外科学与分子生物学ppt课件

外科学与分子生物学Surgerynorthernblot;dotblot;insituhybridization，FISH2聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）：由DNA聚合酶催化，利用极微量DNA片段扩增，经过多个循环周而复始，使目的DNA片段达到扩增3DNA芯片技术在固相膜片上制成成千上万个寡核苷酸点阵，以待测样本DNA、RNA用荧光标记后与之杂交，利用激光共聚焦显微镜对芯片扫描，计算机进行信息分析,1,31,人类基因组计划：humangenomeproject,HGP由美国科学家提出，目的是将细胞内基因组DNA序列全部分析出来。美国1990年正式启动，英、法、德、日、中等国科学家共同参与，2003年4月已宣布完成人类基因组序列图,后基因组计划或功能基因组学：post-genomeproject,functionalgenomics研究基因组中各基因的功能，目前已知功能的基因仅占小部分，大量基因功能尚待阐明,32,Homogenization,33,PCR：polymerasechainreaction,是在模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸（dNTP）存在条件下由耐热DNA聚合酶在体外酶促合成双链DNA反应。其特异性取决于引物和模板DNA的特异性,34,PCR,35,PCR,36,PCR,37,Southernblot,38,39,40,Insituhybridization,41,Microarray,42,Genediagnosistechnique:microarray,43,基因治疗：genetherapy,指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用,向免疫细胞导入细胞因子基因，增强机体免疫功能。包括肿瘤坏死因子类、干扰素类、白细胞介素类（基因增补）导入主要组织相容性复合物抗原基因（MHC），提高肿瘤抗原性，诱导特异性细胞毒性杀伤作用导入抑癌基因。如野生型P53基因，诱导肿瘤凋亡并丧失致瘤性遏制癌基因的表达。采用反义核苷酸序列在癌基因表达时与mRNA特异性结合，以阻遏癌基因表达（基因封闭）导入自杀基因，将某些病毒、细菌中的前药转换酶基因自杀基因导入癌细胞，自杀基因编码的酶类将药物前体在癌细胞内转换为毒性产物，达到杀伤肿瘤目的,44,外科学与免疫学Surgery&immunology,45,免疫系统的组成,免疫系统，immunesystem：参与免疫应答，执行免疫功能的独立解剖学结构。包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子Thymus,bonemarrowLymphnode,spleen，mucosaassociatedlymphoidtissue(MALT)T、Blymphocyte,naturalkillercell,antigen-presentingcellImmunoglobulin,complement,cytokine,adhesionmolecule，MHC(HLA),46,免疫系统组成,47,免疫应答的基本机理,免疫应答是由多种免疫细胞和免疫分子参与的复杂过程，根据参与主要免疫细胞的不同分为T细胞介导的细胞免疫应答和B细胞介导的体液免疫应答。免疫应答效应可保护机体免受抗原异物的侵害，但某种情况下也可导致自身组织的损伤免疫应答三时相：识别相、激活相、效应相,48,T细胞介导的细胞免疫效应机制,CD8+Tcell活化需要双信号TCR特异性识别MHCI分子-抗原肽复合物共刺激信号或第二信号+CD4+T细胞分泌的细胞因子T细胞杀伤靶细胞效应细胞与靶细胞结合杀伤颗粒胞吐机制：穿孔素、颗粒酶、丝氨酸酯酶等受体介导机制：Fas-FasL途径；TNF途径,49,B细胞介导的细胞免疫效应机制,巨噬细胞加工抗原B细胞识别抗原决定簇抗原肽_MHCII分子复合物（第一信号）Th细胞活化产生多种细胞因子（第二信号）B细胞增殖、分化为浆细胞，产生免疫球蛋白（antibody）,50,MHC基因,51,Dendriticcellandtumorantigen,52,NK细胞介导的细胞免疫效应机制,特点：无须抗原刺激，无MHC限制，不依赖抗体，为自然杀伤性质识别靶细胞：与靶细胞膜结合的IgGFc段；LFA-1与靶细胞膜ICAM-1相互作用杀伤靶细胞穿孔素、颗粒酶机制TNF机制NK细胞毒因子,53,免疫记忆机制：immunologicalmemory,机体对胸腺依赖性抗原再次刺激时表现出比初次刺激更为强烈的应答反应，需要T、B细胞的共同参与T细胞免疫记忆：终生存在。即初次免疫应答结束后有长寿性记忆T细胞存活，滤泡树突状细胞可持续低水平保持抗原B细胞免疫记忆：与T细胞免疫记忆相似，初次应答后有长寿性记忆B细胞存活，需要滤泡树突状细胞可持续低水平保持抗原及抗原特异性CD4+T细胞协调,54,免疫调节：immuneregulation,指机体多种因素对免疫应答过程的正负调节作用，以使免疫应答适度，维持内环境稳定例如APC表面MHC分子与黏附分子具有调节作用可溶性免疫分子具有调节作用Fas-FasL系统具有调节作用,55,免疫调节,56,以抗感染免疫为例,抗感染免疫是机体识别、清除病原体的生理性防御机制。免疫学基本理论是建立在感染免疫基础上抗感染免疫特点：天然免疫和获得性免疫共存；病原体不同，免疫机制也不同；病原体可发生免疫逃避或抵抗；不恰当的免疫同样引起损伤与疾病天然免疫：各种屏障，吞噬细胞，NK细胞，补体、细胞因子等获得性免疫：T细胞免疫应答，B细胞免疫应答；免疫记忆（immunologicalmemory）,57,感染的免疫效应机制,58,感染：免疫效应机制,59,抗感染免疫,60,肿瘤免疫学：tumorimmunology,研究肿瘤的免疫源性、机体免疫功能与肿瘤发生发展关系、机体抗肿瘤效应机制以及免疫诊断和免疫治疗的科学肿瘤抗原是恶性转化细胞中出现的蛋白与多肽分子总称肿瘤特异性抗原：tumor-specificantigen，TSA，指正常细胞不存在，肿瘤细胞所独有的抗原。如黑色素瘤抗原基因产物（melanoma-antigen-encodinggene,MEGE）肿瘤相关抗原：tumor-associationantigen，TAA,指可存在于正常细胞或胚胎组织，肿瘤细胞表达增高，如AFP，CEA，CA19-9等,61,Tumorantigen,62,Tumorimmune,63,抗肿瘤免疫应答:细胞免疫占主导地位；体液免疫起一定作用；NK细胞起一定作用,64,肿瘤的免疫治疗：immunotherapy机理：提高肿瘤免疫源性；激发机体抗肿瘤免疫应答能力,免疫治疗分类：主动免疫疗法：activeimmunotherapy,即激活机体抗肿瘤免疫能力，如毒或灭活瘤苗；基因修饰瘤苗；肿瘤抗原肽疫苗等被动免疫疗法：passiveimmunotherapy,即向宿主转移有抗肿瘤活性的治疗因子或细胞，如单克隆抗体；抗体偶联物；淋巴细胞，TNF等,65,主动免疫疗法中肿瘤抗原的制备,肿瘤细胞作为疫苗：加热、冻融、放射线照射等处理，使瘤细胞灭活，保持抗原性，以非特异性刺激因子作为左剂联合注射于患者体内进行主动免疫治疗抗原肽作为疫苗：生化技术纯化肿瘤细胞抗原肽或依据肽序列人工合成抗原肽，结合MHCI分子作为疫苗,66,肿瘤免疫治疗,67,肿瘤的免疫监视与免疫逃逸,免疫监视：immunesurveillence,指机体免疫系统可以识别并消灭表达新抗原的“异己”成分或突变细胞，保持机体内环境稳定免疫逃逸：immuno-evasion，指机体免疫系统无法识别、消灭突变的细胞。是肿瘤进展、转移的基础原因肿瘤抗原性低下；MHCI类分子表达减少、缺乏肿瘤细胞自分泌免疫抑制因子TGF-、IL-10宿主T细胞发育或功能缺陷宿主血清中的封闭因子免疫豁免，即肿瘤细胞表达FasL，引起CTL凋亡,68,Transplantrejection,69,同种异体器官移植排异反应产生机制,排异反应：由受体免疫系统识别供体的异体抗原引发的一系列免疫反应，最终造成移植器官的功能丧失。MHC（MajorHistocompatibilityComplex,主要组织相容性复合物），在人类指HLA(HumanLeucocyteAntigen,人类白细胞抗原)HLAI类抗原可出现在大多数有核细胞；而HLAII类抗原仅见于抗原递呈细胞（AntigenPrensentingCell,APC），如树突状细胞、单核细胞和B淋巴细胞,70,临床抗排异治疗药物的作用机制,几种免疫抑制剂特性以及作用靶点-名称特性作用靶点-环孢霉素A（CsA）土壤真菌提取物抑制NF-AT，阻断T细胞激活和分泌细胞因子(cyclosporine)FK506丝状菌提取物抑制NF-AT，体外抑制活性为CsA的100倍(tacrolimus）硫唑嘌呤（AZa）DNA代谢抑制剂抑制淋巴细胞增殖分化(azathioprine)类固醇肾上腺皮质激素抑制巨噬细胞，清除循环中的T细胞使其回归淋巴结(corticoster