（生物化学与分子生物学专业论文）水稻γ氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体构建.pdf

水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达栽体的构建 缩略词表 缩写名称 英文仝称 a a p a m p a d a u a p b p c d n a c d s d n t p d e p c d t t e b g a b a g a d e d t a g a d g s p g u s i d d m i p t g k a n l b m l n 、 m l m m m r n a o d o r f p c r r o m r a c e s e c t a g u a p a b r i d g e da n c h o rp r i m e r a m p i c i l i n a d a p t o rp r i m e r a b r i d g e du n i v e r s a la m p l i f i c a t i o np r i m e r b a s ep a i r s c o m p l e m e n t a r yd e o x y r l b on u c l e i ca c i d c o d i n gs e q u e n c e d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i t h ；0 t i l r e i t o 】 e t h i d i u mb r o m i d e j l , - a m i n ob u t y r i ca c i d g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e e t h y l e n e - d i a m l n e t e t r a - a c e t i ca c i d g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s eg e n e g e n es p e c i f i cp r i m e r 1 3 - g l u e o r o n n i d a s e i n s u l i n - d e p e n d e n td i a b e t e sm e l l i t u s i s o p r o p y l - 1 - t h i o - b d g a l a e t o s i d e k a n a m y c i n l u r i a b e r t a n i m i n u t e m i n i l i t r e m i n i m o i a r m e s s e n g e rr n a o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n r o u n d sp e rm i n u t e r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s s e c o n d t h e r m u sa q u a r i u sd n a ( p o l y m e r a s e ) u n i v e r s a la m p l i f i c a t i o np “m e r x 。g a l 5 - b o r m o - 4 - c h l o r o 一3 一i n d o l y l b - d g a l a e t o s i d e y a c s y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s 水稻t 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表迭栽体的构建 图表清单 图1 1y 一氨基丁酸的代谢途径 图1 23 r a c e 技术流程示意图 图1 35 r a c e 技术流程示意图 图3 1 水稻总r n a 的电泳图 图3 2r t p c r 扩增产物的电泳图 图3 33 r a c e 巢式p c r 产物电泳图 图3 45 r a c e 巢式p c r 产物电泳图 图3 5 编码序列扩增产物的电泳图 图3 6p c r 鉴定重组载体p m d g a d 中的目的基因g a d 图3 7p m d g a d 的e c o r l x h o i 双酶切结果电泳图 图3 8 重组原核表达载体p e t g a d 的鉴定结果 表1 1 富含g a b a 的物质 表3 1 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的全长c d n a 序列 表3 2 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因核昔酸序列所推导出的氨基酸序列一4 4 表3 3 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因与已报道的序列相似性比较的部分结果4 5 表3 4 水稻g a d 与部分已报道的g a d 氨基酸序列多重比对结果4 7 一 坞 加 们 蛆 蛇 北 锝 柏 叶 馏 鹄 水稻r 氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体的构建 摘要 y - 氨基丁酸( y a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) 是一种独特的非蛋白质氨基酸，是 某些生物体内的一种天然活性成分。y 氨基丁酸在动物体内是一种抑制性神经传 递物质，介导中枢神经系统6 4 上的抑制性神经传导，能系统地对脑血管进行 调节，增强人脑细胞功能，改善记忆力，此外y 氨基丁酸还具有降血压、抗焦虑 等生理功能。在植物体内，t 一氨基丁酸是一种植物次生代谢物，具有提高植物抵 抗害虫的能力等功能。t 一氨基丁酸合成酶( g a b as y n t h a s e ，也称为谷氨酸脱羧 酶，g h l t a m a t ed e e a r b o x y l a s e ，g a d ) 是v 氨基丁酸合成的关键酶。 本研究采用e d n a 末端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s 。r a c e ) 技术，从本实验室筛选出的高g a b a 含量的籼稻( o r y z as a t i v a ls s p , i n d i c a ) “新 9 - 4 ”的胚芽中分离克隆出了y 氨基丁酸合成酶基因，对该基因进行了序列分析 和功能预测，并构建了该基因的原核表达载体。为今后研究该基因的功能、分子 进化及其应用于作物品质基因工程等奠定了基础。具体结果如下： 1 、基因克隆及序列分析：从水稻“新9 4 ”的胚芽中提取总r n a ，根据已 报道的y 一氨基丁酸合成酶氨基酸序列的保守区段设计一对简并引物，利用 r t 。p c r 技术获得7 5 1b p 保守片段，然后以此序列为依据设计特异引物，利用 r a c e 技术获得了1 9 6 2b p 的水稻g a d 基因全长e d n a 序列，包含完整的编码序列 ( 1 4 7 9b p ) ，编码4 9 2 个氨基酸残基，并将该基因命名为o s g a d ，与粳稻( o r y z a s a t i v a 厶s s p j a p o n i c a ) g a d 3 的e d n a 和芥菜( b r a s s i c a j u n c e a ) g a d4 ac d n a 的相 似性分别为9 9 $ 1 1 8 1 。由a 晰推导的氨基酸序列与粳稻( o r y z as a t i v a 厶s s p j a p o n i c a ) g a d 、烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) o a d 同工酶1 和芥菜( b r a s s i c a j u n c e a ) g a d 4 a 的同源性分别为1 0 0 、8 2 和8 2 。推测此基因具有水稻y 氨基 丁酸合成酶基因的功能。 2 、原核表达载体的构建：将y 氨基丁酸合成酶基因的编码序列插入到载体 p e t 2 8 a ( + ) 中，构建了重组原核表达载体p e t 2 8 9 a d ，并通过p c r 和酶切鉴定表明 该重组载体己转化到表达宿主菌b l 2 1 中。 关键词：y 一氨基丁酸合成酶；谷氨酸脱羧酶：基因克隆；r a c e ；载体构建 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表迭栽体的构建 m o l e c u l a rc l o n i n go fg a m m a a m i n ob u t y r i ca c i ds y n t h a s eg e n ef r o mo r y z as a t i v a a n dc o n s t r u c t i o no fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r a b s t r a c t t - a m i n ob u t y r i ca c i d ( g a b a ) ，an o n - p r o t e i na m i n oa c i d ，i san a t u r a la c t i v e c o n s t i t u e n ti ns o m eo r g a n i s m s i na n i m a l s ，g a b as e r v e sa san e u r o t r a n s m i t t e r m e d i a t i n gm o r et h a n6 4p e r c e n to f i n h i b i t o r yn e u r o t r a n s m i t i o n ，s y s t e m a t i c a l l y r e g u l a t e sb r a i nb l o o dv e s s e l ，e n h a n c e st h ef i m c t l o no f h u m a n b r a i nc e l l ，a n di m p r o v e s m e m o r y b e s i d e s ，g a b ac a r l a l s ol o w e rb l o o dp r e s s u r e ，a n df i m c t i o na s a l l a n t i a n x i e t ys u b s t a n c e ，e t c w h i l ei np l a n t s ，g a b ai ss e c o n d a r ym e t a b o l i t ea n di tc a n i m p r o v ep l a n t sr e s i s t a n c et op e s t s 。g a b as y n t h a s e ( a l s on a m e dg l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e ， g a d ) i st h ek e ye n z y m eo f g a b as y n t h e s i sp a t h w a yi np l a n t s i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，w i t ht h et e c h n i q u eo fa m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( r a c e ) ，a g a b as y n t h a s e g e n e w a si s o l a t e df r o mt h ee m b r y oo fo r y z as a t i v a 三s s p i n d i c a x i n - 9 4 ”w h i c hw a sd e t e r m i n e db yt h ei n s t i t u t eo fa g r i c u l t u r a lp r o d u c t q u a l i t ya n dc o n t a i n e dh i g hc o n t e n to fg a b a s e q u e n c ea n a l y s i s ，f u n c t i o np r e d i c t i o n a n dc o n s t r u c t i o no fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro ft h eg e n ew e r ea l s os t u d i e d t h e a n a l y z i n gr e s u l t so ft h eg e n ea r ev e r yh e l p f u lt oe l u c i d a t ei t s f u n c t i o nv a l i d a t i o n ， m o l e c u l a re v o l u t i o n ，a n dp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nc r o pq u a l i t yg e n e t i ce n g i n e e r i n g t h em a j o re x p e r i m e n tr e s u l t so f t h i sd i s s e r t a t i o nw e r ea sf o l l o w s ： 1 m o l e c u l a rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fg a b as y n t h a s eg e n e ac o u p l eo f d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ec o n s e r y e da m i n oa c i ds e q u e n c eo f d i f f e r e n tp l a n t s a7 5 ib pl e n g t hc o n s e r v e df r a g m e n tw a sc l o n e db yr t - p c r ，t h ef u l l l e n g t hc d n aw a so b t a i n e dl a t e rb yr a c et e c h n i q u e ，a n dt h eo b t a i n e df u l ll e n g t h e d n a ( 1 9 6 2b p ) c o n t a i n e da no p e nr e a d i n gf r a m e ( 1 4 7 9b p ) e n c o d i n g4 9 2a m i n o a c i d s t h i sg e n ew a sn a m e da s o s g a d , t h em o l e c u l a rw e i g h t o fi t sd e d u c e d p o l y p e p t i d ew a s5 6k d a i d e n t i t ya n a l y s i so ft h ef u l ll e n g t he d n as e q u e n c es h o w s 9 9 s i m i l a r i t yw i t l lo r y z as a t i v a ( j a p o n i c ac u l t i v a r - g r o u p ) g a b as y n t h a s e ( g a d 3 1 e d n a ，8 1 o f t h a tw i t hb r a s s i c a j u n c e ag a b as y n t h a s e4 a ( o a d 4 a ) e d n a t h e 4 水稻r 氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达栽体的构建 d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo fo s g a ds h o w s1 0 0 s i m i l a r i t yw i t ho r y z as a t i v a 上 s s p j a p o n i c a g a d ，8 2 o f t h a t w i t h n i c o t i a n a t a b a c u m g a d i s o e n z y m e l ，a n da l s o 8 2 s i m i l a r i t yw i t hb r a s s i c aj u n c e ag a d 4 a t h u si tc o u l db ei n f e r r e dt h a tt h e o b t a i n e dg e n ew a sg a b as y n t h a s eg e n e 2 c o n s t r u c t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r b yi n s e r t i n gt h eo r fo fg a b a s y n t h a s eg e n ei n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 8 a ( + ) ，t h i sr e s e a r c hh a s s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dar e c o m b i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 8 9 a d , p c ra n de n z y m ed i g e s to f t h i sv e c t o rp r o v e dt h a ti tw a ss u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e di n t o t h eh o s tb a c t e r i u mec o l ib l 2 1 k e yw o r d s ：o r y z as a f i v a ；g a b as y n t h a s e ；g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ；g e n ec l o n i n g ； r a c e ；v e c t o rc o n s t r u c l i o n 5 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体的构建 前言 随着我国经济和社会的发展，人民的生活水平日益提高，人们对物质生活的 追求已经不满足于温饱，而是越来越重视食物的营养和保健功能，对科学合理的 膳食结构的要求也越来越高。 近年来，我国高血压、肥胖、糖尿病等慢性病显著增多。据了解，目前我国 高血压患者已经超过l 亿，高血压是中国人群脑卒中发病和冠心病发病的最危险 因素。同时，随着人们生活节奏的加快，用脑过度和精神长期处于紧张状态，越 来越多的人患失眠、焦虑和记忆力下降等精神性疾病。 y 一氨基丁酸，是一种非蛋白质的游离氨基酸，是哺乳动物、甲壳类动物、 昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质。2 0 0 3 年5 月2 日美国 ( s c i e n c e 杂志发表了一项研究表明，大脑中一种神经递质y 一氨基丁酸 ( 6 a b a ) 的减少可能是脑衰老的一个原因。研究表明，g a b a 可从根本上镇静神经， 从而起到抗焦虑的效果( 许建军等，2 0 0 3 ) 。o a b a 作用于延髓的血管运动中枢， 使血压降低，同时抑制抗利尿激素后叶加压素的分泌，扩张血管，降低血压。g a b a 能系统参与哺乳动物( 包括人类) 心血管功能调节，可抑制心律失常的发生。此外， g a b a 作为中枢神经系统内重要的抑制性递质对精神性疾病和遗传性疾病有一定 的疗效，这些疾病包括帕金森病，中风，癫病，精神分裂症和老年痴呆症等。 植物体内，g a b a 是细胞自由氨基酸库的重要组分，包括水稻等少数植物体 内均含有g a b a ，但含量甚微。水稻是最重要的粮食作物之一，虽然它只占全部可 耕用土地面积的9 ，但它养活了将近一半的世界人口，在亚洲更是超过2 0 亿的 人以稻米为主食( m a c l e a n 等，2 0 0 2 ) 。倘若能将水稻中的g a b a 含量提高到一定 水平，那么将有近一半的世界人口因降低患高血压、焦虑和心率失常等疾病的概 率而获益。 正是由于其受益面广，富含g a b a 的产品显示了其广阔的开发前景，日本在这 方面已经走在了最前面，近年来，我国也相继开发出了一些新产品。美国国会将 2 0 世纪的最后十年命名为“脑的十年”，这一举措标志着神经科学研究新时代的 到来。它的目标一方面是进一步了解人类最复杂的生理现象一学习和记忆的机理， 另一方面是找出涉及脑的疾病的病因及疗法( 郭晓娜等，2 0 0 3 ) 。因此对g a b a 进行深入研究和开发有着十分重要的意义和广阔的前景。 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体的构建 y 一氨基丁酸合成酶即谷氨酸脱羧酶( g a d ) 是催化谷氨酸脱羧形成抑制性神 经递质y 一氨基丁酸的关键酶。它广泛存在于植物及脊椎动物中枢神经系统的神 经元中，非神经组织如胰岛、睾丸、输卵管中亦存在g a d 。t i a nj 等( 1 9 9 6 ) 的研 究表明，鼻腔给予g a d 6 5 可减少胰岛炎发生，并预防糖尿病。纯化的天然g a d 及基因 重组g a d ，特别是重组g a d 的获得，为胰鸟素依赖型糖尿病( i n s u li n d e p e n d e n t d i a b e t e sm e l l i t u s ，i d d m ，又称i 型糖尿病) 的预防及免疫治疗提供了保障。 本论文采用e d n a 末端快速扩增( r a c e ) 技术，从本实验室所筛选的高g a b a 含量的水稻品种中分离克隆了y 一氨基丁酸合成酶基因，对该基因进行了序列分 析和功能预测，并构建了该基因的原核表达载体，为今后对该基因的功能鉴定、 利用基因工程改良农作物以提高农作物的保健品质和其自身的抗病虫能力 ( r a m p u t h 等，1 9 9 6 ) 奠定了基础。 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体的构建 1 y 一氨基丁酸研究进展 i 文献综述 y 一氨基丁酸( y a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) 是在丁酸的y 位上有一个氨基， 分子式为c 。h 。0 ：n ，化学结构式为：h 2 n c h ：一( o h 2 ) 。- c o o h 。以非结合态的形式存在， 是一种非蛋白质氨基酸，由谷氢酸脱羧而成。 它极易溶于水，不溶于醇、醚和苯，可以通过化学法或生物合成。它是哺乳 动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质，在 人脑能量代谢过程中起重要作用，它具有激活脑内葡萄糖代谢，促乙酰胆碱合成， 降血氨，抗惊厥，降血压，恢复脑细胞的功能1 。少数植物中含有这种非蛋白质氨 基酸。 i iy 一氨基丁酸的分布 植物体内，g a b a 是细胞自由氨基酸库的重要组分，胞液中有几种构型，可 形成类似脯氨酸的环状结构【朔。高等植物组织g a b a 含量通常在0 3 3 2 5 m o l j g ( 3 ，0 9 3 3 4 7 5 m g 1 0 0 9 ) 之间，超过许多蛋白质类氨基酸的含量【3 3 】。 表1 1 寓含g a b a 的物质 t a b l 1 m a t e r i a l sr i c hi 1 1g a b a 物料g a b a 含量( m g 1 0 0 9 )物料g a b a 含量( m g l o o g ) 糙米 3 , 8 茶鲜叶( 经嫌气处理) 1 8 0 2 胚芽2 5 4 乌龙茶( 经嫌气处理) 2 4 5 9 处理后米胚芽2 0 0 , - - 4 0 0红茶( 经嫌气处理)1 7 6 5 发芽糙米( 处理后) 4 0 0绿茶 1 7 4 1 7 4 米糠 1 0 9卜氨基丁酸茶 1 5 0 0 米糠水提取液1 2 5 4贵洲苦丁茶7 1 3 米糠提取液酸水解 2 5 31 鲜蕨 2 3 5 2 桑叶 2 2 6 0 在一些与根瘤菌共生固氮植物的根瘤中，g a b a 以结合态形式存在，苜蓿中结 合态形式的g a b a 高达干重的6 6 t 3 1 。g a b a 和能经过生物催化转化为g a b a 的 水稻r _ 氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表速载体的构建 谷氨酸还广泛存在于细菌真菌、藻类、藓类、蕨类和有花植物中f 3 1 ，在掌叶半夏 和红曲中也含有少量成分。 g a b a 不仅存在于植物体内，同时也存在于在哺乳动物和人类中枢神经系统 中，主要存在于脑内，在外周组织例如胃肠道和生殖器官中也含有。 1 2 y 一氨基丁酸的代谢 在高等植物中g a b a 主要是由l 谷氨酸脱羧而来的。s t r e e t e r 和t o m p s o n 用“c 谷氨酸处理萝h 叶子，结果有大量“c 的g a b a 形成，这表明g a b a 来源于谷 氨酸的脱羧反应。和其他生物样，植物中g a l a 首先在g a b a 转氨酶的作用下与 a 一酮戊二酸发生转氨作用，形成谷氨酸和琥珀酸半醛，琥珀酸半醛经脱氢氧化 形成琥珀酸，进入三羧酸循环。这些反应和a 一酮戊二酸氧化成琥珀酸的反应一 起构成g a b a 支路。g a b a 支路中的3 种酶分别为y 一氨基丁酸合成酶、y 一氨基丁 酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶。g a b a 的代谢途径如图1 1 所示。 转氨酶 异柠檬酸a 酮戊二酸一谷氨酸 i谷氨酸脱籀酶 ( 三羧酸循环)琥珀酰辅酶ay 氨基丁酸 + 1 l g a b a 转氨酶 延胡索酸+ 一琥珀酸+ 琥珀酸半醛 琥珀酸半醛脱氢酶 图1 1y 一氩基丁酸的代谢途径 f i g 1 1 t h ep a t h w a yo f g a b a g a b a 在哺乳动物体内的代谢途径与植物类似。哺乳动物的g a b a 受体可分成 g a b a a 和g a b a b 两种亚型。 1 3 y 一氨基丁酸的生理功能 1 3 1 y 一氨基丁酸在动物体内的生理功能 ( 1 ) “耳聪目明的功能”：2 0 0 3 年5 月2 日美国s c i e n c e ) ) 杂志发表了一项 由中国科技大学、中科院昆明动物研究所和美国犹他大学的科研人员合作研究的 结果，研究发现，大脑中一种神经递质g a b a ( y 一氨基丁酸) 的减少可能是 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体的构建 脑衰老的一个原因。g a b a f l 帮助神经细胞处于对信号的高识别能力状态，科学家 给老年恒河猴大脑视觉皮层的神经细胞施以微量的g a b a ，结果发现神经元的行为 变得“年轻”了。该发现预示着如果能够通过某种手段提高人大脑中g a b a 的含 量，则有可能改善老年人的感觉功能以延缓衰老“1 。 ( 2 ) 抗焦虑的功能：g a b a 是中枢神经系统的抑制性传递物质，它是脑组织中 最重要的神经递质之一，其作用是降低神经元活性，防止神经细胞过热。g a b a 能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外一些物质协同作用，阻止与焦虑 相关的信息抵达脑指示中枢，因此，g a b a 可从根本上镇静神经，从而起到抗焦虑 的效果”。 ( 3 ) 降血压功能： g a b a 作用于延髓的血管运动中枢，使血压降低，同时抑 制抗利尿激素后叶加压素的分泌，扩张血管，降低血压。而且g a b a 还有学功能活 化功能，高血压病人往往肾功能降低，使肾功能活化后，即使盐分摄取量增多， 也可因为利尿作用激活，过剩盐分可从尿中排出，使血压降低，从而可预防高血 压。据报道，黄花等中药的有效降压成分即为g a b a 。 ( 4 ) 调节心律失常的作用：g a b a 自g 系统参与哺乳动物( 包括人类) 心血管功能 调节，可抑制心律失常的发生。有研究发现外源性的g a b a 具有抗心律失常活性， 可对抗多种实验性心律失常。进一步研究认为，g a b a 主要通过对心脏的直接作用 而抗乌头碱性心律失常，与神经调节无关。 ( 5 ) 调节激素的分泌：近年来发现，g a b a 参与了对垂体促性激素分泌的调节， 并有实验证实是通过下丘脑l h r h 细胞近旁g a b a 激导性传递的减少来实现的。g a b a 是脑内抑制性通路的重要物质，对内分泌功能尤其对腺垂体激素分泌功能有重要 的调节作用。研究表明，g a b a 能促进腺量体分泌黄体生成素，并具有促进甲状腺 素释放激素的功能。 ( 6 ) 调节胃酸分泌“”：g a b a 能神经元在胃酸分泌的中枢调节中起重要作用。 在脑内注射g a b a 能增加胃酸的分泌，g a b a 不仅能刺激胃酸的分泌，还能刺激胃蛋 白酶的分泌，并能抗大鼠实验性胃溃疡，这可能是因为g a b a 能, 提高胃组织内部 a t p 、d n a 量，促进胃组织蛋白合成，增加胃壁粘液蛋白量，从而增加了胃粘膜屏 障机能。 ( 7 ) 与某些疾病的形成有关：大熊诚太郎等( 1 9 9 7 ) 研究表明，g a b a 与某些疾 水稻r 氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体的构建 病的形成有关，帕金森病人脊髓中g a b a 的浓度较低，癫痫病患者脊髓液中的g a b a 浓度也低于正常水平。日本大阪大学医学院的研究者对富含g a b a 的米胚食品进行 医学试验，结果显示，g a b a 对k u p p e r m a n 综合症具有显著的改善效果，另外神经 组织中g a b a 的降低也与h u n t i n g t o n 疾病、老年痴呆等神经衰败症的形成有关。我 国的临床医学和日本的研究者都认为，g a b a 能抑制谷氨酸的脱羧反应，与q 一酮 戊二酸反应生成谷氨酸，使血氨降低。更多的谷氨酸与氮结合生成尿素排出体外， 以解除氨毒，从而增进肝机能“。医学上，g a b a 也用于尿毒症、睡眠障碍以及c 0 中毒的治疗药物中。最新的研究表明，有促进酒精代谢作用和消臭效果以及高效 减肥等活性”。 l _ 3 1y 一氨基丁酸在植物体内的生理功能 植物在缺氧、冷害、热刺激、机械刺激、干旱及盐胁迫等多种逆境条件下 g a b a 含量显著增加。r a m p u t h 等( 1 9 9 6 ) 研究发现，由于组织损伤引发g a b a 的迅 速积累，使其在植物抵抗昆虫的斗争中起重要作用。m i c h a e ld m c l e a n 等( 2 0 0 3 ) 对转y 一氨基丁酸合成酶基因的番茄研究发现，植物中g a b a 的积累能提高其对抗 无脊椎昆虫的能力“”。 ， 逆境条件下植物体g a b a 含量增加所产生的功能如下“： ( i ) 调节植物体内p h 值；由于g a d 的活性不仅能被h + 激活，而且在其催化的 谷氨酸脱羧反应中还要消耗质子，因而参与了植物体内的p h 值调节岫。 ( 2 ) 逆境条件下相关代谢中起回补作用：在正常情况下，三羧酸循环是由磷 酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 形成草酰乙酸来行使三羧酸循环的回补功能。当植物体遭 受到某些逆境胁迫时会影响到草酰乙酸行使回补功能，因为p e p 被用于合成苯丙 氨酸进而合成木质素来抵御病虫害，这时就需要通过g a b a 支路合成琥珀酸来为三 羧酸循环提供碳骨架行使回补功能。 ( 3 ) 影响植物生长发育：有证据表明g a b a 的积累和流出是胞间信号转导途径 的一部分，可以对植物的生长和发育起到一定的调控作用。 此外，g a b a 的积累还与氮储备、渗透调节、诱导逆境乙烯的产生以及植物防 御有关。 1 4y 一氨基丁酸的开发应用 水稻t 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表迭载体的构建 近年来，国内外尤其是日本越来越重视对富含y 一氨基丁酸产品的开发，开 发纯天然的药物符合当前所提倡的“药食同源”的趋势，因此富含g a b a 的食品一 定具有广阔的应用前景。目前，在食品领域已开发研制成功的产品有： ( 1 ) 发芽糙米：日本学者t a k a y os a i k u s a ( 1 9 9 2 ) 采用发芽的方法增加糙米 中y 一氨基丁酸的含量，研究发现以在4 0 c 和p h 5 5 的条件下发芽时，y 一氨基丁 酸含量增加最为显著。目前，日本已经成功开发了世界首创的发芽糙米，其g a b a 含量是自米的5 倍，比糙米高出3 倍多。我国郭晓娜等人研究的发芽糙米y 一氨基丁 酸含量达4 7 i m g l o o g ，为发芽前的2 4 倍，此外，中国水稻所黄大年教授及其 研究小组通过诱变选育了一个水稻新品种，每i 0 0 克本产品大米中的y 一氨基丁 酸含量可达5 0 0 毫克左右，比一般水稻品种的精米高5 6 倍。顾振新等啪1 和杨明 毅等”在这方面也做了大量研究和开发工作，并取得了可喜进展。 ( 2 ) y 一氨基丁酸茶：y 一氨基丁酸茶的加工与普通茶叶的加工法相仿，只是 在一般茶叶初制时增加了一道特殊的处理工序。从九十年代初期开始，日本就在 氮气嫌气条件下处理茶叶鲜叶，以提高成品茶中y 一氨基丁酸的含量“”，并首次 开发成功了新型的高y 一氨基丁酸茶。该茶叶中y 一氨基丁酸的质量分数必须达到 1 5 0m g k 9 1 以上。经动物试验和临床试验证实，高y 一氨基丁酸茶具有明显的降 血压效果。因此高y 一氨基丁酸茶自1 9 8 7 年日本投放市场以来深受广大高血压患 者的青睐，正在形成叶茶、袋泡茶和罐装茶饮料等系列产品，引起了世界各茶叶生 产国的关注。 ( 3 ) 其它食品源y 一氨基丁酸：大豆芽、辣椒、南瓜、茄子、番茄和蜜桔等 均已成为制作富集g a b a 的素材。桑叶中含有多种功能性成分，是一种具有丰富的 营养保健食品资源，其g a b a 含量异常丰富，1 0 0g 桑叶干品中g a b a 平均含量达 2 2 6 m g “。目前已经制成了桑叶茶、桑时面条、桑叶汁饮料和桑叶粉末等制品， 以桑叶为原料制成的天然保健制品越来越受到人们的青睐，将可作为很好的植物 性g a b a 富集材料。我国的黄酒也含有丰富的g a b a ，如古越龙山酒中g a b a 含量高 达3 4 8 m g l ”。 此外，y 一氨基丁酸还可应用于饲料工业上。动物随着采食量的增加，即输入 增加，其输出才增加。采食量的多少与畜禽的生产性能密切相关。早在1 9 世纪来， 人们就对下丘脑在控制动物的摄食活动中的作用有了初步的认识，发现饱中枢 水稻y 一氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表述载体的构建 ( 下丘脑腹内侧核) 和摄食中枢( 下丘脑外侧区) 是动物调节摄食的基本中枢，因 此可把富含g a b a 的食物作为饲料添加剂，增强动物的采食能力”1 。 1 5y 一氨基丁酸的检测 随着对神经药理学的深入和临床神经系统疾病病因的探索，要求建立快速、 精确的微量氨基酸定量分析方法，目前g a b a 的检测方法有：( 1 ) 放射受体法，此 法不够稳定，结果的重复性极差；( 2 ) 薄层扫描法，此法易受环境影响： ( 3 ) 高效液相色谱法，此法有一定的优势，但其样品要进行衍生操作；( 4 ) 氮基酸分 析仪法，此法准确，灵敏度高，操作简单，重现性好，但不利于大批量样品的快速分 析5 。 综上所述，g a b a 无论对于动物还是植物都具有非常重要的生理功能，尤其对 于人体，g a b a 作为中枢神经系统内重要的抑制性递质对精神性疾病和遗传性疾 病有一定的疗效，这些疾病包括帕金森病，中风，癫病，精神分裂症和老年痴呆症 等。因此对g a b a 进行深入研究和开发有着十分重要的意义和广阔的前景。 2 谷氨酸脱羧酶研究进展 谷氨酸脱羧酶( g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ，g a d ，e c 4 1 1 1 5 ) 是催化谷氨酸 脱羧形成抑制性神经递质y 一氨基丁酸的关键酶( 如图1 1 ) 。它广泛存在于植物及 脊椎动物中枢神经系统的神经元中，在非神经组织如胰岛、睾丸、输卵管等中亦 有存在。 2 1 谷氨酸脱羧酶的分离纯化及其理化性质 不同生物体中谷氨酸脱羧酶的理化性质不尽相同? 在大肠杆菌中的，g a d 可 被培养基中的谷氨酸诱导生成，产量可达1 0m g l ，纯酶由6 个相同的5 3k d a 亚基 组成，每个亚基含有一分子磷酸吡哆醛( p l p ) 共价结合到赖氨酸残基，酶在低 温、低蛋白质浓度、高于p h 6 0 时易发生离解，最适底物是l 一谷氨酸。p h 4 o p h 4 5 之间酶活最高“”。植物体中的g a d 活性与植物衰老、种子发育和成熟有关，i n a t a m i 等从黑麦中获得两种不同的g a d ，根中g a d 的相对分子量为3 1 0 k d a ，类似于ec o l i g a d 。对植物g a d 结构进行分析发现一些植物g a d 的c 一末端部分结合有一个特殊的 区域，g a d 活性通过这个区域受c a ”调节，说明植物g a d 区别于其它来源g a d 的显 水稻r 氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表迭载体的构建 著特征在于它存在的钙调蛋白区域。近年来研究发现，哺乳动物神经系统含有两 个不同的g a d 基因，分别产生g a d 6 5 ( 相对分子量6 4 4 8 6 d a ) 和g a d 6 7 ( 相对分子量 6 4 4 7 0 ) 两种酶。各种组织中g a d 的这两种同功酶的功效以及g a b a 的生理学意义仍 在进一步研究中。哺乳动物胰脏b 细胞产生g a b a ，表明胰b 细胞具有g a d 活性。 1 9 9 0 年，b a e k k e s k o w 研究发现胰g a d 6 5 是胰岛素依赖症糖尿病人( i 型糖尿病) 血 清中自抗体的靶抗原。 2 2 谷氨酸脱羧酶的活性调节 g a d 由磷酸吡哆醛( p l p ) 与脱辅基酶蛋白构成，p l p 是g a d 的辅基，对g a d 发挥活 性起重要作用。g a d 在体内通过p l p 与脱辅基酶蛋白的解离和聚合而调节g a d 酶的 活性。s e l i g m a n 等( 1 9 7 8 ) 研究了腺嘌呤核苷酸和g l u 对g a d 活性的影响，发现核 苷酸的抑制作用包括g l u 促进的p l p 解离和脱辅基酶蛋白的形成，去除核苷酸后加 入p l p ，酶可恢复正常活性。一些植物g a d 的c 一末端部分结合有一个钙调蛋白( c a m ) 结合域( c a m b d ) ，g a d 活性通过这个区域受c a 2 + 调节“”。 2 3 谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达 s t a u s b a u c h 等( 1 9 7 0 ) 最先报道了ec o l lg a d 活性区域的部分氨基酸残基， m a r a s 等( 1 9 9 2 ) 报道了ec o l ig a d 完整的氨基酸序列。基于这种氨基酸序列设 计的d n a 探针，将两种不同结构的g a d 基因g a d a 和g a d b 成功克隆，每个基因编码 一条含4 6 6 个残基的多肽，二者之间只有5 个氨基酸残基的差异。 o hs h 等( 2 0 0 5 ) 以拟南芥g a d 基因片段为探针，从水稻根的c d n a 文库中分离 得到了一个g a d 基因( r i c g a d ) 2 2 1 ；y e v t u s h e n k od p 等从烟草叶的e d n a 文库中分离 得到了两个不同的g a d s 基因，g a d l 和g a d 3 ，分别编码4 和4 9 1 个氨基酸酸残基 。“：p a r kk b ，3 ig e 等( 2 0 0 5 ) 通过电穿孔法将水稻谷氨酸脱羧酶基因 o s g a d c ( 一) 导入了双歧乳酸杆菌，显著的提高了重组菌的g a b a 产量。”。 h u a n g 等( 1 9 9 0 ) 通过从鼠脑提取p o l y ( a ) + r n a ，构建c d n a 文库，经免疫杂交 筛选、鉴定，获得g a dc d n a 克隆。k a r t s e n 等( 1 9 9 1 ) 从培养的人胰岛细胞中分离 p o l y ( a ) + r n a ，构建c d n a 文库，用已知g a da d n a ( g a d 一1 ) 的探针筛选，得到一类与 g a d 一1 不同的g a de d n a ( g a d 一2 ) 。b u 等( 1 9 9 2 ) 通过分子克隆分离到人g a d 6 5 和g a d 6 7 的c d n a 。 水稻r 氨基丁酸合成酶基因的克隆及其原核表达载体的构建 2 4 谷氨酸脱羧酶的应用 胰鸟素依赖型糖尿病( i n s u l i n d e p e n d e n td i a b e t e sm e l l i t u s ，i d d m ，又 称i 型糖尿病) 是自身抗原介导免疫反应破坏胰岛b 细胞的自身免疫性疾病。在 初发i d d m 及糖尿病前期( p r e d i a b e t i o ) 个体中有高水平的g a d 抗体( g a d - a b ) 。 g a d a b 是i d d m 的特异性免疫标志。用天然或重组g a d ，以g a d 和g a d