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吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽及其生物活性的研究 摘要 食品工业的飞速发展迫切需要具有功能特性和营养特性的蛋白质，作为食品 的原料成分或添加基料。因此，一方面要大力开发具有优质特性的蛋白质资源， 另一方面是要对现有的蛋白质( 尤其是植物蛋白质) 进行改造，以满足人类的特 殊要求。这就是通常意义上的改性蛋白质。由于现有的大多数蛋白质来源丰富， 价格低廉，所以采用特定目的的改性技术，就可以获得较高的经济效益。 蛋白质是由各种氨基酸相互联接而构成的具有空间结构的生物大分子，其理 化性质( 尤其分子量、氨基酸组成、静电荷和表面疏水性等) 和功能特性直接相 联系。蛋白质改性就是用生化因素( 如化学试剂、酶试剂等) 或物理因素( 如热、 射线、机械振荡、电磁场等) 使氨基酸和多肽链发生某种变化，引起蛋白质大分 子空间结构和理化性质的改变，从而获得较好功能特性和营养特性的蛋白质。然 而，单一的改性技术往往不能达到目的。 大豆蛋白质营养价值高，资源丰富，原料成本低。除了提供人体所必需的氨 基酸外，还具有一定的加工特性和生理活性。然而，大豆蛋白质在现代食品加工 中的应用受到一定的限制。这是因为：首先，大豆蛋白的功能性质还不能满足现 代食品加工的需求；其次，大豆制品易产生异味；再次，有些大豆制品的生物效 价低。为此，加强或改善大豆蛋白的功能特性和生物活性，开发新的功能食品， 成为食品及医疗保健业亟待解决的问题。 大豆肽是大豆蛋白经酶促水解后形成的一定分子量范围的多肽混合物。在氨 基酸组成上，大豆肽几乎与大豆蛋白相同，富含人体必需的氨基酸。与大豆蛋白 相比，具有良好的理化性质和生理活性所以酶促水解大豆蛋白生产大豆肽是大 豆深加工的一个重要方面。在食品、医疗等领域均有广泛的开发和应用前景，大 豆肽的研制与应用备受国内外的关注。 本试验采用生物物理和生物工程技术相结合，既物理方法预处理与酶结合， 生产大豆肽。 对各种预处理方法进行比较，发现采用微波处理效果明显，能使水解度提高 5 以上，基于生物物理学中电磁学理论，论证了微波处理效果显著原因。在大 豆蛋白酶解制备大豆肽领域中，采用微波等物理因子预处理为大豆肽的制备工艺 添加了一个新的亮点。能提高水解度、缩短水解时间、从而提高经济效益，这在 食品加工中有重大意义 大豆肽的水解精制工艺最佳条件：温度为5 5 ，p h 为9 5 ，底物浓度为2 ， 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 酶与底物比为6 ，水解l h ，此条件下，水解度为9 2 2 7 。 通过添加1 海胜碳对大豆肽进行脱臭、脱色及脱苦处理，可获得色清、味 好的大豆肽。并对脱苦机理进行系统分析通过阴阳离子交换柱可去除9 5 1 的 盐分，得到精制的大豆肽。 大豆肽的功能特性研究结果表明：在5 0 的高浓度大豆肽仍具有较好的流动 性；在5 以下有较好的着色度；在不同的p h 范围内有较好的溶解性；并具有良 好的乳化性及乳化稳定性，在食品工业中具有良好的加工特性。 本试验对大豆肽的生理活性进行了研究，发现大豆肽具有抗氧化性、促进发 酵、降血脂、抗疲劳等活性。其作为功能性保健品具有深远意义。 关键词：大豆蛋白大豆肽酶水解 h 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 a b s t r a c t t h ep r o t e i no ft h en o u r i s h m e n t a lc h a r a c t e r i s t i ca n dt h ef u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c i s u r g e n t l yd e m a n dw i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h ef o o di n d u s t r y , u s e da s t h er a w m a t e r i a lc o m p o s i t i o na n dt h ea d d i t i o n a lo ft h ef o o d t h e r e f o r e i ti sn e c e s s a r yt o d e v e l o p t h eh i g h q u a l i t yc h a r a c t e r i s t i cp r o t e i nr e s o u r c e st oc h a n g et h ec u r r e n tp r o t e i n ( p l a n tp r o t e i np a r t i c u l a r l y ) t os a t i s f y d e m a n do ft h ep r o t e i n t h ec u r r e n tm a j o r i t y p r o t e i nr e s o u r c ei sa b u n d a n t ，t h ep r i c ei sc h e a p ， s oy o uc a na c q u i r et h eh i g h e ra n d e c o n o m i cp e r f o r m a n c e b y t h e p a r t i c u l a rp u r p o s em o d i f yt e c h n i q u e p r o t e i ni sc o n s t i t u t e dm u t u a l l yb ye v e r yk i n do fa m i n oa c i d s ，a n di th a ss p a c e s t r u c t u r e i t sp h y s i c sa n dc h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c ( p a r t i c u l a r l yt h em o l e c u l a rw e i g h t ， a m i n oa c i d sc o n s t i t u t e s ，t h es t a t i ce l e c t r i c i t y , a p p a r e n td i s p e r s ee t c ) c o n t a c tw i t h f u n c t i o nc h a r a c t e r i s t i cd i r e c t l ya n d m u t u a l l y t h em o d i f ys o yp r o t e i nc a nb ed o n eb yb i o c h e m i c a lf a c t o r ( c h e m i s t r yr e a g e n t ， e n z y m er e a g e n t ，e t c ) o rp h y s i c a lf a c t o r ( h e a t i n g ，r a d i a t i n g ，m a c h i n ef l a p p i n g ) ，w h a t t a k ep l a c ea m i n oa c i d sa n dp e p t i d ec h a i nb ys o m ec h a n g e ，c h a n g i n gc a u s e dt h eb i g n u m e r a t o ri np r o t e i ns p a c ec o n s t r u c t i o nw i t ht h ep h y s i c sa n dc h e m i s t r y b u ta c q u i r e d p r o t e i n w i t ht h ef o o df u n c t i o nc h a r a c t e r i s t i ca n dt h en o u r i s h m e n tc h a r a c t e r i s t i c h o w e v e r , i tu s u a l l yc a n ta t t a i nt h ep u r p o s eb ys i n g l et e c h n i q u e b a s e do nt h i sp o i n t ， t h ep a p e ra d o p t e dt h eb i o p h y s i c a lt e c h n i q u ea n db i o c h e m i s t r yt e c h n i q u et op r o m o t e t h er a t eo f h y d r o l y s i s t h es o yp r o t e i nn o u r i s h m e n tv a l u ei s h i g h ，t h er e s o u r c e s a r ea b u n d a n t ，a n d m a t e r i a lc o s ti sl o w i na d d i t i o nt op r o v i d i n gt h eh u m a n b o d y a ne f f e c t i v ea m i n oa c i d s ， i th a st h ep r o c e s sc h a r a c t e r i s t i cc e r t a i n l ya n dp h y s i o l o g ya c t i v i t y h o w e v e rt h es o y p r o t e i ns u f f e r ss o m e r e s t r i c ti nt h em o d e m a p p l i c a t i o ni nf o o dp r o c e s s i n g t h i si sf o r ： f i r s t ，t h ef u n c t i o nc h a r a c t e r i s t i co ft h es o yp r o t e i nc a n n o ts a t i s f yt h ed e m a n do f m o d e mf o o dp r o c e s s i n g ；s e c o n d ，t h es o yp r o t e i np r o d u c t sc r e a t ee a s i l ys o m es u a n g e s m e l l ；t h i r d ，s o m es o yp r o t e i np r o d u c t sc a nn o tb ea b s o r b e df u l l y s o ，i ti s t h e u r g e n t l yr e s o l v e dp r o b l e m i nt h ef i e l do ff o o da n dm e d i c a lf i e l dt h a td e v e l o p m e n tn e w f u n c t i o n a lf o o dt oe n h a n c e p r o t e i nf u n c t i o nc h a r a c t e r i s t i ca n db i o a c t i v i t y t h es o yp e p t i d ei st h em i x t u r et h a tt h es o yp r o t e i ni sh y d r o l y z e db ye n z y m e i n c e r t a i nm o l e c u l a rw e i g h ts c o p e ，i ti sa ss a m ea st h es o yp r o t e i ni na m i n oa c i d s l 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 c o n s t i t u t e d ，e n r i c hi nt h ee f f e c t i v ea m i n oa c i d s c o m p a r e dw i t ht h es o yp r o t e i n ，t h e s o yp e p t i d eh a st h eg o o dp h y s i c a la n dc h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c sa n db i o a c t i v i t y i ti s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta s p e c t st h a t s o yi s f u r t h e rd e v e l o p e db ys o yp r o t e i n h y d r o l y z e d t h e e x t e n s i v ef o r e g r o u n do fd e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o ni nt h er e a l mo f f o o d 、m e d i c i n ei se n j o y e d b y t h ed o m e s t i ca n di n t e r n a t i o n a l b a s e do nt h ep e o p l eo ft h ep a s t ，t h i sp a p e ra d o p t e dp h y s i c sc o m b i n e sw i t h b i o t e c h n o l o g y t op r o d u c e s o yp e p t i d e c o n t r a s t i n gw i t ho t h e rp r e t r e a t m e n t s m i c r o w a v eh a sf l b e t t e rr e s u l t ，i n c r e a s e s d h 5 o b v i o u s l yo rm o r e b a s e d o nt h et h e o r i e so fe l e c t r o m a g n e t i s mi nb i o p h y s i c s ， a r g u e d t h er e a s o no fm i c r o w a v eo n p r o t e i nh y d r o l y s i s t h es o yp r o t e i ni sad i e l e c t r i c ， t h ee l e c t r i cc h a r g ei np o s i t i v eo rn e g a t i v ei sg e n e r a l l yn o th e a v yt ob e l o n gt oi nt h e b i o p h y s i c a lr e a l m “p o l a rm o l e c u l ed i e l e c t r i c ”t h ep r o t e i n m o l e c u l a rv i b r a t e si n e l e c t r o m a g n e t i s m f i e l dt a k i n gp l a c et od e c r e a s ei nm o l e c u l a rw e i g h ta n dc h a n g i n gt h e s p a c ec o n s t r u c t i o n t h i si s m o d i f i e dp h e n o m e n o n ：t h ec l o s ec o n s t r u c t i o no fp r o t e i n l o o s et h u sm a k e st h ee n z y m em o r ee a s i e rt oa t t a c kt a r g e t i m p r o v i n gt h ed e g r e e h y d r o l y s i s t h i si san e w b i tb r i 曲ti np r o c e s s i n go fs o yp e p t i d e e x a l t a t i o nd e g r e e h y d r o l y s i s ，s h o r t e nt i m ea n di n c r e a s i n ge c o n o m i cp e r f o r m a n c ew h a th a v et h eg r e a t s i g n i f i c a n c ei nf o o dp r o c e s s i n g a tt h es a m e t i m e ，r e f i n e d c r a f t p r o c e e d i n g s t u d i e ds h o wt h eb e s tt e r m ： t e m p e r a t u r e5 5 。c 、p h 9 5 、s u b s t r a t ec o n c e n t r a t e2 、e n z y m e d o s e6 、t h et i m e1 h o u r ，i tc a ng e tt h ed e g r e eh y d r o l y s i s9 2 2 7 ；b ye l e c t r o p h o r e s i sa n ds e p h a d e x g 2 5 i n d i c a t et h a tt h em o l e c u l a rb e l o w5 0 0 0 ，a n dt h ea m i l l oa c i d si se q u i l i b r i u m i na d d i t i o n l a c t i v a t ec a r b o nc a nt a k eo f fs m e l l ，t a k eo f fc o l o ra n dt a k eo f fb i t t e r a n dt h em e c h a n i s m p r o c e e d i n gs y s t e mi sa n a l y z e da n da c q u i r et h ec l a r i t y , f l a v o rs o y p e p t i d e a tt h es a m et i m e i tc a nb et a k ea w a y9 5 1 s a l t ，g e t t i n gt h er e f i n e ds o y p e p t i d e s t h i se x p e r i m e n tr e s e a r c h e st h ef u n c t i o nc h a r a c t e r i s t i co fs o yp e p t i d e ：u n d e r5 0 h i g hd e n s i t ys t i l lh a v e t h eg o o d l i q u i d i t y ；h a v eg o o dd e l i q u e s c e n c e w i t h i nt h e s c o p eo f 5 b e l o w ；h a v eg o o ds o l u t i o ni nd i f f e r e n tp h ；h a v eg o o de m u l s i f yc h a r a c t e r i s t i ca n d e m u l s i f ys t a b i l i t yc h a r a c t e r i s t i c ；h a v eg o o d c h a r a c t e r i s t i ci nf o o di n d u s t r y t h i se x p e r i m e n td e t e c t i v e sp a r to fa c t i v i t i e so ft h es o yp e p t i d e ：t h es o yp e p t i d e h a sg o o d a n t i o x i d i z e s 、p r o m o t ef e r m e n t a t i o n 、d e c r e a s e t h et r i g l y c e r i d ei ns e r u m 、 i v 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 a n t i - f a t i g u ec h a r a c t e r i s t i c i th a st h ep r o f o u n dm e a n i n g i nt h ef u n c t i o n a lf o o d k e yw o r d s ：s o yp r o t e i ns o yp e p t i d ee n z y m eh y d r o l y s i s v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：穆这民 签字同期：卯j 年 2 月，砷 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：穆损 导师签名 鹰易 签字r 期：协，j 年6 月i 莎日签字同期：“年舌月，尹同 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 皂话：3 鲁 毕6 。主g 妪 d 蚌礤一生) 。 6 邮编： n 。o 内容提要 食品工业的飞速发展迫切需要具有功能特性和营养特性的蛋白质，作为食品 的原料成分或添加基料。 大豆蛋白质在现代食品加工中的应用受到一定的限制。大豆蛋白的功能性质 还不能满足现代食品加工的需要为此，加强或改善大豆蛋白的功能特性和生物 活性，开发新的功能食品，成为食品及医疗保健业亟待解决的问题。 大豆肽是大豆蛋白经酶促水解后形成的一定分子量范围的多肽混合物。 本文采用生物物理方法和生物工程技术相结合，即物理方法预处理与酶结 合，生产大豆肽。 采用微波预处理大豆分离蛋白能使水解度提高5 以上，并对其进行理论论 证。同时，对大豆肽的水解、精制工艺进行研究，确定最佳条件- 温度为5 5 ， p h 为9 5 ，底物浓度为2 ，酶与底物比为6 ，水解l h ，此条件下水解度( d h ) 为9 2 2 7 ：得到大部分分子量分布在5 0 0 0 以下、氨基酸含量平衡的大豆肽；通 过脱色、脱苦、脱盐处理，得到精制大豆肽。并对其功能特性进行研究：在高浓 度下仍具有较好的流动性；在5 以下有较好的着色度；在广泛的p h 范围内有较 好的溶解性；具有良好的乳化性及乳化稳定性。对其生理活性的研究表明：大豆 肽具有抗氧化性、促进发酵、降血脂、抗疲劳等生理活性。 采用生物物理和生物工程等高新技术对大豆蛋白质进行深加工，制备大豆生 物活性肽，提高了农副产品的附加值，并为工业化生产提供理论依据在食品工 业和保健、医疗等领域开辟了一个新的天地，进而提高人们生活水平，增进身体 健康。 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活胜的研究 苷有抗癌等作用。 1 2 大豆蛋白的研究 表1 89 1 列举了发展中国家与发达国家利用蛋白质的比例。 表1 发展中国家和发达国家主要食用蛋白质资源 t a b e ltm o s tr e s o u r c eo f p r o t e i ni nd e v e l o p i n ga n dd e v e l o p e dc o u n t r y 众所周知，蛋白质是一切生物细胞中最重要的有机物质之一，是细胞结构中 最重要的物质。不同蛋白质的存在构成了生命的多样性。如最大量的一类蛋白质 是酶，它是生物代谢的推动者；结构蛋白构筑了生物的机体，而机体的运动又是 由肌动蛋白和肌球蛋白来推动的：运载蛋白把氧、药物、营养因子、金属离子等 多种物质运送到机体的各部分，同时把代谢产物运出体外：营养蛋白就像仓库， 贮存了大量营养以备不时之需。见表2 。 美国在第二次世界大战之后，就开始研究了蛋白质的提取和应用，距今有 4 0 年历史了。1 9 8 5 年试制出了大豆分离蛋白，从而把大豆蛋白提精、提纯“o 。 目前，大豆制品主要包括大豆粉、大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白和大豆组织蛋白 等，在各类食品中得到了广泛的应用。但大豆蛋白质溶解度低，无法作为功能 性成分在乳品、饮料、糖果等食品体系中加以利用”0 】。大豆蛋白质有一定的抗原 性，而且蛋白质的消化率和生物效价远不及牛奶、鸡蛋等动物蛋白质，因而大大 限制了大豆蛋白质的利用范围。试图通过其他方法，改善其营养价值和功能特性， 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活j 生的研究 进一步扩大其利用范围，具有重要的意义。 表2 大豆与几种食物的8 种氨基酸含量比较( m g 1 0 0 9 ) t a b e l 2 c o m p a r i t i o n o ft h ee i g h tk i o d s o fa m i n oa c i do n s o y b e a na n do t h e rf o o d 1 3 大豆肽的开发 1 3 1 活性多肽的研究 天然蛋白质除了提供能量与合成人体蛋白质所必需的氨基酸外，新近发现蛋 白质所具有的特殊生理功能越来越引起人们的关注。这就是所谓的蛋白质的第三 功能。从单纯以蛋白质的消化性、氨基酸的组成含量评述蛋白质的营养价值，发 展到目前着眼于蛋白质序列中低肽的生理保健功能，是蛋白质生物化学与营养学 的一个飞跃。所有的生物，从最简单的病毒到最高级的人类，它们千变万化的 蛋白质都是由相同的2 0 种氨基酸组成，也就构成了千姿百态的蛋白质世界。生 物学者在对蛋白质的深入研究过程中，发现一类由氨基酸构成但又不同与蛋白质 的中间物质，这类具有蛋白质特性的物质被称作多肽。生物化学家给多肽的简单 定义：氨基酸能够彼此以酰胺键( 也称肽键) 相互连接的化合物称作肽。一种肽 含有的氨基酸少于1 0 个就被称为寡肽，超过的就称为多肽。氨基酸为5 0 多个以 上的多肽称为蛋白质。多肽和蛋白质只有肽链长短之别，二者间没有严格的区分。 蛋白质在由氨基酸构成的时候，是一个立体的多维结构，其中有条主骨架，这 个主骨架就是多肽链( 也称主链) 。因此，任何一种蛋白质和其对应的多肽主链 的原子是相同，而侧链就不完全相同。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物 活性物质。以失活状态存在的具有氨基酸序列多肽，通过体内消化释放，并在动 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活- 眭的研究 物的肠道消化过程中充当新陈代谢的潜在的生理效应物被称为生物活性肽。由体 内产生的神经功能肽称为内生神经功能肽( e n d e r p h i n s ) 。由植物蛋白水解得到得 称为外源神经功能肽( e x o r p h i n s ) 】。现已发现源于食物蛋白质的酶解物的一 些特殊的序列，具有促进吸收、降血压、调节血清中血脂水平、促进钙质吸收等 功能。这些低肽不仅能提供人体生长发育所需营养物质，且同时具有防病、治病、 调节人体生理机能的功效，因而人们有可能从食品蛋白质中生产满足人们特定需 要的活性肽。特别是许多活性肽的组成氨基酸并不一定是氨基酸。这就为人类更 为充分利用蛋白质资源，尤其那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源，生产能 更好满足人类保健需要的食品基料提供了新的机遇“。 1 3 2 大豆活性多肽的研究 本世纪4 0 年代，一些西方学者在进行蛋白质改性研究时，用酶法改性蛋白 质来补充极其缺乏的鸡蛋。由于受技术水平的限制，水解过程不易控制。水解物 的苦味、臭味等问题未能解决。大豆多肽的研究无多大的进展。在6 0 年代末， 蛋白酶被用于脂肪、骨和蛋白的分离，肉的嫩化，以及食品功能性质的改善等。 随后，酶改性蛋白的研究一直是众多学者关注的课题。随着生物技术的进步和生 命科学的发展，使大豆肽的生理功能逐步被人们发现。一些活性肽的结构和生理 功能逐渐明确，推动了活性肽的研究开发”“i 。 大豆蛋白活性肽是以大豆为基本原料，通过现代生物技术将大豆球蛋白转化 为小分子肽。最新研究表明，许多蛋白质水解物中含有多种具有生理活性的肽， 大豆作为新一代的超级蛋白营养素和多功能生理活性物质，具有广阔的应用及市 场前景。据资料报道 2 4 。2 “，小分子大豆肽不仅有很好的溶解性、低粘度、抗凝胶 形成性，而且在体内消化吸收快，a d i b i 和m a t t h e w s 1 8 - 2 3 等研究表明，2 - - 3 个氨基酸组成的低肽有比游离氨基酸更好的吸收性能。最近研究表明，饮食中的 小肽( 2 - - 3 个氨基酸) 和大肽( 1 0 - - 5 1 个氨基酸) 能够完整地通过肠道吸收， 作为生物活性肽在组织水平上引起机体的生物学效应。而且，蛋白质利用率高； 它还具有低抗原性不会产生过敏反应。此外还具有能促进肌红细胞复原，促进 脂肪代谢等生理活性。应用领域见图1 1 2 “。 d 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活胜的研究 医药品 广提供特殊营养弋_ 特殊病人营养剂 1、肠道营养剂 l酶的生产 l发酵工业 酶 与底物比 底物浓度，确定了酶水解的最佳工艺参数为：温度为5 5 。c ，p h 值为 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 1 9 吉林农业大学硕士学位论文大豆肤及其生物活】生的研究 3 。1 3 聪闯对承麓反应戆彭璃 由图7 、图8 可知，猩水解前3 0 m i n 系1 o h 内d h 和n s i 变化显著，而之后 d h 和n s i 变化缓慢，这是因为蛋白酶具奄专一性，随著水解时闷延长，礞自酶 可永解韵肽键逐渐减少，同时蛋白酶活力以半衰期方式下降之缘故。综合分析， 选择1 o h 。 9 0 8 。 一 17 。 囊 _ 羹s o 5 0 4 0 0 03 04 0 j 0 1 t t 7 对闰对承解液l 和n s i 豹彰晌 f i g 、7 e f f e c to ft i m eo nt h ed ha n dn s io fh y d r o l y s a t e 一d h p n s i 图8 时间对水麟液d h 和n s i 的影响 f i g 8 e f f e c t o f t i m e o l ld h a n d n s i o f h y d r o l y s a t e 弱 翳 瞄 蛐 巧 强 二一hz品hd 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽及其生物活胜的研究 3 14 预处理对水解作用的影响 物理方法预处理可以提高水解度，在其它条件不变下，对比直流、交流、紫 外、水浴、微波等预处理对d h 和n s i 的影响。如图9 所示，不同预处理使d h 和n s i 有不同程度的提高，微波作用明显。可提高水解度5 以上。这与文献报 道微波作用显著相符5 ”。 图9 物理因子预处理对水解液d h 和n s 螬q 影响 f i g 9e f f e c to fp h y s i c a lf a c t o rp r e t r e a t m e n to nn s ia n dd ho f h y d r o l y a s a t e 预处理的目的是：一是使蛋白质充分变性，二是使蛋白质尽可能多的打开二 硫键，三是除去异味。预处理常采用物理方法和化学方法。物理方法如加热处理 等，化学方法如加酸、加碱处理或添加化学试剂，可以大大提高酶解效果1 4 。但 是化学方法引入杂质，且有可能导致氨基酸受到一定程度的破坏。而且降低产品 的营养价值，影响产品最终品质。本试验通过采用几种不同的物理方法对比，得 到操作简便可行的预处理方法。 蛋白质的理沦眭质由其结构决定，大豆蛋白有2 s 、7 s 、1 1 s 、1 5 s 亚基构成， 其之间的相互键合形成了致密的空间结构。这种致密坚实的结构对蛋白酶的分解 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 作用必然有着较强的抵抗能力。由于大豆蛋白的7 s 、1 1 s 球蛋白的结构特性，当 蛋白质用酸、碱、盐溶液、有机溶剂、加热、高压、激烈振荡和辐射等1 5 叫处理时， 会不同程度地改变其构象，这个过程称为变性。从分子结构上看，变性作用是多 肽特有的折叠结构发生的变化，成为无规卷曲或混乱伸展的结构，它仅涉及蛋白 质的二、三、四级结构的变化，而并不包括一级结构肽键的破坏，使其成为松散、 柔韧的直链状态，使那些原来在分子内部包藏体不易与蛋白酶作用部位由于分子 结构的疏松而暴露出来。而本文通过加热、脉冲、微波处理等物理因子作用于蛋 白质，使其空间结构改变，增加酶作用位点，有利于提高水解速度。 大豆蛋白属多价两性电解质，它的正负电荷中心一般不重合，在生物物理学 领域属于“有极分子电介质”范畴，生物蛋白质大分子固有频率约为5 x 1 0 h z ， 此频率恰好相当于微波3 x 1 0 8 1 0 ”h z 频率范围。蛋白质分子在交变电磁场中振 动，每个分子的正负电荷都受到交变电场力的作用。蛋白质分子受到强烈的拉伸、 撞击、挤压等作用，并产生极化效应，造成以极性分子形式存在的大豆蛋白质分 子部分降解或空间结构改变，产生分子改性现象等一系列生物物理与生物化学反 应。 由于物理因子的作用，使蛋白质的紧密结构变得疏松，增加了酶的作用靶部 位，提高了水解度，对提高经济效益有重大意义。 3 2 水解液的精制 3 2 1 活性碳处理大豆肽水解液的效果 通过对比不同加碳量对水解液的影响，由表5 、表6 可知，随着活性碳的添 加，明显的减少液体的吸光度，发现1 ( w v ) 活性碳能明显减少色泽，且氮损 失率较合理。故1 添加活性炭可除去水解液的色泽、气味及苦味，可改善肽及 其产品特性，在食品工业中有重要作用。 表5 活性碳对肽液透明度的影响 t a b e l5 e f f e c to f a c t i v ec o r b o no nc l a r i t yo f p e p t i d e 吉林农业大学硕士学位论文大豆酞及其生物活陆的研究 表6活性碳对蛋白质损失率的影响 t a b e l6 e f f e c to fa c t i v ec a r b o no i lt h el o s so fp e p t i d e 在分析食品蛋白的水解片断，发现水解片断增加了食品的苦味【5 “。早在1 9 5 2 年m u r r a y 和b a k e r l 5 3 就发现乳蛋白水解物和酪蛋白水解物有苦味，这是蛋白水 解物研究的先河。同时，也使许多学者对蛋白质水解物的风味给予了极大的关注。 经过半个世纪的不断探索，已经取得了不少可喜成果。发现当这些带苦味的水解 物用活性碳处理后口味得到了改善，并从活性碳洗脱出极苦的多肽。这一研究揭 示了蛋白质水解物的一些性质，即苦味物质是多肽而不是游离氨基酸，并且这些 肽可以用疏水吸附加以分离。 蛋白质水解物的苦昧主要来自于水解物中的疏水性多肽，天然蛋白质是无味 的，一方面是因为它的疏水性基团大多被包裹在分子内部无法与味蕾接触，另一 方面，是因为分子量太大，分子构型复杂，使其在空间上不易接近于味蕾的味觉 接受器，因而不呈现任何滋味。当蛋白质大分子被水解成为分子量较小的多肽时， 其中包裹的疏水性基团就会暴露出来，含有较多疏水基团的多肽与味蕾接触就产 生苦味，其苦味的大小与肽链的平均疏水度有关。 在6 0 7 0 年代，大量苦味多肽被分离纯化，这些肽的肽长可短至2 3 个氨基 酸残基，也可长达数十个氨基酸残基】。这一研究成果为以后蛋白质水解过程中 苦味的控制以及水解物中苦味物质去除奠定了基础。在弄清了苦味成分的化学性 质后，人们有针对性的找到了解决这一问题的办法。这些方法概括起来包括：蛋 白质底物的选择、蛋白酶的筛选、水解程度的控制、苦味物质的选择性分离、类 蛋白反应、覆盖、外切蛋白酶的应用。 至目前为止，对苦肽的疏水度与苦味关系还没有统一的认识，一般还是采用 n e y ( 1 9 7 1 ) 提倡的q 规则即q = f f t n ( 其中q ：多肽的平均疏水度【5 “，f t ：氨 基酸侧链的相对疏水度n ：氨基酸数) 一般说来疏水性氨基酸残基在多肽中比 例越高，则该多肽的苦味可能越强【5 6 6 91 。很多研究表明【”6 2 ) ：苦肽的苦味不仅 与疏水度有关，而且与氨基酸的排列顺序有关。证实了疏水性氨基酸残基位于 c 一末端，苦昧更强之外，还发现n 一端为疏水性或碱性氨基酸残基( 如a r g ) 对苦 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 单位g l l 6 9 n 3 3 2 2f 值”1 分析 在氨基酸混合物中，支链氨基酸( b r a n c h e dc h a i na m i n oa c i d s 简称b c a a ) 与芳香族氨基酸( a r o m a t i ca m i n oa c i d s 简称a a a ) 的摩尔比称为f i s c h e r 值， 简称f 值。高f 值寡肽是蛋白酶作用食品蛋白后形成的一种低分子量生理活性肽。 因其具有独特的氨基酸组成和生理功能，而受到食品和医疗界的高度关注。 本试验所得大豆肽的f 值为3 6 0 5 。可以通过精制获得比值大于2 0 以上高f 值寡肽。高f 值寡肽具有消除或减轻肝性脑症状，大量动物试验和临床证明， 注射或口服高f 值氨基酸混合物可使病人血中b c a a a a a 接近或大于3 。并能 有效的维持血中b c a a 的浓度。从而纠正血脑中氨基酸的病态模式，改善肝昏 迷程度和精神状态。c o n n h e 【7 3 】等研究认为肝昏迷的发生不仅取决与血浆中f 值，而且与血氨浓度有关。b c a a 还可以通过增加氮储留来降低病人血氨浓度c 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 甚至可使血氨浓度恢复正常水平。从而减轻或消除了肝性脑病的症状口”。改善肝 功能口5 1 和改善多种病人蛋白质营养失常状态及抗疲劳等功能。除可制作治疗肝疾 病药品外，还可以广泛用于保肝，抗肝功能食品，烧伤、外科手术、脓毒血症等 高付出病人及消化酶缺乏患者的蛋白营养品和肠胃道营养剂，及高强度劳动者和 运动员食品营养强化剂等。 3 3 3 分子量分布的研究 3 3 3 1 电泳对分子量分布的确定 由图l o 可见大豆蛋白水解后，分子量大大降低，说明2 7 0 9 碱性蛋白酶作用大 豆分离蛋白水解的主要水解肽分子量集中在5 0 0 0 以下。 图l o 大豆肽s d s - - p a g e 图谱 a ：大豆肽b ：大豆分离蛋白c ：胰岛素 f i g 1 0 s d s p a g e p r o f i l eo f s o y b e a n p e p t i d e a ：p e p t i d eb ：p r o t e i ni s o l a t e c ：i n s u l i n 3 3 3 2 凝胶层析指示分子量分布 由图l l 、1 2 可见，大豆蛋白水解物中肽分子的分布是连续的，即水解物中存在 着各种大小不等的肽分子，说明大豆蛋白的酶促反应中水解反应是连续进行的，故 此肽分子呈现连续分布；通过对比胰岛素的凝胶图可以看出，大多数肽的分子量为 5 0 0 0 以下，水解物中低肽分子占相当大的比例。而水解的大豆蛋白或大肽分子只占 少数。通过增加时间或其它方法可提高小肽的含量。 吉林农业大学硕士学位论文大豆肽及其生物活性的研究 1 2 0 1 0 0 8 0 量 恕6 0 8 4 0 2 0 1 0 02 0 03 0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 09 0 01 0 0 0 图1 1 胰岛素标准品分子量分布曲线 f i g 1 lm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o np r o f i l eo fi n s u l i ns t a n d a r ds a m p l e n ) t i m e 2 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 01 2 0 01 4 0 0 图1 2 大豆肽分子量分布曲线 f i g 1 2 m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o np r o f i l eo fs o y b e a n p e p t i d e 蛐 屿 如 如 拍 加 如 ； 0 吕c寸nn凸o 吉林农业大学硕士学位论文大豆肤及其生物活性的研究 3 4 功能性分析 3 4 1 表观粘度分析 由图1 3 可知，肽溶液的粘度随浓度增高而变化不大。大豆蛋白质的浓度在 o 1 0 之间变化时，粘度变化较为平缓，但是当浓度高于1 0 以后，粘度直 线上升。而大豆肽液的流动性极好，浓度在5 0 时也富有流动性。大豆肽比大豆 蛋白作为食品原料的更适合性在于它的高浓度时的低粘度和高溶解度。 0 _ 受 0 魁 橡 + 大豆分离蛋白 1 5 01 2 5