（生物物理学专业论文）tgfβ活化激酶样基因的克隆和初步功能研究.pdf

摘要 转化生长因子b 活化激酶( t g f ba c t i v a t e dk i n a s e ，t a k l ) 在t g fb 刺激 的细胞中，通过对丝裂素活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e d p m t e i nk i n a s e ，m a p k ) 激酶m k k 3 、m k k 4 和m k k 6 的磷酸化激活压力活化激酶( s t r e s s a c t i v a t e d 瞄n a s e ) s a p k l 和s a p k 2 ，从而激活s a p k 信号转导通路；w 汰1 也参与白细 胞介素1 ( i m e r l e l l k i n ，i l 1 ) 和肿瘤坏死因子( t 啪o rn e c r o s i sf a c t o r ，t n f ) 信号 转导通路，在细胞分裂、分化、发育和胞外基质形成中起着重要的作用。 通过大规模人类c d n a 测序并结合生物信息学分析，我们从肽脑c d n a 文 库中克隆到一条t g f b 活化激酶样基因( t a k l l i k eg e n e ，t a k l ) ，并对其结构 和功能作了初步分析。t a k lc d n a 全长1 9 9 7 b p ，编码一个2 4 2 个氨基酸残基的 多肽，其c 0 0 h 末端与人、小鼠以及爪蟾t a k l 高度同源。t a k l 基因定位于 人类染色体2 1 q 2 1 。逆转录p c r ( r t _ p c r ) 分析发现t a k l 基因在成人和胎儿 大多数组织中都有较高的表达。此外，t a ，也在乳腺癌、结肠癌以及前列腺癌 组织中有很高程度的表达。n o r t l l e m 杂交显示t a l ( i ，在外周白细胞中有表达，且 其表达条带与预期一致。构建的t a k i ，p q e 3 0 连接质粒在大肠杆菌中得到了很 好的表达，我们用n i - n 1 a s u p e r n o w 柱对t a k l 表达蛋白进行了纯化。 关键词：t g fb 活化激酶样基因；n o n l l e m 杂交；逆转录p c r ；蛋白表达 a b s t r a c t 1 r a n s f o m l i n gg r o w mf a c t o r ba c t i v a t e dk i n a s e ( 1 、a k l ) m a ys t i m u l a t e t h e s 仃e s s a c t i v a t e dk i n a s e s ，s a p k la n ds a p k 2 ，1 e a d i n gt o 也ea c t i v a t i o no fs a p k s i g n a l i n g 咖s d u c t i o np a t h w a y ，v i ap h o s p h o r y l a t i o no ft h em a p h n a s ek i m s e s m k k 3 ，m l o “a n dm k k 6 ，i nc e l l ss t i m u l a t e db y 打a n s f o r n l i n gg r o w t l lf a c t o rb ( t g f b ) t a k l i s a l s oi n v 0 1 v e di nt l l es i g n a lt r a n s d u c t i o np a 1 w a y so f i n t e d e u k i i l1 ( i l l ) 锄dt u r n o l l rn e c r o s i sf k t o r ( 1 n f ) t a k lp l a y sac r u c i a lr o l ei nb i o l o g i c a lp r o c e s s e s s u c ha sc e ud i v i s i o n ，d i 任b r e n t i o n ，d e v e l o p m e n to re x 把a c e l l u l a rm a m x f o n n a t i o n b yl a 玛e s c a l es e q u e n c i n ga n a l y s i s o ft h eh 啪a nf e c a lb m i nc d n a l i b m r ya i l d b i o i r l f o n a t i c sa i l a l y s i s ，w ei s 0 1 a t e dan o v e lh u m a nt a k l l i k e ( t a k l ) g e n ea n dh a d s o m er e s e a r c h e so n t h es 由n l c t u r ea n d f u n c t i o n o f t a k i ，t h e l a k lc d n a 、v a s1 9 9 7 b a s ep a i ri n1 e n g t l l ，e n c o d i n gap u t a t i v ep r o t e i no f2 4 2a m i n oa c i d s ，w h j c hs h a r e da h o m o l o g y 讪mh u m a n ，m o u s e ，a 1 1 dx e n o p u s t a k l n e1 a k l g e n ew a s l o c a t e di n b 岫a 1 1c h m m o s o m e 2 1 q 2 1 i k v e r s et r a n s c 打p t i o np c r r e v e a l e dt h a tt a k l g e n e w a s e x p r e s s e du b i q l l i t o u s l yi nh u m a n a d u ha n df b t a lt i s s u e sa n de x p r e s s e dh j 曲1 yi nb r e a s t c a r c i n o m ag i 一1 0 1 ，c o l o na d e n o c a r c i n o m ag i - 1 1 2 ，a n dp r o s t a t i ca d e n o c a r c i n o m a p c 3 n o r t b 锄b l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a t t h et a k lm r n a 、v a se x p r e s s e d p r e d o m i n a n u yi np e r j p h e r a lb l o o dl e u k o c y t e t h e 扛a n s c 邱t2 o k bw a sc o n s i s t e m w i mt l l ee x p e c t e ds i z e n ec o n s t m c t e dt a k l - p q e 3 0 p l a s m i d 邯e x p r c s s e dh i 曲1 y i ne c d 疗稍t l lm ei i l d u c t i o no fi p t g t h er e c o m b i n e dp r o t e i nw a sp u r i f i e dw i m n i - n t as u p e m o w c l l r o m a t o g r a p h y k e y w o r d s ：t g f - ba c t i v a t e d k i n a s el i k c g e n e ；n o m l e mb l o t ；r r - p c r ；p r o t e i n e x p r e s s i o n 第一部分 综述 一、新基因结构和功能研究 获得新基因的方法主要包括筛选基因文库和c d n a 文库以及定位克隆等。现在c d n a 文库的大规模测序是获得新基因的主流手段。此方法的成熟有赖于全长c d n a 文库构建策 略的成熟和核酸数据库的完善。其基本原理是将从c d n a 克隆获得的5 e s t 或3 e s t 与核 酸数据库的全长基因进行比较，若e s t 无对应的已知基因，那么该e s t 可能就代表一个新 基因的5 端或3 端。然后对该克隆进行引物行走( p r i m e rw a 她n g ) 测序，这样就可得到 该基因的全长。判断新基因c d n a 是否为全长的方法主要包括e s t 对照分析和n o r t h e m 杂 交，这是从m r n a 水平进行推导的。也可通过w e s t e m 杂交检验c d n a 的最大开放阅读框 是否为有效开放阅读框的问题 1 】，从而在蛋白质水平推导其全长性。若获得的c d l q a 并非 全长则可通过r a c e ( r a p i d a n a l y s i s o f c d n ae n d ) 方法获得全长c d n a 。通用的方法是采 用s m a r t ( s w i t c h i n g m e c h n i s m a t 5 e n do f r n a t f a n s c r i p t ) 技术，即用d ( t ) n 为引物合成 c d n a 第一链，在特异性片段合成完毕后，会自动合成一段d ( c ) n 。利用这种特性可合成r a c e 引物。利用特异性引物与5 或3 作相应的p c r 就可以得到全长c d n a 【2 】。 传统上对基因结构和功能的研究主要包括组织表达谱分析、原核和真核系统蛋白表达、 基因敲除、r n a 干扰技术( r n ai n t e l f e r e n c e ，r n a i ) 、生物大分子相互作用( 酵母双杂交和 噬菌斑显示) 、三维结构测定及蛋白质功能分析。n o 毗e m 杂交和r 1 二p c r 都可以得出可靠 的组织表达谱 3 】。在大肠杆菌和酵母表达系统中对目的基因进行表达，获得的蛋白既可以 用于结构分析也可以用于蛋白质功能研究。r n a 干扰技术现在运用的越来越多，通过特异 r n a 序列与靶基因的结合，引起靶基因表达的上调或下调，从而抑制某些基因尤其是那些 与癌症、a i d s 等疾病相关的基因的表达。酵母双杂交噬菌斑显示技术的发展既可以用来检 验已知或未知蛋白质问的相互作用，也可以用来发现新的靶蛋白和检测一些蛋白功能结构 域，对特定代谢途径中蛋白质相互作用关系网络的认识上也有重要的作用。 另一方面，真核生物基因表达有高度的时空特异性。基因表达水平随细胞、绸织和器官 的不同而有所不同，在细胞生长、发育、增殖、分化以及凋亡等不同的生理活动也表现出不 同的表达水平。基因表达可在转录水平、翻译水平以及翻译后水平等多层次得到调控。如珠 蛋白在胚胎期、胎儿期和成人期有明显不同的表达水平。人类基因组计划( h u m a l lg e n o m e p r o j e c t ，h g p ) 完成后，发现人类基因只有3 - 4 万个，比预期的1 0 万个基因数要少很多 4 ， 5 1 ，这只是线虫或果蝇基因数量的两倍，其中人有而鼠没有的基因只有3 0 0 个。如此少的基 因数目，能产生如此复杂的功能，这可能就是基因表达调控的复杂性引起的，也从根本上修 改了以前认为的“一个基因一个酶”的观点。 2 0 0 3 年4 月，人类基因组精细图完成，标志着对人类基因组的研究从结构基因组学 ( s 打u c t u m lg e n o m i c s ) 过渡到功能基因组学( f i l n c t i o n a lg e n o m i c s ) 。结构基因组学以建立高 分辨率的遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学主要包括应用微点阵、基因表达系列分 析( s a g e ) 、蛋白质组、生物信息学等方法来研究基因组表达概况、基因组多样性、模式生 物体等。蛋白质组学是由w i n g c r 于1 9 9 4 年提出的 6 ，指的是由整个基因组编码的全部蛋 白质。基因组是固定的，而蛋白质组是动态变化的，可随生物体发育的不同阶段、细胞所在 的状态及外界刺激因数的影响而有所变化。因此蛋白质组能够反映出基因的真实表达情况。 现在在蛋白组学研究中广泛运用的方法主要是双向凝胶电泳( 2 - d i m e n s i o n a lg e i e l e c 订0 p h o r c s i s ，2 一d e ) 和质谱技术( m a s ss p e c 仃0 m e t mm s ) 。另外结合传统的蛋白质鉴定方法 如e d m 降解法和氨基酸组成分析等方法也可对蛋白质功能进行研究。 比较基因组学主要是利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和组织结构上 的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系以及基因 组的内在结构。现在已经完成测序的模式生物主要有大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠等。 从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般都比较小，g + c 比较高， 编码基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少，但有基因冗余现象；模式生物的基因组 中，内含子和外显子的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致；维持最基本生命活 动的蛋白是保守的，在各种不同的物种中，绝大多数的核心生物功能是由相当数量的定向进 化同源( o n h 0 1 0 9 0 u s ) 蛋白承担。两种物种中蛋白总数上的差别是由承担各自特有任务的蛋 白数目的不同而造成的。通过比较基因组学的研究可以对基因组结构有更深的认识，对于阐 明人类基因功能具有重大的价值【7 。 二、生物信息学分析 生物信息学是上世纪八十年代发展起来的一门新兴学科，随着人类基因组计划和功能基 因组学的进行，基因组时代、后基因时代生物学及其相关研究领域所产生的海量数据，使得 2 生物信息学成为生命科学领域中最重要的研究课题之一。 生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指 数增长的生物学数据的一门学科。生物信息学位于生物、计算机、数学等多个领域的交叉点 上，其研究目标是揭示”基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律”。 生物信息学研究内容主要包括：( 1 ) 计算机高性能计算和新算法的需求。如用于序列同 源性的b l a s t 算法，f a s l a 算法和多序列比对算法；用于进化树分析的c l a s t w 算法、f i t c h 算法等；神经网络模型构建等。( 2 ) 数据库的开发管理，生物学应用软件的开发维护，以及 各种在线生物学分析工作的完善。各种数据库几乎覆盖了生命科学的各个领域。核酸序列有 g e n b a i l l 【、e m b l 、d d b j 等三大数据库；蛋白质序列有s w i s s p r o t 、p i r 、o w l 、n r l 3 d 、 眦m b l 等数据库：蛋白质片段数据库有p r o s i t e 、b l o c k s 、p r i n t s 、p f h m 等：三维结 构数据库有p d b 、n d b 、b i o m a g r e s b a n k 、c c s d 等。各种数据库的开发为分析利用与日 俱增的生物学数据提供了极大的方便。( 3 ) 数据分析与应用，即从大量数据中获取有用的生 物学信息。如g e l l b a l 】1 c 中e s t 数据库中收集的人e s t 序列几乎包含人类所有基因序列信息， 其中包括了大量未发现的人类基因的信息，可利用这些信息发现新基因，对人类的基因定位、 剪接形式进行大规模预测和基因表达谱分析 8 】；利用转录组数据库搜索基因组中各个基因 转录情况及对组织特异性进行预测；利用蛋白质数据库对未知蛋白空间结构进行预测；通过 对比较基因组学数据库的搜索寻求那些可能在进化过程中起重要作用的基因。 生物信息学的应用主要体现在以下几个方面： ( 1 ) 基因组和蛋白质组分析。通过对模式生物、病原性生物和经济生物基因组序列分析， 发现新基因；通过基因序列预测编码蛋白，进而预测蛋白质的高级结构和生物学功能，阐明 结构与功能之间的关系；在基因水平研究单基因疾病和多基因疾病的致病机制；通过基因组 和对应蛋白质组之间的比较，研究基因在时间上的发育表达水平和在空间上的组织分布的差 异，进而研究基因的表达调控和生理学作用。比较基因组学，研究不同物种之间编码顺序上 和组织结构上的同源性阐明物种进化关系以及基因组的内在结构。大规模的基因功能研究， 如酵母基因组6 0 0 0 多个开放阅读框干扰实验数据库 9 】，酵母蛋白质组酵母双杂交矩阵【1 0 等。目前人类基因组精细图谱以及酵母、线虫、果蝇、拟南芥等模式生物的基因组测序也已 经结束。这些数据的积累为生物学研究提供了很多有用的信息。 ( 2 ) 基因芯片开发与分析。基因芯片包括微阵列( m j c m a m 【y ) 和寡核苷酸芯片两种。微阵 列主要包括c d n a 微阵列( 表达谱阵列) 和基因组微阵列。这一技术具有高度自动化、并 行化和多样化的特点，被广泛应用在序列分析、表达谱分析、肿瘤相关基因分析和药物诊断 设计等。基因芯片已成为后基因组时代基因功能分析和药物开发的支撑技术之一。 ( 3 ) 药物开发。基因组研究对药物学和药理学研究产生了重大影响，尤其是为分子药理学 研究、新药筛选及药靶设计等提供了新的研究基础。综合利用各种生物信息学资源可以大大 缩短新药的开发周期，对已有药物进行改造降低其毒副作用，并可以指导开发针对于个人遗 传背景的个性化药物。 三、t g f b 活化激酶结构与功能研究 人类细胞中存在2 0 0 0 多种蛋白激酶( p r o t c i nk i n a s e ) 和1 0 0 0 多种蛋白磷酸梅( p r o t e i n p h o s p h a i a s e ) 1 l 】，分别负责催化蛋白质磷酸化与去磷酸化，在体内形成一个复杂的调节网络， 调节细胞的复制、生长、发育、分化、凋亡等过程，控制着生物体的生长发育乃至衰老死亡。 蛋白质的磷酸化水平是通过激酶和磷酸酶相互作用来调节的 1 2 】。这种相互作用是一种可逆 的动态平衡过程，与细胞代谢的其他调控方式相比，具有以下几个方面的优点：( 1 ) 可以调 控细胞内已经存在的酶的活性，与酶的重新合成和分解相比，不仅节省原材料，而且能使调 控反应更加迅速有效。( 2 ) 蛋白质磷酸化和去磷酸化在细胞信号转导过程中可以级联放大外 来信号，从而增加细胞对外来刺激的反应灵敏性。( 3 ) 与其它调节方式如产物反馈抑制、变 构调节相比，蛋白质磷酸化和去磷酸化作用较少受细胞代谢产物的影响，可以准确专一地对 信号作出反应。( 4 ) 蛋白激酶和磷酸酶一旦被激活，其活性可以通过某种方式( 如自身磷酸 化去磷酸化) 维持较长的时间，在持续调控反应中发挥重要作用。 蛋白激酶以a t p 或g t p 作为磷酸基团的供体，对蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸 进行磷酸化。蛋白激酶家族主要包括【1 3 】：( 1 ) 、a g c 组，包括环核苷酸依赖家族( p k a 和 p k g 家族) 、蛋白激酶c 家族等；( 2 ) 、c a m k 组，包括c a 2 + ，钙调素调节的蛋白激酶家族、 s n n ，a m p k 家族等；( 3 ) 、c m g c 组，包括细胞周期因子依赖蛋白激酶( c d k ) 家族、m a p 蛋白激酶家族、糖原合成酶3 激酶( g s k 3 ) 家族等；( 4 ) 、酪氨酸蛋白激酶组及其它激酶； ( 5 ) 、其它蛋白激酶类，包括p o l o 家族，m e i ( ，s t e 7 家族等。根据蛋白激酶底物的特异性又 可将真核生物蛋白激酶分为丝苏氨酸蛋白激酶( p s k ) ，酪氨酸蛋白激酶( p t k ) 和双底物 特异性蛋白激酶【1 4 。双底物特异性蛋白激酶是近十年来才发现的一种既能磷酸化底物上的 丝苏氨酸残基，又能磷酸化酪氨酸残基的双重底物特异性蛋白激酶，它一般被归入丝苏氨 4 酸激酶类。 绝大多数蛋白激酶由2 5 0 3 0 0 个氨基酸残基构成催化功能区域，分为1 2 个功能亚区 1 4 。这些亚区的氨基酸序列高度保守，包含不变或接近不变的氨基酸残基，它们被一些保 守性较低的氨基酸残基分隔开。这些高保守的结构域在激酶活性方面起重要作用。对3 7 0 种蛋白激酶的氨基酸序列进行比较，将保守性在9 5 以上的氨基酸残基作为不变或接近不 变氨基酸，结合依赖c a m p 的蛋白激酶o l 催化亚基( p k a - c ) 的晶体结构 1 5 ，发现激酶催 化结构域折叠成大、小两叶( 1 0 b e ) 状结构，小叶包含亚结构域i i v ，与核苷三磷酸的锚 定和定向有关，大叶包含v i x i ，与底物的结合和磷酸基团的转移有关，亚结构域v 则可 能是两部分的联接。不同类型蛋白激酶的区别主要集中在、亚区，如第区丝氨酸 ，苏氨酸蛋白激酶的保守序列为：a s p l e u - l y s - p m - g l u - a s n ，而酪氨酸蛋白激酶的保守序列 则为：a s p l e u - a 唱- a l a - a s n 或a 咿l e u - a l a a l a - a 曾a s n 。真核生物蛋白激酶在其功能域的 氨基酸序列高度保守，功能域折叠形成催化核心结构，其中距催化区氨基末端8 0 - 1 8 0 个残 基的三联体a 曙_ a s e - l e u ，a s p p h e - g l y a 1 a _ p r 0 一g 1 u 是保持催化活性所必须的。这种催化核心 结构有3 方面功能：( 1 ) 在二价阳离子( m 矿+ 或m n 2 + ) 参与下，辅助a t p ，g t p 的结合和定 向；( 2 ) 受体蛋白质肽的结合与定向作用；( 3 ) 催化a t p 或g t p y - 磷酸基团转移到受体丝氨 酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基上。 蛋白激酶对底物的磷酸化作用具有选择特异性，不仅体现在对不同底物中的丝氨酸 ( s e r ) 、苏氨酸( t h r ) 和酪氨酸( t 姐) 等氨基酸残基的磷酸化是有选择性的，就是对同一 种底物的不同位点的氨基酸残基也具有选择性。这样就可使得同一蛋白质被磷酸化修饰后可 产生不同的空间构象，从而具有多样化的功能。 蛋白激酶可以通过自身磷酸化，去磷酸化以及激活剂抑制剂对激酶活性进行调节。研究 发现几乎所有蛋白激酶均能通过分子内机制催化自身磷酸化或者被蛋白磷酸酶去磷酸化，从 而导致其活性被激活或者抑制。如m a p k 酪氨酸残基的磷酸化，可激活h d m 激酶和m a p k 激酶( m a p k k ) 。另外，激活剂抑制剂也可调节蛋白激酶活性，如c a 2 + 和c a m 可激活 c a 2 + c a m 激酶，m 矿+ 可激活组蛋白激酶，而3 - 脱氧腺苷、氯化高铁血红素等抑制蛋白激酶 的活性。 t g fb 结构与功能研究 转化生长因子b ( t m n s f o m i n gg m wf 如t o r - b ，t g fb ) 超家族 1 6 包括t g f b 、活化素 ( a c t i v i n s ) 、抑制素( ；n h i b j n s ) 、缪勒氏管抑制物质( m u l l e r i i n h b h o r s ，m i s ) 和骨形成蛋 白( b o n em o e p h o g e n e t i cp m t e i n s ，b m p ) 等，它是一类具有多种生物学活性的细胞因子，参 与调节细胞的增殖、分化、发育和凋亡等多种生命活动。 t g fb 有t b fb l 、1 1 g fb2 、t u f83 、t g fb lb2 、t g f b4 和t g fb56 个弧型人体 内只有t g fb l 、t b fb2 、t g f b3 三种 1 7 。t g f b 是一个由两个结构相同或相似的亚单位 通过二硫键连接而戍的二聚体分子。人1 f b l 、t g f 2 和1 g f 83 的基因分别定位于染色 体1 9 q 3 、1 q 4 1 和1 4 q 2 4 ，三个亚型的核苷酸序列高度同源，均含有7 个外显子，所编码的 前体分子c o o h 一末端都有9 个保守的c y s ，这表明这三个基因可能来自同一个祖先。对人 t g f b ，基因的研究发现，其5 端序列包含5 个明显的调控区：1 个类增强子活性区、2 个 负调控区和2 个启动区。 t g f 发挥生物学效应主要通过两条途径：受体磷酸化或者与g t p 结合后引起c a 2 + 变 化、c a m p 等第二信使的产生，从而引起一系列生物效应。 t g fb 受体分为i 型和i i 型，均具有丝氨酸，苏氨酸激酶活性，共同介导t g fb 超家族 成员的跨膜信号传导。i 型受体分子量为6 5kd ，i i 型受体分子量为8 5kd 1 l o kd ，两 种受体与t u fb 。的亲和力远远大于1 g f 02 的亲和力。i 型和i i 型受体是跨膜蛋白，分为 胞膜外区及胞浆区。其激活方式为：1 fb 与细胞膜表蕊的型受体结合成二聚体，被i 型 受体所识别，其中i i 型受体胞浆区结构域的丝氨酸苏氨酸磷酸化，激活i 型受体：活化的 i 型受体再进一步作用于细胞内的下游分子，使t g fb 的信号向细胞内传导【1 8 】。 1 b fb 活性测定方法分为生物学及免疫学两类。生物学测定法是通过t g fb 刺激或抑制 敏感细胞株增殖、调节细胞基质形成、抗原表达程度来确定其活性和含量。常用正常大鼠肾 成纤维细胞软琼脂克隆法和m v i l u 水貂上皮细胞生长抑制3 h t dr 掺入法。该法具有灵敏 度高和直接表现t b f b 生物功能的特点。另一种检测方法是酶联免疫( e l i s a ) ，优点是操 作简单、专一性强、稳定性好和能区别不同的t g fb 亚型【19 】。 t g fb 是一种抑癌因子，可引起细胞生长周期阻断作用，其表达或激活方面的缺陷及 t g fb 受体或受体后水平缺陷都可导致生长抑制作用消失进而导致细胞恶性增殖。也有研究 表明在肿瘤生长的晚期阶段，t g f0 作为肿瘤的促进因子，通过刺激血管生成、细胞播散、 免疫抑制及合成细胞外基质等提供适宜肿瘤生长、浸润及转移的微环境 2 0 。 6 t g f b 活化激酶结构与功能研究 1 9 9 5 年在哺乳动物中发现了t g fb 活化激酶( t g fba c t i v a t e dk i n a s e ，t a k ) ，t a k 是一 个被t g f0 信号活化的新的丝裂素活化蛋白激酶激酶激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp m t e i nk i n a s e k i n a s ek i n a s e ，m a p k k k ) 2 1 】。在肿瘤细胞和分化组织中发现1 a k lm r n a 有四种剪接异构 体t a k l 一a ，t a k l b ，t a k l 一c 和1 a k - d 2 2 - 2 4 。它们是由两个剪接位点处可变外显子 ( a l t e m a t i v ee x o n s ，a e ) 的出现或者缺失引起的。这两个位点都位于t a k lm r n a 编码的 c o o h 一末端区域，该区域可以结合t a k l 结合蛋白2 ( t a k lb i n d i n g p r o t e i n 2 ，t a b 2 ) 【2 5 ， 2 6 。t a k l m 和t a k l d 只包含一个剪接位点a e l ，t a k l c 包含一个剪接位点a e 2 ，而t a k l - b 则包含两个剪接位点。a e 2 对下游编码序列阅读框有着很大的影响。在四个剪接体中，a e 2 长度为1 1 6 b p ，编码3 8 个氨基酸，另外有两个多余的碱基。在t a k l a ，t a k l _ b 的阅读框 中，a e 2 和它的下游序列共编码9 8 个氨基酸残基。t a k l - d3 一末端编码序列与t a k l a ， t a k l - b 有所不同。在剪接体c 和d 中，c o o h 末端区域被一段只有1 0 个氨基酸残基的多 肽所替代，而这段序列是由可变剪接位点处的序列以另一种阅读框翻译产生的。剪接体具体 结构见图1 。t a k l a 编码6 3 3 个氨基酸残基，分子量为7 0 0 k d ；1 a k l - b 编码6 6 0 个氮基酸 残基，分子量为7 2 9 k d ：t a k l c 编码5 1 8 个氨基酸残基，分子量为5 6 7 k d ；t a k l - d 编码 4 9 1 个氨基酸残基，分子量为5 3 7 k d 。 1 k 1 口【二= = 一 t k 1 - b 口【= = 簟二】i 1 赢褂- c 口 = = 二】 t k 1 一日 = ：二 1 6 02 的3 6 04 6 d 5 6 0 6 6 0 图1t a k l 四种剪接异构体示意图 2 4 】。数字表示氨基酸残基数目。氨基末端灰色区代表 t a k l 的催化区。两个a e 编码区用黑色表示。外显子1 7 用黑灰色( 咖) 和轻灰色( c ，d ) 表示。 f i g1 s c h e m a t i c so f 也ep r o t e i ne n c o d e db yt h et a k lm r n a s p l i c ev a v i a l l t s t h eg r e yb o xo f n h 2 - e n dr e p r e s e n t st h ec a t a l y t i cd o m a j n t h e t w oa l t e m a t j v ee x o n sa r es h o w e dj nb l a c k 1 h ee x o n 17i ss h o w e di nd a r kg r e y ( v 捌觚t sa 明db ) a n d1 i 曲tg r e y ( v a r i a n t sca 1 1 dd ) t a k l 的不同剪接体在不同组织中有不同的表达水平。t a k l a 和t a k l - b 在大多数组织 7 中表达很丰富。而不包含外显子1 6 的t a k l 一c 和t a k l d 表达水平只有t a k l 的3 4 。t a k l 的四种剪接体由1 7 个外显子组成，跨越染色体上7 1 k b 的d n a 序列。所有的外显子纳含子 接头部分都符合g t ，a g 规则 2 7 。外显子l 包含了t a k lm r n a 的5 - u t r ，编码蛋白氨基 末端的4 0 个氨基酸残基；外显子2 到8 编码激酶活性区：外显子9 到1 7 包含3 u t r ，编 码t a k l 不同异构体的羧基末端。可变外显子a e l 和a e 2 分别对应于外显子1 2 和1 6 。通 过酵母双杂交搜索和基因扫描，分离到t a k l 的三个结合蛋白t a b l ，t a b 2 和t a b 3 2 6 ， 2 7 ，3 0 。1 a b l 被认为是t a k l 的直接激活因子，t a b 2 作为一个接头蛋白，定位于t a k l a 羧基端外显子1 2 一1 7 编码的1 7 8 个氨基酸残基，在i l 1 信号转导通路中通过连接t a k l 到 t a r f 6 上来激活t a k l 。t a k l5 端没有t 猢陡盒，但在7 9 9 一1 2 1 5 ，1 3 6 2 1 6 4 6 b p 处有两 个c p g 岛和几种转录因子，其中包括s p l 位点。t a t a 盒的缺乏和c p g 岛、s p l 位点的存 在是看家基因( h o u s ek e e p i n gg e n e ) 的典型特征，这与1 1 a k lm i 冰a 的广泛表达是一致的【1 5 】。 通过人1 a k l 蛋白与果蝇，爪蟾以及小鼠同源结构域比较发现，外显子1 6 和1 7 编码的区域 保守性很强，这表明保守的c 0 0 h 末端在发挥激酶功能上是很重要的 2 8 】。 a 1 0甲甲叩甲甲7 0 蚺 b l bt “ 社x ，噜匕刍t n r 旷口t r 口1 ，盯n 口、n ，旷t 兰= = = 刁 120671 0 0 s 1 7 l n1 j 啦 t 球七匕，口 玎r 匪 匕n 了七n 丁 d d r r r 旷d 百三= = = 1，j ，0 1 0 1 2 5 - t 1 0t a 强蝌唯e j t r 盯v 七n ，七n ，廿t r 口1 n n 丁一矿t = = = = ： 205t l o1 1 2 3 t 1 7 mt n b 亡r 盯盯t n ，r 口 七n 了t r 一口屯弋! = = = 3 图2t a k i 组织结构示意图【2 4 】。a ：t a k l 基因图。c p g 岛用白色盒子表示；黑色方框代表 第1 7 个外显子：箭头代表转录起始位点；b ：t a k l m r n a 的可变剪接。两个可变外显子用 黑色显示。 f i g2s c h e m a t i c so ft a k lm r n ao 曙a f l i z a t i o n a m a po ft a k lg e n e t h ec p g i s l a n d sa r e s h o w e dw i t hw h i t eb o x e s t h eb l a c kb o x r e p r e s e n t se x o n17 t h ea r r o wr e p r e s e t 也t h e s t a r ts i t e b a l t e m a t i v es p l i c i n go f l l a k lm r n a t h ea l t e m a t i v ee x o n sa r es h o w e di nb l a c k t a k l 的四个剪接异构体产生调节作用的机理以及生理学作用都不相同。目前对t a k l 8 的功能研究基本上都只局限于t a k l - a 。在t g fb 刺激的细胞中，t a k l 激活压力活化激酶 ( s t r e s s a c t j v a t e dk i n a s e ) s a p k l 和s a p k 2 ，在一些生理过程如细胞分裂、分化、发育和胞 外基质形成中起着重要的作用【3 0 。t a k l 可通过p 3 8 3 1 、c - j u n n 末端激酶( 州k ) 、m a p k 以及核因子kb ( n f - xb ) 【3 2 】诱导的激酶进行信号传导。它们的信号转导机理包括通过激 活t a k l s a p k 通路来活化a p 1 家族( c o u n ，a t f 一2 ) 中的转录因子【3 3 - 3 5 】以及通过t g fb 受体磷酸化作用于一种叫s m a d s 的转录因子进行【3 5 】。研究表明t a k l 通过对m a p 激酶 m k k 3 、m k k 4 和m k k 6 的磷酸化来激活s a p k l 和s a p k 2 2 1 ，3 6 - 3 7 】，并且1 a k l 也参 与白细胞介素l ( i n t e r l e u k i n ，i l 1 ) 和肿瘤坏死因子( t u m o u rn e c r o s i s f a c t o l t n f ) 信号转导 通路 2 5 ，3 2 ，3 7 - 3 9 。i l l 和t n f 结构上没有什么相关，但生物学功能相似，都是由活化的 巨噬细胞产生，都可引起一些诸如胞外基质降解的反应。i l 1 和t n f 的受体都可激活两个 s a p k 通路以及转录因子和n f - kb 【4 0 4 2 。 通过过表达和双链r n a 干扰( r n a j ) 技术分析了果蝇t a k l 同源蛋白在胚胎生成和幼 虫发育过程中的作用，发现果蝇t a k l 在胚胎外表层中的过表达足以诱导j n k 靶基因的转 录。也有研究表明t a k l 相关激酶在哺乳动物细胞培养中通过激活n l k ( n e m o 一1 i k e k i n a s e ) 拮抗w m 介导的信号传导【4 3 4 4 】。t a k 的线虫同源蛋白m o m 4 激活一个n l k 皿家族成员 l l t - 1 ，拮抗线虫中w n t 介导的生理过程 4 4 - 4 5 。 t a k l 在i l 1 信号通路中起连接t i f 6 到n i k i k k 以及m a p k k j n k 级联反应的作 用( 图3 ) 。i l 一1 在细胞炎症过程中起着重要的作用。当i l 1 结合到它在细胞表面的i 型受 体( i l 一1 ri ) 时，i l 一1 引发一个导致转录因子n f - kb 和k 活化的信号级联反应，并且i l - 1 通过蛋白t r a f 6 和下游的激酶包括n f kb 诱导激酶( n f - kbi n d u c i n gk i n a s e ，n i k ) 和i kb 激酶( ikb k i n a s e ，i k k ) 进行信号传递 4 6 - 5 2 】。 当i l 1 结合i l 1 r j 后，i l 1 r j 与i l 1 受体辅助蛋白形成复合物，从而引起m y d 8 8 和 丝，苏氨酸激酶i r a k 募集到受体上。i r a k 然后从受体复合物上解离下来，与转导i l - 1 信 号到n i k i k k a 邝激酶通路的n 认f 6 发生相互作用【5 6 - 5 7 。t r a f 6 与i r a k 和n i k 发生 相互作用，因此它可能是在信号通路中作为这些信号分子的锚定位置 4 6 ，5 8 。而在受到i l - 1 刺激后，t a k l 被募集到t r a f 6 上，这样就可以激活t a k l 乃至n i k 。n i k 和m a p k k k 有同源性 4 7 ，但没有直接证据表明n l k 是作为m a p k k k 起作用的，而1 a k lm a p k k k 可以磷酸化另一种m a p k k k 样激酶n i k 则是相当少见的。n i k 在体外可以磷酸化i k k - a ， 但i k k n 与m a p k k 没有同源性，并且n i k 不参与j n k 或者p 3 8 m a p 激酶的活化 4 8 5 0 。 0 n i k 中一个对催化活性很重要的保守氨基酸残基t 1 1 r 5 5 9 不能被t a k l 磷酸化，但是可以发 生自身磷酸化【6 0 。1 a k l 可对n i k 非催化区的n 末进行端磷酸化，该区域可能可以部分激 活n l k 以至于在催化区发生自身磷酸化，很可能就在t h r 5 5 9 位置，从而刺激其催化活性。 l k k 则进一步活化转录因子n f * b 。n f kb 可上调细胞核中许多炎症相关基因的表达。 未活化细胞中，n f k b 在细胞质中被一种抑制蛋白i xb 引起失活。受到外界刺激后，ixb 蛋白特定的s e r 残基被磷酸化，随后被降解，引起n f - * b 的核定位和活化【5 3 5 5 】。 n i k 和i k k a b 组成的激酶复合物参与i kb 蛋白的磷酸化作用，在i l - 1 介导的n f - kb 的活化中起重要作用，但对j n k 的活化没有效果 5 8 5 9 】，表明n 不参与j n k 下游的 信号传导途径。n h f 6 在受到i l 1 信号刺激后可以募集到t a k l ，从而将其激活；而活化 的t a k l 与t a b l 发生作用，通过活化m a p k k 进一步激活j n k ，从而引起a p 1 家族的活 化。这是1 l 】信号传导的另一条通路。 i l 一1 l l - 1 r i = m 拓8 8 + l r a k + t r a f 6 + 。点 i ；( 1n f 南姻 士 a p 1n f ，k b 日c t i 均“0 na c t i v a 蛀o n 图3t a k l 在i l 1 信号传导通路中发挥作用的模型 f i g3 m o d e i f o r t h e m i e o f t a k l i n t l e i l - is i g i l a i i i n g p 甜l w a y 1 0 第二部分 实验部分 材料与方法 1 材料 1 1 组织材料 正常人1 8 周胎脑：胎儿由上海市第一人民医院提供，取全脑组织，用生理盐水洗去血 污后于液氮中冻存。 1 2 实验材料 h u m a l l m u l n d l et i s s u ec d n a p 锄e l ，美国c l o n t e c h 公司产品 h u m a n t h m o rt i s s u ec d n a p 柚e 1 ，美国c l o n t e c h 公司产品 h 啪a i lf e t a lt i s s u ec d n ap a l l e l ，美国c