（生物化学与分子生物学专业论文）白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究.pdf

白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 摘要 以厦门树白蚁( g l y p t o t e r m e sx i a m e n e n s i sl ie th u a n g ) 为材料，经p b s 缓 冲液( p h6 7 ) 匀浆抽提处理、硫酸铵分级分离获得白蚁纤维素酶( e n d o 1 ，4 1 3 d g l u c a n a s e ，e c3 2 1 4 ，简称e g a s e ) 粗酶。进一步经d e a e s e p h a r o s ef a s t f l o w 阴离子交换柱层析、s h e p h a d c xg 1 0 0 凝胶过滤柱层析等纯化，得到比活 力为4 5 8 7u m g 的电泳单一纯的酶制剂，测定该酶的分子量约为4 4 8l e d ，等 电点0 i ) 为6 1 ，酶的紫外吸收峰在2 7 8n l l l ，荧光发射峰在3 3 4 n l t l 。 该酶水解羧甲基纤维素钠的最适p h 值为5 0 ，最适温度4 0 ，米氏常数 值为7 1 9 7m g m l ，为0 7 7 4m m o l ( l m i n ) ( p h5 0 ，4 0 ) 。酶的热稳定 性研究表明：该酶在p h4 6 9 0 和在温度低于4 5 下稳定。 化学修饰剂：溴代乙酸( b r a c ) 、n 溴代丁二酰亚胺( n b s ) 、碳化二亚胺、 醋酸酐、对氯汞苯甲酸( p c m b ) 、巯基乙醇( m t ) 、乙酰丙酮、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、 苯甲基磺酰氟( p m s f ) ，对酶修饰研究结果表明：眯唑基、吲哚基、羧基和氨 基是该酶的活性功能基团，而蛋白质分子中巯基、二硫键、胍基、硫醚基和羟 基与酶活力无关。溴代乙酸( b r a c ) ，n b s ，醋酸酐的抑制机理表现为非竞争性 类型抑制常数分别为4 2 8m m o l l 、8 3 1m m o l l 和1 6 5m m o l l 。 金属离子对酶活力的影响：结果表明卤素阴离子( c 1 。，b f ，r ) ，碱金属离 子( l i + ，n a + ，k + ) 对酶活力也没有影响。c a 2 + ，z n 2 + ，m n 2 + 对e g a s e 具有明 显的激活作用，重金属离子c u 2 + ，p b 2 + ，h 9 2 + 对酶具有不可逆抑制作用。 有机溶剂对酶活力的影响：甲醇、乙醇和丙醇这三种一元醇对酶均表现为 抑制的作用，抑制强度依次是甲醇 丙醇 乙醇。乙二醇、丙二醇和丙三醇对 酶也都具有强烈的抑制作用，其半抑制浓度( i c s o ) 分别为3 8 、1 4 5 和 1 6 2 。其中乙二醇的抑制作用是可逆过程，其抑制常数( k 0 为3 8 。苯酚对 厦门树白蚁e g a s e 的半抑制浓度( i c s o ) 为o 2 5m o l l ，其抑制机理表现为竞争 性类型，苯酚和底物( s ) 竞争游离酶( e ) 的结合部位，但不能和结合酶( e s ) 结合。其抑制常数硒为o 6 4m o l l 。 关键词：厦门树白蚁；纤维素酶；分离纯化；酶学性质；活力调控 9 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 a b s t r a c t e n d o 一1 ，4 - d - d - g l u c a n a s e ( n g a s e ，e c3 2 1 4 ) w a sp u r i f i e df r o mg l y p t o t e r m e s x i a m e n e n s i sl ie th u a n gb ye x t r a c t i o nw i t h0 0 1m o l lp b sb u f f e r0 h6 7 ) a n d a m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n ，t h ec h r o m a t o g r a p h y o nd e a e - s e p h a r o s ef a s tf l o w s e p h a d e xg - 10 0 ，t h ep u r i f i e de n z y m ew a sas i n g l eb a n do np o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n dt h es p e c i f i c a c t i v i t yw a sd e t e r m i n e dt ob e4 5 8 7u m g t h e e n z y m ew a sd e t e r m i n e dt ob e4 4 8k db ys e p h a d e xg 一10 0g e lf i l t r a t i o n t h ee n z y m e ( e g a s e e ) w a sm o d i f i e d r e s p e c t i v e l yb ys e v e r a l c h e m i c a l m o d i f i c a t i o nr e a g e n t s ，s u c ha sb r o m o a e e t i ea c i d ( b r a e ) ，n - b r o m o s u c c i n i m i d e ( n b s ) ，a z o d i c a r b o x y l a t e ( e d c ) ，a c e t i ca n h y d r i d e ，p c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e ( p c m b ) ，1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l ，a n da c e t y la c e t o n e ( 从) ，h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) ， p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e ( p m s f ) ，a tc e r t a i nc o n d i t i o n ，a n dt h er e s i d u ea c t i v i t y w a sa s s a y e di nn o r m a lr e a c t i o nm e d i a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e s i d u e so f h i s t i d i n e ，t r y p t o p h a na n de a r b o x y lo fa c i d i ca m i n oa c i d sl y s i n ea n da r g i n i n ew e r e n e c e s s a r yf o rt h ee n z y m ea c t i v i t yw h i l et h er e s i d u e so fm e r c a p t o ，d i s u l f i d eb o n d ， l - a r g i n i n eg u a n i d i n e ，s u l f i d e ，s e r i n ed e f o r m i t y , w e r en o tn e c e s s a r yf o rt h ee n z y m e a c t i v i t y t h ee n z y m em o d i f i e dw i mn - b r o m o s u e e i n i m i d ei st o t a l l yi n a c t i v a t e da n di t s c h a r a c t e r i s t i cp e a ko f u v - a b s o r p t i o ns p e c t r u ma t2 7 8 姗a l s od e s t r o y e d ，t h e3 3 4 n l n p e a ko ft h ef l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u mi sg r a d u a l l yd e s c e n d e da n de v e n t u a l l y l o s t ，i n d i c a t i n gt h a tt h et r y p t o p h a i lr e s d u e sa r ee s s e n t i a lt ot h ee n z y m ef u n c t i o n b y t h em e t h o do fc l t s o u sp l o t ，t h en u m b e ro fe s s e n t i a lt r pw a sf o u n do n l yo n e t h ee f f e c t so fs e v e r a lm e t a li o n so nt h ee n z y m ea c t i v i t yh a db e e ns t u d i e d t h e r e s u l t ss h o wt h a t ：c l ，b r ，i 。a n dl i + ，n 矿，k + h a dn oe f f e c t so nt h ea c t i v i t yo ft h e e r l z y m e ，w h i l ec 0 2 + c o u l di n h i b i t t h e e r l z y m ea c t i v i t yb y4 0 1 w h e ni t s c o n c e n t r a t i o nr e a c h e dt o0 4 5m m o l l c u 2 + p b 2 + h 9 2 + a n dc d 2 + c a ni n h i b i tt h e e n z y m ea c t i v i t y 埘t l lt h ei n h i b i t o rc o n c e n t r a t i o nl e a d i n gt o5 0 o fe n z y m ea c t i v i t y l o s t ( i c s 0 ) w e r ee s t i m a t e dt ob eo 5 1 ，1 2 ，0 18a n d2 5m m o l l ，r e s p e c t i v e l y t h ei n a e t i v a t i o ne f f e c t si ni o n ss o l v e n t s ( c u 2 + , p b 2 + , h 9 2 + ) h a v eb e e ns t u d i e d u s i n gt h ek i n e t i cm e t h o do fl i n e w e a v e r - b u r kp l o t a n dt l l e i ri n h i b i t i o nt y p e sa n d 1 0 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 i n h i b i t i o nc o n s t a n t sh a v eb e e nd e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n a c t i v a t i o n o ft h ee n z y m ei nt h e s ei o n ss o l v e n t sw a sn o n - r e v e r s i b l er e a c t i o n 1 1 1 ee f f e c t so fs e v e r a lo r g a n i cs o l v e n t0 nt h ee n z y m ea c t i v i t yh a db e e ns t u d i e d n er e s u l t ss h o wt h a t ：m e t h a n o l ，e t h a n o l ，p r o p a n o l ，g l y c o l ，p r o p y l e n e ，g l y c e r i n , a c e t o n e ，d i m e t h y ls u l f o x i d e ，1 , 4 - d i o x a n ea n dp h e n o l ，i n h i b i tt h ee n z y m ea c t i v i t yi n d i f f e r e n td e g r e ew i t ht h ei n h i b i t o rc o n c e n t r a t i o nl e a d i n gt o5 0 o fe n z y m ea c t i v i t y l o s t ( i c s o ) w e r ee s t i m a t e dt ob e1 0 1 ，1 5 1 ，1 6 5 ，3 8 ，1 4 5 ，1 6 2 ，0 8 5 ，0 5 8 m o f l ，0 4 8m o l l ，0 2 5m o f l t h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s mo fg l y c o la n dp h e n o la r e r e v e r s i b l e ，t h ei n h i b i t i o nc o n s t a n t s ( k oo fg l y c o la n dp h e n o la l e3 8 a n d0 6 4 m o l l k e yw o r d s ：g l y p t o t e r m e sx i a m e n e n s i s l ie th u a n g ；c e u u l a s e ；p u r i f i c a t i o n ；e n z y - m a t i cc h a r a c t e r i z a t i o n ；a c t i v i t yr e g u l a t i o n 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果， 均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究 生学术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 酶学) 课题( 组) 的研究成果，获得( 酶 学) 课题( 组) 经费或实验室的资助，在( 陈清西教授) 实验室 完成。( 请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未 有此项声明内容的，可以不作特别声明。) 声明人( 签名) ：翊j 7 2 0 0 8 年7 月；) 日 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送 交学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图 书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入 全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的 标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位 论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年 月日解密，解密后适用上述授权。 ( 4 ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“或填上相应内容。保密学位论 文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学 保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的， 默认为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：噍缈l 2 0 0 8 年7 月3 1 日 | 自蚊纤维蘩爵的分离化丑性质研究 第一章引言 1 _ l 白蚁简介 白蚁，亦称虫尉。白蚁体软弱 而扁，色、淡黄色、赤褐色或黑褐 色均有，各种不同种类体色不一样。 器为鲍型的咀嚼式，触角念珠状。 有长翅、短翅和无翅型。具翅种类 有两对狭长膜质翅，翅的大小、形 状以及翅脉序均相似，故称等翅目。 白蚁的翅绎短时问飞行后，能自基 部特柏的横缝脱落。 心黪爨稀晒哺髓瞻穗蛳舞睁彬l 我国已经记录的白蚁有4 0 0 多种”】，足世界上拥有白蚁物种虽多的国家之 一，主要分布在我国的南部和东部。长汀以南各人林区，向蚁的分布更为集中， 娄群则更为复杂，种类则更加多样。这些种类绝大部分作为自然界生态系统中 的一员，对于人类不仅无害，而且还是有益的。白蚁可清除枯枝、落叶、风折 木、倒木及伐根等垃圾、蛀食、消化地球上最难分解、目前人类还很难利用的 天然物质纤维素，推进自然界物质转化维持牛志平衡，枉热带、可 _ 热带的广 阔林区每年都有数不尽的 古枝落叶、枯萎的杂草及砍伐剩下的树基、残根被腐 蚀或腐烂口】。 必然影响植物的生长，而通过白蚁蛀食，经白蚁体内原生动物消化分解纤 维素，可使之很快转化为腐殖质，加速物质循环，促进植物的生长，维持牛态 平衡。白蚁可供人们直接食用，如油渣或烹调成各种食品，广泛分布于我曰南 方的一类土柄性白蚁，其蚁巢内有众多苗圃，并可向地面长出鸡苁菌，这类真 菌实属山珍可烹调成上等菜肴八宴。白蚁还可加工成许多保健食品：如白蚁 酒、自蚁茶、白蚁胶囊等。但是另一方面，白蚁对人类确实也存在着有害的一 面。在白蚁分布区的木结构、砖木结构、钢筋混凝土结构、钢结构等各种类型 和结构的房屋建筑都有可能受到白蚁的危害。每年造成的经济损失都超过1 0 亿 元人民币。其中，对名胜古迹造成的损害难以用经济标准来衡量“千里之堤， 以蝼蚁之穴溃”。从古代开始，人们就已经知道白蚁对江河水库堤坝有非常严重 瞪 。裳 m 繁 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 的毁坏。白蚁在堤坝里面筑巢通向堤坝内外两边，造成堤坝外的洪水通过蚁道 涌入堤坝内发生险情。1 9 9 8 年长江全流域特大洪水中，在荆江大堤上发生了因 多起白蚁筑巢造成的险情。白蚁喜食木质纤维的特性使其对农、林业资源有着 严重的危害，影响林业木材的生产和园林观赏植物的生长，破坏景观。农业产 品中的甘蔗、木薯、花生、芋头、桑、茶、玉米、小麦、烟草、板栗、茯苓等 都会受到白蚁的危害。白蚁还能危害电缆、交通设施。电力电缆遭白蚁咬穿护 层后，可能引起短路事故使电力输送中断。铁路讯号电缆因蚁蛀失灵后，使运 输安全受到严重威胁。在我国南方地区白蚁蛀食埋地电缆护套相当普遍，因白 蚁造成的通讯故障占6 0 。蚁酸等白蚁分泌物可以为害金属【4 棚。 有害的白蚁，虽种类不多，总体而言所占的比例十分稀少，主要有木白蚁 科的堆砂白蚁c r y p t o t e r m e s 、楹白蚁i n c i s i t e m e s 、鼻白蚁科的乳白蚁c o p t o t e r m e s 散白蚁r e t i c u l i t e r m e s 和白蚁科的土白蚁o d o n t o t e r m e s 、大白蚁m a c r o t e r m e s 等。然而，由于白蚁繁殖力强，生活隐蔽，危害性极大。白蚁对于城市建筑、 环境绿化、交通电讯、物资仓储、水上船只、图书档案、家具衣物、林木果树、 作物花卉、水库堤坝等构成威胁，甚至在银行金库内白蚁可大量蛀食、毁坏钱 币。所以白蚁的危害涉及到国计民生的方方面面，可造成巨大损失。 1 1 1 形态特征 厦门树白蚁( g l y p t o t e r m e sx i a m e n e n s i sl ie th u a n g ) 购自厦门穿山甲白蚁 防治公司，厦门由于自然条件很适合白蚁的生长繁殖，因此白蚁的分布很广。 厦门树白蚁的形态特征归纳如下【7 , 8 , 9 】： ( 1 ) 兵蚁：体长6 5m m 左右，乳白色，触角1 6 1 7 节。上颚镰刀形，左 上颚中点前方有一明显的齿，齿尖斜向前；右上颚内缘的对应部位有一不明显 的微齿。前胸背板背面观元宝状，侧缘尖括号状，角的前方各有一斜向后方的 裂沟，前缘及后缘中央有凹刻。 ( 2 ) 有翅成虫：体长2 7 2 9m m ，翅展4 5 - - 5 1r a i n 。头胸腹背面黑褐色， 腹面棕黄色。触角1 9 节。前胸背板中央有一淡色的十字纹，纹的两侧前方各有 一椭圆形的淡色点，纹的后方中央有带分支的淡色点。翅长大，前翅鳞大于后 翅鳞。整个翅面有微毛，翅中部有棒状突起，前后缘有尖头状乳突。 ( 3 ) 工蚁：体长4 1 6 1 - 4 1 9 0m m 。头黄色胸腹部灰白色。触角1 7 节。囟门 1 3 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 呈小圆形的凹陷。 ( 4 ) 蚁后和蚁王：体长7 0 8 0n 1 1 n ，体宽1 3 1 5r a n l 。头胸部和有翅成虫相 似，但色较深，体壁较硬。蚁王体略有收缩。 ( 5 ) 卵：乳白色，椭圆形，长径0 1 6 - - - 0 1 8m n ，一边较平直，短径o 1 4m l t l 。 1 1 2 生活习性 白蚁属社会性群体生活昆虫，并有复杂的组织分工。在一个群体内的个体， 从形态和分工上可分为两大类型，即生殖型和非生殖型。 生殖型：为有性的雌蚁和雄蚁，它们的职责是保持旧群体和创立新群体， 在这个类型中有三个品级。( 1 ) 大翅型或有翅型：体躯骨化，黄、褐或黑色，有 两对发达的翅，脱翅后可以成为创立新群体的父蚁和母蚁。每年春夏之季。雨 后天气闷热的傍晚，突然从蚁巢中飞出大量的长翅繁殖蚁，在离巢不远处的建 筑物附近低飞，飞行时间很短，这种现象称为婚飞或群飞( 分群) 。群蚁在低空 飞舞，好像在开舞会，各自毫无拘束地自由选择对象。情投意合者飞落地面， 各自脱掉翅膀，雌雄成双追逐，通常为雌前雄后，完成婚配大事，寻找合适场 所，建筑新巢，产卵，繁殖后代，另立新的群体。这对新婚的雌雄蚁，就是未 来新群体的母蚁和父蚁，也就是新群体中的蚁后和蚁王。这对伴侣终身过着一 夫一妻制的文明社会生活。白蚁婚飞分群在我国长江以南各地常可看到，但不 是婚飞中的所有个体都能成双建立新群，当它们大量飞出时，常被各种鸟类、 捕食性昆虫或其他动物吃掉，其中只有少数喜结良缘成为伴侣。尽管是少数， 也足以维持其种族繁衍并造成对木质建筑物的危害了【l0 1 。( 2 ) 短翅型：称为补充 生殖型，在地栖性种类中较为常见。( 3 ) 无翅型：也是补充生殖蚁，完全是无翅 个体。只存在于极原始的种类中。 非生殖型：是指没有生殖能力的白蚁。它们无翅，生殖器官已经退化，主 要担负劳动和作战的任务，因而又有工蚁与兵蚁之分1 1 , 1 2 , 1 3 。工蚁：在蚁群中 数量最多，担任巢内很多繁杂的工作，如建筑蚁冢，开掘隧道，修建蚁路，培 养菌圃，采集食物，饲育幼蚁与兵蚁，看护蚁卵等。在无兵蚁的种类中，它们 还要负责抵御外敌。兵蚁：虽有雌雄之分，但不能生殖。兵蚁的头部长而高度 骨化，上颚发达，但已失去了取食功能，而成为御敌的武器，还可用上颚堵塞 洞口、蚁道或王宫入口。由于兵蚁失去了取食功能，因而食物由工蚁饲喂。兵 1 4 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 蚁分两型：大颚型兵蚁上颚形成各种奇异的形状，好似一把二齿的大叉子。 象鼻型兵蚁头延伸成象鼻状，当它与敌搏斗时，可喷出胶质分泌物，涂抹 敌害【1 4 】。 白蚁属不完全变态的渐变态类，生活史复杂。白蚁按其生活习性又可分为 两个类别。一是木栖性白蚁：群体大小不一，在木质建筑物，如木制门窗、木 制地板、木制屋、铁道枕木、木制桥梁、枯树等的啮空部分建巢，取食木质纤 维，为木材制品的大害虫。木材被蛀变空，建筑物容易倒塌。铁路枕木被蛀， 影响使用寿命，对交通安全威胁极大。二是土栖白蚁：在地面下土中筑巢，或 巢高出地面成塔状，称为蚁冢。土栖性白蚁以树木、树叶和菌类等为食 1 5 , 1 6 】。 白蚁的生存繁衍、延续种族靠繁殖蚁( 有翅成虫) 来完成。每年4 - 6 月份 是白蚁群体的繁殖季节，成千上万头带翅膀的繁殖蚁从原群体蚁巢中迁飞出去， 脱翅后的成虫雌雄个体结成配偶，一旦有适宜的地方就会生存下来，创建新的 群体，这就是又一代白蚁群体的开始。白蚁的脱翅繁殖蚁婚配后约一星期就开 始产卵，壮年的蚁后每昼夜产卵量可达数万粒，蚁卵孵化为幼蚁的过程约为二 十天左右。从脱翅繁殖蚁产卵至第一龄幼蚁的诞生，大约需一个月的时间，幼 蚁经过几次蜕皮，约一个月左右即可变为成年的工蚁和兵蚁。一个成熟的白蚁 群体以脱翅繁殖蚁婚配起至群体内首次产生下一代有翅成虫，约需七十年的 时间，即可再次分飞繁殖。白蚁王国内的这种繁衍演变，在其五十年至八十年 的群体寿命中，几乎一年3 6 5 天时间里，周而复始，延续着它种族的繁荣和生 存。 1 1 3 白蚁肠道微生物 白蚁一个明显特征就是其食木性，食物范围极广，包括木材( 完好的或已腐 解的) 植物叶片、腐殖质、杂物碎屑以及食草动物粪便等。白蚁生活的营养物质 主要来源于植物和木材的纤维素及半纤维素。白蚁虽然取食大量的纤维素，但 是光靠白蚁本身并不能完成消化纤维素的全部过程【r 7 1 。白蚁之所以能以纤维素 为食，是因为其体内含有许多种微生物和细菌。这类微生物与白蚁之间是共生 关系，只有依靠这些微生物的协助，才能使纤维素消化完全转变为白蚁可以吸 收利用的物质。每次蜕皮后肠内微生物随之失去，所以必须与群体内同伴保持 密切接触，通过相互喂食或吞食其他个体排出的粪便等方法才能重新恢复肠内 1 5 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 微生物【1 8 】。 白蚁消化道呈螺旋状，主要由3 部分组成：即前肠、中肠和后肠。见图1 ， 与一般昆虫相比，白蚁后肠相当发达，约占全部肠道总容积的4 5 。由于大多数 白蚁个体较小，肠道内的微环境条件难以准确描述，但可肯定从前肠向后肠推 移，逐渐变为无氧状态至充满微生物的后肠部分达到最低的氧化还原电位( 5 0 - - , 2 7 0m v ，不同种变化较大) ，此处p h 值近中性( 6 2 7 6 ) ，但食土白蚁的后肠 p 1 区p h 值高达1 1 0 以上【1 9 2 0 2 1 1 。膨大的后肠一直被人们认为是一种厌氧“消 化器”，与羊和牛的瘤胃相似，其中有大量的共生微生物，共生微生物降解纤维 素和半纤维素，发酵形成短链脂肪酸，脂肪酸被白蚁吸收氧化。几乎所有的实 验证据表明：白蚁后肠中共生微生物( 包括原生动物) 是木质素、纤维素和半纤 维素消化的驱动力【2 2 1 。 肠 肠 肠 氏 肠 图l 白蚁肠道的解剖示意图 f i g 1g e n e r a lm o r p h o l o g yo ft h et e r m i t eg u t a ：低等食木白蚁肠道；b ：高等食土壤白蚁肠道 低等白蚁后肠中有大量原生动物定居，早在1 9 3 8 年，人们就肯定了低等白 蚁后肠中原生动物对纤维素消化的重要性。h u n g a t e 2 3 提出了一个白蚁共生利用 纤维素的过程，即木质纤维素食物颗粒进入后肠后，首先被原生动物吞噬。大 部分纤维素被原生动物厌氧发酵为乙酸、c 0 2 和h 2 ，乙酸由原生动物分泌到体 外，继而被白蚁后肠吸收作为生命活动的营养来源。y a m i n 2 4 1 在研究原生动物 对白蚁营养重要性时也发现：当消除了原生动物的动原白蚁( z o o t e r m o p s i s s p ) 重 新感染上原生动物后，这些白蚁存活时间明显较未重新感染原生动物的对照白 1 6 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 蚁长，重新感染后肠内含物的白蚁也是如此。这揭示了以纤维素为食的原生动 物和白蚁之间的营养关系。y a m “2 5 】也首次成功地体外纯化培养了食纤维素原 生动物。从白蚁中分离到原白蚁毛丝虫( t r i c h o m i t o p s i st e r m o p s i d i s ) 和球形披发虫 ( t r i c h o n y m p h as p h a e r i c a ) ，这两种原生动物都需纤维素为碳源才能生长，而且 前者不能以葡萄糖、纤维二糖、羧甲基纤维素、肝糖、淀粉代替纤维素作碳源 为生【2 6 捌。 许多研究表明，虽然大部分纤维素酶活性存在于后肠中，并很大程度上来 源于原生动物，但其他一部分酶则来源于白蚁自身，所以认为低等白蚁消化纤 维素是由白蚁自身合成和原生动物分泌的纤维素酶的共同作用，并且来源不同 的纤维素酶组分具有协同作用【2 8 。o 】。 低等白蚁能够自身合成纤维素酶组分产生一个新的疑问，就是为什么低等 白蚁仍要依赖于原生动物才能以纤维素而不能以淀粉为生，因为纤维素和淀粉 的水解产物都是葡萄糖。一个可能就是，在没有原生动物的白蚁后肠中，纤维 素水解速度或程度不能满足白蚁的代谢需求。如果是这样的话，那么原生动物 对纤维素降解作用除产生纤维素酶外，还有其它作用。例如，低等白蚁肠道虽 然在后肠区域有相对较大的体积，但本质上仍是一条线性管道。大量具有吞噬 作用的原生动物的存在，实质上增加了后肠的物理分隔，从而延长了不溶性食 物颗粒的滞留时间。即延长了纤维素和纤维素酶的接触时间，如食物颗粒在黄 肢散蚁( r e t i c u l i t e r m e s f l a v i p e s ) t 3 l 】后肠中滞留时间可达2 6h 以上。白蚁自身产 生的纤维素酶吸附于纤维素颗粒上，被原生动物吞噬后，仍可起作用，且可与 原生动物产生的酶起协同作用。高等白蚁肠道的解剖学特征较低等白蚁更为精 细，分隔更多，某些区域具有表皮突起，这些特殊性足以能延长木质纤维素食 物和水解酶的接触时间，原生动物的存在已显得毫无必要。 显微研究表明，低等白蚁和高等白蚁后肠中都有大量形态和密度不同的细 菌定居。已从低等白蚁和高等白蚁肠道分离到多种异养型细菌，大多数为兼性 厌氧菌，有的甚至是严格好氧菌，包括链球菌( s t r e p t o c o c c u s s p ) 、拟杆菌 ( b a c t e r o i d s s p ) 、肠杆菌( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 、葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s s p ) 和芽孢 杆菌( b a c i l l u s s p ) 3 2 】等。白蚁肠道细菌与其所共生的白蚁在种上有很大的特异性。 白蚁对纤维素的消化可归功于原生动物、真菌以及白蚁自身产生的酶，所 以细菌在白蚁消化纤维素过程中直接作用可能不大。虽然有许多关于从白蚁肠 1 7 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 道中分离到具纤维素酶活性菌株的报道，如t h a y e r 从黄胸散白蚁 ( r e t i c u l i t e r m e s s p e r a t u s ) 后肠中分离到能够以木屑为惟一碳源生长的蜡样芽孢杆 ( b a c i l l u s c e r e c u s ) 制5 质沙雷铁氏菌( 兜嗍砌m a r c e s c e n s ) 3 3 1 ，且产生相当高的 羧甲基纤维素酶活性，但这些研究并不能令人信服地说明肠道细菌对纤维素的 消化具有决定性作用。 c | 戴唆收稠增 触f b 酣h h 耵试惜 钒 图2 白蚁后肠能量代谢途径 f i g 2e n e r g ym e t a b o l i s mo ft e r m i t eh i n d g u t ( 引自k u d oe ta l , 19 9 8 ) 肠道细菌对白蚁消化纤维素和半纤维素的作用至今仍是一个悬而未决的问 题。白蚁肠道细菌的消除，可使白蚁在较短时间内死亡( 几个星期) ，反映了肠 道细菌对白蚁的生命必然有着某种重要作用。肠道细菌可能对纤维素降解为葡 萄糖或其他中间产物转化为可供白蚁利用的乙酸的后续阶段有重要作用。 s c h u l t z 3 4 等研究了从黄肢散白蚁中分离的链球菌和拟杆菌2 个菌株的单独培养 和共培养，发现共培养时，链球菌发酵葡萄糖为乳酸，拟杆菌发酵乳酸为丙酮 酸、乙酸和c 0 2 ，所以认为这两种菌之间的乳酸交叉营养可能是构成白蚁肠道 内整个发酵过程的一部分。 1 8 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 1 2 纤维素简介 1 2 1 纤维素分子结构与种类 葡萄糖是一种六碳醛糖，它在水溶液中以三种形式存在即：q 葡萄糖，直 链式葡萄糖，1 3 葡萄糖嘲这三种存在形式在水溶液中以相互转变，如图所示： h c h 2 0 hc h 2 0 hc h 2 0 h 一葡萄糖 直链式葡萄糖p 葡萄糖 纤维素分子中的单糖也是葡萄糖，它们是1 - c 与4 c 相结合的，但糖苷键 是p 式的【3 6 3 7 1 。纤维素的控制水解产物是纤维二糖。它象麦芽糖一样是由两个 个葡萄糖分子所组成的，但苷键不是a 式而是1 3 式。如下图所示； h o o o 纤维= 撼基 o h 纤维素分子是由葡萄糖分子通过p 1 ，4 一糖苷键连接而成的链状高分子聚合 物，基本重复单位是纤维二糖，是地球上最丰富的生物聚合物。直链状大分子纤 1 9 白蚁纤罐膏醇分离化爰性质研究 维素折叠起来，形成具有高结晶的基本构成单位，这种基本构成单位集中起来 构成微小的结构单位，再由很多微小单位构成纤维索i ”4 0 1 。 圈3 纤维素分子结构模型 f i g3 t h es u n u k m o d e lo f e e l l u l o s e 纤维素结晶结构中存在着各种结晶变体，许多科学家对纤维素结构变体做 了大最研究工作。迄今为止，已发现固态下纤维素存在着五种结晶变体，即， 天然纤维素( 纤维素i ) ，人造纤维素i i 、i i i 、和纤维素v h “，这五种结晶变 体各有不同的晶胞，并可由x 射线衍射、红外光谱、r 跚蛐【4 ”光谱等方法加以 辨别。 纤维素i 是天然存在的纤维素形式，1 9 7 3 年m e y e r 和m i s c h 悃x 射线研 究天然纤维素的结构，并提出了一个单斜晶胞模型。这种结构是在一个两链单 斜晶胞中含有反平行的链，采用直链的构象，并采用反平行链的堆砌排列，以 后被b l a c k w e l l 、鞠e k o 和m u g g l i 4 4 】等人用不同的模拟方法对纤维素进行测定， 都得到类似的平行链堆砌结构和十分接近的氢链长度。 纤维素i i 是纤维素i 经由溶液中再生或丝光化过程得到的结晶变体，是工 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 业上普遍使用的纤维素形式。这种结晶变体与纤维素i 由很大的不同。早期关 于纤维素的结构普遍采用a n d r c s s 4 5 】提出的单斜晶胞模型，晶胞内含有两条 反平行链。具有二次螺旋对称。是一种反平行链的结构。 纤维素i i i 是干态纤维素的第三种结晶变化，也称氨纤维素。将纤维素i 或 纤维素用液氨或胺类处理，再将其蒸发掉所得到的一种低温变体。1 9 5 1 年 l e g r a n d l 4 6 - 4 8 】发现，由纤维素i 或纤维素i i 制得纤维素i i i ，在水的作用下得到不 同的x 射线衍射图，注意到纤维素i i i 晶体结构随母体原料不同而有差异，并 将由纤维素i 得到的纤维素i i i 称为纤维素i i i p 。由纤维素i i 得到的纤维素i i i 称为纤维素i i i b 。后来m a r r i n a n 4 9 , 5 0 用红外光谱分析方法及h a y a s h i 5 1 ，5 2 1 等用x 射线衍射方法都发现了这种区别，并称前者为纤维素i i i 后者为纤维素i i i b 。纤 维素i i i p 是相似与纤维素i 的平行结构。纤维素i i i p 是相似于纤维素i i 的反平行 结构，并有相似的链片结构。纤维素i 的形成有一定的消晶结构，当氨或胺除 去后，结晶度和分子排列的有序度都下降。 纤维素是纤维素的第四种结晶变体，将纤维素i 、i i 、i i i 经由不同的方 法制得。将粘胶纤维素或丝光化棉在2 5 0 2 9 0 的甘油中经不同时间加热处理， 将纤维素乙二胺配合物在甘油或二甲基甲酰胺中加热：将纤维素，或纤维素 i i i b 在2 6 0 的甘油中加热分别制得纤维素i v ，1 0 0 下将不能溶解的纤维素 黄酸酯分解，纤维素醋酸酯在1 0 0 用2m o f ln i - 1 4 0 h 水解，纤维素三醋酸酯 或硝酸酯水解。 纤维素v ，1 9 5 9 年e l l e f s e n 5 3 , 5 4 1 等第一次报道了纤维素v 的结晶变体，它 是一种纤维素的再生形式。将纤维素( 棉花) 或纤维素i i ( 丝光化棉) 放入浓 度为3 9 o - 4 2 3 的盐酸中，于2 1 处理2 4 3h ，用水将再生所得到的纤维 素粉末即为纤维素v 。 1 2 2 纤维素的降解 纤维素的降解主要有酸水解、酶水解和微生物水解。酸水解和酶水解可用 于生产糖浆，供食品工业作甜味剂，并通过发酵转变为醇、燃料或其他化学物 质。微生物水解的产物可为家畜、家禽提供饲料【5 5 】。 纤维素分子中p 一1 ，4 一糖苷键对特别敏感，在一定p h 值、温度和时间下糖苷 2 1 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 键断裂，聚合度下降，还原能力提高，这类降解纤维素的反应称为酸水解。其 基本过程为失水葡萄糖单元上的某个缩醛原子迅速原子化，形成共轭酸，糖苷 键上的正电荷缓慢地转移到c l 上，由于c o 键的断裂形成一个碳锗阳离子， 由于水分子迅速攻击碳镣阳离子，得到有力的糖残基并重新形成水合氢离子。 纤维素有酸水解试剂有浓酸、稀酸非水介质，水解方法有多相和均相两种。 纤维素的氧化降解，纤维素分子的末端含有潜在醛基，失水葡萄糖单元上 有三个羟基，是一种多元醇的结构，容易被氧化。在分子链上引入羰基或羟基， 使得功能基改变。纤维素分子链发生氧化的方式有两类：选择性氧化和非选择 性氧化。一些试剂可使纤维素发生特定位置和形式的氧化，如用高碘酸盐氧化 纤维素得到i i 型氧化纤维素，用亚氯酸氧化纤维素得i i i 型氧化纤维素，称之 为选择性氧化。纤维素大多数氧化反应是不规则的，即无选择性的。在纤维素 失水葡萄糖单元不同反应位置上引入羰基或羟基，并引起分子链的断裂。纤维 素不同结构部位有不同有不同的反应性，失水葡萄糖单元上三个羟基反应性也 不同，不同氧化剂又有不同的氧化方法，造成无选择性氧化反应非常复杂。 纤维素的微生物降解，自然界中，纤维素能被成千上万种真菌、细菌和放 线菌等微生物降解，微生物靠分解纤维素来维持自身的代谢。微生物分解纤维 素有两种方式，一是由外部向内部发展，另一种是由外向内分解。细菌一般是 粘在纤维素纤维上，从纤维的表面向内部增生，在接触点处纤维素被分解，使 得纤维素表面呈现锯齿状蚀痕，被细菌破坏后的纤维素，如果被某种溶液溶胀， 纤维素就很容易被分解。霉菌的菌丝呈线状对纤维素的降解集中在纤维的端部， 由外向内降解纤维素【5 6 】。 纤维素的光降解，光能使得纤维素降解并发生化学变化，生成氧化纤维素 和有强还原性的有机物。当在潮湿和氧气充足的情况下，纤维素能很快被光降 解。纤维素的光降解有直接光降解和光敏降解。纤维素吸收光的辐射能量后， 使得化学键断裂称之为直接光降解。氧气的村早存在能加速纤维素的直接光降 解。水蒸气能抑制纤维素的直接光降解。纤维素直接光降解强度下降，聚合度 下降，溶解度和还原能力增加。纤维素吸收光子能量引起c c 键和c o 键的断 裂。所以纤维素分子吸收光发生直接光降解所需的能量相当于波长3 4 0a m 或者 更短的紫外光。波长大于3 4 0a m 的光不能引起纤维素的直接光降解。纤维素能 吸收近紫光或可见光引起纤维素的降解，称为纤维素的光敏降解【5 7 】。 白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究 纤维素的热降解，在高于1 2 0 时纤维素很不稳定，通过各种热的反应分 解成较小的分子。在3 0 0 以上纤维素及其衍生物转变成石墨和碳化物。高辐 射也能引起固态纤维素物理和化学性质的改变，辐射的能量损失后在纤维素分 子键上形成随机分布的高能电子，这些电子在纤维素分子上迅速定位，引起键 的氧化降解。纤维素在加工过程中，机械应力的作用大大改变纤维素纤维的物 理化学性质，如纤维素分散、长度变短、还原端度增加、聚合度和强度下降， 对各种化学反应和酶水解的可及度和反应性能提高。从而造成纤维素的机械降 解。 1 3 纤维素酶简介 纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生 资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，属于 糖苷水解酶，是一种糖蛋白【5 8 】。它们协同作用分解纤维素产生寡糖和纤维二糖 最终水解为葡萄糖。葡萄糖，既可作为营养物质为人体直接吸收，又能通过发 酵生成甲醇、乙醇等可替代石油等矿质燃料的供能物质。可见纤维素是人们从 生物方面解决粮食和能源问题的重大希望。但就目前而言，得以利用的纤维素 仅是很小的一部分，因为其水解成葡萄糖极为困难。纤维素酶正是解决这个难 题的关键所在。 1 3 1 纤维素酶的研究历史 自从1 9 0 4 年在蜗牛消化液中被发现，至今已经历三个发展阶段【5 9 】。第一阶 段是8 0 年代以前，主要工作是利用生物化学的方法对纤维素酶进行分离纯化。但 由于纤维素酶来源广泛、组分复杂、纯化甚为困难，故进展缓慢。第二阶段是1 9 8 0 年至1 9 8 8 年，主要工作是利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆和一级 构的测序。t r i c h o d e r m a r e e s e i 的内切酶和外切酶，c e l l u l o m o n a s f i m i 的内切酶和外 切酶的基因已被克隆和测序，并在大肠杆菌，酵母菌等中得到表达【鲫。第三阶段 是1 9 8 8 年至今，主要工作是利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子 的结构和功能进行研究，包括纤维素酶结构域的拆分、解析、功能性氨基酸的