（生物化学与分子生物学专业论文）玉米芯多糖分离纯化及结构研究.pdf

中文摘要 从玉米芯( c o r n - c o b ) 中提取出酸提水溶性粗多糖，经g c 分析 表明其单糖组成为g l c 、x y l 、g a l ，摩尔比为1 7 0 5 ：3 2 7 ：1 o o 。水 溶性粗多糖用乙醇分级法分离出c c a 、c c b 、c c c 三种组分。c c c 经酶法和s e v a g e 法联合脱蛋白后，经s e p h a r o s ec 卜“b 柱层析收集、 纯化，最终得级分c c c p 。c c c p 经s e p h a r o s ec l - _ 6 b 柱层析和d e a e s e p h a d e xa 2 5 柱层析检验，成单一狭窄对称峰。纯度鉴定表明， c c c p 在分子量大小和极性上都较为均一。 c c c p 为灰白色粉末，经g c 分析表明单糖组成为g l c 、x y l 、 g a l ，摩尔比为4 4 0 ：2 6 5 ：1 0 0 。 c c c p 结构分析采用了淀粉酶解，纤维塞酶鲤，部分酸水解，高 碘酸氧化，s m i t h 降解，i r 分析，g c 分析，甲基化分析等方法。甲 基化产物经酸水解、还原、乙酰化后用g c 一m s 联机分析。 ( 分析结果表明：c c c p 为少分枝结构：主链由x y l 构成，吡喃型 x y i 以l 一3 连接，( 1 3 ) x y l 在4 一o 处有分枝；支链由g l c 、g a l 构成，其中g l c 主要以a ( 1 - - 4 ) ，1 3 一( 1 4 ) 键型为主，且( 1 4 ) g l c 在6 一o 处有分枝，此外g l c 还存在1 3 、1 6 键型：g a l 主要以1 3 键型存在，在6 一o 处有分枝，还有卜- 6 键型；平均每 1 0 个糖残基有1 个分技；末端残基为x y l 、g l c 、g a l 。j 关键词：玉米芯j 多糖；分离纯化j 结构研致 a b s t r a c t w a t e r - s o l u b l ec r u d ep o l y s a c c h a r i d eh a sb e e ne x t r a c t e db ya c i df r o m c o r nc o b g c a n a l y s i si n d i c a t e dt h a ti tc o n t a i n e dg l u c o s e ( g l c ) 、x y l o s e o f y l ) a n dg a l a c t o s e ( o a l ) a n di t sm o l a r r a t i oi s1 7 0 5 ：3 2 7 ：1 0 0 t h e c r u d ep o l y s a c c h a r i d eh a sb e e nf r a c f i o n a t e db ye t h a n 0 1 t h r e ef r a c t i o n s ： c c a 、c c b 、c c c w 黜g o tr e s p e c t i v e l y c c cd e p r o t e i n i z a t i o n e db yt h e c o m b i n e dm e t h o d so f e n z y m ea n d s e v a g e p u r i f i e db ys e p h a r o s e c l 呕b g e li l l ( r a t i o n s oc c c pw a sg o t b yg e lf i l t r a t i o no ns e p h a r o s ec 卜6 b a n dd e a e s e p h a d e xa - 2 5 t e s t ，c c c pw a s as i n g l es t r a i ts y m m e t r y a p e x t h ei d e n t i f i c a t i o no f p u r i f yi m p l i e st h a tc c c pw a sr e s p e c t i v e l yu n i f o r m o nm o l e c u l a r w e i g h ta n dp o l a r i t y c c c pi sa g r a ys u b s t a n c e g c a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tc c c pw a s c o m p o s e d o fg l c 、x y l a n d g a l a n d i t s m o l a rr a t i o i s 4 4 0 ：2 6 5 ：1 o o h y d r o l y s i sw i t ha m y l a s ea n dh y d r o l y s i sw i t hf i b r i ne n z y m e ，p a r t i a l h y d r o l y s i sw i t ha c i dw e r eu s e do l lt h es t r u c t u r e - a n a l y s eo fc c c p ，a l s o s m i t h d e g r a d a t i o n ，i i l g c ，m e t h y l a t i o na n a l y s i s e t cw e r eu s e d m e t h y l a t i o np r o d u c t i o nw e r eh y d r o l y z e d ，d e o x i d i z e ，t h e na n a l y z e db yg c 一m s t h er e s u l 招r e v e a l e d 出a tc c c pi sak i n do f l o w l yb r a n c h e ds t r u c t u r e t h em a i nc h a i ni sm a i n l ym a d eu po f ( 1 3 ) - l i n k e d x y la n daf e w r e s i d u e sa r es u b s t i t u t e da t4 o t h es i d ec h a i ni sc o m p o s e do f ( 卜4 ) 一l i n k e d - g l c ，( 1 3 ) l i n k e d - g l c ，( 1 6 ) - l i n k e d - g l ca n d ( 1 3 ) 1 i n k e d g a l ， ( 1 6 ) - l i n k e d - g a l s o m eo ft h e ( 1 4 ) 1 i n k e d o l ca n d ( 1 3 ) d i n k e d - o a lr e s i d u e sa r es u b s t i t u t e da t6 - o o na v e r a g e ，t h e r ei s1b r a n c h a m o n g1 0m a i nr e s i d e s t h en o n r e d u c e de n di sc o m p o s e do f x y l ，g l ca n d 0 8 1 k e y w o r d s ：c o m - c o b , p o l y s a c c h a r i d e ，p u r i f i c a t i o n , s t r u c t u r a l - a n a l y s i s ， i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：舀蛙日期：星丝i ! 生： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学盥 留r 作糍：压蛙指尉嘶隧镪 日勰丑i ：墨日舰 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：盔垒盔墼! 坚：卑毖起 电话： 2 2 i 显鱼兰 通讯地址：羝盎本纽蚤j l 盘趁量 邮编：么! 心 引言 糖类与生命科学研究进展 糖类是自然界中存在的一类具有广谱化学结构和生物功能的有机 化合物，几乎所有的动物、植物和微生物体内都含有。糖不但是细胞 能量的主要来源，在细胞的构建、细胞的生物合成和细胞生命活动的 调控中，糖均扮演着重要的角色。i 参与生命活动的调控科学家们 认为，糖链几乎参与了真核生物的所有生命过程。在分子内，糖链影 响蛋白质的折叠、抗原性和其它生物活性；在分子问，能通过糖缀合 物糖链与蛋白质的相互作用来介导细胞的识别，调控生命过程，都离 不开糖的参与。糖链是生命多样性的重要调控分子，从发育的细胞分 化，到生命的生化反应：从生命信息的传递，到抗癌机理，都有糖分 子的参与，不搞清糖的生物学机制，就无法深入洞察生命的本质。2 糖是生命的建筑材料作为细胞的框架，纤维素多糖支撑着植物世界的 大厦。植物的根、茎、叶、花、果实、种子，如果没有多糖细胞壁的 有力支撑，就不能有千变万化的几何形状。鲜花的婀娜多姿，绿树的 巍然挺拔，木质部的输水导管，韧皮部的养分通道，全是多糖的杰作。 昆虫几丁质的外骨骼也是一种多糖，这种壳多糖是昆虫在几十亿年进 化过程中的选择，它不但支撑着昆虫的机体，具有很好的机械强度， 还不失一定的韧性，在变态发育的演化中，一次次胀裂蜕去，又一次 次更新出合乎尺寸要求的新衣“1 。3 糖链是重要的信息分子许多研 究结果表明：糖类是生物体内除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生 物大分子，尤其是作为一类重要的信息分子，它在受精、发生、发育、 分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用；在炎症 和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常繁殖和转换、病原体感染、植 物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程中都存在 糖类的介导。1 。当代主流化学家们正在认识到这样的事实：糖类是天 才、绝妙的简明信息箱。1 。因此，糖类作为生命的信息分子已经得到 普遍承认，也就是说，糖类是生命过程的重要功能性分子之一。 糖类的研究已有近百年的历史，约1 0 0 年前德国著名科学家 e f i s c h e r 开始糖类的研究，在同一时期他也对肽类迸行了研究。一 个世纪过去了，从生命科学的角度来看，糖类研究尽管也有很大进展， 但是，与蛋白质和核酸的飞跃式的发展相比，显得远远落伍“3 。主要 原因有两点。l 理论上简单化：人们过低地估计了糖类对生命过程的 贡献，过去，药理学家们认为糖类只不过是一种能源和细胞的内支撑 物；在药物化学家考虑糖类合成时只涉及到一个基本反应：碳一氧键的 形成。觉得化学反应很简单，缺乏研究兴趣。2 研究方法困难重重； 由于糖类的纯化处理和结构鉴定都令人十分烦恼，很少有人肯在方法 上花很多工夫，或者绕着走“1 。应当说糖类研究的滞后，影响了人们 对生命本质的认识。 糖的研究在经历了一个多世纪的缓慢发展之后，随着分子生物学 的兴起，物理和化学技术的发展，从2 0 世纪7 0 年代开始，由于糖化 学和生物化学两个传统专业的结合使糖链的细胞和分子生物学研究成 为可能，糖的研究也得到了复兴，便诞生了一个新的研究领域一糖生 物学“。糖生物学是研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功 能的- - ) 7 学科，其研究领域包括糖化学、糖链生物合成、糖链在复杂 生物系统中的功能和糖链操作技术”1 。 近年来，随着糖类结构和功能关系研究的突飞猛进，人们日益认 识到糖类在生命现象中的重要意义，糖类结构和功能的研究将成为继 蛋白质、核酸之后在生命科学领域中探索生命奥秘的第3 里程碑。1 。 二多糖的研究进展 多糖是来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分 子物质，是所有生命有机体的重要组成部分，并与维持生命所需的多 种生理功能有关“1 。 2 ( ) 多糖的功能研究 对多糖的研究，最早是在2 0 世纪4 0 年代，但多糖作为广谱免疫 促进剂而引起人们的极大重视则是在2 0 世纪6 0 年代。经过4 0 年的不 断发展，人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识；多糖具 有广泛的生理活性，它不但能激活t 细胞、b 细胞、m 巾、c t l 细胞、 l a k 细胞等免疫细胞的活性，还可以激活网状内皮系统吞噬，清除老 化细胞和异物以及病原体的作用，还能促进i l 一1 、i l 一2 、t n f 、i n f y 的生成，调节机体抗体和补体的形成，提高机体抗肿瘤免疫力，达 到抑制或消灭肿瘤细胞的效果。如人参多糖、黄芪多糖能调节免疫功 能；香菇多糖、茯苓多糖能抗肿瘤：还有些能抗感染、降血糖、降血 脂；肝素多糖除抗凝血外，还有抗血栓、抗粥样动脉硬化、抗病毒等 活性”。近年来的研究发现，多糖的衍生物尤其是硫酸酯化多糖具有 独特的作用受到人们的广泛重视。许多无活性的多糖经硫酸酯化引入 硫酸根后，具有抗凝血、抗病毒等功能“”，如：香菇多糖、地衣多糖、 右旋糖苷、木聚糖具有抑制艾滋病病毒( hiv ) 的活性。因而多糖的 研究已成为人们关注的一个热点，各国学者从各种生物材料中寻找与 提取具有一定生理活性的多糖成分的研究十分活跃，从而便多糖类的 研究有了空前迅速发展的趋势n “。 ( 二) 多糖的结构研究 多糖的结构是其生物活性和功能的基础，认识和了解多糖的结构 有助于更好地利用和开发多糖。作为一类大分子，结构层次的分类沿 用了蛋白质的分类方法，也可分为级、二级、三级和四级结构。但 糖类的结构十分复杂：如立体异构，单糖之间的连接位置，还有a 、 b 构型之分。虽然多糖的结构测定及合成有自身的难度和特殊性，但由 于多糖在生命研究中的重要地位，在各国科学家的努力下，已经在分 析手段、结构研究上取得了不少进展： 经过2 0 多年的研究，除了更多专一的糖苷酶被应用于结构分析 外，还建立了多种质谱分析方法。继2 0 世纪7 0 年代中期引入的 h f _ 惦( h i g h - f i e l d - m s ) 后，8 0 年代又引入了快原子轰击质谱( f a b m s ) 技术，使得h f - f a b m s 得以用于多种含糖生物分子的结构分析，随后 引入的电喷雾质谱( e s m s ) 和基质辅助的激光解吸电离质谱( m a l d i m s ) 分析方法其灵敏度由于引进q - t o f ( q u a d - t i m eo ff i g h t ) 而大幅度提 高，可分析飞摩尔( 1 0 1 5 m o l e ) 级的样品以提供糖蛋白糖基化位点和糖 链序列信息。这些技术与外切糖苷酶、荧光标记衍生物、h p l c c e 和 n 躲技术的联合使用，可测定出糖链的组成和连接方式“。毫克级的 糖链可用s d s p a g e 分析，从蛋白上释放的糖链也可经荧光标记后用 适当组合的h p l c 、外切糖苷酶和m s m s 进行分析“。 完整的多糖结构分析包括对多糖的一级结构和高级结构的分析。 目前能有效分析多糖的一级结构的方法有化学方法、物理方法和生物 方法。化学方法是最古老且最经典的，有甲基化分析、s m i t h 降解、 过碘酸氧化、三氧化铬氧化法、部分酸水解等；物理方法主要有红外 光谱、核磁共振波谱、气相色谱、质谱、气质联用、快原子轰击质谱、 毛细管电泳等；生物学方法主要是利用特异性糖苷酶进行的酶法分析 “。而目前用于多糖高级结构分析的方法主要是物理方法，诸如x 射 线纤维衍射、核磁共振、电子衍射等“”。 尽管多糖的结构数据库已经建立，糖链的计算机处理软件的开发 也在密锣紧鼓地进行，但目前多糖结构分析中，表征聚糖的最重要参 数是其一级结构，即聚糖的糖残基序列，目前糖序列的测定仍是糖类 研究中最大的难点之一“。因而多糖研究中要解决的关键技术问题是 糖链结构分析方法的建立，在糖链的分析上需要建立高分辨率、快速 的序列测定方法和构象研究的方法与模型。相信随着基因组学研究的 进展，作为后基因组学的一个分支，糖组学也会象蛋白质组学一样在 2 1 世纪迅速发展“1 。 ( 三) 活性多糖的构效关系 活性多糖的化学结构是其生物活性的基础。多糖的构效关系就是 指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系，是当前糖化学和 糖生物学共同关注的焦点问题。l 多糖的糖组成和糖苷键类型从菌 体中获得的活性多糖一般是由葡萄糖构成的，而且葡萄糖主链上的b 1 ，6 糖苷键是抗肿瘤所必需的。由植物中提取的抗肿瘤活性多糖一般 由半乳糖或半乳糖醛酸等组成，如从禾本科植物箬竹中提取的由木糖、 4 阿拉伯糖及半乳糖等组成箬竹多糖可促进巨噬细胞产生肿瘤细胞坏死 因子“”。2 多糖中的官能团多糖中的官能团的种类或有无对其生物 活性有极大的影响，而这些官能团往往可以通过一定的化学方式进行 添加或消除，所以多糖中官能团的改造已成为研究多糖构效关系的有 力手段。常用于多糖官能团改造的方法有：降解、羧甲基化、硫酸酯 化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化、二乙基氨基乙基化、碘化、氨化等。 不同官能团改造方法对其生物活性的影响各不相同。如非硫酸化葡聚 糖、木糖呋喃聚糖、核糖呋喃聚糖、肝素和凝胶聚糖无抗爱滋病毒( h i v ) 活性，不抑制逆转录酶( r t ) ，但硫酸化后，有抑制逆转录酶( r t ) 的活 性，不仅抑制细胞的游离，而且也抑制细胞的生长，更有意义的是在比 抑制细胞生长的浓度低1 0 1 0 0 倍的情况下，也抑制细胞受h i v 的影 响，显然，硫酸根在抑制h i v 一生长的过程中起了重要的作用“。因 而，硫酸化酯多糖的研究成为国际糖生物化学领域人们普遍关注的热 点。3 多糖高级结构多糖高级结构与功能的关系至今还不十分清楚， 但科学家已肯定高级结构对功能的影响比一级结构还重要。一般高级 结构呈屈状螺旋的多糖活性较高，而可拉伸带状或皱纹型带状的活性 一般较低甚至没有。4 溶解度多糖的活性与溶解度有重要的关系， 如b 一( 1 3 ) d 一葡聚糖不溶于水，将其部分羧甲基化后，水溶性提高， 它的抗肿瘤活性也明显提高“。5 其他因素多糖的分子量、黏度以 及分子中的游离羟基对多糖的活性都有影响刈。 由于多糖本身的原因，如多糖的结构太复杂，其质量标准不易控 制；多糖的结构测定及合成有自身的难度和特殊性；有些多糖在天然 产物中含量很低而不易分离以及多糖的活性与多种因素有关等，给多 糖的研究和临床应用带来很大限制。故对多糖进行深入的研究，规范 多糖的提取方法，搞清多糖的构效关系，进一步探讨多糖作用机制， 加强临床实验，研制好的剂型，提高生物利用度，还需要广大医学工 作者的共同努力n ”。 三糖药物学研究现状 已有不少研究结果确证，糖类作为信息分子在受精、发生、发育、 分化，神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用：炎症和 自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换、细胞识别和病原体 感染等生物学过程都有糖类的介导。在这一系列的生物过程中，最重 要的生物活性因子便是糖链。它在生命活动中的功用并不亚于蛋白质 和脂类，这就预示着重要的天然糖和人工糖的巨大医疗保健价值，以 糖为基础的糖药物学的研究和开发便成为现在世界生物化学与生物医 学交叉点的新的边缘学科【5 】。糖药物的研究与开发必将成为2 1 世纪新 药开发的一个重要领域。 糖药物的晟重要的特点，它们中间的大多数是作用于细胞表面。 因为糖类或糖复合物主要分布在细胞表面，参与了细胞和细胞，细胞 和活性分子的相互作用【4 、2 2 。而且往往是一系列生理和病理过程的 第一步，如果这第一步被阻断了，有关的生理和病理也不能随之发生。 由于多数以糖类为基础的药物的作用位点是在细胞表面，而不进入细 胞内部，因此这类药物对于整个细胞、进而整个机体的干扰，要比进 入细胞核、质内小得多。就这点而言，糖药物是副作用相对较小的药 物。因此不仅可以作为治疗疾病的药物，而且可以作为保健类药物1 2 3 。 糖药物的来源很广，包括糖类及可通过与糖类、糖类相关结合蛋白和 酶相互作用的化合物。根据一项调查，美国的糖类治疗剂销售量，从 1 9 9 3 年的3 2 9 亿美元增加到2 0 0 0 年的5 2 5 亿美元；糖药物的市场份 额也从1 9 9 3 年的1 3 ，增加到2 0 0 0 年的2 4 2 4 1 。 和发达国家相比，我国的糖药物学研究有较大的差距，但我国科 学家依靠现有设备，发挥自身优势，在药物学的基础研究中也取得了 不少成绩：发现糖类可作为生物反应调节剂( b 砌田对巨噬细胞( m 中) 、 细胞因子及补体产生影响，也可用作免疫抑制剂或用于制备控释制剂。 在我国到目前为止，只有云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、裂褶多糖、 茯苓多糖等用于临床，但它们在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、 愈溃疡等疑难病症的治疗方面已显示了诱人的前景1 2 0 l 。展望未来，我 国开发糖药物有着得天独厚的条件，蕴藏了丰富的生物资源，其中仅 特有植物有9 2 种，已被研究开发的只占其中很少一部分，同时还有深 6 厚的传统中医药理论和临床实践可供借鉴。相信经过我国科研人员的 辛勤工作，一定会拥有自己独立的知识产权，在世界糖药物研究领域 里写下辉煌的篇章【2 ”。 目前多糖的研究以美国、日本以及一些欧洲发达国家处于领先地 位。我国对多糖的研究起步较晚，始于7 0 年代，但我国多糖资源十分 丰富，具有巨大的开发潜力。近年发展很快，研究对象包括真菌类、 藻类、地衣类、细菌类、高等植物和动物类，其中，以中草药多糖为 主。 玉米是世界大宗粮食作物之一，播种面积位居第三，仅次于水稻、 小麦、我国玉米分布极广，栽培面积和产量均居世界第二位。每年产 玉米上千亿公斤，估计玉米芯产量在1 0 0 0 万吨。目前，我国农村玉米 芯主要作为燃料和饲料，而在工业上，玉米芯主要作为生产糠醛和木 糖醇的原料，用作其它方面的仍是不多 2 6 - 2 9 1 。为了使这一废弃物质得 到合理利用，本文选取玉米芯为材料，试图找出开发玉米芯综合利用 的新途径。 玉米芯的化学分析表明，玉米芯含粗蛋白2 2 ，粗脂肪0 4 ， 糖5 4 5 ，粗纤维2 9 7 ，矿物质1 2 ，糖含量较高适合作提取多 糖的原料。本论文以玉米芯为材料建立有效的玉米芯多糖的提取、纯 化方法、阐明玉米芯多糖的结构，试图发现其生理活性。 注：本文所用缩写符号 g l y 一甘油e r y 一赤藓醇x y l - 木糖 g a l 一半乳糖g l c 一葡萄糖 一粗多糖的研究 结果与讨论 ( - - ) 物理性状 玉米芯酸提水溶性粗多糖为褐色粉末，易溶于水。 ( 二) 总糖含量及蛋白质含量 1 总糖含量 以混合单糖标准品作标准曲线，酚硫酸法测得总糖含量为5 9 。 2 蛋白质含量 凯氏定氮法测得粗糖中蛋白质含量为2 9 7 5 。 ( 三) 组成分析 1 纸层析法( p c ) 定性分析 经1m h 2 s 0 4 完全酸水解，p c 分析，证明其含有g l c 、x y l 、g a l 。 2 气相色谱( g c ) 定量分析 酸提水溶性粗多糖g c 分析表明，其单糖组成为g l e 、x y l 、g a l ， 摩尔比为1 7 0 5 ：3 2 7 ：1 0 0 ( f i 9 1 ) 。 ( 四) s e p h a r o s ec i b 柱层析检查 经s e p h a r o s ec l _ 吒b 柱层析，酚硫酸法测多糖分子量分布范围 较宽，需要进一步分级、纯化( f i 9 2 ) 。 二粗多糖的分级纯化和c c c p 的纯度鉴定 ( 一) 粗多糖的乙醇分级 将粗多糖用乙醇分级，调终浓度分别为3 0 、5 0 、7 0 ，离 心( 3 0 0 0 r p m ) 得到三个级分，即c c a 、c c b 、c c c 。把三个级分分 别经s e p h a r o s ec l _ _ 6 b 柱层析，酚硫酸法测糖分布，结果是c c a 收率最高( 5 4 7 ) ，但峰较宽；c c b 收率较低( 2 1 7 ) ；而c c c 收率 居中( 2 3 6 ) ，峰形较好，分子量分布范围较窄( f i g t 3 ) ，水溶性好， 糖含量较高，故选c c c 作为进一步研究的对象。 ( 二) 冻溶分级 将c c c 配成均匀的5 糖溶液，于冰柜中( 一2 0 ) 冰冻2 4 小时， 在室温下缓慢融化，1 0 0 0 0r p m 离心2 0 分钟，除去少量沉淀。 ( 三) 脱蛋白、脱色素 将c c c 用链蛋白酶和s e v a g e 法联合脱蛋白，用h 2 0 2 脱色、透 析、醇沉，常规干燥。 ( 四) s i ；p h 8 r o s ec i 广_ - 6 b 柱层析纯化 将脱蛋白、脱色素后的c c c 配成5 糖溶液经s e p h a r o s ec l 6 b ( 2 5 9 0 c m ) 柱层析，酚硫酸法测多糖分布，收集糖峰洗脱液，经 浓缩、真空冷冻干燥，最终得淡黄色粉末状多糖c c c p 。 ( 五) c c c p 纯度鉴定 1 s e p h a r o s ec i _ _ 6 b 柱层析检查 苯酚一硫酸法测糖分布，呈单一狭窄对称峰( f i g 4 ) ，表明c c c p 分子量均一。 2 比旋光度检测 在不同浓度的低醇溶液中，c c c p 的比旋光度基本一致。 3 醋酸纤维素薄膜电泳检测 图谱呈单一谱带。 4 d e a e - s e p h a d e xa 2 5 柱层析检验 用0 4 1 6 m o l ln a c i 梯度洗脱，酚一硫酸法测多糖分布，呈单一 狭窄对称峰，表明c c c p 极性均一( f i g 5 ) 。 上述纯度鉴定结果表明，c c c p 为纯度较好的多糖样品，可以进 行结构研究。 9 三c c c 化学修饰 ( 一) 硫酸酪的制备 1 多糖硫酸化的方法有多种，但都不可避免的有多糖的降解发 生，而其共同点是硫酸化反应中硫酸基的来源均为氯磺酸。氯磺酸毗 啶法，反应条件温和简单，收率高，产物回收方便，是最理想的硫酸 化方法。 称取彻底干燥的多糖粉末9 0 0 m g ，采用氯磺酸毗啶法制备硫酸酯， 简称c c c s 。 2 硫酸根含量的测定 用比浊法测定硫酸根含量为1 4 8 7 ，离子色谱法( i c ) 测得硫酸 根含量为l1 6 7 。因离子色谱法检澳9 硫酸根含量有较高的稳定性，故 硫酸根含量以i c 结果为准。 ( 二) 硫酸化前后性质比较 在硫酸化过程中，由于s 0 3 一取代了多糖羟基中的一，因此硫酸 基的弓l 入使多糖的一级结构和高级结构都发生变化，因而c c c 和c c c s 的性质有较大差异。 ( 1 ) 柱层析结果比较s e p h a r o s e c l - 6 b 柱层析表明，c c c 和c c c s 均为单一峰，c c c s 的洗脱峰位明显前移，说明由于s 0 3 w 的引入，其 相对分子质量明显增大( f i g 6 ) 。 ( 2 ) 比旋光度c c c 在不同浓度的低醇溶液中，比旋光度基本一 致， 8 d = + 8 。，c c c s l 的比旋光度为 d ”n = + 2 5 。，说明硫 酸化使多糖的结构发生变化，因而在比旋光度上表现出明显的变化。 ( 3 ) 醋酸纤维薄膜电泳c c c 和c c c s 均呈单一谱带，但c c c s 的迁 移速度，迁移距离较c c c 明显增大，且易于着色，经乙醇漂洗后不易 脱色。 ( 4 ) 红外光谱二者在3 4 0 0 c m - 1 、1 6 3 0c m - 1 、1 0 4 0c m - 1 左右有多糖 母体的特征吸收峰；c c c s 在1 2 6 0c f f l 处出现硫酸酯键的特征吸收蜂。 表明硫酸基的引入及构象的变化( f i g 7 ，8 ) 。 1 0 四c c c p 的研究 ( 一) 物理性状 1c c c p 为淡黄色粉末，易溶于水。 2 旋光值为 q ”o = + 8 。 3 分子量约为5 2 4 万。 ( 二) 糖含量 以混合单糖标准品作标准曲线，酚硫酸法测定，总糖含量为9 2 8 。 ( 三) 组成分析 1 纸层析法( p c ) 定性分析 经1mh 2 s 0 4 完全酸水解，p c 分析，证明含有x y l 、g a l 、g l c 。 2 气相色谱( g c ) 定量分析 g c 分析表明，其单糖组成为g l c 、x y l 、g a l 、摩尔比为4 4 0 ：2 6 5 ： 1 0 0 ( f i g 9 ) 。 ( 四) 碘反应 c c c p 溶液遇碘变成棕红色，证明有a ( 1 4 ) g l c 短链存在。 ( 五) 红外光谱分析【3 0 l ( i r ) c c c p 在8 4 5 一c m 、8 9 0 1 c m 有特征吸收峰，表明c c c p 存在a 、 b 糖苷键，另外，在1 0 0 0 - - 1 2 0 0 c m 、1 2 0 0 - - 1 4 0 0 c m 、2 8 0 0 - - 3 0 0 0 一c m 、 3 2 0 0 3 5 0 0 j c m 均有多糖的特征吸收峰( f i g 1 0 ) 。 ( 六) 唾液淀粉酶解 将c c c p 与唾液淀粉酶一起3 7 c 保温4 8 小时，取少量与碘反应， 无颜色变化，证明a ( 1 4 ) g l c 短链被水解掉，再经s c p h a r o s cc l 一 6 b 柱层析检查，发现峰位明显后移，但峰形仍为单一对称峰，说明 c c c p 中存在一定量的8 ( 1 4 ) g l c 片段，且存在于分子的外围部分， 所以唾液淀粉酶解时被水解下来。由此证明：c c c p 分子由a 型糖苷 键组成。 ( 七) 纤维素酶解 将c c c p 与纤维素酶一起3 7 保湛4 8 小时，经s c p h a r o s c c l _ - 6 b 柱层析检查，发现峰位明显后移，但峰形仍为单一对称峰，说明c c c p 中存在一定量的1 3 ( 1 4 ) g l c 片段。 ( 八) 部分酸水解 将c c c p 用0 0 5 m 三氯乙酸进行部分酸水解水解完成后，离心， 沉淀做g c 分析( f i g 1 i ) ；上清用无水乙醇蒸除三氯乙酸至中性，透 析；袋外部分干燥做g c 分析( f i g 1 2 ) ；袋内部分加乙醇醇析，上清 干燥后做c j c 分析( f i g 1 3 ) ，沉淀一部分做g c 分析( f i g 1 4 ) ，另一 部分做高碘酸氧化。 f 实验结果l 如下： 表1部分酸水解产物分析 x y l g a lg i e 袋外部分 2 7 71 0 01 9 8 袋内醇析上清6 6 71 o o7 9 6 袋内醇析沉淀 o 2 11 o o2 6 4 从表1 可以得出如下结论： ( 1 ) 从袋外部分检出x y l 、g a l 、g l c ，说明这三种糖存在于分 子的支链或主链末端，在水解时以单糖或双糖的形式释放。 ( 2 ) 袋内醇析上清检出三种糖分别为：x y i 、g a l 、g l c ，其摩 尔比为：6 6 7 ：1 o o ：7 9 6 。说明g a l 、g l e 、x y l 可以形成支链或主 链的边缘，其中g l e 所占比例较大，可能是构成支链的主要成分。 ( 3 ) 袋内醇析沉淀中检出x y l 、g a l 、g l c ，其摩尔比为0 2 1 ：1 o o ： 2 “，这三种糖共同构成核心结构。 将袋内醇析沉淀经s e p h a r o s ec 卜6 b 柱层析检查，发现峰位明显 后移，但峰形仍为单一对称峰，说明水解掉的糖可能处在分子边缘， 水解后并不改变分子的核心结构。 ( 九) 高碘酸氧化和s m i t h 降解 【原理部分】：高碘酸氧化是一种选择性的氧化反应，它只能作用 于多糖分子中连二羟基及连三羟基处。当连二羟基的c c 键被断开 后，产生相应的醛，当断裂连三羟基的c c 键时，产生甲酸及相应 的醛，此反应定量进行，每断开l m o l c - - - c 键，消耗l m o l 高碘酸，由 此可知，每生成i m o l 甲酸必然对应消耗2 m o l 高碘酸，因此通过测定 1 2 高碘酸消耗量和甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置，直链多糖的 聚合度及直链多糖的分枝数目等，高碘酸氧化产物经n a b l - 1 4 还原，得 到的多糖醇用稀酸在温和条件下水解，可发生特异性降解，即s m i t h 降解。s m i t h 降解的特点是只打断被高碘酸破坏的糖苷键，两未被高 碘酸氧化的糖残基仍连在糖链上，这样，多糖醇经s m i t h 降解，就可 以得到小分子的多元醇和未被破坏的多糖和寡糖片断，对这些产物进 行分析，便可推断出糖苷键的键型及其位置。 下面以葡聚糖为例，反应式如下： 1 以1 一位键合( 1 6 类似) 彝卷紫毋辩。曛卜卷舻秽嚣礴晦； 滁e 黼 舒鞠黪 颤终 i 翎。举酸， z 譬轴1 2 以1 一位键合( 1 2 ，6 类似) ci。bohg“，沁l 。熟鹄蛾懑；0 1 1 一黼j ) 翩糖 渊 蹦二_ 翻 爹撇k 黼 戳 小结： 1 1 一、1 6 键型消耗2 m o l 高碘酸，生成1 m o l 甲酸；1 2 、1 2 ，6 、l 一4 、1 4 ，6 只消耗高碘酸，不生成甲酸； 2 不被高碘酸氧化的己糖残基键型为： 1 3 、l 一2 ，3 、l 一2 ，4 、卜3 ，4 、l 一3 ，6 、1 2 ，3 ，4 ： 3 产生甘油的键型为：1 一、l 一2 、l 一6 、1 2 ，6 ；产生赤藓醇 的键型为：1 4 、1 4 ，6 ； 4 吡喃型木糖1 一键型消耗2m o l 高碘酸，生成1 t o o l 甲酸；吡喃 型木糖产生甘油的键型为：1 2 、1 4 ；吡喃型木糖不被高碘酸氧化 的己糖残基键型为：1 3 、1 2 ，3 、1 2 ，4 、1 3 ，4 。 【实验结果1 ：c c c p 高碘酸氧化及s m i t h 降解结果见表2 、3 及 f i g 1 5 1 8 。 表2c c c p 及c c c p ( c c c p 主链部分) 高碘酸氧化结果分析 反应进称样高碘酸高碘酸耗生成甲甲酸生成 样品行时间量总耗量量己糖基酸量量己糖基 ( h )( r e t 0 0 1 ) ( r e t 0 0 1 )( m o l m 0 1 )( m m 0 1 )( m o y m 0 1 ) c c c p1 6 50 2 9 8o 2 1 3 0 7 1 40 0 4 00 1 3 4 c c c p 1 4 l0 1 2 6o 1 3 71 0 8 70 0 1 4o “l 由表2 可知： 1 产生甲酸，说明g l c 、g a l 存在l 一或l 一6 键型；) ( y l 存在l 一键型； 2 高碘酸消耗量明显大于甲酸生成量的2 倍，说明存在大量的只 消耗高碘酸而不产生甲酸的键型，即g l e 、o a l ：l 一2 、l 一2 ，6 、1 4 、l 一4 ，6 键型：或毗喃型木糖：1 2 、1 4 键型： 3 高碘酸消耗量及甲酸生成量显示分子中可氧化糖基占5 8 0 5 ， 不可氧化糖基占4 1 9 5 ； 4 从甲酸生成量可以推测此多糖为分枝较少的结构。 1 4 表3c c c p 高碘酸氧化及s m i t h 降解产物分析 甘油赤藓醇木糖半乳糖葡萄糖 完全酸水解 3 2 55 6 43 6 61 0 0o 8 7 s m i t h 袋外部分 2 。5 54 s 64 。6 l1 o oo 9 1 袋内上清 降解 袋内沉淀+ 由表3 可知： 1 完全酸水解中检出x y l 、g a l 、g l c ，说明三者中均存在不被高 碘酸氧化的键型，即x y l ：l 一3 、1 2 ，3 、卜- 2 ，4 、1 3 ，4 ：g a l 、 g l c ：l 一3 、l 一2 ，3 、1 2 ，4 、1 3 ，4 、1 3 ，6 、1 2 ，3 。4 键 型； 2 由于在袋外部分检出x y l 、g a l 、g l c ，说明x y l 、g a l 、g l c 中 不被高碘酸氧化的键型或是位于主侧链的末端或边缘，或是间隔排列 在能被高碘酸氧化的键型之问； 3 检出大量的赤藓醇，说明g a l 、g l c 存在大量的1 4 、1 4 ，6 键型；检出一定量的甘油，说明g a l 、g l c 存在定量的l 一、l 一2 、 l 一6 、l 一2 ，6 键型；也可能x y l 存在l 一2 、l 一4 键型： 4 袋内部分醇沉检出x y l ，说明主链中x y l 有不被高碘酸氧化的 键型。 ( 十) 甲基化分析 【原理部分】：甲基化分析是确定糖链连接次序所必不可少的实验 手段。其基本原理是先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基 化，进而将多糖中的糖苷键水解，水解后得到的化合物，其羟基所在 的位置，即为原来糖基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例， 可推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占地比例。 用此种方法得到的羟基及n a b h 4原醛基后产生的羟基，经乙酰 化可得到甲基化糖醇乙酸酯( 此产物易挥发，可进行g c 分析) 。在经 g c 与g c m s 联机分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱谱图的 主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。 反应通式如下： h 广墨c h ，+ n a o h c h z e h & - c h 广s c3 + _ 矿喀一e h ；妇v ( d m s o ) ( 二甲基亚碰蘸朋离子 。；_ c 。p p + r 一洲一r 一。q 。产釜c h ，2 。c h ；_ 豇c h p p + r o h 一r o q 。o ，鍪c h ， 势) ( 糟羟蘑。髀钠j 3 、r 一岛a q 洲3 | r o c h 3 + n a i ( 碘甲烷)( 甲醚甲基化糖) 以n ( 1 4 ) 葡聚糖为例： 1 6 爵叫 另外，甲基化衍生物的裂解规律1 3 l 】为： 各种单糖甲基化衍生物的基峰均为4 3 ，为c h 3 c o + ； 被甲基化、乙酰化的单糖分子中，带有甲氧基的碳原子容易与 相邻的碳原子间发生断裂，形成正离予。 下面以1 。5 - d i a c e t y l 2 ，3 ，4 ，6 - t e t r a o - m e t h y l - d - g i c 为例，断裂方式 如下： 车h 一：d c o e h 3 撕= = ：燕hb 赢o - - - c h 3 二： 2 0 亏。” 车h o e h 。 ，1 b ，一一一t 一峥，- = 一一一， 1 6 1 - 4 幸h o c h ，。2 0 5 4 9 一靠：= 苔= 蓉泛。童一 主要碎片( m e ) 为：4 5 、1 1 7 、1 6 1 、2 0 5 。 以1 6 1 、2 0 5 进一步裂解为7 1 、8 7 、1 0 1 、1 2 9 、1 4 5 。如图所示： 彳h o e 心己蟮醚i 4 2 菏h 一。一c h 3 奄一o e 飞匾矿嚣一o h ：e 魄m 玲l 渤)c h 2 柳l e 酚) 表4c c x 甲基化产物分析 峰号甲基化单糖键型主要离子碎片 1 2 ，3 ，4 一x y l l 一4 3 1 0 1 1 1 7 1 6 1 2 2 ，3 ，4 ，6 一g l c 1 4 3 4 5 7 1 8 7 1 0 1 1 1 7 1 2 9 1 4 5 1 6 1 2 0 5 3 2 ，3 ，4 ，6 一g a l l 一4 3 4 5 7 1 8 7 1 0 1 1 1 7 1 2 9 1 4 5 1 6 1 2 0 5 4 2 ，4 一x y l 1 34 3 1 1 7 5 2 ，4 ，6 一g l ci 一34 3 4 5 8 7 1 0 1 1 1 7 1 2 9 1 6 1 6 2 ，3 ，6 一g l c 1 4 4 3 4 5 8 7 9 9 1 0 1 1 1 3 1 1 7 2 3 3 7 2 ，4 ，6 一g a l 1 3 4 3 4 5 8 7 1 0 1 1 1 7 1 2 9 1 6 1 8 2 ，3 ，4 一g l c l ，6 4 3 8 7 9 9 1 0 1 1 1 7 1 2 9 1 6 1 1 8 9 9 2 ，3 ，4 一g a l1 64 3 8 7 9 9 1 0 1 1 1 7 1 2 9 1 6 1 1 8 9 l o2 一x v l1 3 44 3 1 1 7 2 6 1 1 1 2 ，3 一g l c1 - 4 64 3 1 0 1 1 1 7 2 6 1 1 22 4 一g a l1 3 6 4 3 8 7 1 1 7 1 2 9 1