（生物物理学专业论文）功能化磁性微粒的制备、表征和应用.pdf

_ 、 囊 p r e p a r a ti a b s t r a c t m a g n e t i cp a r t i c l e s w i t hm a g n e t i s ma n ds p e c i a ls t r u c t u r ea r ec o m p o s e do f p o l y m e ro rf u n c t i o n a lm a t e r i a l s i tc a nn o to n l yb ee n d o w e dw i t hf u n c t i o n a lg r o u p so n s u r f a c eb yc o p o l y m e r i z a t i o no rs u r f a c em o d i f i c a t i o n ，b u ta l s ob es e p a r a t e dq u i c k l y a n de a s i l yf r o mm i x t u r e sb ye x t e r i o rm a g n e t i cf i e l d t h e r e f o r e ，t h ef u n c t i o n a l m a g n e t i cp a r t i c l e sh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nv a r i o u sf i e l d s ，s u c ha sm a g n e t i c m a t e r i a l ，b i o t e c h n o l o g y , b i o m e d i c a le n g i n e e r i n g ，o r g a n i cc h e m i s t r ya n dc a t a l y s t s ，e c t o v e rt h ep a s tf e wy e a r s ，t h ep r e p a r a t i o no fv a r i o u sm a g n e t i c p a r t i c l e sa n dt h e i r a p p l i c a t i o n si nd i f f e r e n tf i e l d sh a sb e c o m eo n eo f t h er e s e a r c hh o t s p o t s p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no ff u n c t i o n a lm a g n e t i cp a r t i c l e sa let h ek e y s t o n eo f t h i st h e s i s i nt h i sw o r k , m a g n e t i co d sp a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db a s e do nt h r e e s t e p r e a c t i o n s i n c l u d i n gc o p r e c i p i t a t i o n ，s o l - g e lp o l y m e r i z a t i o na n da l k y l a t i o n t h e c h a r a c t e r i z a t i o no f t h ep r e p a r e dp r o d u c tw a ss t u d i e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e a n df o u r i e r - t r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o m e t r y t h ep a r t i c l e sw e r eu s e da sm a g n e t i c s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( m s p e ) a d s o r b e n tf o rt h ee x t r a c t i o no ff a t - s o l u b l ev i t a m i n si n f r u i tj u i c e m i l kb e v e r a g e t h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o na n de f f i c i e n c yo ft h ep a r t i c l e sf o r f a t - s o l u b l ev i t a m i n sw e r ei n v e s t i g a t e d b yc o u p l i n gm s p ew i t hc a p i l l a r y l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , l o wc o n c e n t r a t i o n so ff a t - s o l u b l e v i t a m i n si nf r u i tj u i c e m i l k a b s t r a c t b e v e r a g ec a nb ed e t e c t e dw i t h o u tt h ei n t e r f e r e n c ef r o mo t h e rs u b s t a n c e si nt h es a m p l e m a t r i x k e yw o r d s ：m a g n e t i co c t a d e c y l s i l a n ep a r t i c l e s ；m a g n e t i cs o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ； c a p i l l a r yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；f a t s o l u b l ev i t a m i n s 目 录 目录 摘要i a b s t r a c t ii 目录iv 第一章绪论1 1 1 磁性微粒的研究进展1 1 1 1 磁性微粒的概述1 1 1 2 磁性微粒的结构1 1 1 3 磁性微粒的特性2 1 2 磁性微粒的制备3 1 2 1f e 。0 。磁流体的制备3 1 2 2 使用硅烷化试剂对f e 。0 进行表面修饰3 1 3 磁性微粒的应用9 1 3 1 酶的固定化9 1 3 2 核酸的分离和富集1 0 1 3 3 靶向药物1 1 1 3 4 肿瘤热疗1 2 1 3 5 免疫分离和检测1 2 1 4 本课题的研究思路1 3 目录 第二章磁性si0 。微粒的制备和表征15 2 1 引言15 2 2 实验部分。15 2 2 1 实验试剂15 2 2 2 主要仪器和设备16 2 2 3 磁性si0 ：微粒制备原理和主要流程16 2 2 4 磁性si0 。微粒的表征18 2 ，3 结果与讨论1 9 2 3 1 磁性si0 ：微粒形态19 2 3 2 磁性sio ：微粒的红外光谱2 0 2 3 3 磁性si0 ：微粒的磁滞回线。2 0 2 4 结论。2 1 第三章磁性o d s 微粒的制备和表征2 3 3 1 引言。2 3 3 2 实验部分2 3 3 2 1 实验试剂2 3 3 2 2 主要实验仪器和设备2 4 3 2 3 磁性o d s 微粒的制备原理和主要流程2 4 3 2 4 磁性o d s 微粒的表征2 5 3 3 结果和讨论2 5 3 3 1 磁性o d s 微粒的形态2 5 3 3 2 磁性o d s 微粒的红外光谱2 6 v 目录 3 3 3 磁性o d s 微粒的磁滞回线2 7 3 4 结论2 8 第四章磁性o d s 微粒的应用2 9 4 1 引言2 9 4 2 实验部分3 0 4 2 1 实验试剂3 0 4 2 2 主要实验仪器3 0 4 2 3 磁性固相萃取3 1 4 2 4 真实样品处理3 1 4 2 5c l c 分析3 i 4 3 结果与讨论7 。3 1 4 3 1 标准品的c l c 分离条件的优化3 2 4 3 2 磁性固相萃取的吸附和洗脱条件的优化3 4 4 3 3 真实样品分析和定量3 7 4 4 结论3 9 第五章全文总结和展望4 0 5 1 存在的问题和总结4 0 5 1 1 总结4 0 5 1 2 存在的问题4 0 5 2 展望4 1 参考文献4 2 致谢5 4 v i 目录 攻读硕士学位期间已发表和待发表的论文5 5 功能化磁粒的制备、表征及应用 第一章绪论 1 1 磁性微粒的研究进展 1 1 1 磁性微粒的概述 磁性微粒( m a g n e t i cp a r t i c l e s ，m p s ) 作为一种磁性分离载体，是从上个世纪 七。i 年代开始发展起来并已应用于生物学、医学、材料学等各个领域的新型多功 能试剂。磁性微粒一般由磁核与其他基质复合而成。由于磁核对外磁场的响应， 磁性微球可在磁场中做定向移动。利用这一性质可以对m p s 进行定位，或将m p s 从周围介质( 多为液体) 中迅速分离出来；也可以变换移动磁场，借助m p s 对 研究对象施力。由于m p s 的表面多为可修饰表面，可与各种生物活性物质( 如 抗体、抗原、酶、受体、核酸等) 偶联，这些生物活性物质被同定于m p s 上之 后可以在反应介质中进一步识别相戍的抗体、配体、底物、核酸，从而达到分离 或枪测的日的。冈此，m p s 集载体功能和分离功能于一身，利用物理学、化学及 生物医学原理，将许多繁琐复杂的步骤简单化，使传统测试或分离的周期大大缩 短，在生物医学( 临床诊断、酶标、靶向药物) 、细胞学( 细胞标记、细胞分离) 和生物t 程( 酶的同定) 等领域都有着广泛的应用前景。 1 1 2 磁性微粒的结构 从目前研究的情况看，磁性微粒一般为核壳式结构( 如图l a ，b 所示) ，由磁 性物质的超细粉术组成核，功能高分子材料组成壳层( 见图1 i a ) ；或者将功能高 分子材料作为核，磁性材料作壳层( 见图1 i b ) ；也可做成夹心结构，即外层、内 层为功能性高分子材料，中问层为磁性材料( 见图1 1 c ) ；除此之外，还有混合型， 就是多核结构，由磁性材料和功能性材料混合而成( 见图1 1 d ) 功能化磁粒的制备、表征及应用 o oo ab 九苌n ：篇兰- 洳k a go lh l 姥l 廿r l 黏s e移 戮m a g n e t i cm a t e r i a l s a c o r e s h e l l ；b s h e l l c o r e ： c m u l t i p l el a y e r ；d m i x u p 图1 1 磁性微粒的分类 f i g u r el 一1t h ec l a s s i f i c a t i o no fm a g n e t i cp a r t i c l e s 1 1 3 磁性微粒的特性 磁性微粒主要有以下特性： ( 1 ) 表面效应和体积效应：表面效应是指超细微粒表面原子或分子具有很 大的化学活性，其表面能随着粒径的变小而增加：体积效虑是指物质的带电能级 随着超细微粒包含的原子数的减少而增加，从而使物质的物理性质冈能级间歇的 4 、= 连续而发生异常。以上两种效应具体表现为：随着微粒比表面积的增大，微粒 官能团密度增大，因而达到吸附平衡的时问缩短，粒子的稳定性提高； ( 2 ) 磁效应：磁性微粒可以在外磁场作用下方便地进行富集分离和磁性导 向。当磁性微珠的粒径小于3 0n m 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强的磁性； 去掉外磁场时磁性很快消失，从而磁性微粒能够在磁场中不被永久磁化； ( 3 ) 生物相容性：磁性微粒应用在生物工程、尤其是在生物医学t 程时， 必须具有良好的生物相容性。例如，多数生物高分子如多聚糖、蛋白质、脂类具 有良好的生物相容性，在人体内可降解，不与人体组织器官产生免疫抗原性。这 种性质在靶向药物中尤其霞要； ( 4 ) 物理化学特性：磁性微粒的物理化学性质稳定，具有一定的机械强度 和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其内含的磁性物质 不易被氧化，磁性能彳i 易下降； ( 5 ) 功能基特性：磁性微粒表面具有多种反应性的功能基团，如o h 、 2 功能化磁粒的制备、表征及应用 c o o h 、- n h 2 等，以连接具有生物活性的物质。 1 2 磁性微粒的制备 1 2 1f e 3 0 4 磁流体的制备 日前f e 3 0 4 磁流体的制备方法有化学共沉淀法【1 训、氧化沉淀法【5 卅、中和沉 淀法嗍、水热反应法嘲和微波辐射法等。其中应用得最广泛的是化学共沉淀法 和氧化沉淀法【l l 】。 1 2 1 1 化学共沉淀法 化学共沉淀法是将铁盐和亚铁盐按一定比例配成溶液，选用适当的碱性沉淀 剂( 如氨水、氢氧化钠等) 进行共沉淀反应，其反应式为： f e 2 + + 2 f e 3 + + 8 0 h 。= f e 3 0 4 【+ 4 h 2 0 从反应式来看，反应物的摩尔计量比为f e 2 + f e 3 弋l 2 时可以得到磁性 f e 3 0 4 微粒。但是，由于在制各过程中f e 2 + 容易被氧化成f e ”，因此在实际操作中 f e 2 + 应该稍微过量。操作必须在一定的p h 值下进行，整个过程需要通入氮气保 护。使用化学共沉淀法制备的f e 3 0 4 磁性微粒的粒径一般都可以控制在一个数量 级上( 2 1 5n m ) 1 1 2 】，具有很好的超顺磁性，能够广泛地应用于各种生物样品的 分离和富集。 1 2 2 2 氧化沉淀法 氧化沉淀法是将亚铁盐溶液和碱性溶液混合生成f e ( o h ) 2 ，然后通入空 气或者其他氧化剂使部分亚铁离子氧化生成f e ”。其反应式为： f e 2 + + 2 0 h 。= f e ( o h ) 2 6 f e ( o h ) 2 + 0 2 = 2 f e 3 0 4 卜卜6 h 2 0 采用氧化沉淀法制取的f e 3 0 4 磁性微粒平均粒径及磁性能变化范围很大。通 过升高f e ( o h ) 2 氧化温度和减小f e ( o h ) 2 氧化速率可使所制取的f e 3 0 4 磁性微 粒的平均粒径增大。随着f e 3 0 4 磁性微粒平均粒径的增大，磁性能相应提高。 1 2 2 使用硅烷化试剂对f e 3 0 4 进行表面修饰 功能化磁粒的制备、表征及应用 当前采用硅烷化试剂对f e 3 0 4 表面进行修饰主要有二种方法：( 1 ) 直接使用 带有功能基团的硅烷化试剂偶联到含羟基的磁性粒子表面；( 2 ) 采用溶胶凝胶 法先在磁性微粒的表面包覆层二氧化硅，然后再利用二氧化硅表面的硅羟基与 其他的硅烷化试剂偶联；( 3 ) 用微乳液技术来制备硅烷化试剂修饰的f e 3 0 4 磁性 微粒。 1 2 2 1 硅烷化试剂直接包覆 该方法直接利用磁性粒子表面的羟基与带有活性功能基团的硅烷化偶联剂 进行反应，使硅烷化试剂与磁性微粒共价结合，制备出带有某一活性基圈的磁性 微粒。h u n g - , 等 1 3 】使用硅烷化试剂n ( p 氨乙基) 吖氨丙基三甲氧基硅烷( a p a p t ) 对f e 3 0 4 磁性粒子进行修饰，制备出的磁性微粒再与c u 2 + 结合，然后应用于特定 蛋白质的分离和富集。m a 等f 1 4 】使用硅烷化试剂3 氨丙基三乙氧基硅烷( a p t s ) 与f e 3 0 4 磁性粒子反应生成带有氨基活性基团、平均粒径为7 5n m 的磁性微粒， 该磁粒可大大增加酶的固定化效率。 严向阳等【1 5 】用a p t s 直接与f e 3 0 4 反应，制备了超顺磁性、表面修饰一n h 2 、 粒径为3 5p m 的功能化磁性微粒，带有氨基的磁性微粒进一步与戊二酸酐反应， 可转化为一c o o h 修饰的功能化磁性微粒。其原理如图1 2 所示： 一 。争n h ，2 ，一 f + 蚤0 一一o o ： 图1 2 磁粒表面氨基化及氨基转化为羧基的过程示意刚b 1 f i g 1 - 2s c h e m eo f t h es i l a n i z a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o no ff e 3 0 4p a r t i c l e sf r o ma m i n o t e r m i n a lt oc a r b o x y lt e r m i n a l | 1 5 1 4 傀 锨i l 瓣 磷洲 功能化磁粒的制备、表征及应用 直接使用硅烷化试剂修饰磁性微粒操作简便，表面功能基团含量高，但是由 于f e 3 0 4 磁性粒子本身的粒径太小，制备的磁性微粒容易发生团聚现象，形成 2 0 0 - 4 0 0a m 左右大小的团簇，且微粒的粒径大小不易控制。 1 2 2 2 溶胶凝胶法( s t 6 b e r 法) 采用溶胶凝胶法先在磁性微粒的表面包覆一层二氧化硅，s i 0 2 表面含有硅 羟基容易被其他的活性基幽修饰。通过改变制备过程中硅烷化试剂四乙氧基硅烷 ( t e o s ) 的加入量和水解反应的时间，可以很好地控制磁性微粒的平均粒径的 大小【j 6 d s 。 溶胶凝胶法是日前最常用的一种s i 0 2 包覆法，是s t s b e r 1 9 1 于1 9 6 8 年提出的。 其特点是操作简单、反应条件温和、成奉低和不用表面活性剂等。采用溶胶凝胶 法制备磁性微粒是通过t e o s 将s i 0 2 包覆到f e 3 0 4 磁性微粒表面【2 3 l 。反应的 过程中首先将f e 3 0 4 磁| 生微粒与含有水、酒精和t e o s 的混合溶液混合，然后在 超声波震荡水域中将磁性微粒分散，接着边搅拌边缓慢地加入氨水，反应1 2 小 时左右即可将s i 0 2 成功包覆在f e 3 0 4 磁性微粒表面。通过控制一些反应参数可 以达到控制s i 0 2 包裹厚度的日的，例如氨水的浓度以及t e o s 与水的比例等。 图1 3 给出了通过调整t e o s 的加入量制备出不同粒径的磁性微粒的透射电镜 图。 图1 3 包覆彳i 同厚度的s i 0 2 的磁性微粒的电镜图 f i g 1 - 3t e mi m a g e so f i r o no x i d en a n o p a r t i c l e sc o a t e dw i t hv a r i o u st h i c k n e s s e so f s i l i c a s h e l l s t s i 5 功能化磁粒的制备、表征及j 衄用 图2 中a 、b 、c 图是制备磁性微粒过程中分别加入1 0 、6 0 和1 0 0 0m gt e o s 所得到的微粒的透射电镜图，可以看出随着t e o s 量的增加，磁性微粒的体积增 大。图d 是表面均匀包覆6n m 厚度的s i 0 2 壳层的磁性微粒高分辨率透射电镜图。 c h i a n g 纠2 4 】采用溶胶凝胶法制备f e 3 0 4 磁性微粒，然后成功将其用于细菌细 胞内超纯质粒d n a 的提取，与传统方法相比具有时间短、产量大、纯度高的特 点。l u 等【2 5 】对溶胶凝胶法进行改进，首先用四甲基氧氧化胺( t m a ) 使f e 3 0 4 磁性微粒形成胶体溶液，然后加入硅酸钠在碱性条件下在f e 3 0 4 磁性微粒表面包 覆s i 0 2 薄层，接着加入酒精和氨水使f e 3 0 4 磁性微粒发生团聚，最后加入t e o s 在团聚的f e 3 0 4 磁性微粒表面成功包覆一层s i 0 2 ，其过程如图1 4 所示： n a ，s i 0 ，t m a _ | _ = _ - 一 p l l = l0p e p t i z e d f e 3 0 4 w i t ht h i n f e 3 0 | n a n o p a r t i c l e s i 0 2l a y e r a g g r e g a t i o n f e 3 0 4 s i 0 2 n a n o p a r t i c l e s 图1 4 核壳型f e 3 0 4 s i 0 2 磁性微粒制备过程示意图嘲 f i g 1 - 4s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f t h es y n t h e t i cp r o c e s so ff e 3 0 ds i 0 2c o r e s h e l l n a n o p a r t i c l e s l 2 5 l 1 2 2 3 微乳液法 微乳液法是使用两种互一i 相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成乳液， 6 功能化磁粒的制备、表征及应用 在微泡中经成核、聚结、团聚，热处理后得到纳米粒子，用此法得到的纳米粒子 单分散性和界面性好，其分散相是均匀的纳米级液滴。根据连续相和分散相的成 分，可分为水包油( o w ) 型即正相微乳液和油包水( w o ) 型即反相微乳液【2 6 1 ， 亦被称为反胶束微乳液。 s h e n 等【2 7 1 使用正相微乳液法成功合成中空型f e 3 0 4 磁性微粒，旨先将有机 溶剂环已胺加入到分散有磁性微粒的水相中，经过搅拌形成微乳液，环已胺液滴 表面包覆一层f e 3 0 4 磁性微粒，然后使用溶胶凝胶技术再包覆一层s i 0 2 ，最后制 备出含有直径为3 0 0 4 0 0l l m 左右中空核、4 0r i m 左右s i 0 2 壳层的超顺磁性f e 3 0 4 磁性微粒。其制备过程如图1 5 所示： m a g n e t i ch o l l o w s i l i c am i c r o s p h e r e 图1 - 5 正相微乳液法制备f e 3 0 4 磁性微粒1 2 7 】 f i g 1 - 5s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f t h en o r m a lp h a s em i c r o e m u l s i o np r o c e s sf o rt h es y n t h e s i s o ff e 3 0 4 m a g n e t i cm i c r o p a r t i c l e s | 2 7 1 功能化磁粒的制备、表征及应用 反相微乳液法又称为反胶束微乳液法，是最近发展起来的一种制备纳米粒子 的胶体化学方法，在纳米材料学、纳米化学等方面发挥着越来越重要的作用 2 8 - 3 0 】。 反相微乳液法的反应在反胶束提供的微环境中进行，条件温和，操作简便，粒子 大小和粒径可以通过改变实验条件加以控制【3 l 】。y a n g 掣3 2 】应用反胶束微乳液法 成功制备出具有生物活性、物理稳定性、纳米粒径等优良特性的f e 3 0 4 磁性微粒。 这种微粒具有很大的比表面积，其表面具有直径约为1 5n m 的小孔，能够使很 多生物大分子渗透进去，成为很多生物大分子的良好载体，所制备的磁性微粒成 功地应用于酶的同定化和免疫检测。 l e e 等【3 3 】报道了使用w o 反相微乳液法制备包覆二氧化硅的f e 3 0 4 磁性微 粒的过程，如图1 6 所示： 图嗲围 r e v e r s em l c e l l e| m i x t u r eo fn a n o p a r t i c l e s l l ( w a t e r - i n - o i l ) l a n de x c o s sr e a c t r d s i 图i - 6 反相微乳液法制备_ 二氧化硅磁性微粒示意卧3 3 】 f i g 1 - 6s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h es y n t h e s i so f u n i f o r m l ys i z e ds i l i c a c o a t e dm a g n e t i t e n a n o p a r t i c l e su s i n gr e v e r s em i c r o e m u l s i o nm e t h o d p 3 1 何晓晓等【3 4 】采用化学沉降法和油包水反相微乳液方法制备了以f e 3 0 4 为核、 s i 0 2 为外壳的超顺磁性硅壳磁纳米颗粒。通过将生物素标记的单链寡聚核苷酸探 针修饰在纳米颗粒的表面，构建了一种具有超顺磁性的d n a 纳米富集器。t a r t a j 等【3 5 】在w o 反相微乳液环境中通过水解t e o s 的方法成功制备了半径为2 0n m 左右的s i 0 2 f e 3 0 4 磁性微粒，其电镜图如图1 7 所示： 8 功能化磁粒的制备、表征及应用 图1 7s i 0 2 f e 3 0 4 磁性微粒结构电镜图1 3 5 】 f i g 1 7t y p i c a lt e mm i c r o s t r u c t u r e o fs i 0 2 f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s 3 5 】 1 3 磁性微粒的应用 磁性微粒作为一种新型的功能材料已经得到了广泛的研究，其巨大应用潜力 引起了各国研究者的高度关注。硅烷化试剂修饰的f e 3 0 4 磁性微粒具有很好的磁 导向性、生物相容性和功能基特性等特点。通过对硅烷化试剂修饰的磁性微粒的 表面进一步进行修饰，可以结合各种功能分子，如酶、抗体、核酸、金属离子和 细胞等，因此硅烷化试剂修饰的磁性微粒在酶的同定化、核酸的分离和富集、靶 向药物、肿瘤热疗以及免疫分离和检测等领域有着广泛的应用前景。 1 3 1 酶的固定化 酶的固定化是指通过物理吸附、化学结合或者利用生物亲和性等方法使酶固 定到一定的载体上，从而达到提高酶的稳定性和回收利用的日的。硅烷化试剂修 饰的f e 3 0 4 磁性微粒作为酶同定化的载体具有以下优点：( 1 ) 加载量大，因为磁 性微粒具有很大的比表面积，并且s i 0 2 表面具有大量微小空穴，可以使很多生 9 功能化磁粒的制备、表征及应用 物大分子渗透到其中；( 2 ) 同定酶的种类多，冈为s i 0 2 表面含有的硅羟基是一 种活性基团，很容易被其他的化学试剂修饰，从而带上各种彳i 同的基团，用于各 种不同酶的同定化：( 3 ) 易于酶、底物和产物的分离回收，操作简易；( 4 ) 良好 的生物相容性和亲水性，可以提高酶的稳定性和催化效率。 k o b a y a s h i 等人【3 6 】制备出l o 1 5r i m 的超细f e 3 0 4 微粒，然后用n ( 2 氨乙 基) 一、n ( 6 氨己基) 一、n ( 4 氨丁基) 3 氨丙基三甲氧基硅烷对f e 3 0 4 微 粒进行硅烷化处理，然后同定化嗜热菌蛋白酶。y a n g 等【3 7 1 用反胶束微乳液法制 备的f e 3 0 4 磁性微粒成功应用于过氧化氧酶的同定化，同定化之后的酶具有良好 的反应活性和很高的催化效率，并且对于温度和p h 等物理化学条件的改变具有 长期的稳定性。程凡亮等【3 8 】采用正硅酸乙酯与n ，( p 氨乙基) 氨丙基三乙氧基 硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，一步法制备了氨基化的磁性微 粒，此微粒经戊二醛处理后，采用共价法同定木瓜蛋白酶，同定化酶的热稳定性、 p h 耐受性和贮存稳定性都明显高于游离酶。l i u 等【3 9 1 用包覆s i 0 2 的f e 3 0 4 磁性 微粒同定小牛血清蛋白( b s a ) ，结果表明用磁性微粒作为载体可以大大增加同 定化酶的加载量。z h a n g 等f 4 0 ，4 l 】通过戊二醛将漆酶( 1 a c e a s e ) 固定到包覆s i 0 2 的f e 3 0 4 磁性微粒上，发明了能够用于测定对苯二酚( h y d r o q u i n o n e ) 和儿茶酚 ( c a t e c h 0 1 ) 的生物传感器。 1 3 2 核酸的分离和富集 目前磁性微粒在核酸的分离和富集中发挥着越来越重要的作用。用硅烷化试 剂修饰的磁性微粒分离富集核酸具有以下优点：( 1 ) 利用磁性微粒的超顺磁性 可以在外界磁场的作用下迅速达到对核酸的分离富集，与电泳等传统方法相比更 加简便、快速。( 2 ) 硅基质的磁性微粒表面带有大量亲水性的羟基基团，该功能 基团的亲水性质可以使非特异性的疏水作用力最小化，从而提高分离的特异性和 核酸的纯度。( 3 ) 表面的亲水基团很容易被其他的硅烷化试剂修饰，从而带上各 种不同的功能型基团，应用范同大大增加。( 4 ) 硅基质的磁性微粒表面具有很多 纳米级孔穴，具有很大的比表面积，使核酸的分离效率提高。 c h i a n g 等【2 4 1 用溶胶凝胶法制备出s i 0 2 包覆f e 3 0 4 磁性微粒，将其用于细菌 1 0 功能化磁粒的制备、表征及应用 细胞超纯质粒d n a 的提取分离，结果表明使用此法分离d n a 与传统方法相比 具有省时、产量大、纯度高等特点。x i e 等【4 2 】将硅烷化试剂修饰f e 3 0 4 磁性微粒 应用于人类血液染色体d n a 的提取，大大简化了d n a 分离的程序，并且具有 很好的重现性。何晓晓等【4 3 j 采用正硅酸乙酯与n ( p 氨乙基) 吖氨丙基三乙氧 基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，制备了大小均匀的氨基化二氧 化硅纳米颗粒。由于表面氨基化使纳米颗粒在一定的p h 环境下的芎( z e t a ) 电位 为正值，与带负电荷的质粒d n a 通过静电结合能快速形成纳米颗粒质粒d n a 复合物，并对结合的d n a 有明显的保护作用。该研究小组对磁性微粒在核酸的 富集中的应用做了进一步研究，构建出一种具有超顺磁性的d n a 纳米富集器【3 1 i 。 z h a n g 等 4 4 , 4 5 将硅烷化试剂修饰的磁性二氧化硅微粒应用于植物基因组核酸的 提取分离，成功获得了高纯度、长度大于8k b 的玉米基冈组d n a ，用此法分离 核酸具有简便、快速和易于自动化的特点。s t o e v a 等m 1 建立了s i 0 2 微粒为核、 表面为a u 、内部为f e 3 0 4 的三层复合磁性微粒探针分析d n a 。 1 3 3 靶向药物 在生物医学领域，磁性纳米粒子经过表面修饰而带有一定电荷或功能基团， 可与特异性抗体结合，作为药物载体用于药物的输运。这种磁性载体能借助于外 加磁场的导向作用，将药物运送到人体预定的病变部位进行控制释放，这样即可 以减少毒副作用，不杀死正常细胞，又可降低药物用量，大大提高了药物效率， 因此被形象地称为“生物导弹 技术。 f e 3 0 4 磁性微粒因粒径小、灵敏度高、毒性低、性质稳定、原材料易得等 优点被广泛应用于靶向药物的研究。早期使用的磁性微粒的包覆材料是生物相容 性聚合物，如p v a 和p l g a 等 4 7 , 4 9 ，也有报道使用p e g 修饰的磁性微粒用于靶 向药物的研刭4 9 1 。最近s i 0 2 因其良好的特性也开始应用于靶向药物磁性材料的 包覆。l i a n g 等【5 0 1 用硅烷化试剂修饰的f e 3 0 4 磁性微粒与h e p a m a - i 单克隆抗体 结合，然后用于抑制体外培养的肝癌细胞的生长，获得了良好的抗癌效果。c h e n 等【5 l 】成功制备了核壳型包覆二氧化硅的f e 3 0 4 磁性微粒，并在其表面上连接上抗 癌药物阿霉素( d o x o r u b i n c i n ) ，这种微粒在靶向药物方面具有很大的应用潜力。 r o y 掣5 2 】制备了粒径为3 0n m 左右的二氧化硅磁性微粒，装载脂溶性光敏抗癌药 功能化磁粒的制备、表征及心用 物，通过试验证明该载体药物能够进入到细胞质，并在光照的作用下杀死肿瘤细 胞。此外，r o y 等【5 3 】还在二氧化硅磁性微粒的基因靶向治疗方面做了深入的研究。 1 3 4 肿瘤热疗 热疗法治疗肿瘤是一项非常有前景的肿瘤疗法，这种方法与化学疗法配合使 用可以取得很好的治疗效果。磁性微粒在外界磁场的作用下可以被靶阳运送到病 变部位，然后在交变磁场的作用下由于磁滞后作用( m a g n e t i ch y s t e r e s i se f f e c t s ) 产生热量将癌变部位加热到4 3 - - 一4 8 之间，选择性杀死肿瘤细胞而f i 伤害到正 常细胞。随着纳米技术的发展，德国学者j o r d a n 提出一种新的热疗法一纳米磁 流体热疗( m a g n e t i cf l u i dh y p e r t h e r m i a ，m f h ) 法，该法在治疗肿瘤方面取得了 重要进展 5 4 , 5 5 ，此方法的优点就是靶i 幻定位升温，无磁微粒的组织彳i 受损伤。磁 性微粒经局部注射或经导管注入瘤体后，在交变磁场作用下吸收电磁波转化为热 能，使瘤区升温达到所需的治疗温度以杀死肿瘤细胞【5 酬。 j o r d a n 等【5 7 1 研究了彳i 同细胞对f 、= 同修饰滋流体的吞噬行为，证实了与葡聚糖 磁性微粒相比，氨基硅烷磁性微粒的生物相容性和稳定性较好，表面电荷更多， 与血浆蛋白的连接增加，对细胞的吸附和吞噬行为更好。马勇杰1 5 s 1 等的研究表 明，在同一细胞培养的条件下，肺癌细胞s p c a 1 明显地比正常胚胎细胞w i 3 8 更易吞噬氨基硅烷磁性微粒，且前6h 内未观察到纳米磁性粒子进入w i 3 8 细胞。 凡进人癌细胞内的磁性微粒具有良好的生物相容性并可以在细胞中停留数代之 久。肿瘤细胞吸收磁性微粒的高效性，磁性微粒随肿瘤细胞的分裂在其子代细胞 中的高保留性为肿瘤的细胞内磁热疗创造了条件。 磁靶向热疗的体外实验及动物实验研究已经取得了令人鼓舞的效果。由于磁 响应材料或载体无器官特异性，故适用于多种恶性肿瘤的治疗，并可携带4 i 同的 化疗药物及放疗制剂，可望同时达到热疗、化疗、放疗、栓塞等多晕治疗肿瘤的 目的。但有关剂型的改进、如何使磁粒分布均匀、用最小的磁量达到最大的靶向 体积、合理电磁场的选择等尚需进一步探索。 1 3 5 免疫分离和检测 免疫学研究中，可以利用抗体、抗原特异性可逆结合的原理来测定免疫活性 1 2 功能化磁粒的制备、表征及应用 组分的存在和浓度。硅烷化试剂修饰的f e 3 0 4 磁性微粒通过化学键合或物理吸附 的方法将抗原或抗体同载于磁性微粒的表面得到免疫微粒。免疫微粒在外界磁场 的作用下可以快速有效地进行细胞分离和免疫分析，该方法具有特异性高、分离 快、重现性好等特点。 借助免疫磁性分离技术，可以达到快速分离和检测的目的。1 9 8 2 年， p o u r f a r z a n e h 等人【5 9 】在荧光染料或放射性同位素标记的磁性微粒表面偶联抗体或 抗原，制成一种磁性免疫检测试剂，可以非常简单方便快速地对标奉中的抗原或 抗体进行定性或定量测定，它们具有特异性好，灵敏度高，准确性好的优点，被 称为免疫检测方法的革命性发展。在免疫检测中经常利用一些具有特殊物理化学 性质的标记物如酶、同位素、荧光染料分子等对抗体( 或抗原) 分子进行标记， 在抗体和抗原识别后通过对标记物的定性和定量检测来达到对抗体( 或抗原) 检 测的日的。j o s e p h s o n 等【删将戊二醛活化的硅烷化磁性微粒用于人血中淋巴细胞 的分离。p a n 掣6 1 】发明了一种免疫检测器，将癌胚抗原的抗体( a n t i c e a ) 连接 到二氧化硅磁性微粒上，然后用于癌胚抗原( c e a ) 的测定。y a n g 等【3 7 】等用反 相微乳液法制备的f e 3 0 4 磁性微粒设计出一种免疫测检测系统，将抗体固定在磁 性微粒上，用于异硫氰酸荧光素标记的庆大霉素( g e n t a m i c i n ) 的定量检测。d e n g 等【6 2 】使用溶胶凝胶法制备包覆s i 0 2 的f e 3 0 4 磁性微粒，并将这种微粒应用到微 囊藻素( m i c r o c y s t i n s ) 的榆测和分离，结果显示其分离效率达到了9 5 以上。 1 4 本课题的研究思路 磁性微粒具有巨大的应用潜力和前景，但国内的研究水平与国际的研究水平 相比还有很大的差距，本文依托本实验窜现有的条件，奉着创新性和系统性的思 想，将材料制备及结构分析研究与分析化学技术相结合，具有重大的现实意义。 本课题是围绕着磁性微粒的制备及其在生物样品分离富集中的应用来开展 研究的。实验根据磁性微粒制备和应用分为以下三个环节：磁性s i 0 2 微粒的制 备和表征；磁性o d s 微粒的制备和表征；磁性o d s 微粒的应用。具体研究内容 如下： ( 1 ) 采用化学共沉淀法制备磁性f e 3 0 4 微粒，并在此基础上，采用溶胶凝 胶法对磁性f e 3 0 4 微粒进行表面修饰，是磁性f e 3 0 4 微粒表面包覆一层s i 0 2 。 功能化磁粒的制备、表征及心用 ( 2 ) 使用十八烷基三氯硅烷作为功能化修饰试剂，通过硅烷化反应制备磁 性o d s 微粒。 ( 3 ) 将制备的磁性o d s 微粒作为一种磁性同相萃取材料，与毛细管液相色 谱技术相结合，应用到果奶中的脂溶性维生素的提取和测定中。 1 4 功能化磁粒的制各、表征及应用 2 1 引言 第二章磁性s i 0 2 微粒的制备和表征 为了使磁性微粒稳定并带有多种活性功能基团，必须对制备的磁性微粒的表 面进行修饰。日前磁性微粒表面修饰的方法很多，常用的方法有表面钝化和轻度 氧化、表面活性剂或者聚合物包裹、贵金属包裹、碳包裹以及二氧化硅包裹等。 通过以上方法修饰的磁性微粒可形成一种核一壳型结构，位于中心的磁性微粒与 外界环境隔绝，从而使得磁性微粒避免被氧化，同时不易被酸或碱腐蚀。 使用硅烷化试剂进行二氧化硅包裹是日前最常用的一种包覆方法，与其他方 法相比，它具有以下的优点：( 1 ) 水相系统中的高度稳定性；( 2 ) 表面再修饰的 简易性；( 3 ) 包覆厚度的可控性；( 4 ) 出色的生物相容性。基于以上的特性，二 氧化硅包覆的磁性微粒在各个领域中得到了广泛的应用，例如酶的固定化、特定 蛋白质的分离、核酸的分离、免疫测定技术、重金属的分离和富集等等。 溶胶凝胶法是日前最常用的一种s i 0 2 包覆法，是s t 6 b e r t l 9 】于1 9 6 8 年提出的。 其特点是操作简单、反应条件温和、成本低和不用表面活性剂等。采用溶胶凝胶 法制备磁性微粒是通过四乙氧基硅烷( t e o s ) 将s i 0 2 包覆到f e 3 0 4 磁性微粒表 面。通过改变制备过程中硅烷化试剂( t e o s ) 的加入量和水解反应的时间，可 以很好地控制磁性微粒的平均粒径的大小。 2 2 实验部分 2 2 1 实验试剂 f e c l 3 6 h 2 0 、f e c h 4 h 2 0 、无水乙醇、氨水( 质量分数2 5 ) 均购于广 州化学试剂厂，分析纯；盐酸购自广州市东红化工厂，分析纯。四乙氧基硅烷 ( t e o s ) 购白天津市化学试剂研究所；高纯氮气购自广东省普莱克斯韶钢液化 工业气体有限公司；所用水均为超纯水，由e l g a 纯水系统( e l g a ，l o n d o n ， u k ) 制得。 1 5 功能化磁粒的制备、表征及应用 2 2 2