a 与蜂毒素杂合巧肽基因，在酵母中非分泌表达，但 表达量偏低。( 2 ) 在杆状病毒载体中表达。1 9 9 1 年h e l l e r s 等人将编码前c e c r o p i na l l 中山大学硕士学位论文 肽原的c d n a 片段克隆到苜蓿斜纹核型多角体病毒( a c n p v ) 多角启动子的下游， 目的基因成功地在重组感染的粉纹液蛾( t r i c h o o p l u s i a n i ) 末龄幼虫和天蚕滞育蛹中 表达( 6 0 0 岸咖l 血淋巴) 。约7 0 的表达产物被酰胺化，通过活性电泳和质谱分析 具有较高的活性；1 9 9 1 年和a n d e r s o s 等人将c e c r o p i na 与葡萄球菌蛋白a 融合在 一起，插入到a c n p v 多角体启动子下游的t - p a 信号肽后，在重组感染的s f 9 细胞 和t r i c h o p l u s i a n i 末令幼虫也成功地进行表达。( 3 ) 在植物表达载体中表达。黄大年 等( 1 9 9 7 ) 以抗菌肽b 基因受控于水稻a 构成一个嵌和基因，新构建载体p c b1 ，基 因枪法转化水稻：我国由8 6 3 计划立题，也已将c e c r o p i nb 及s h i v a 基因等转化我 国六个马铃薯主载品种，温室接种鉴定初步获得与国外同样的结果；热带作物生物 技术国家重点实验室已把抗菌肽成功地在广霍香、西红柿中表达，并获得了抗性植 株( 张家明等，1 9 9 8 ) 。( 4 ) 在大肠杆菌中的表达。1 9 8 9 年j a y n c s 报告将修饰过 的c e 蛆o p i n b 基因以融合蛋白的方式在e c o l i 中表达，并发酵到1 0 0 0 立升；谢维等 ( 1 9 9 6 ) 根据己知家蚕c m i v 的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，首次合成 丁家蚕c m i v 基因并将其克隆到金黄色球菌a 蛋白与1 9 g 亲和结构域z z 的融合蛋 白的表达载体中，获得了融合表达；李秀兰等( 1 9 9 9 ) 在家蚕c m i v 氨基酸序列的基 础上，进行了近5 0 的氨基酸替换，设计并合成了新的抗菌肽基因序列，并采用大 肠杆菌偏爱的密码子，在大肠杆菌v e t 2 8 ( a ) 中载体中进行融合表达；孙超等( 2 0 0 1 ) 报导多肽抗生素a p i d a e c i n 基因在乳酸乳球菌进行融合表达。 大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的原核表达系统。与其他表达系统相比， 该系统具有遗传背景清晰、可供选择的表达载体和宿主菌突变体多、发酵工艺和分 离纯化方法成熟、成本低廉、培养方便、周期短、表达量高等优点。成为基因工程 产业化中理想的表达系统，也是重组蛋白表达的首选系统。由于抗菌肽分子量小， 碱性氨基酸多，在水溶液中以自由卷曲形式存在，因此易被蛋白酶降解，而且大多 数抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有杀伤作用，所以抗菌肽在原核表达系 统几乎都是以融合蛋白形式进行表达( p a n ge t 以，1 9 9 1 ) 。实际上抗菌肽融合表达具 有很多优点f l i e r se ta l ，1 9 9 3 ) ：( 1 ) 融合表达载体的s d - a u g 已固定，翻译起始信 号组织合理，利于翻译起始。( 2 ) 不管是在细胞内还是分泌到胞外，抗菌肽以融合 形式表达可保护抗茵肽免受蛋白酶降解。( 3 ) 许多被用于融合的蛋白都对一些分子 中山大学硕士学位论文 具有亲和力，可用一步法纯化，简化了蛋白分离纯化的工。( 4 ) 融合分子的存在， 可掩盖抗菌肽的抗菌活性合在一起不具抗菌活力原去免疫动物获得抗体因而对宿主 无杀伤作用。( 5 ) 即抗菌肽与融合蛋白结融合蛋白可直接用做抗，不需要把抗菌肽 再连到半抗原上。( 6 ) 抗菌肽以融合形式表达可增强m r n a 及表达产物的稳定性。( 7 ) 抗菌肽以融合形式表达后，可通过化学和专一酶切的方法获得天然的n 端，这对抗 菌肽功能的研究非常重要，因为n 端多一个至几个氨基酸有可能会影响抗菌肽的活 力 泛素融合技术最初由v a r s h a v s k y 等人于1 9 8 6 年开始应用，泛素融合技术的 一个主要用途就是可以极大地提高重组蛋白的表达量，并且这种作用在真核和原核 细胞中同样存在。目前推测这种表达量的提高是由于翻译过程中，新生的泛素分子 可以迅速折叠形成高级结构，从而保护后翻译出来的肽链免受胞质内蛋白酶降解。 外源基因融合泛素后不仅产量会提高，而且表达产物的可溶性也会增加。可能的原 因是泛素下游的新生多肽可能会和泛素部分存在着较弱的相互作用，从而阻止了新 生肽链间的相互聚合，泛素实际起到了分子内伴侣的作用。一些较难表达或表达量 很低的异源蛋白，都己经用泛素融合技术进行了成功的表达。例如，b a k e r 等人( 1 9 9 4 ) 在大肠杆菌中共表达了人的一种谷胱甘肽s 转移酶g s t p l 和酿酒酵母的泛素特 异性