（生物物理学专业论文）节旋藻形态建成相关蛋白（smr1）的分子特征及抗体制备.pdf

摘要 一、s m r l 的分离与纯化 通过对3 株节旋藻原螺旋形藻丝、由螺旋形变直的藻丝，以及直线彤回变成 螺旋形的藻丝所作的蛋白质s d s p a g e 分析表明，螺旋形与直线形藻丝间奄少 存有5 个差异蛋白，分别位于5 3 1 、5 2 0 、3 18 、2 1 9 和2 0 3k d a 处。以钝项节 旋藻s p 。s 为材料，对其中差异较明显、位于2 1 9k d a 处的蛋白( s m r i ) 进行 分离与纯化，主要步骤、技术参数与结果如下：( 1 ) 采用冻融法破芥节旋藻细 胞，s m r l 提取液的最佳p h 为6 8 ；( 2 ) 硫酸铵分级沉降可有效去除杂蛋白， s m r l 主要在硫酸铵饱和度为4 0 5 0 的级分中；( 3 ) 用t r i s h c i 缓冲液溶解 硫酸铵沉降级分并依次经s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶过滤层析、q s e p h a r o s ei ：f 强阴离 子交换层折后，剖得了i 乜泳纯的s m r 】，提取率约为柑提液总蛋白的00 6 5 。 二、s m r l 的分子特征 纯化后s m r i 的双向电泳分析显示，其纯度大 ：9 0 ，等电点( p i ) 为49 8 ： 刚一：色潜分析结果表明，s m r l 的二级结构中。螺旋、0 ，折叠和无规卷曲的组 成依次为3 l 、1 2 和5 7 。同时，e s i 。m s 鉴定结果显示s m r l 中有5 条肽 段、共5 3 个氨蟮酸的序列与藻蓝蚩白连接多肽c p c l 的高度一致，且分布于c p c i 笫3 0 1 0 l 位氮基酸残基i x j ；n 端测序结果显示s m r l 的n 端序列与c p c 的箱 3 0 4 4 位氮基酸序列完全一致；m a i ，d i ，t o fm s 测得s m r l 的精确分子量为 l6 7 1 2d a 。由上述结果推测$ m r l 很可能是一种由c p c i 基因表达并经修饰后形 成、氩基酸序列与c p c l 中第3 0 i7 1 位一致的同源蛋白。考虑到不同藻株问c p c i 基因的差异，我们应用p c r 等技术从s p s 中克隆出c p c h d 的操纵于并进行测 序，进而根据s p s 中s m r l 的核昔酸f 列推导得其氨基酸序列。生物信息学分 析结果显示，根扼s m r l 氨基酸序列预测出来的分子量、等电点、二级结构等 珲论值与测得的实验值非常吻合，并可能由7 个。一螺旋形成结构域，在节旋藻 形态建成中行使其生物学功能。 、s m r l 的原核表达及抗体制各 由于从节旋藻中提取并分离纯化s m r i 的得率低，难以满足抗体制备等实 际需要。夺研究应用转基因原核表达策略，通过对目的蛋白诱导温度与时间等表 达条件优化，并应用镍亲和层析等分离搜术获得了足量、电泳纯的s m r j 产物。 其中，所构建的表达顷粒中目的蛋白诱导表达的适宜温度为2 5 3 0 、时问为 6 - 12h 。 同时，进步以原核表达所获得的s m r l 为抗原，通过免疫黑眼纯种新西 兰兔制备抗体。菇进行了4 次免疫，每次免疫的蛋白量依次为】、0 5 、o 5 和 o 5m g 。晟后一次免疫结束两同后，颈动脉放血并收集血清。通过间接e i _ ，i s a 捌w e s t e r nb l o t 对所制抗体的特异性和效价等分析表明，效价高达1 ：5 1 2 0 0 ，日 均能与原核表达的s m r l ，以及节旋藻中的s m r l 发生免疫反应。这说明所制备 s m r l 抗体的效价高、特异性好，从而为进一步利用免疫共沉淀、蛋白质互作、 蛋向质芯片等技术深入研究并揭示s m r1 对节旋藻形态建成的生物功能与调控 婀络等奠定基础。 关键词：饨顶早旋藻；形态建成：蛋白质：分离纯化；分子特征；原核表达 抗体 i i a b s t r a c t lt i l ep u r i f i c a t i o no fs m r l t h ep r o t e i n ss d s p a g ea n a l y s e so ft h ew i l d - t y p ed r t h r o s p i r ap l a t e n s i ss t r a i n s s p s ，s p ba n ds p - tw i t hr e g u l a rh e l i c a lm o r p h o l o g y ，a n dt h e i rc o r r e s p o n d i n gl i n e a r v a r i e t i e sa n dt h er e v e r t a n tv a r i e t i e sw e r ep e r f o r m e dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r e w e r e5 s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t b a n d si nc o l r l m o l lb e t w e e nt h eh e l i c a la n dl i n e a r f i l a m e n t s 、w h i c hw e r el o c a t e da t5 31 ，5 20 ，3i 8 ，21 9a n d2 0 3k d a ，r e s p e c t i v e l y f m - t h e r m o r e ，u s i n gt h ef o l l o wp r o c e s sa n dc o n d i t i o n s ，t h em o s ts i g n i f i c a n tb a n da t 2 1 9k d aw a sp u r l f l e df r o ms p s f i r s t l y , t h es o l u b l ep r o t e i ne x t r a c l sw a se x t r a c t e d w i t ht r i s ，h r c l ( p l i68 ) ，s e c o n d l y ，i no r d e rt or e m o v ep a r to fo t h e rp r o l e i n se f f e c t i v e l y t h ec 1 + a d ee x t r a c tw a sp r e c i p i t a t e dw i t ha n l n l o n i t l ms u l f a t ei n 4 0 5 0 0 ；s a t i n a l i e n i q n a l l y ，t h er c d i s s o l ，e dp r e c i p i t a t ew a sa p p l i e dt os e p h a c r 3 1s - 2 0 0g e l - f i l t r a t i o na n d q s e p h a r o s e f fa n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yi nt u r n ，a n dt h ee l e c t r o p h o 1 e s i s p u r i t i e ds m r 1w a so b t a i n e da n di t sy i e l dw a sa b o u to0 6 5 2 t h ei l l o l e c u l a l c h a r a c t e r i s t i c so fs m r l t h ej 。e s u l te l 2 - d ea n a l y s i ss h o w e dl h a tt h ep ie l j s m r l a s4 9 8a n dt h ep u r i t y o fp r e p a r e ds m r le x c e e d e d9 0 t h es e c o n d a r ys u l 1 c t t l r eo fs m r lw a si n v e s t i g a t e d b yc i r c t a rd i c h r o i s ma n a l y s i s a n dt h e r e s u l tr e v e a l e dt h a tt h ec o o l e n to | c 【一h e l i x 3 - s h e e ta n dr a n d o n 1c o i lo fw a s31 12 a n d5 7 ，r e s p e c t i v e l 3p t n - t h e l 1 1 1 0 r e ， h e e s i m sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ed e t e c t e d5p o l y p e p t i d e s ( c o n t a i n5 3a m i n oa c i d s ) b e l o n g e dt oc p c l ，a n dl h em a l c h e ds e q u e n c e sw e r ed i s t r i b u t e di nt h e3 0 1 i l 】0 1 5 a m i n o a c i d m o r e o v e r , t h en t e r m i n a ls e q u e l l c eo fs m r lw a sc o m p l e t e l ) ，m a t c h e dw i t ha s e c t i o no f c p c i ，a n dt h ee x a c tm o l e c u l a rw e i g h to fs m r l 、v a s16 7 1 2d a ，w h i c hw a s d e t e r m i n e db ) ，m a l d i f o fm s a c c o r d i n gt ot h er e s u l t sa b o v e ，i tv 、：a ss p e c u l a t e d t h a ts m r 1w a sah o m o l o g u eo fc p c lw i t hi d e n t i c a la m i n oa c i ds e q u e n c e ，a n dw a s f o r m e db yc l e a v a g ea n dm o d i f i c a t i o no fc p c l i lw a sr e p o r t e dt h a tt h en u c l e o t i d es e q u e n c e so fc p c lw e r ed i f f e r e d w i t h a r t k r o s p i r as t r a i n t h u st h ec p c h i do p e r o ni na r l h r o s p i r as p sw a sc l o n e da n d s e q u e n c e d ，a n dt h e nt h ea m i n oa c i do fs m r lw a sd e d u c e da c c o r d i n g t ot h e c o r r e s p o n d i n gn u c l e i o t i d es e q u e n c e t h a nt h et h e o r e t i c a ld a t ao fm o l e c u l a rw e i g h t ，p l a n ds e c o n d a r ys t r t l c t u r ow a sp r e d i c t e da n db ec o m p a r e dw i t ht h ee x p e r i m e n t a lo n e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h et w ok i n d so fd a t aw e r ec o n s i s t e n t m o r e o v e r ，i tw a s r e v e a l e df r o mt h ep r e d i c t e ds e c o n d a r ys t r u c t u r et h a ts m r id o m a i nw a sc o m p o s e do f 7d h e l i xs e c t i o n s ，w h o s ef u n c t i o nw a si n v o l v e di nm o r p h o g e n e s i so fa r t h r o s p i r a ， p r o b a b l y 3 e x p r e s s i o na n di t sa n t i b o d yp r e p a r a t i o no fs m r i i l v a ss od i f f i c u l tt op r e p a l es u f f i c i e n ts m r lf r o ma t l k r o s p i r af o rp r e p m l i n g a n t i b o d y rt h a tw et u r n e d t oe x p r e s ss m r li nec o ia f t e rs l u d i e dt h ee x p r e s s i o n c o n d i t i o n s s u c ha si n d u c e dt e m p m a t u r ea n di n d u c e dt i m e ，i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a t t 1 1 ef e a s i b l et e m p er a t u r ea n dt i m et b re x p r e s s i o no fs m r lw e l e2 5 3 0o ca n d6 1 2h 1e s p e c l i ，e l y f i n a l l y t h ee x d i e s s e dp r o d u c tw a sa p p l i e dt on i a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y f o ro b t a i n i n gs m r lw i t hh i g hp m 。i t 3 f u r t h e l i n o l e ，1 1 1 ea n t i b o d ya g a i n s te x p i _ e s s e ds m r lw a sp r e p a r e db yi m m u n i z i n g t h ep u r e b l o o dn e wz e a l a n dr a b b f l sf o r4t i m e st h eq u a n t i t yo fs m r 1f o re 、，e r yt i m e w a s1 ，0 5 ，o5a n d0 5n 堪，i l lu , l r n t h a nt i l em l t i b o d 3 i ( a n t i s e r u m ) w a sc o l l e c t e di n2 w e e k sa f t e rt i l el a s ti m m u n i z a t i o n ，a n dw a sd e t e r m i n e di t sl i t e ra n ds p e c i f i c i t y , w i t h i n d i r e c te l s aa n d 、 r e s t e r nb l o t t h er e s u r si n d i c a t e dt h a tt i l ea n t i b o d ya g a i n s t s i v l r1w a sw i t hat r i e re l 、1 ：512 0 0 ，a n db o u n ds p e c i f i c a l l yt oe x p r e s s e ds m r la n d 爿，一l h l o s p i ，4 “s m r l e i t h e r t h e r e b y ，t h e f u n c t i o no fs m r ii n a s l t h l o s p i ， ， m o r p h o g e n e s i s c o u l db er e v e a l e db ys o m ei m m u n o l o g i c a ln l e t h o d s s u c h a s c o i l n i m 】n o p r e c i p a t i o n a n dp r o t e i nm i c r o a r r 3 i k e 3w o r d s ：ap 4 t h r o s t ) i r ap l a l e n s i s ；m o r p h o g e n e s i s ；p r o t e i n ；p u r i f i c a t i o n ；m o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；a n t i b o d y , v 缩略语 v 双向电泳 过硫酸铵 牛血清自蛋白 圆二色谱 二硫苏糖醇 蒸馏水 脱氧核苷二磷酸 乙二胺p q 乙酸二钠 晦联免疫吸附实验 电喷雾电离质暗 光漂白荧光恢复技术 叔氧水 异丙基b d 一硫代半乳糖苷 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 硝酸纤维素膜 天然聚丙烯酰铵凝胶电泳 磷酸缓冲液 j 二游引物 苯甲基磺酰氟 下游引物 聚偏氟乙烯膜 十二烷基磺酸钠 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰铵凝胶电泳 节旋藻螺旋形态建成相关蛋白 t a q 聚合酶 n ，n ，n ，n 。四甲基对乙二胺 免疫印迹 昕 旺 e m m 鹏 瞰 唧 唧一一 一 一 一耋：一 一雌一 嘟 卧 一 腿一哪 一 淞 一一 一 致谢 春华秋实，寒暑糊易，回想两年的硕士生涯，：受益良多，感慨万千。在此论 文繇挎完成之际，蓬以诧文献绘所有关心弱帮助我静入。 首先嚣感谢的是我的导师江志平博j 二，一位严谨又不失灵活，冷静而兼具开 拓思想的年轻科研一c 作者。十多年来，老师一直致力于肖旋藻形态建成方面的研 究，瓿藻程；保存瓤蛋l 鑫研究，坚守子秘研一线。论文的选题、实疆黥漫罚一、数据 的分帮亍元不凝聚着老判j 心向。老师岛强裔斗的人生哲学，严谦进取的治学精神 和乐观向上的q 三活态度，使我受益曛浅。 惑谟| 我的师j 扬突受硕在实验中给予的窦菠蘩助积建竣链意见；在生活中 给予的关心和照顾：在我身处逆境时给予的支持和鼓励。 感谢书所陈了元院士、华跃进所长、沈圣泉* 配、徐步进教授、叶庆富教授、 崔海臻教授、l 鞋鹱茏副教授、黄建巾尉教授、傅俊杰燕 i 教授、张永熙鼷教授、孙恚 明高级实验师、赵小俊实验师、柴巍红老师以及本所其他老师对我的关心和支持。 感谢作物研究所邬飞波教授在学习、工作和生活诸方面的关心和支持。 感淤零实验室马美簿硬、营学成博士、划憨耀颈、鄂风蓬颈、赵鞭溥 1 _ 、黄晖硕士、李雪斌颈上、周晓月等同学在学习与，! l 活h 给予的关心、帮助稳 照顾。 特剐感罄溪江大学研究坐处领豢及农i 2 与生物技术学陵谤究生摹喜袁熙贤老 师、马永芳老师、吴晓鼎老师的热情指导与帮助。 感游窭友徐g i 硕士、宋艳龄硕：b 、何李黎硕士、蓖静硕士别+ 我早出晚归的包 窑，熊钔i 远在穗乡的我惑受期家庭般的温暖，在此由衷缝对你们说声，溺辫! 感谢我的同学隳嘲友方剑英、吴迪瑶、陈胜、计琳婷、蔡维秩、陈默、关叶 飞、张珊珊、沈晓贤、林君、陆辉明等给予的关心和支持，是体们让我的生活变 褥多姿多彩，我蜂永远珍蠖这纯囊携友谊。 最后，我要特别感谢我的父母和妹妹，是你们一直在背后默默支持着我，鼓 扇着我，绘我无微不至的关怀。哉将以我的一生作为回报，你们的微笑才是我努 力靛曩终掰檬。 际唬燕 2 0 0 6 年5 月于杭卅i 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 节旋藻( a r t h r o s p i r a ) 系蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 、颤藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、 颤藻科( 0 s c i 】l a i o r i a c e a e ) 的一个属，是种光合放氧的原核丝状微藻( 胡鸿钧： 1 9 9 7 ) 。目时已发现这个属至少有钝顶节旋藻( a r t h r o s p i r a p l a t e n s i s ) 极大节旋藻 ( a r t h r o s p i r am a x i m a ) 、盐泽节旋藻( a r t h r o s p i r as u b s a l s a ) 等3 8 个种其中钝 顶节旋藻和极大节旋藻已是困内外研究最多，并己实现商业化丌发应用的两个 种。廿旋藻与其同科的螺旋藻( 勋i r u l i n a ) 因分类学上的历史原因，两者间在属 的划分和归类上长期混淆并存有分歧。现代分子系统学等最新研究成果支持将节 旋藻和蝶旋藻划分为颤藻利下的两个并列的属，而以往大量研究并应用于商业化 生产丌发的所谓的“j 螺旋藻”，实际上应属节旋藻。目前，国内外较为普遍的观 点是在产品和产业上因习惯原因仍用“螺旋藻”，或者在“螺旋藻后括号内注“节 旋凛”，即螺旋藻( 节旋藻) ，但存学术论文则应采用已被广人学者普遍接受的“节 旋藻”这一属名( n e l i s s e ne ta ，l9 9 4 ；v o n s h a ko fa 1 2 0 0 0 ：胡鸿钧，2 0 0 3 ) 。 掘考古学家推测，节旋获早在3 5 亿年前即己存在于地球，1 ，是最早出现的 光合印物之一f s c h o p p , 】9 9 3 ) 。虽然节旋藻细胞中不存在高等植物所具有的叶绿 体，但它仍能利用光能将c 0 2 转化为育机! 物，f l 光能 化苹高达18 ( c i f e r r i 1 9 8 3 j 。除其高效窭曼的光合作用外，节旋藻另一个引人注目的特点就是其极高的 营养价值。它刁i 仅含有大量的蛋白质( 6 0 7 0 ) ，而且所含的多糖、b 嗣萝i 、 襄、y j 麻酸、矿物质、维生索等生物活性物质具有促进新陈代谢、增强机体 免疫力、延缓衰老等功效，并对癌症、刖：炎、糖尿病和高血脂等多种疾病有显著 的预防和辅助治疗作娟( 张晓1 9 9 9 ；s w i t z e r 1 9 8 2 ；s a a c h e ze fa 1 2 0 0 5 ；b e l a y ： 2 0 0 2 ) 。因此，节旌藻被联合圈粮农组织和世界卫生组织分别誉为“2 l 世纪昂理 想的食品”和“2 j 世纪的最佳保健品”( 吴丌围，1 9 9 8 ；李定梅，19 9 5 ) 。 1 节旋藻的形态特征及其多形性变异 1l 节旋藻的形态特征 节旋藻的藻丝( f i l a m e n t ) 是山许多圆柱状细胞连结而成的单列丝状体，其 典型的形态学特征呈疏松或紧密的有规则的螺旋形( h e l i c i t y ) 或波浪形 浙江大学硕士学位论文 ( u n d u l a t i o n ) ，两端钝圆，无分枝、无异形细胞，长约5 0 0i x m ，宽约6 1 2 “m ， 螺径约3 0 7 0u m ( s f i n c h e ze ta 1 ，2 0 0 5 ；o r i c ，1 9 8 3 ) 。 市旋藻细胞呈圆柱形，其中无细胞核和细胞器，只具有拟核区和类囊体等结 构。节旋藻细胞壁具有四个结构层次：最外层的氨基酸组分比例类似于革兰氏阴 性菌；第三层可能是缠绕于藻丝体上的蛋白质小纤维；第二层为肽聚糖层，它可 以向藻丝的垦面折叠，并与第一层共同形成分隔细胞的内厢隔，该隔层可能与藻 丝体的螺距有关( v a ne y k e l e n b m g ，1 9 7 7 ) 。这四层结构中的肽聚糖层是最为坚硬， 它是维持细胞刚性的主要结构。此外，肽聚糖层还具有7 l 洞结构( p e r f o r a t i o n ) ， 有学者推测它可能与藻丝体的运动和形态相关( p a l i n s k ae ，a 1 ，2 0 0 0 ) 。 l2 节旋藻的多形性 节旋藻的典型特征虽为螺旋形或波浪形，但其藻丝体长度、蝶旋度等形态学 特钲却存在较大差异，即节旋藻的多形性( p o l y m o r p h o l g y ) 。李晋椭( 2 0 0 2 ) 对 7 株g ! 长于不同环境条件的的钝顶节旋藻进行了娃微分析，发现这些藻株的藻缝 体具有紧密螺旋形、疏松螺旋形利波浪彤种形态，并且各藻株的藻丝氏、螺旋 数、螺旋长度等形态学参数也存在较大差异，有时町相差数倍，甚至十几倍( 汪 志平等，19 9 8 a ) 。即使生长于同一环境，节旋藻也具有许多不同的形态特征。b a i 等( 1 9 8 0 ) 指出生长在南非马度赖淡水湖中的节旋藻具有三利叫：尉的形态，分别 为s 型( 纺锤彤) 、c 型( 哑铃形) 和hj 型。进一步的研究表明，这三种形态之 间存在着_ 、日- f t 转变的现琢( b a ie ta 1 ，1 9 8 0 ；h i n d a k 1 9 8 5 ) 。 12 】 环境因子引起的节旋藻多形性变异 众多研究表明，坏境因子( 光照、营养等) 的改变会诱导节旋藻发生形态上 的变异( 表1 1 ) 。当光照较强( 1 0k l x ) 或紫外线强度较高时，藻丝体的螺旋 度堵大，呈现较紧密的螺旋形念；光强较弱时，则反之( b a ie t 口f ，1 9 8 0 ；尤珊等， 2 0 0 2 ；w ue l 甜、2 0 0 5 ) 。这种形态变异可能是节旋藻自我保护的种机制，藻丝 体通过增大螺旋度使自身的受光面积缩小到最低限度，从而减小高光强或紫外线 引起的损伤( w ue t 口2 0 0 5 ) 。当环境中营养元素缺乏时，藻丝体的螺旋度也会 增人，笔者认为节旋藻可能通过这种形态的改变来减少受光面积，以降低光合作 用，从而减少别营养元素的需求使自身适应营养缺乏的环境。温度也是影响节旋 藻形念的重要环境因子之一，温度升高可加大藻丝体的螺旋度或改变螺旋方向 ( 如左旋变为右旋) ( 汪志平，2 0 0 0 ；m u h l i n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。据报道，当环境温度 升高时，节旋藻细胞中不饱和脂肪酸的含量会降低，从而影响细胞膜的流动性， 该现象是否与藻丝体的形态变异相关还有待进一步的研究( h o n g s t h o n ge ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。其他环境因了，如p h 、搅拌、培养基类型等，包会对节旋藻的形态产d i 较大影响( 表1 1 ) 。 然而，因环境条件变化较大而使正常形态的节旋藻无法承受时，藻丝体会完 全失去螺旋形态，变为直线形，且能够稳定遗传( 吴丌图，1 9 9 8 ；i , e w i n ，1 9 8 0 ) 。 进一步研究表明，藻丝体处r 最佳的生长条件时，螺旋形藻丝体的数量较直线形 的多；而生长条什变差时，则 n 现相反的现象( b a i ，1 9 8 5 ；汪志平等，】9 9 7 ) 。b a i ( 1 9 8 5 ) 认为直线形藻丝1 1 4 = = 是螺旋形的突变你，而且它对恶劣环境的耐受能力较 强。w a n g 等( 2 0 0 5 ) 进一步指出，直线形藻丝体可能是节旋藻适应极端恶劣环 境的种机制。 1 2 2 诱变因子引起的节旋藻多形陀变异 人们在列节旋藻进行历变育种时，发现诱变后的藻丝体h 现较大的形态变异 ( 表l 一2 ) 。y 射线对节旋藻的形态具有明显的诱变效应，高剂量( 10 0k r a d ) 辐照能伎藻丝休明显变短且螺旋度减小，呈现短直的趋势( 胡天蜴等，19 9 0 ；汪 志平等，1 9 9 8 a ；汪志平等，1 9 9 8 b ；龚小敏等，1 9 9 6 ；汗志平等，1 9 9 7 ) 。而当高剂量 y 一荆线作用于藻细胞或短的藻丝片段时，山该藻细胞或藻丝片段发育而成的藻 丝体变得超氏，是野生型藻丝体长度的1 8 1 5 倍( 胡天赐，19 9 0 ；汪忐平， 19 9 8 a ) 。低剂量( 3 0r a d ) y 射线辐照对节旋凛的历变效应较少见报道，但其可 能具有使直线形藻丝体回变为螺旋形的潜在效应( 汪志平等1 9 9 7 ) 。近年来，激 光电丌始应用于节旋藻的诱变育种，其诱变效应为：藻丝体变短，螺旋度减小， 甚至变为直线彤，与高剂量y 射线的历变效应相似( 赵炎生等，1 9 9 7 ；赵萌萌等， 2 0 0 5 ；陈必链等，2 0 0 0 ) 。 化学诱变剂也能引起节旋藻的多形性变异。研究表明，经甲基磺酸乙酯 ( e m s ) 处理的节旋藻藻丝体会变长且螺旋度有所增大( 张学成等，1 9 9 0 ；崔海 浙江大学硕士学位论文 瑞等，1 9 9 7 ) 。有趣的足，亚硝基胍( n t g ) 对节旋藻藻丝体的诱变效应恰好与 e m s 相反，它可使节旋藻藻丝体变短，且螺旋数目减少( 殷春涛等，1 9 9 7 ) 。由 此词见，不同的诱变园子司能引起节旋藻形态向两个截然不同的方向变异。 表1 1环境因子对节旋藻形态的影响 f a b l e1 一it h ee f f e c t so f e n v i r o n m e n tf a c t o r so nm o r p h o l o g yo f a r l h r o s p h l a 环境因子藻丝体形态特征文献 光照光照强( 1 0k l u x ) ：藻丝体较长、较粗，蝶旋度尤珊等，2 0 0 2 大，上浮性差。 光照弱( 1 0 5 ：藻丝体变短、老化裂解。 p h 1 1 0 ：裂解严重。 浙江大学硕十学位论文 表1 2诱变因子对节旋藻形态的影响s t a b l e1 - 2t i l ee f f e c t so fd e n a m m j _ 1 t so nm o r p h o l o g yo f a r t h r o s p i r a 4 e m s ：甲基磺酸乙酯：n t g ：弧硝基胍。 浙江人学硕十学何论文 2 节旋藻形态建成机理研究进展 节旋藻中普遍存在多形性现象，当环境条件发牛变化或存在诱变园子时，其 藻丝体形态将发生变异，甚至出现直线形。值得注意的是，藻丝体一旦变直就难 以回变成螺旋形态，并能将其形态稳定地遗传给后代。在生产一卜，变直的节旋藻 会造成产量急遽下降、质量变差、藻丝体难以采收及易受颤藻( 会产生藻毒素) 污染等一系列严重问题，而带来重大的经济损失。同时，变直的藻丝体胙以回变 为螺旋形的特性使优良品种在生产中失去应用价值，阻碍了节旋澡的大规模生产 与丌发。冈此，迫切需要阐明节旋藻形态建成的外界影响凼子及内在调控机理， 以指导生产实践，并为进一步揭示生物形态建成这一重要课题奠定皋础。 2 0 多年爿，节旋藻的多形性一直受到人们的关注( l e w i n 、19 8 0 ；i i i n d a k 1 9 8 5 ： 汪忐平等，19 9 7 ；m t l h l i n ge fa l ，2 0 0 3 ；w a n ge t ，2 0 0 5 ) ，但是有关l ：节旋藻形态 变异利形态建成机理的研究却仍处于初步阶段。1 9 8 0 年，e y k e l e n b u r g 等在电了 显微馈f 观察到节旋藻横膈膜和细胞形态变异的现象，并1 妇此指出节旋藻的形态 可能与细胞壁f 1 k 聚糖层相关。m i l h l i n g 等( 2 0 0 3 ) 通过研究节旋藻中螺旋方嘲 逆转的现象，进一步表明节旋凛的形态变异与肽聚糖层中出现某种新物质何关。 然而，这些新物质是由肽聚糖层中原有物质转变而来，还是通过某利，途径传送全 肽聚摊层的呢? 超砬微结构显示，节旋藻的肽聚糖层具有孔洞( p e r f o , a t i o n ) 结 构，推测细胆可能通过孔洞分泌某种物质以维持螺旋形态( p a l i n s k ag ，“，、2 0 0 0 ) 。 总之，作为维持细脞刚性的重要结构，肽聚糖层在节旋藻形态建成机理的研究t 一 透渐受至i 的重视。 与此同时，w a n g 等( 2 0 0 5 ) 从分子遗传学角度对节旋藻的形念建成机耻进 行了研究。结果表明当节旋藻m 螺旋形转变为直线形时，不仅在形态上发生了变 异，而且在遗传水平上电发尘了改变。值得指出的是，当仃旋凛由直线形回变为 螺旋形时，其遗传水平上的改变也随之回复。白此，汪志平( 2 0 0 0 ) 提出了节旋 藻j 钐态建成的转座予调控模型，即当节旋藻转座子插入形态建成相火基因时，使 该基因失活，进而使藻丝体变为直线形：当在外界刺激的作用l i ，转座子从形态 建成相关基冈卜脱落，使该基因f 常表达，从而使直线形藻丝体回变为正常的螺 旋形态。 浙江人学硕士学位论文 3原核生物形态建成相关蛋白的研究进展 桐对于节旋藻而言，其他原核生物，如大肠杆菌、枯草杆菌等，在形态建成 机理方面的研究要深入得多，这为进一步研究节旋藻形态建成的机理提供理论借 鉴和奠定技术基础。 结构简单的原核生物电具有多种多样的形态，如球形、杆状、螺旋状等。但 是f q - 种物质决定了原核q 一物的形态昵? 人们首先想到的是维持细胞刚性的细胞 壁，并指出细胞壁是以合成新物质并将其插入肽聚糖层的方式米调控细胞形态建 成的( i i e n n i n ge la 1 ，1 9 7 2 ；b r a u ne ld f ，19 7 3 ；d r i e h u i se ta 1 ，1 9 8 7 ) 。随后，人们 发现原核细胞中也存在细胞骨架蛋白，如m r e b 、c l _ e s 等( m a y e r ，2 0 0 3 ；o r a u l n a n n ， 2 0 0 4 a ) 。由此，细胞生物学家认为原核细胞骨架蛋白才。足决定和维持细胞形态建 成的主要物质。进一步的研究表明，原核细胞胃架蛋白的结构与功能密切相关， 即它们需要装配形成一定的结构，刊能行使其控制形态建成、凋控细胞分裂等一 系列功能( a m o se a l ，2 0 0 4 ；m o l 】e 卜、et l s e l _ e ld ，2 0 0 5 ) 。 31 m l e b 的结构与功能 人们在研究细菌形态建成机制的过程中，发现了一种与杆状细胞形态建成j ? j 关的基因，b ( m u r e i nc l m r t e l eb ) ( w a c h ip ，a l ，1 9 8 7 ) 。此后，人们对t f l r e b 及其编码产物m 1 e b 的结构、功能等方面展丌了进一步的研究，结果发现m r e b 足肌动蛋自丝( a c t i nf i l a m e n t ) 的类似蛋白，且具有凋控细胞j i ；态的功能( b o r ke t ( ，19 9 2 ：v a nd e ne n tc ，a l2 0 0 1 ) 。 3 1 1m r e b 的结构 与肌动蛋白丝类似，m r e b 也以螺旋丝状结构( h e l i c a lf i l a m e n t o u ss t r u c t u f e ) 的形式仔在于细菌细胞中。m r e b 币体先聚合形成单链，再由两条单链相互缠绕 形成一条m r e b 原丝，最后由多条m r e b 原丝装配形成螺旋丝状结构环绕于细胞 膜内壁上( 图1 1 a ) ( j o n e se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。值得指出的是，在bs u b t i l 曲中还存在 一种m r e b 的类似蛋白( m r e b 1 i k ep r o t e i n ，m b l ) ，它也能装配形成螺旋丝状结 j 匈( 图1 1 b ) ( j o n e se t 以，一2 0 0 1 ；a b h a y a w a r d h a n ee ta 1 ，1 9 9 5 ；d e f e us o u f oe ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。有所不同的是，m r e b 的螺旋丝状结构主要定位于细胞中部，在细胞两极 浙江大学硕： 学位论文 几乎不存在；而m b l 的螺旋丝状结构则从细胞一极延伸到另一极，且螺距 【( 1 7 0 _ + 0 2 8 ) l m 明显大于m r e b 螺旋丝状结构的螺距 ( o 7 3 o 1 2 ) “m ( j o n e se ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 c a r b a l l i d 。一l 6 p e z 等( 2 0 0 3 ) 在运用光漂白荧光恢复技术( f l u o r e s c e n c er e c o v e r y a f l e rd h o t o b i e a c h j l l g f r a p ) 研究b s u b t i i i s 的m b l 螺旋丝状结构时发现，它也 是一种动念结构，即会在细胞膜下面沿着自身的螺旋轨迹旋转。d e f e u - s o u f o 等 ( 2 0 0 4 ) 利用时间间隔显微镜对绿色荧光蛋白标记的m r e b 和m b l 进行研究，也 得到了与c a l - b a l l i d o l d p e z 等( 2 0 0 3 ) 类似的结论，即bs u b t i l 打中的m r e b 和 m b l 的螺旋丝状结构都能沿着自身的螺旋轨迹转动，且在1r a i n 之内就可以完成 3 6 0 。的旋转。g r a u m a n n ( 2 0 0 4 a ) 指出这种运动可能是一种潜在的细胞动力来 源。 a b 图1 - 】m l e b ( a ) # nm b l ( b ) 装配所形成的结构 f i g1 1 t h es t r u c t l l r e sa s s e m b l i e dw i t hm r e b ( a ) a n dm b l ( b ) a ：m ! 矗秆状纲菌纲胞麒内世装配形成的螺旋丝状结构，b ：m b l 在杆状细菌细胞膜内壁 装配形成的螺旋丝状结构：a 、b 均由笔者根据参考文献( j o n e se l 口7 ，2 0 0 1 ；a b h a y a u a l d l n a n e e la l 一1 9 9 5 ；d e f e us o u f oe l 口f ，2 0 0 4 ) 绘制。 312m l e b 的 三要功能 m r e b 是一种润控杆状细胞形态的重要决定蛋白质( j o n e se ta 1 ，2 0 0 1 ；f i g g e e ta 1 2 0 0 4 ) 。研究表明，若ec o i l 、s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 和bs u b t i l i s 等杆：i 尤 细菌中的m r e b 发生突变，则导致菌体变成球形( f i g g ee la 1 ，2 0 0 4 ；d o ie la l ， 1 9 8 8 ：g r a u m a n ne ta f 。2 0 0 4 b ) 。另外，存在于bs u b t i l 打中的m b l 也与杆状细胞 的形态建成相关，且与m r e b 共同调控b s u b t i l i s 细胞的形态( j o n e se la l ，2 0 0 1 ) 。 浙江大学硕士学修沦文 j o n e s 等( 2 0 0 1 ) 分别对口s u b t i l 括的m r e b 突变株和m b l 突变株的细胞形态进行 了研究，并发现n - z r e b 突变株的细胞形态异常主要表现为细胞呈球形或变宽，而 m b l 突变株的细胞形态异常则主要表现为细胞伸长和无规卷曲。可见，m r e b 主 要参与调控细胞的宽度，而m b l 主要控制细胞的长度和保持细胞长轴方向的直 线性。近年来，人们已通过研究进一步发现m r e b 和m b l 可能是通过凋控细胞壁 合成来调控杆状细胞的形态建成。例如，c a u l o b a c t e r 仃e s c e n l u s 的自h 胞壁合成受 m r e b 调控，而bs u b t i l i s 的细胞壁合成则受m b l 调控( c a r b a l l i d o l d p e ze ta 1 2 0 0 3 f i g g ee t 日f ，2 0 0 4 ；d a n i e le ta i ，2 0 0 3 ) 。 此外，m r e b 还是细胞存活矛u 染色体分离所必需的物质( g r a u m a n n 2 0 0 4 a ： k r u s ee la 1 ，2 0 0 3 ：d e f c us o u f oe ld f 。2 0 0 3 ) 。 32 c r e s 的结构与功能 为研究新月柄杆卣( c a u l o b a c t e s 。仃c s c c b s ) 细胞形态建成的调控机制， a u s l n e e s 等( 2 0 0 3 ) 运用1 1 n 5 转座予插入技术构建了两个新月柄杆菌的形态突变 株，并利