（生物化学与分子生物学专业论文）转录子抑制杂交tsh方法建立及应用研究.pdf

摘要 器官形成特异表达基因识别不仅是研究细胞及组织分化和器官形成分子机理的重要途径之 一，同时也是基因组序列解读和系统生物学研究的基础。由于种种原因的限制，以往研究主要通 过表达序列标签( e s t ) 等途径识别器官形成特异表达基因，但获得e s t 所使用内切酶覆盖c d n a 种类的限制，又因在校正低丰度转录子和富集目的c d n a 等方面的缺陷，使得e s t 途径的器官 特异表达目的基因的识别方法时间和经济成本高，目的基因识别率处在较低水平。 1 4d n a 连接酶能够以d n a 为模版代谢d n a 5 磷酸与r n a 3 羟基连接形成磷酸二酯键，研究 表明，t 4d n a 连接酶在实现d n a 与r n a 的连接的反应中对d n a 模版序列有倾向性，用t 4d n a 连 接酶在拟南芥m r n a 的5 端连接有倾向性的通用模板标签序列，r t - p c r 建立c d n a 文库，从库 中分离了1 5 4 个全长c d n a 圳：高效通用模板和连接体系被广泛应用于相关研究1 3 3 6 1 ，成功获得 了目的基因全长c d n a 。这些研究结果使得在更新常规器官特异表达目的基因的识别方法时，不 使用内切酶获得e s t 、避免c d n a 的损失成为可能。 本研究口的旨在基于上述研究结果，结合近年在校正低丰度转录子和富集目的c d n a 等方面 的最新研究进展，建立基于器官表达全转录予的转录了消减杂交( t s h ) 方法，克服常规方法中 存在的不足，并通过t s h 方法的运用检测其使用效率。研究内容包括，1 ) 高纯度r n a 的获得； 2 ) 反转录体系优化；3 ) 非酶切接头连接体系比较和建立；4 ) 杂交校正低丰度转录子研究；5 ) 目的c d n ap c r 富集条件优化：6 ) t s h 方法使用效率研究；7 ) 器官特异表达基i - 丈jt s h 方法识 别应用研究。 研究取得以下结果，1 ) l i c i 法分离的r n a 纯度高于常规t r i z o l 方法：2 ) 建立了效率高于 常规方法的混合反转录体系：3 ) 建立了基于t s h 接头的连接体系：4 ) 确立了r n a 过饱和杂交 的低l 度转录了校止方法：5 ) 建以了优化的u 的c d n a 钳集p c r 反麻体系。6 ) 对质粒六个已 知衷达基因进行t s h 方法识别，在建妒的t s h 文库中枪出血个h 的基因中的四个，另非h 的 基凼末检出，与预期一致。7 ) 识别了，铃薯茎和叶特异表达基凶l o 个，其l | 包括来r i 其叶绿体 和线粒体毖组摹l 州。 研究的基木结论包括，1 ) 建矿了转录子消减杂交( t s h ) 方法，基本实现了克服常规方法 i i i 存在不足的同的，消减文库榆测p c r 阳性率和同的基因识别；簪显著提商。2 ) 办法可用丁细胞、 组织和器官特片表达犀i n 的识别研究。 进步研究需考虑的问题包括，1 ) 住日前t s h 接头基础上，增加发计标签序列，用标签序 列扶得直接反应接头连接效率的指标，代替目前采用的反转录反应后的m 接指标，更准确反映连 接效率，便j ：连接效率提岛的研究；2 ) 本研究结束前所订双链特芹核酸酶( d u p l e x s p e c i f i c n u c l e a s e ，d s n ) 没能到货，尽管d s n q f - 常昂贵，但有必要比较d s n 署i i h a e l i i 在消减非口的c d n a 中区别，确定更高效率消减方法。3 ) 增) j 1 s u p e r s c r i p t l l l 扩大反转录酶筛选范围，进步完浮混合 反转录反应体系反转录效率，减少目的c d n a 可能的损失。 关键词：基因识别，器官形成，校正和宙集，r n a ，日的c d n a a b s t r a c t i d e n t i f i c a t i o no fg e n e se x p r e s s i n gd u r i n go r g a nf o r m a t i o ni sn o to n l yo n eo fa p p r o a c h e st o e x p l o r em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fc e l l so rt i s s u ed i f f e r e n t i a t i o na n do r g a nd e v e l o p m e n t ，b u ta l s oo n eo f p o s t u l a t i o n st oa n n o t a t eg e n o m ea n ds t u d yo fs y s t e mb i o l o g y v c 叮f e wa p p r o a c h e sa r ea v a i l a b l eu pt o d a t ef o rt h et a r g e tg e n ei d e n t i f i c a t i o nd u et ov a r i o u si 屯a s o n s e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g ( e s t ) i sa l m o s t d o m i n a t e do n e h o w e v e r , t w or e a s o n sr e s u l ti ne s t a p p r o a c hb e i n gh i g hc o s to ne x p e n d i t u r ea n dt i m e ， a sw e l la sl o we f f i c i e n c yo nt a r g e tg e n ei d e n t i f i c a t i o n o n ei st h a te n d o e n z y m eu s e di nt h em e t h o dc a n n o tc o v e ra l ls o r t so fc d n a si na no r g a n t h eo t h e ri st h a tl o wa b u n d a n tr n a sa r en o tn o r m a l i z e da n d e n r i c h e de n o u g h b o t hl e a dt ol o s so f t a r g e tg e n e s t 4l i g a s ei sa b l et ol i g a t e5 p h o s o p h a t eg r o u pa td n aa n d3 h y d r o x y lg r o u pa tr n a r e c e n t s t u d yi n d i c a t e st 4l i g a s es h o w st e n d e n t i o u s n e s st od n at e m p l a t ew h i l ei ti su s e dt ol i g a t ed n aa n d r n a ae d n al i b r a r yw a ss e tu pa f t e rat a gs e q u e n c e ( g e n e r a ld n at e m p l a t e ) w a sl i g a t e dt o5 e n do f m r n af r o ma r a b i d o p s i s 15 4f u l l - l e n g t hc d n a sw a si s o l a t e df r o mt h el i b r a r y s i n c et h e n ，g e n e r a l t e m p l a t ea n di t sl i g a t i o nr e a c t i o na r ew i d e l yu s e di ns t u d i e sc o n c e m e dt oi s o l a t ef u l l - l e n g t he d n a c l o n e so ft a r g e tg e n e ss u c c e s s f u l l y t h i sm a k ei tp o s s i b l et or e f r e s hm e t h o df o ri d e n t i f i c a t i o no fs p e c i f i c g e n e s ，o f w h i c he n d o e n z y m ei sn ol o n gu s e dt od e c r e a s el o s so f c d n a s b a s e do na l la b o v ea n dr e c e n t l yp r o g r e s sn o r m a l i z a t i o na n de n r i c h m e n tf o rl o wa b u n d a n tr n a ， t h i ss t u d ya i m st oe s t a b l i s ham e t h o dc a l l e dt r a n s c r i p ts u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n ( t s h ) c o v e t i n ga l l t r a n s c r i p t se x p r e s s i n ga no r g a n t h em e t h o di st ob et e s t e db ya p p l i c a t i o n o v e r c o m eo fd r a w b a c k si n t h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d si se x p e c t e d f o l l o w i n gq u e s t i o n sa r es t u d i e d ，i ) h o wt oo b t a i nt o t a lr n aw i t h h i g hp u r i t y 2 ) h o wo p t i m i z er e v e r s et r a n s c r i p t i o nr e a c t i o n 3 ) h o wt oe s t a b l i s ho fl i g a t i o nr e a c t i o nw i t h n o n e n d o e n z y m e 4 ) h o wt on o r m a l i z el o wa b u n d a n tr n ab yh y b r i d i z a t i o n 5 ) h o wt oo p t i m i z ep c r r e a c t i o nf o re n r i c h m e n t 6 ) h o wt ot e s te f f i c i e n c yo ft s hu t i l i z a t i o n 7 ) a p p l i c a t i o no fi d e n t i f i c a t i o no f o r g a n ss p e c i f i cg e n e sb yt s h s o m em a j o ra c h i e v e m e n t so f t h i ss t u d yi n c l u d e1 ) t h a tp u r i t yo fr n ai s o l a t e db yl i c lw a sh i g h e r t h a nt r i z 0 1 2 ) am i x t u r er e v e r s et r a n s c r i p t i o nr e a c t i o nw a se s t a b l i s h e d 3 ) al i g a t i o nr e a c t i o nf o rt s h a d o p t e rw a ss e t u p 4 ) d e t e r m i n a t i o no fh y b r i d i z a t i o nw i t hr n ao v e r - s a t u r a t i o n 5 ) s e tu par e a c t i o n s y s t e mf o re d n ae n r i c h m e n t 6 ) 4o u to f5g e n e se x p e c t e dw e r ei d e n t i f i e df r o map l a s m i dc a r r i e d6 g e n e s ，an o n t a r g e tg e n ew a sn o tf o u n da se x p e c t e di nt h el i b r a r ym a d eb yt s h 7 ) 10g e n e se x p r e s s i n g i nl e a f sa n ds t e m ss p e c i f i c a l l yw e r ei d e n t i f i e di np o t a t o s o m eo ft h o s ea r ef r o mg e n o m e so fc h l o r o p l a s t a n dm i t o c h o n d r i a a sac o n c l u s i o no ft h es t u d y ，t s hi se s t a b l i s h e d ，w h i c ho v e r c o m e sr o u g h l yd r a w b a c k sp r e s e n ti n c o n v e n t i o n a lm e t h o d s p o s i t i v er a t i o f o r s c r e e n i n gl i b r a r yb yp c ra n d i d e n t i f i c a t i o nr a t i oa r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n v e n t i o n a lm e t h o d s t s hi sp o w e r f u lt o o lf o rs p e c i f i cg e n ei d e n t i f i c a t i o no f c e l l sa n dt i s s u ed i f f e r e n t i a t i o na n do r g a nf o r m a t i o n 1 i f o rt h ef u r t h e rr e s e a r c h ，c o n s i d e r a t i o n sh a v et ob et a k e n 丛f o l l o w i n g ，1 ) d i r e c t e di n d e xh a v et ob e u s e df o ri n s t e a do fi n d i r e c to n et oi n d i c a t el i g a t i o ne f f i c i e n c yo ft s ha d o p t e r 2 ) d u p l e x - s p e c i f i c n u c l e a s e ( d s n ) i sa l l a l t e r n a t i v ef o rs u b t r a c tn o n - t a r g e te d n a i ti sn e c e s s a r yt oc o m p a r ee f f e c t b e t w e e nd s na n dh a e l i lo ns u b t r a c t i o no fn o n t a r g e tc d n a 3 ) a d ds u p e r s c r i p ti i lt of u r t h e ro p t i m i z e t h em i x t u r er e v e r s et r a n s c r i p t i o nr e a c t i o n k e yw o r d s ：g e n ei d e n t i f i c a t i o n ，o r g a nf o r m a t i o n ，n o r m a l i z a t i o na n de n r i c h m e n t ，r n a ，e d n a 1 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：召瑙 时间： 研年f 月罗日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论义的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用f i 同方式在1 i 同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究牛签名：巧墙 导师签名： 诲 时间：聊年月彦日 时间：砷年月少日 宁夏大学硕j ：学 论文 筇亭引占 _ 一i i i i i i ! ，_ ! - 第一章引言 随着后基因组时代的到来，人类基因组计划己由序列( 结构) 基因组学向功能基因组学转移。 功能基因组学是基因组时代的核心和焦点。其所要解决的问题包括如何识别基因组组成元素及注 解重要元素的功能。基因识别是基因组学研究的基础，早在四年前，科学家已经预见到序列爆 炸的大趋势，提出了人类后基因组计划，即在基因组静态的碱基序列逐步搞清楚后，转而对基因 组进行动态的生物学功能的研究。对基因功能的研究包括一个基因在什么组织或器官表达、何时 表达以及基因具体功能是什么。因此，解读序列信息何时何处表达以及对未知功能序列基因 的研究是后基因组时代至关重要的阀题。 高等真核生物的所有生命现象，例如细胞生长、组织或器官形成、恶性转化、特定代谢产物 分泌等都是基因选择性表达的结果，要弄清这些生命现象的分子调节机制，就要对选择性表达的 基因进行分离、克隆、序列分析，然后研究其氨基酸组成，表达产物的结构功能。因此，找到识 别基因功能和特性的方法对于研究生物发育、器官形成等都是必不可少的i 。 基因识别及功能研究是系统生物学研究的基础。系统生物学是在细胞、组织、器官和生物体 整体水，f 研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用，并通过计算生物学来定量描述和预测生 物功能、表型和行为。系统生物学将在基因组序列的基础上完成由生命密码剑生命过程的研究， 这是一个逐步整合的过程，由生物体内各种分了的鉴别及其相互作用的研究到途径、网络、模块， 最终完成整个生命活动的路线图。目前，系统生物学已在预测医学、预防医学和个性化医学中得 到应用，系统牛物学将f i 仪推动生命科学和牛物技术的发展，而且对整个固民经济、社会和人类 本身产生重大和深远的影响。因此，比较和研究识别皋因功能和特性的力法对于2 l 世纪的生物 学发展j 有重人意义。 1 1 器官形成表达基因识别方法 识别器官形成表达基因是研究萸发育或分化分子机理的重要途径之一。识别分化表达基冈的 ，j 法t 要何m r n a 蕴异显示1 2 j ，r n a 指纹( r n af i n g e r p r i n t i n g ) 1 3 i 。限制性酶切片段差异显示 ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n td i f f e r e n t i a ld i s p l a y ，r f d d ) i 引，接i 大l 表达系列( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ， s a g e ) 分析 5 1 ，实时定量p c r ( r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r ( t a q m a n ) ) i 】，抑制消减杂交法 ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) i l0 。，交瓦扣除r n a 差别显乃技术( r e c i p r o c a ls u b t r a c t i o n d i f f e r e n t i a lr n ad i s p i a v ) i t o l 以及d n a 微列阵分析( d n am i c r o a r r a y ) 1 1 2 书j 等。 微阵列虽然- j | 高通量识别口的，但微阵列分析所用的试剂盒及有必设备较为昂贵，另外，用 于设计探针的日的基因j 孚列或同源序列必须l 二j = u ，这是微阵列分析使用的前提，这极大地限制了 j 在器官或器官形成基因的识别研究巾的应卢甘i l 。m r n a 差异显示( m r n a 差显) 技术具自易操 作等优点，但由于假刚件率岛( 7 0 左右 、重复件差等原因，实际应用非常有限。存m r n a 差 异显示技术原理的基础上，出现j ，值得一提的限制性膨切片段筹片显示( r f d d ) 。 r f d d 足m r n a 差异显j ：结合c d n a a f l p 改进的差异显j 系统，r f d d 的特点是崩优先识别 c d n a 序列的限制性内切酶( t a qi 等) 酶切c d n a ，目的c d n a 片段一端连接标识序列，作为引物互 宁疆寸：学硕i 学仲沦之菊一章引占 i - i - l _ i 一一 1 l 补序列进行扩增，另一端连接尽可能覆盖所有可能的c d n a 的探针引物接头( p r o b ep r i m e r ) 。最终 获得高重复性和低假阳性的差显结果，但内切酶t a qi 及以后使用的r s a l 对c d n a 的识别率不足8 0 ，使得部分m r n a 丢失是该方法的严重不足【i o l 。 上世纪六十年代，b a u t z 和r e i l l y 等用消减的方法纯化t 4 噬菌体m g n a t l 。5 1 首次提出核酸消 减( s u b s t r a c t i o n ) 的概念。但实现完全杂交需大量m r n a ，且杂交后克隆低丰度m r n a 困难。核酸 分子杂交动力学研究极大推定了体外分子杂交的运用l 幡吲，d u g u i d 和d i n a u e r 将i i n k e r s i ；i 入到 c d n a ，使c d n a 在杂交循环间进行选择性扩增1 3 “2 0 i ，但如何富集( e n r i c h m e n t ) 和校正 ( n o r m a l i z a t i o n ，又翻译为均一化或平衡化) 低丰度转录子成为了在转录子水平识别器官或器官 形成基因的最大障碍。 通常情况下，正常真核细胞内，总m r n a 的2 0 是高丰度的l o 种左右m r n a ，每种约5 0 0 0 个拷贝，5 0 0 - - 2 0 0 0 种中等丰度的m r n a 占总m r n a 的4 0 一6 0 ，1 0 0 0 0 - - 2 0 0 0 0 种低丰度m r n a 占总m r n a 的2 0 - - 4 0 ，每种约1 1 5 个拷贝，人类大脑中极低丰度的m r n a 约为其总m r n a 的 i 1 0 7 【2 1 1 。由于中等和商丰度c d n a 在文库l l i 重复j h 现，致使随机测序检测文库的过程巾，检测到 表达羞极低转录子的效率非常低：通过叫做c d n a 文库校正( c d n al i b r a r yn o r m a l i z a t i o n ) 或c d n a 校 正的途径，可实现减少高丰度c d n a 重复出现、增加低午度转录子检出率。 较早用于富集和校正低丰度转录子的方法有，羟基磷灰石( h y d r o x y la p a t i t e ) 柱分离单链和 双链c d n a 2 2 - 2 4 j 、限制性内切酶消化舣链c d n a1 2 5 1 、抑制扩增单链c d n a 2 6 - 2 7 1 和扩增质粒文库重 缔合( r e a s s o c i a t i o n ) 1 2 s - 3 j 等；这些方法即不适合于全长m r n a 的富集和校正，也不能富集和校正 无p o l y ( a ) m r n a 之外的其。色 r n a ，如m i c r o g n a 。因核酸杂交动力学的方面的原因，固体介质杂交 获得伞- l 受m r n a 的富集和校正效率不及液相介质1 3 2 - 3 3 l 。 1 2 抑制消减杂交技术 d i a t c h e n k o 等延续了消减的思路，用眄次杂交后进行抑制p c r 的方法，实现了分化特片表达 c d n a 校止利禽集1 0 0 0 倍，并将其叫做抑制消减杂交( s s h ) h o ，c l o n t e c h ( p a l oa l t o ，c a ，u s a ) 将其制成试剂盒，墩名为s s hp c rk i t ，并逐步流行。 s s h l 用形成前后两器官或旃不同处理器官分别分离提取总r n a ，两种r n a 分别绛 o l i g o d ( n 反转录p c r 得到全部表达m r n a 的c d n a ，婀者冉经内切酶酶切，其中一者作为d r i v e r c d n a ，另一。者分两份分装后，各自连接两i ：同的5 接头，分别称为t e s t e r a 和t e s t e r b 。 用d r i v e r 分别与t e s t e r a 和t e s t e r b 完成第一次杂交，根据核酸杂交级动力学，在杂交的变 性和复性过程中，d r i v e rc d n a 簟链问、t e s t e rc d n a 堆链问及d r i v e r 与t e s t e r 簟链间，岛丰度i j 源 单链c d n a 能够较快识别互补，形成同源舣链c d n a 。杂交产物中u 的产物是t e s t e r 中特异出现 的、有5 接头的单链c d n a 。 将d r i v e r 与t e s t e r a 和d r i v e r 与t e s t e r b 杂交反应混合，用过量d r i v e r 继续与之杂交，完成第 二次杂交，在过最d r i v e r 挑力下，进一步饱和与d r i v e r 单链c d n a 劂源的t e s t e r a 和t e s t e r b 单链 c d n a ，形成j i 有单个接头的舣链，第二二次杂交的日的j h 物足使t e s t e r a 和b 中特异出现的、有4 i 同5 接头的单链c d n a 形成双链c d n a 。 2 宁大学硕1 学伊沦史第尊引言 两次杂交中通过无接头与无接头、无接头与单接头、相同单接头单链c d n a 的识别互补形成 双链c d n a ，因正向和反向引物之一无识别的接头序列，这些双链c d n a 不能在其后的p c r 中 形成完整产物：唯有t e s t e r a 和b 中特异出现的、有不同5 接头的单链c d n a 形成的双链c d n a ， 因其正链和负链有5 端有不同的接头，可通过p c r 形成完整产物，这些产物源自分离获得t e s t e r r n a 的器官特异表达的基因。 通过抑制p c r ，无接头、单5 接头和相同5 接头的双链c d n a 不能成为模版d n a ，无完整 p c r 产物。从而被消减和抑制：同时，有不同5 接头的单链c d n a 形成的双链c d n a ，通过p c r 被富集和校正，这是s s h 识别器官特异表达基因的实质所在。 尽管s s h 通过两次杂交和抑制p c r 达到了低丰度转录子校正和富集的目的，但其存在以下不 足，极大地限制了方法的应用：1 ) 以o l i g o d t 为引物反转录p c r 获得其后用于杂交的c d n a ，因 此，未能覆盖不含p o l y ( a ) 的其它r n a ( 如m i c r o r n a 等) ，从而造成其丢失。2 ) 使用的内切酶无 法保证在全部种类的c d n a 上有酶切位点f 2 6 1 ，未连接接头的c d n a 在实验中丢失，损失了可能的目 的c d n a 。3 ) t e s t e r 与d r i v e r 问目的c d n a 浓度比( r ) 影响富集程度，s s h 不能识别r 20 l i c l 法所舟 r n a o u 2 驯o d ，s o 甲均侑为】9 3 6 ，l i c i 2 32 三种连接体系比较结果 为了研究a m v 反转录反席条件和体系的可靠性，以便于以纯化所得m r n a 为模板o l i g o d ( t ) 为引物直接反转录得到经过纯化的单链e d n a ，测起始m r n a 及纯化后单链e d n a 的浓度，计 算r n a c d n a 的j 衣虞比值，以此作为阳性对照，咀上再次捌定重复三次阳性对照结果蜘表2 - 2 所示。 按照冉法巾的实验设计建立三种不同r n a 加接头连接体系用蚓一反转录酶僻化反转录 反应，反转录产物用r n a 驿h 消化并纯化后获得单链e d n a ，分别测连接反应前起始r n a 及其 纯化后的c d n a o d 值计算两者的浓度和r n a c d n a 的浓度比值，以此作为问接衡簧。种连接 体系的连接效幸的指标。 2 - 2m r n a 与e d n a 白勺浓度 m p g h j l ) i9 0 0 测定和汁算的m r n a c d n a 平均值为】0 3 9 这表明尽管存在实验攫差，但此反转录反应体 系和举什r ，以o l i g o d ( n 为引物的m r n a 的反转录效率接近干1 0 0 该结果嗣叶表明州 r n a c d n a 浓度比值作为栏头连接的悱封燃青一定的町靠性。 在此条件下建的三种琏摇体系计算的r n a c d n a 的浓度比值站架袁叫，t 4d n a 琏摇胁 娃接体系艟忧，t d t 转移痹聚核甘酸形成们同质木端体系敞，p o l y ( a p o i y m e r a s e 扶褂的质 p o l y ( a ) 末端体系最差( 数据未提供) ， 2 33 三种反转录酶反转录效率比较结果 l q 浓胜的r n a 特取，份，分别i i a m vm m l vs s l l 鼬臣转录n 得j e c d n ae d n a 、 c d n a3 ， he p 竹中傲次n f 柙同体积m e d n a l 、c d n a 2 、e d n a 3 ，先分混合称为c d n a 混 慢混台物的站终体e ：。j c d n a l 、e d n a 2e d n a 3 的请 1 1 ，然后分别以c d n a l 、e d n a ，c d n a 3 ， c d n a i 鼢模扳tl h o l i g o d ( t ) 和37 随即引物为0 i 物做p c r ，经io 昧脂蒋凝腔电潍得剑如h2 - 2 的结粜。 34 目2 - 2p c r r 镕c d n a 白可1 琼# 口自女目m la n c i - p c r r 月l d n a i l a n e2 ：p c r me d n a * l a n e3 + p c r r 口c d n a 2 i _ 4p c r r me d n a 3 宁疆大学硕l 学伊论文第二幸转袋纲e d n a 获得研究 由图2 2 可知，以不同反转录酶反应产物为模板，p c r 扩增产物大小差距明显，其中以a m v 、 m m l v 、s s l l 三种反转录酶反转录产物混合为模板，经过p c r 扩增所得产物，能包括来自单个 反转录酶所得最终产物，因此，为了保证能使转录组尽可能全部r n a 被转录，减少低丰度r n a 的损失，本研究采用以单个反转录产物混合为模板，进行下一步的p c r 扩增，简称混合反转录 体系。 2 4 小结 本章研究得到以下结果：i ) 依据两种不同r n a 分离方法所得r n a 电泳图谱及数据分析的 比较结果，得到了l i c i 法分离的r n a 纯度高于常规t r i z o l 方法；2 ) 通过计算r n a c d n a 的浓 度比值间接衡量三种连接体系的连接效率，建立了基于t s h 接头的连接体系；3 ) 利用p c r 扩增 技术间接检测三种反转录酶的反转录效率，建立了效率高于常规方法的混合反转录体系。 本部分研究优化了从总r n a 的提取到转录组c d n a 获得的每一步反应，基本确保了高纯度 r n a 的获得：t s h 接头连接体系的建立消除j ，为连接头而使用内切酶所惜来的1 i 足，提高了获 得全长c d n a 的效率；混合反转录体系的建立提高了反转录的效率，这些反应体系的建：记和优化 为全转录组c d n a 获得研究奠定基础。 1 2 宁夏大学硕f j 学忙沦文 箱i 争目的c d n a 校j ：和高蕈研究 第三章目的c d n a 校正和富集研究 目的e d n a 的校正和富集是研究识别器官形成表达基闪的重点，本部分研究包括两个研究内 容，一是过饱和杂交方法比较，目的旨在确定效率更高的目的e d n a 校正方法：二是比较p c r 反应条件和循环数，确定目的e d n a 富集的适宜条件。 3 1 实验材料 3 1 1 菌株、载体 菌株j m l 0 9 3 1 2 试剂与仪器 除2 1 2 所述的外，本实验还用到以下试剂与仪器：d n a s e l 、h a e1 i i 购i ! l t a k a r a 公司：r n a s e a 购白北京鼎围生物公司；p c r 试剂：d n t p ( 2 5m m o l l ) 、1 0 l ap c rb u f f e r 、l at a q 酶( 5 u i i l ) 、 m y 上下游引物( 1 “1 ) 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：p c r 回收试剂盒g e n e l u t e t m p c rc l e a n u pk i t 购自s i g m a 公司；p g e m te a s y 载体购i 刍p r o m e g a 公司：氨苄青霉素( a m p ) 购自上 海求德乍物化工公司：胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 、酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 为o x o i d 产品；琼脂粉为北 京化学试剂公司产品；琼脂糖为上海化学试剂公司产晶：n a c i 为北京化学试剂公司产品；d l 2 , 0 0 0 m a r k e r 、i p t g 、x g a l 及低熔点琼脂糖均购l ，i t a k a r a 公司。 3 2 实验方法 3 2 1 杂交反应 ( 1 ) c d n a 过饱和方法的杂交反应体系 c d n a 过饱和办法的杂交反应是用过量的c d n a 与r n a 进行杂变，能与c d n a 配对的r n a 在c d n a 过饱和的情况下都将肜成r n a c d n a 杂链，所以剩下的r n a 就是u 的r n a 即在另一 器官或细胞中未有的。用器官或细胞的过耸的c d n a 与另器官或细胞的r n a 进行杂交，体 系如卜： r n a 2 o p l c d n a 4 0 p l 1 0 p c rb u f f e r2 5 u l = b d d h 2 0 甭 2 5 p l 反应条件：9 4 c2m i n ：6 0 c5m i n ： ( 2 ) r n a 过饱和方法的杂交反应体系 5 0 1 5m i n ：降垒常温4 c 保存，反应两个循环。 1 3 宁砭大学硕l j 学伊沦之第i 聋目的c d n a 校j f 和高袋研究 r n a 过饱和方法的杂交反应是用过量的r n a 与c d n a 进行杂交，能与r n a 配对的c d n a 在r n a 过饱和的情况下都将形成r n a c d n a 杂链，所以剩下的c d n a 就是目的c d n a 即在另一 器官或细胞中未有的。用一器官或细胞的过量的r n a 与另一器官或细胞的c d n a 进行杂交，体 系如砥 c d n a2 0l a l r n a 4 0 i _ t l 1 0 x p c rb u f f e r 2 5 ) 1 l 幸b d d h 2 0 至 2 51 a l 反应条件：9 4 2m i n ；6 0 1 25r a i n ；5 0 1 5r a i n ；降至常温4 保存，反应两个循环。 3 2 2 目的c d n a 的获得与纯化 3 2 2 1c d n a 过饱和方法的目的c d n a 的获得与纯化 ( 1 ) d n a s e i 消化杂交反应产物 杂交反应产物为r n a 、c d n a 、r n a c d n a ，其中r n a 即为特异r n a 。用d n a s e l 消化c d n a 和r n a c d n a 。 在微量离心管中配置下列反应液，全量5 0 1 a l ； r n a 2 0 - 5 0 肛g 1 0 d n a s eib u f f e r 5 0 肛l d n a s ei ( r n a s e f r e e ，5 u t a l ) 2 0 0 l r n a s ei n h i b i t o r ( 4 0u r t l ) 0 5 i l l 卒f d e p ch 2 0 全 5 0 1 a l 3 7 反应2 0 3 0m i n ： 加入5 0l a l 的d e p ch 2 0 ； 加入1 0 0i l l ( 等量) 的苯酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分混匀； 离心，墩卜层( 水层) 移罕5 卜一微量离心管| 1 y j l l a 1 0 0 i l ( 等量) 的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，充分混匀： 离心，取上层( 水层) 移全另微景离心管中； 加入1 0 肛l ( i i o 量) 的3 mn a o a c ( p h 5 2 ) ； 加入2 5 0p l ( 2 5 倍殳) 的冰尤水乙醇，2 0 ( 2 放置3 0 6 0m i n ： 离心回收沉淀，用7 0 的冷乙醇清沈沉淀，真空l ：燥，加适量d e p ch 2 0 溶解。 ( 2 ) t 4d n al i g a s 存r n a 末端) j 1 m y 接头反应 体系l 司2 2 2 2 的( 3 ) ( 3 ) 目的r n a 的反转录反应 体系同2 2 2 3 1 4 宁理，：学硕l j 学伊论文第巷 | 的c d n a 校i f 和南袋研究 ( 4 ) 用k n a s ea 消化混合物中的r k n a 和t r n a 以1 0 8 l 反应体系中加入l p l r n a s e a 计算，消化混合物中的r r n a 和t r n a 。 ( 5 ) 用r j q a e sh 消化r n a c d n a 中的r n a “嘻； 体系同2 2 3 ( 6 ) 在反应体系中加入1 1 0 量的3m o ln a a c ( p h 5 2 ) 和2 5 倍体积的冰无水乙醇，- 2 0 ( 2 放置3 0 - 6 0 r a i n ，离心回收沉淀，干燥，加适量t e 溶解c d n a 。 ( 7 y r 4d n al i g a s e 在c d n a 末端加m y 接头反应 体系同2 2 2 2 的( 3 ) 3 2 2 2r n a 过饱和方法的目的c d n a 的获得与纯化 ( 1 ) 用r n a s ea 消化杂交反应产物 杂交反应产物为r n a 、c d n a 、r n a c d n a ，其中c d n a 即为特异c d n a 。以1 0 p l 反应体系 中加入l “lr n a s ca 计算，消化混合物中的r n a 。在反应体系中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇 ( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分混匀后于4 下1 2 ，0 0 0r p m 离心1 5 r a i n 。去上清，加入1 1 0 量的3 m o l n a a c ( p h 5 2 ) 和2 5 倍体积的冰无水乙醇一2 0 放置3 0 6 0r a i n ，