（应用化学专业论文）水溶性阳离子卟啉的合成及其聚集行为的研究.pdf

济南大学硕+ 学位论文 摘要 水溶性阳离子卟啉的研究引起了人们极大的兴趣。水溶性阳离子卟啉具有优异的 生物活性，可以作为潜在的抗癌、抗菌药物和核酸结构及动力学探针。血清蛋白是卟 啉类光敏分子的天然载体，参与定向输送卟啉分子至肿瘤部位并将其输送入肿瘤细胞 内。卧啉与蛋白以单位点或多位点的结合作用可以影响卟啉的输送、新陈代谢。反过 来，卟啉在蛋白上的结合也会使蛋白的分子构象发生变化，影响蛋白的生理功能。同 时卟啉的分子结构及聚集状态与其功能密切相关，因此研究水溶性阳离子卟啉在不同 体系中的聚集行为及与生物大分子如血清白蛋白、核酸的相互作用具有十分重要的意 义。本文合成并系统研究了具有生物活性的水溶性阳离子卟啉在不同体系中的聚集行 为及与生物大分子的相互作用。论文主要包括以下几个方面的内容： 第一部分概述了水溶性阳离子卟啉的研究意义、水溶性卟啉的合成研究现状、卟 啉化合物聚集现象及聚集体类型、水溶性卟啉聚集行为研究现状及本论文的研究内容 及特点。 第二部分介绍t a d l e r l o n g o 法合成卟啉的反应机理，合成了双亲型卟啉m e s o 四 ( 4 羟基苯基) n f 啉( t h p p ) 及m e s o 四一( 4 三甲铵基苯基) 卟啉( t m a p ) 、5 - 苯基- 1 0 ，1 5 ，2 0 三一( n 甲基4 一吡啶基) 卟啉( t r i m p y p ) 、5 ，l o ，1 5 三苯基- 2 0 ( n - 甲基4 吡啶基) 卟啉 ( t p m p y p ) _ 三种水溶性阳离子卟啉化合物，讨论了实验过程中的影响因素并进行了光 谱表征。计算了水溶性卟啉化合物的摩尔吸光系数及荧光量子产率。 第三部分研究了卟啉化合物在阴离子表面活性剂溶液中的聚集行为。双亲型卟啉 t h p p 在中性a o t ( 冈j , - 2 乙基己基硫代琥珀酸钠) 水溶液中形成了j 型聚集体，该聚集体 具有荧光且发射带红移以及具有强的共振光散射信号。离子强度影响聚集体的形成而 与卟啉的浓度无关，卟啉在高于c m c ( 1 临界胶束浓度) 的情况下可以由单体向j 型聚集体 转化。在低于c l l l c 时阳离子卟啉t m a p 与表面活性剂分子相互作用形成了j 型和h 型 聚集体。当p h 为6 8 时主要形成h 型聚集体，p h i 2 0 时主要形成j 型聚集体。 第四部分研究了水溶性阳离子卟啉与生物大分子血清白蛋白、核酸的相互作用及 卟啉的聚集行为。t m a p 在水溶液中以单体形式存在，在r l 时( r = 【t m a p d n a ) ， t m a p 在d n a 分子表面发生聚集，吸收光谱有明显的减色效应，卟啉的荧光被猝灭。 在r 5 4 7 0 时，形成的是j 型聚集体。因所处微环境的浓度、酸度和离子强 度等因素的不同，这两种聚集型体之间是可以相互转化的。 m ， ， ； r ， ：垒生 图1 5 卟啉聚集体内分子排列方式 f i g 1 5 s c h e m eo f m o l e c u l ea r r a n g e m e n ti np o r p h y r i n a g g r e g a t e 1 4 水溶性卟啉聚集行为研究现状 1 4 1 阴离子卟啉的聚集 在阴离子卟啉聚集行为研究中，“明星”分子当属t s p p ，它曾被f l e i s c h e r 等人【2 0 】 首先研究了在较高离子强度下的聚集行为。质子化型体中有荷正电卟吩内核和荷负电 外围之间的静电引力，对形成卟啉聚集体起了额外的稳定作用，因而会很容易形成 j 型聚集体 4 6 , 4 7 】。 金瑞祥等f 4 8 1 用分光光度法研究了t s p p 水溶液中聚集体的形成及酸度、温度和表 面活性剂等实验条件的影响，推测了形成聚集体的可能模式。通过拉曼光谱【4 明和荧光 衰减动力学研究f 矧，结果表明t s p p 发生聚集时，荧光寿命值会因选b 带或q 带激 发波长而不同，对应着聚集体不同的有效尺寸，并提出j 型聚集体内分子单体的线性 排列形式。a g g a r w a l 等刚研究了不同浓度、p h 及离子强度时t s p p 聚集的动力学过 程。n a c l 在t s p p 分子周围形成反离子云降低了卟啉分子间的静电排斥，诱导t s p p 形成聚集体，降低了吸光度、荧光量子产率及寿命。聚集过程分为两个阶段，首先形 成h - 型聚集体然后转化为j 型聚集体。聚集动力学过程中诱导期的存在可能与h 型 聚集体的形成有关。 4 济南大学硕士学位论文 通过圆二色性法和荧光偏振研究表明t s p p 的j 型聚集体形成棒状，且线性振子 方向沿长轴方向f 翻。t s p p 聚集后在光谱和电化学等方面的性质会发生改变，可以对 比地用共振拉曼光谱研究t s p p 的聚集行为。溶液中卟啉聚集体的光衰减以及高光压 下发光和暂态吸收谱特征表明，卟啉自由碱会因聚集类型而有不同的瞬态吸收和荧光 衰减光谱特征【5 3 】。用时间分辨荧光法发现了t s p p 的j 型聚集体激发态从s 2 到s l 的 超快弛豫过程，其经历时间大约小于3 4 0f s ，且可以通过泵浦探针光谱得到辅证【5 4 1 。 t o n i z z o 等【5 5 】考察了t s p p 在不同环境下的影响光谱特征的光学性质。 通过紫外可见吸收光谱、荧光光谱和共振光散射研究了在二氯甲烷中各种酸 ( h x ，x = c 1 ，b r ，i ，c f 3 c o o ，c f 3 s 0 3 ，t f p b ) 对t s p p 聚集状态的影响。加入酸 后，最初的t s p p 自由碱单体逐步转化为j 型聚集体，并且聚集体的类型与酸根阴离 子无关。在过量的t b a x 存在下，h c i 和h i 的加入使t b a x 阳离子和t s p p 二酸离 子之间形成了单体离子对。继续增大酸的浓度，t s p p 全部质子化并最终开始聚集【5 6 1 。 除了高浓度、高酸度和高离子强度可以诱导生成卟啉j 型聚集体外，冠醚或者阳 离子表面活性剂都会对t s p p 的聚集行为产生显著影响，具体体现在紫外可见光谱和 共振光散射光谱上【5 7 9 】。适量的k c l 和1 8 冠6 醚共存下，促使t s p p 形成了j 型聚 集体，用时间分辨荧光各向异性研究的结果求得聚集数约为2 2 个唧】，而通过共振光 散射光谱确定的t s p p 的平均光谱聚集数为1 2 9 个【6 1 1 。 通过紫外可见光谱和荧光光谱研究t s p p 聚集行为表明【6 2 l ，当阳离子表面活性剂 c t a b 小于临界胶束浓度( c m c ) 时，体系中存在着h 型和j 型两种聚集体，前者的形 成速度要快于后者，但后者的形成过程会受到无机阳离子的加速；而当超过c m c 时， 体系中t s p p 以胶束内单体形式存在。t s p p 的h 型和j 型聚集体有着不同的荧光各 向异性值。通过电子透射显微镜照片观察j 型聚集体的尺寸和结构，揭示了卟啉分子 可能呈“纤维状 排列或呈“带状”螺旋堆叠。 t c p p 在水_ - - 氟乙酸中的n 质子化型体形成了j 型聚集体，吸收光谱和荧光光 谱的谱带明显红移，拉曼光谱表明所形成的j 型聚集体中的分子排列与t s p p 的j 型 聚集体相似【6 3 】。m c h f l e 等对比了t c p p 和t s p p 受阴离子调控的聚集行为，综合了紫 外可见光谱、拉曼光谱、荧光法、核磁共振和原子力显微镜等研究手段来考察非共价 键合卟啉聚集体，并用激子理论定性的探讨了光谱微扰的原因【“，6 5 1 。 混合带有相同电荷的阴离子卟啉t c p p 和阴离子m e s o 苯基三( 对磺酸基苯基) 卧啉时，能够发现存在杂聚集现象i 删，这似乎说明石万堆积也是一个不可忽视的作 水溶性阳离子h 啉的合成及其聚集行为的研冤 用力。人们进行了很多相关的旨在探讨t 万作用本质和它在卟啉聚集过程中影响的 研究工作【6 7 石们。这种堆叠作用属于“弱力强变化”，能够导致卟啉分子呈现一定的几 何构型或构象，金属离子的配位作用也会产生电子的重新分配，可以归结到“立体效 应 和“电子效应 的综合效果，这恐怕是考察聚集行为进而实现人为调控而必须正 视的关键所在。 1 4 2 阳离子卟啉的聚集 对于阳离子卟啉的聚集现象，关注并不是太多。t m p y p 在水中的自聚集一直倍 受争议，因为人们对t 万堆积作用能否与静电斥力抗衡表示怀疑【7 。 k a n o 掣7 1 ，7 2 1 通过吸收光谱、核磁共振及共振光散射研究了不同数目烷基取代吡 啶卟啉在水溶液中的自聚集行为并用热力学方法考察了影响阳离子卟啉自聚集的主 要影响因素。1 hn m r 表明达到毫摩尔级的卟啉容易发生自聚集，出现宽峰信号说明 n d 比n h 的互变异构化速率可能要慢，t m p y p 并未形成二聚体。因为在k n 0 3 存 在下，低浓度的二甲基取代的卟啉发生自聚，而三、四甲基取代的卟啉仍以单体形式 存在。二甲基取代的卟啉二聚时具有较负的焓变和熵变，说明色散力在聚集过程中起 着主要的作用。p c 3 p y 在水溶液中也形成二聚体，增大k n 0 3 的浓度，聚集过程的熵 变增加而焓变几乎不变。热力学参数表明p c 3 p y 二聚体的形成是疏水作用协同下范 德华力相互作用引起焓增加的结果。静电斥力阻碍了进一步的聚集，而其他阳离子卟 啉却形成了高级聚集体，可能是延长的烷基链增加了疏水作用所致，结果表明外围取 代基团影响聚集体的形成。d i x o n 等1 7 3 1 用德拜休克尔公式分析光谱数据估计了在不 同离子强度下阳离子卟啉形成二聚体的可能性及程度。 s i s k o v a 等【7 4 j 通过吸收光谱及共振拉曼光谱表明阳离子卟啉t m p y p 通过与四个 b h 4 。之间的相互作用而形成j 型聚集体。m o s i n g e r 等【7 5 】报道了t m p y p 等阳离子卟啉 及金属配合物在中性水溶液中形成光致聚集体。在碘离子存在下，阳离子卟啉光化学 反应产生单线态氧，将碘离子氧化为碘三离子，与阳离子卟啉形成离子对进而形成卟 啉聚集体。离子对聚集体的形成使卟啉三线态快速猝灭而限制了单线态氧的生成，当 达到光致碘三离子的临界浓度时，没有单线态氧的生成。d n a 、环糊精或杯芳烃的 加入与卟啉形成超分子配合物阻碍了离子对的形成，高温也能使聚集体消失。s n 卟 啉由于两个轴向配体而保持了光敏性。 通过紫外可见吸收光谱、荧光和共振光散射光谱考察了在二氯甲烷中各种酸 济南人学硕士学位论文 ( h x ，x = c i ，b r ，i ，c f 3 c o o ，c f 3 s 0 3 ，t f p b ) 对t 2 p y p 、t 3 p y p 和t p y p 等三种取 代基位置不同的同分异构体的影响，说明了卟啉聚集行为与酸和卟啉的种类都有关 系，并可总结为三种模式：( 1 ) 酸化后聚集：( 2 ) 过度酸化则解聚集；( 3 ) 大量阴离子t h p b 存在时，才能使吡啶基部分发生质子化1 7 6 1 。 q i u 等【7 7 1 通过吸收光谱、核磁共振、荧光光谱、圆二色谱及动态光散射研究了阳 离子卟啉t p p o c 3 p y 与阴离子表面活性剂s d s 在水溶液中的相互作用。在低于c m c 的情况下，t p p o c 3 p y 形成了h - 型和j 型聚集体并在达到c m c 时转化为胶束增溶单 体，增溶位置不是在胶束内核而是在s d s 分子链之间。 混合阳离子卟啉t m a p 和阴离子卟啉t s p p 可以得到1 ：1 的杂聚集体【7 8 】，该二聚 体的b 带吸收峰发生蓝移，且加入的一些聚电解质，则解聚集发生，导致荧光发射 强度的恢复。相似地，混合m e s o 四( 4 甲基3 磺酸苯基) 卟啉和m e s o 四( 苄基吡啶基) 卟啉会受酸碱诱导，呈现出吸收峰越来越明显的分裂【7 9 1 。阳离子卟啉诱导t s p p 形成 手性三元杂聚集体的过程中起着两种作用：其一是根据不同的立体和电子效应，它们 促使t s p p 形成h 一型和j 型聚集体；其二是充当“手臂”的功能，屏蔽掉t s p p 和负 电荷基质问的静电斥力【8 0 1 。g e n a d y 等f 8 l 】报道了带负电的硼卟啉与阳离子卟啉间形成 盐桥而合成了卟啉二聚体或五聚体并描述了其电子及能量转移过程。同样混合阳离子 卟啉t m a p 与阴离子卟啉t s p p 的c o 配合物的水溶液可以得到h 型和j 型聚集体， 通过t e m 可以观察到三角型和球形的卟啉聚集体【3 2 】。 1 4 3 卟啉与d n a 的相互作用及聚集行为 最早报道卟啉与d n a 的相互作用的是f i e l s 3 】。早在1 9 7 9 年，f i e l 就指出耵仰y p 和c t d n a 的作用非常好，其可以与c t d n a 以插入作用的方式紧密结合。从此以后， 关于卟啉化合物与d n a 的相互作用的研究得到了飞速的发展。对于卟啉和d n a 的 结合方式，人们已经研究了许多种卟啉化合物，其中研究最多的就是含吡啶正离子和 胺正离子的卟啉，除此之外如四似三烷基胺甲苯基) 卟啉、四 三烷基膦基甲苯基) 卟啉等也被用于研究卟啉和d n a 的相互作用。 通过对一些卟啉的研究人们发现其与d n a 的作用通常有三种模式瞰1 ( 如图1 6 所 示) ：( 1 ) 插入模式；( 2 ) 外部沟槽结合；( 3 ) 外部自堆积结合。当卟啉采用插入方式和 d n a 相互作用时，卟啉的s o r e t 带会发生明显的红移( 通常大于1 0i h n ) 以及强烈的减 色效应。这种红移和减色通常作为判断与d n a 是否以插入模式作用的依据。之所以 水溶性阳离了卟啉的合成及其聚集行为的研究 s o r e t 带会在插入模式时有明显的变化是因为和q 带相比较，s o r e t 带对一些环境因素 更敏感，如溶剂、浓度、聚集状态、离子强度、是否与其他分子结合等。 自堆积结台 沟槽结合插入结合 图1 6 卧啉与d n a 的三种作用结合模式 f i g 1 6 c a r t o o no ft h r e ep o s s i b l eb i n d i n gm o d e so fp o r p h y r i n sw i t hd n a 卟啉和d n a 的结合模式与很多因素有关。对于那些含疏水性取代基团的卟啉， 它们和d n a 在水溶液中的相互作用因有自身的聚集作用而十分复杂，不同的聚集状 态和d n a 的作用也不同。而水溶性的卟啉如t m p y p 由于带有四个正电荷而有非常 好的水溶性，即使在浓度达到1 0 3m o l u 1 时也不会有自身的聚集【8 5 l 。但是含有含膦 基团的水溶性卟啉，却因为石t 堆积作用而极易聚集【8 6 1 。 带有不同电荷的卟啉和d n a 的作用各不相同。t m p y p 和d n a 的相互作用表现 出非常强烈的插入作用【8 3 】，但是在其他含有吡啶正离子的化合物中由于电荷数目和位 置的不同【8 7 】，它们和d n a 的相互作用也各不相同。含有三个4 吡啶正离子的卟啉以 插入方式和d n a 相互作用，但是只含有一个正离子的卟啉却是以沟外结合和外部堆 积的方式与d n a 相作用的【8 8 l 。而含有两个毗啶正离子的卟啉，包括顺式和反式，与 d n a 也有多种结合方式【2 9 8 9 】。同样是吡啶正离子，t 3 m p y p 和d n a 仍然是以插入作 用相结合，而t 2 m p y p 不能和d n a 以插入作用相结合 9 0 , 9 1 1 。t m a p 同样带有四个在 4 位上的正电荷，但是由于空间因素的影响，和d n a 也不能以插入方式相互作用陬 9 2 1 。t m p y p 虽然通常以插入的模式和d n a 相互作用，但是也可以其他的方式与d n a 相互作用【9 3 , 9 4 。以插入模式作用时，它与d n a 的作用位置主要是在富含g - c 的位置， 以其他的方式作用时则主要在富含a t 的区域1 9 5 】。如果卟啉配有金属时，不同的金 属与卟啉结合的空间结构不一样，它们与d n a 作用的方式及位置也各不一样【9 6 嗍。 因此卟啉可以作为探针来研究d n a 的结构。 由于磷酸骨架带有负电荷，所以一般带有正电荷的卟啉比较容易和d n a 结合， 济雨人学硕士学位论文 而带有负电荷的卟啉不易和d n a 相互作用。但是近年来也有一些关于带负电荷的卟 啉与d n a 相互作用的报道。v i c e n t e 等【1 0 0 , 1 0 1 】合成了带有四个负电荷的四( 4 巢型碳 硼烷基苯基) g b 啉，并发现它在环内的n 原子发生质子化后与d n a 有较好的相互作 用。c h a t t 两e e 等【l 叼则发现一些含有羧基亚甲基氧基苯基的负电荷卟啉与d n a 有较 好的相互作用。c h e n 等【1 0 3 】发现通过加入阳离子卟啉t m p y p ，可以与带负电的t s p p 在d n a 表面形成具有手性的二元聚集体，并且二元聚集体的手性与两种卟啉的摩尔 比及与d n a 的结合方式有关。 1 4 4 卟啉与蛋白质的相互作用及聚集行为 卟啉与蛋白质之间的非共价键相互作用对于在分子和细胞水平上理解卟啉光反 应的机理和效率至为重要。血清蛋白、高密度或低密度脂蛋白以及抗体是卟啉类光敏 分子的天然载体，参与定向输送卟啉分子至肿瘤部位并将其输送入肿瘤细胞内。卟啉 与蛋白以单位点或多位点的结合作用可以影响卟啉的输送、新陈代谢以及卟啉分子的 存在方式，即质子化程度、聚集行为以及单体的浓度。反过来，卟啉在蛋白上的结合 也会使蛋白的构象发生变化，影响蛋白的生理功能。 b o r i s s e v i t c h 等【1 0 4 1 嗍用吸收光谱、荧光光谱、共振光散射及闪光光解技术研究了 两种水溶性卟啉t m p y p 及t s p p 与b s a 的相互作用，在4 0 8 5 的p h 范围内，两 种卟啉以自由碱形式存在且都与b s a 有结合作用。卟啉的结合对b s a 的荧光有猝灭 作用，相反卟啉单体的荧光得到增强。当t s p p 的浓度大于b s a 的浓度时在b s a 分 子表面形成聚集体，同时b s a 自身也有聚集体的形成。而t m p y p 在b s a 表面不能 形成聚集体。h u a n g 等【1 0 7 1 使用共振光散射成像技术研究了蛋白质的加入引起的t s p p 的j 型聚集体，建立了定量测定蛋白质的新方法。 c o s t a 等【1 0 s 】通过稳态及瞬态荧光光谱研究了t s p p 在不同p h 的水溶液中与两种 药物载体蛋白h s a 及萨乳球蛋白的相互作用。t s p p 在一定的p h 下可以形成j 型聚 集体或与蛋白质形成配合物。圆二色谱表明t s p p 的加入没有改变蛋白质的二级结构， 并根据f 6 r s t e r 能量转移公式计算了结合卟啉与色氨酸间的临界距离。他们【1 0 9 1 还进一 步研究了两种水溶性阳离子卟啉t s p p 及t m p y p 与载体蛋白在反相胶束中的相互作 用。水池的大小影响t s p p 的聚集体类型，蛋白质的加入使t s p p 形成h 型聚集体， 但随摩尔比增大，又促进了j 型聚集体的形成。由于反相胶束对构象的影响，结合作 用比在水溶液中要弱。与t s p p 不同，蛋白质的加入对t m p y p 的荧光猝灭作用很弱。 9 水溶性阳离子卟啉的合成及其聚集行为的研究 v a l a n c i u n a i t e 等o 】用吸收光谱、荧光光谱考察了在酸性条件下b s a 对t s p p 形 成j 型聚集体的影响。结果表明，b s a 的加入促进了j 型聚集体的形成并且t s p p 聚 集体类型的动态平衡与两者的摩尔比有关。低摩尔比时促进了j 型聚集体的形成，在 较高的摩尔比时，部分j 型聚集体进入了蛋白质分子内部，在更高的摩尔比时，有两 者配合物的形成。张红芬等【1 1 1 】采用电化学法、荧光法和紫外法研究了t s p p 与b s a 之间的相互作用，结果表明b s a 与t s p p 相互作用生成l ：1 的t s p p b s a 超分子体系。 另外，加入环糊精体系后，磺丁醚- f l - c d 和羟丙基移c d 均能促进t s p p 与b s a 发生 反应。建立了一种简单、快速、准确的水溶性卟啉的电化学分析方法。 y i n 等2 】通过吸收光谱、核磁共振及荧光光谱研究了两种羧基卟啉衍生物m a c 及t a 4 c 在水溶液中的聚集行为以及与b s a 的相互作用。m a c 与伊环糊精形成包合 物阻碍了与b s a 的相互作用。t a 4 c 在水溶液中以松散的二聚体形式存在，吸收光 谱呈现出三q 带特征，b s a 加入后，吸收光谱s o r e t 带和q 带发生了明显变化，并 分三个阶段，荧光强度增强。 d a v i l a 等3 j 报道了对四( 2 ，6 - - - 氯3 磺酸基苯基) z n ( i i ) 1 1 - 啉与人血清白蛋白以 两个结合位点结合，卟啉的激发三线态在两结合位点间与分子氧反应生成单线态氧， 单线态分子氧在结合了卟啉的蛋白附近对蛋白产生不可逆转的损害。而z n t d c s p p 的万自由基阳离子仍然与h s a 结合，但不从邻近蛋白链的氨基酸残基上吸引电子。 q i n 等【1 1 4 】用光学生物传感器研究了三种水溶性阳离子卟啉与h s a 的相互作用。通过 热力学参数的计算表明静电引力为结合过程的主要驱动力。 郭灿城等【5 】利用紫外、荧光方法研究了m e s o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 四 4 ( n 吡咯烷基) 苯 基】卟啉与b s a 的相互作用，结果表明该卟啉利用疏水作用力进入b s a 的疏水性空 腔，形成牢固的卟啉蛋白复合物并引起b s a 的荧光猝灭。李早英等【1 1 6 1 研究了水溶性 季铵盐卟啉化合物与b s a 的相互作用。水溶性季铵盐卟啉化合物和蛋白质之间的作 用通常是借助静电引力形成的，该季铵盐卟啉的水溶性极好，分子体积较大，因而它 们不能进入b s a 分子的疏水腔中而是结合在蛋白质分子表面合适的位置上并与色氨 酸残基保持恰当的距离。另外，该卟啉对b s a 中产生的内源荧光的色氨酸残基和酪 氨酸残基的微区构象无明显影响。 可以看出，水溶性卟啉化合物与d n a 、蛋白质等生物大分子都有明显的相互作 用，其生物活性与卟啉的电荷性质、分子结构及聚集状态密切相关。反过来，与生物 大分子的相互作用也会使卟啉自身的聚集状态发生改变，从而影响卟啉的输送和新陈 l o 济南大学硕士学位论文 代谢。因此研究水溶性阳离子卟啉在不同体系中的聚集行为及与生物大分子如血清白 蛋白、核酸的相互作用具有十分重要的意义。而研究最多的是阴离子卟啉，关于阳离 子卟啉的聚集行为研究较少，本文旨在合成具有不同结构特点的阳离子卟啉化合物， 从而研究其在不同体系下的聚集行为。 1 5 本论文的研究内容及新颖性 1 5 1 本论文的主要研究内容 ( 1 ) 合成具有不同取代基团、不同电荷数目的阳离子卟啉化合物，如m e s o 四( 4 三甲 铵基苯基) 卟啉、5 一苯基1 0 ，1 5 ，2 0 三( n 甲基4 吡啶基) 卟啉，并进行光谱表征。 ( 2 ) 研究所合成的水溶性阳离子卟啉在水溶液及不同溶剂体系中的聚集状态、在表面 活性剂溶液中的聚集行为，考察离子强度、p h 等因素的影响。 ( 3 ) 研究所合成的水溶性阳离子卟啉与小牛胸腺d n a 的相互作用及聚集行为，考察浓 度、离子强度等因素的影响，重点研究卟啉聚集行为的变化。 ( 4 ) 研究所合成的水溶性阳离子卟啉与血清白蛋白的相互作用及聚集行为，探讨两者 之间的结合方式及对血清白蛋白分子构象的影响。 1 5 2 本论文的新颖性 ( 1 ) 系统研究了具有生物活性的水溶性阳离子卟啉在不同体系中的聚集行为及与生物 大分子的相互作用。 ( 2 ) 运用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、共振光散射及表面张力测量研究了卟啉化合 物在阴离子表面活性剂溶液的聚集行为，结合吸收光谱及荧光各向异性考察了 m e s o 四( 4 - 羟基苯基) 卟啉在a o t 溶液中形成j 型聚集体的动力学过程，并提出了 理论模型。 ( 3 ) 结合多种光谱手段研究了具有不同结构、不同电荷数目的水溶性阳离子卟啉与小 牛胸腺d n a 的相互作用及聚集行为，采用光谱拟合软件p e a k f i t 将吸收光谱进行 解析，考察卟啉在不同条件下的聚集状态。 ( 4 ) 研究了水溶性阳离子卟啉m e s o 四( 4 三甲铵基苯基) 卟啉与牛血清白蛋白、人血清 白蛋白的相互作用，结合同步荧光光谱、荧光各向异性讨论了两者的结合方式及 对血清白蛋白分子构象的影响。 济南大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章卟啉化合物的合成及表征 卟啉的合成方法尤其是产率的提高一直是人们研究的热点，a d l e r l o n g o 法【l8 】和 l i n d s e y 合成法【1 9 】是合成卟啉化合物的两种经典方法。近年来，许多化学工作者也提 出了不少针对性强的改进方法，如郭灿城法【1 1 7 1 、混合溶剂法【1 1 引、微波诱导法【1 1 9 ，1 2 0 1 等。但a d l e r - l o n g o 法合成卟啉化合物方法简单，后处理比较容易，是现在广泛采用 的合成方法。本章采用经典的a d l e r - l o n g o 法合成了t h p p 及不对称吡啶基卟啉，通 过柱层析及薄层层析将产物分离，进一步甲基化得不对称阳离子卟啉。 2 2 卟啉合成的反应机理及实验方案 + 睁簿 n 辑当 o h 堂 4 r o h n 图2 1 卟啉合成的反应机理 f i g 2 1 。t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo fp o r p h y d ns y n t h e s i s r r 飞芦 h 水溶性阳离：f 卟啉的合成及其聚集行为的研冗 吡咯与苯甲醛或各种取代醛在酸催化下脱水生成链状化合物，当聚合单元的数目 为4 时，链状化合物在氧气氛围中被氧化环合生成卟啉化合物。其反应机理如图2 1 所示。 将对羟基苯甲醛或对二甲氨基苯甲醛与吡咯在丙酸介质中回流，将反应产物进行 处理可得对称的t h p p 或t a p p 。而不对称吡啶基卟啉化合物的合成则是将混合醛( 4 - 吡啶苯甲醛及苯甲醛) 与吡咯在丙酸中回流，反应产物经柱层析和薄层层析分离后得 到。含吡啶基卟啉及t a p p 与碘甲烷在d m f 中反应得到水溶性的阳离子卟啉化合物。 实验方案如图2 2 所示。 吡咯+ 。不同取代基的醛鲨型璺鎏-卟啉化合物 鲨垩茎竺- 蒸掉部分溶剂苎鲨兰塑，真空干燥 竺星塑壁翌星星堑堡竺- 纯品竺苎些 目标化合物 - 结构表征 2 3 实验部分 2 3 1 仪器与试剂 图2 2 卟啉合成实验方案 f i g 2 2 s y n t h e t i cs c h e m eo fp o r p h y r i n s j j 1 型电动搅拌器( 江苏金坛) ；7 8 1 型磁力加热搅拌器( 江苏金坛) ；t d a 8 0 0 1 型 温度测量控制仪( 浙江余姚) ；s h z d ( i i i ) 型循环水式真空泵( 河南巩义) ；r e 5 2 c s 型旋 转蒸发仪( 上海亚荣) ；f t s 1 6 5 型红外光谱仪( 美国p e r k i n e l m e r ) ；5 0 0 m h z 核磁共振 波谱仪( 美国v a r i a n ) ；l a m b d a3 5 型紫外可见分光光度计( 美国p e r k i n - e l m e r ) ；l s5 5 型荧光光度计( 美国p e r k i n e l m e r ) 。 吡咯( 上海国药) 、对羟基苯甲醛( 上海试剂) 、4 吡啶甲醛( 济南诚汇双达) 为化学纯， 苯甲醛( 天津大茂) 、对二甲氨基苯甲醛( 上海国药) 、丙酸( 天津科密欧) 、甲醇( 天津广 成) 、n ，n 二甲基甲酰胺( 天津广成) 、二氯甲烷( 天津广成) 、三氯甲烷( 天津科密欧) 为 分析纯，薄层析硅胶( 青岛海洋) 为化学纯、柱层析硅胶( 青岛海洋) 为试剂级，其他试 剂为分析纯。 济南人学硕士学位论文 2 3 2 合成方法 2 3 2 1t h p p 的合成【1 1 8 】 取3 0m l 丙酸、3 0m l 的硝基苯、3 0m l 的冰醋酸加入装有球形冷凝管和温度计 的三口瓶中，加热至回流。在1 0m i n 内，用恒压滴液漏斗滴加溶有2 4 4g ( 2 0m m 0 1 ) 对羟基苯甲醛的2 0m l 丙酸。在1 5m i n 内，用恒压滴液漏斗滴完含有2 0 8m l 新蒸 吡咯的2 0m l 硝基苯。加热回流4 0m i n ，得墨绿色液体，冷却、静置过夜，抽滤， 得黑绿色粗产品。将粗产品转移到2 5 0m l 的烧杯中，加入5 的n a o h 溶液，加热， 直至完全溶解，抽滤，以除去不溶物，得蓝黑色液体，转移滤液至烧杯中，滴加浓盐 酸调溶液p h 值6 7 之间，溶液中会有沉淀析出，溶液呈现蓝紫色，滴加浓氨水至 溶液显中性，静置片刻后，抽滤，得蓝紫色粘状物。晾干，用无水乙醇重结晶，称重 为1 0 2g ，产率为2 9 。 2 3 2 2t d a p p 的合成 ， 在装有机械搅拌器、球形冷凝管、温度计的2 5 0m l 三口瓶内，加入5 9 7g ( 4 0 m m 0 1 ) 的对二甲氨基苯甲醛，用1 0 0m l 的丙酸将其溶解，加热沸腾后( 1 3 0 c ) ，立即 滴加溶于1 0m l 丙酸的2 7 7m l ( 4 0m m 0 1 ) 新蒸吡咯，控制滴加速率为2 3 滴秒，溶 液的颜色由澄清变为黑色，回流反应约2h ，冷却至室温，减压蒸出约一半溶剂，加 入等量溶剂的甲醇，静止过夜，抽滤，得到紫黑色晶体，在1 2 0 以下烘箱中干燥， 用氯仿充分洗涤，抽滤、干燥，得到亮紫色晶体，产品质量：1 9 0 2 5g ，产率为2 4 2 1 。 2 3 。2 。3t m a p 的合成 在装有磁力搅拌器、球形冷凝管( 带有导气管) 、温度计的1 0 0m l 三口瓶内，加 入o 5gt d a p p ，7 1g ( o 0 5m 0 1 ) 碘甲烷，2 0m ld m f ，加热至回流( 1 2 0 。c ) ，紫色不 溶物溶解，搅拌下回流反应3 0m i n 后，将反应液移入烧杯中冷至室温。加入6 0m l 丙酮，静置2 4h 使碘化卟啉完全沉淀，抽滤，滤饼暗红色，用丙酮洗涤，干燥，得 暗红色沉淀，产品质量：1 7 2g ，产率为7 1 。 2 3 2 4 不对称吡啶基n l 、啉的合成【1 2 1 】 在装有机械搅拌器、球形冷凝管、温度计的2 5 0m l 三口瓶内，加入1 0 2m l ( 1 0 m m 0 1 ) 的苯甲醛，2 2 9m l ( 2 4m m 0 1 ) 口 t 啶醛，用5 0m l 的丙酸将其溶解，加热回流 ( 1 3 0 c ) ，立即滴加溶于2 0m l 丙酸的2 2 1m l ( 3 2m m 0 1 ) 新蒸吡咯，控制滴加速率为 1 5 水溶性阳离予卟啉的合成及其聚榘行为的研歹 2 3 滴秒，溶液的颜色由澄清变为黑色，用薄层析板跟踪反应( 展开剂矿氯仿：y 甲醇= 5 0 ：1 ) ，可清楚地看到六个色带，回流反应约2h ，冷却至室温，减压蒸出约一半溶剂， 加入等量溶剂的甲醇，静止过夜，抽滤，得到紫黑色晶体，在1 2 0 以下烘箱中干燥， 得产品的总重量为1 0 2g ，产率为2 0 6 。 将粗品用少量的氯仿溶解，用( 2 0 x2 0c m ) 薄层析板分离提纯，所用展开剂为氯 仿、乙醇的混合液( 体积比为5 0 ：1 ) ，层析板上可较好的分离出六个色带，分别取第 二色带及第五色带于磨砂漏斗中用氯仿洗涤至洗液为无色，用旋转蒸发仪浓缩，干燥， t p p y p ( 第二色带) 及t r i p y p ( 第五色带) 质量分别为0 2 7g 和0 2 1g 。 2 3 2 5t p m p y p 及t rim p y p 的合成 在装有磁力搅拌器的1 0 0m l 单口瓶内加入t p p y po 1 2g ，溶于2 0m l ( v 氯仿：m = 4 ：1 ) 混合溶剂中，然后加入碘甲烷1 4 2g ( 0 1m o l ，6 2m e ) ，在室温下搅拌反应5h ， 反应结束可清楚地看到有紫红色沉淀生成，抽滤，干燥得产品质量0 0 6 9 9g ，产率为 6 5 。按同样方法得t r i m p y p0 0 9 7g ，产率为7 5 2 4 结果与讨论 a d l e r o l o n g o 法以丙酸为介质回流，反应温度高，可以克服成环张力，对于合成 具有较大位阻的卟啉特别是不对称卟啉有明显的优点。但此方法同样存在产率较低的 缺点，其产率受溶剂、反应温度、反应时间等多种因素的影响。 2 4 1 溶剂的影响 实验表明，催化剂和溶剂对产率影响极大，溶剂直接影响到吡咯上n 原子的极 化，以及苯甲醛上羰基的极化，进而影响反应的速率。根据文献报道，含强供电基团 的醛在合成卟啉尤其是合成不对称卟啉时使用混合溶剂法可得到较高的产率，但我们 在合成t d a p p 时却发现用单一的溶剂丙酸比用混合溶剂产率稍高。 原因我们分析可能是因为由于二甲氨基n 原子上存在一对孤对电子，而乙酸的 p k a 值较小，使n 原子与h 质子结合而使产物较多地溶解，实际中我们测试了t d a p p 在丙酸和乙酸中的溶解度，发现在乙酸中的溶解度稍大于在丙酸中的，证实了我们的 猜测。而且不对称卟啉的合成较对称卟啉的合成所要求的反应体系的温度较高，这也 说明有较高沸点的单一溶剂要好于混合溶剂。 1 6 济南大学硕上学位论文 2 4 2 反应温度的影响 不同类型的反应所需要的反应温度不同，在合成卟啉时反应温度我们控制在溶剂 微沸的温度，即烧瓶的壁上刚有回流液的温度。温度太高则副产物增多，太低则产率 下降。但在进行基团修饰时( 如甲基化) ，应视卟啉化合物在溶剂中溶解的难易程度不 同采用不同的反应温度。 2 4 3 芳香醛取代基的影响 已经证明含有弱的给电子基团( c h 3 ，一o c h 3 ) 或吸电子基团( 一c 1 ，- b r ) 的芳香醛较 容易形成相应的卟啉化合物，随着芳香醛取代基给电子能力的增强，产率有减少的趋 势，其原因与吡咯的缩合过程有关。在酸性介质中，r 的给电子或吸电子能力影响 碳正离子的形成，而碳正离子是缩合成卟啉的重要因素之一，因此，吸电子基团有利 于卟啉的形成，如含有供电子基团( 二甲氨基) g b 啉产率则较低。 2 4 4 搅拌速率对反应的影响 滴加吡咯过程中应在剧烈搅拌下进行，因反应溶剂量较大采用机械搅拌为宜，搅 拌缓慢则易使吡咯分散不均匀而发生自聚生成粘稠的黑色产物。而对生成的卟啉进行 基团修饰时，应视反应溶剂的量和反映的难易程度选用机械搅拌或磁力搅拌。继而控 制搅拌速率。 2 5 光谱表征 2 5 1 红外光谱 图2 3t h p p 的红外光谱 f i g 2 3 t h e1 rs p e c t r u mo f t h p p w a v e n u m b e r ，c m 1 图2 4 t m a p 的红外光谱 f i g 2 4 t h ei rs p e c t r u mo f t m a p 水溶性阳离子卟啉的合成及其聚集行为的研究 根据特征吸收峰归属卟啉分子中特定的基团、卟啉环上取代基的结构、在卟啉化 合物的表征中，可根据样品的红外光谱，与各种红外特征吸收峰位置对照，判别目标 化合物是否为我们设计的产物。红外光谱可用于判断卟啉分子中是否带有羟基、烷基、 苯基、羰基、氨基等官能团，各卟啉化合物的红外光谱如图2 - 3 2 8 所示。 由i r 谱图可知，所有化合物在1 6 0 0 ，1 5 0 0c m 。1 附近有强吸收峰，表明分子内存 在苯环。卟啉化合物在3 3 0 0c m - 1 附近有吸收，显示n h 键的存在，随着取代基的不 同，红外吸收峰存在差异。现以t p p y p 为例，对红外光谱中各峰的指认如下： 图2 5 t p p y p 的红外光谱 f i g 2 5 t h ei rs p e c t r u mo f t p p y p 图2 6t r i p y p 的红外光谱 f i g 2 6 t h ei rs p e c t r u mo ft r i p y p 图2 7t p m p y p 的红外光谱图2 8t r i m p y p 的红外光谱 f i g 2 7 t h ei rs p e c t r u mo f t m p p y pf i g 2 8 t h ei rs p e c t r u mo f t r i p y p 在t p p y p 的红外光谱图中，3 0 5 7 、3 0 2 2c m d 两条谱带归属为芳香化合物的c h 键伸缩振动，2 9 7 6 、2 9 2 3c m d 为卟啉中吡咯环上的c h 伸缩振动，面内弯曲振动出 现在9 6 6c m 。1 处，并且是较强的吸收谱带。1 6 3 9 、1 5 8 6 、1 4 6 9c m l 处吸收谱带是苯 环共轭体系的c - - - c 骨架振动和吡啶环共轭体系的c = c 、c = n 骨架振动吸收峰。6 9 8 9 6 6c m d 为卟啉环骨架振动频率。 甲基化后由红外光谱图可知在2 9 6 0 ，1 3 8 0c m 。附近出现较强吸收峰表明存在 l r 摹oo磊蓦g星h 摹oq蠹#一目磊占 摹ooiigg蠹j工 趼雨人学坝十字位论文 c h 3 中的c h 伸缩振动吸收峰。 2 5 2 核磁共振 由于扩大的环电流相互作用使所有卟啉化合物的1 hn m r 谱均在_ 2 3p p m 之 间有特征的卟啉环内质子峰，其他质子的信号出现在低场，所合成产物的1 hn m r 图谱见附录b 。 卟啉化合物1 hn m r 数据总结如表2 1 所示。 表2 1 系列卟啉化合物的1 hn m r 数据 t a b l e2 1 1hn m rd a t eo fas e r i e so fp o r p h y r i n s ( d m s o ) 2 5 3 吸收光谱 卟啉化合物具有大环共轭体系，因而具有典型的紫外可见吸收光谱。卟啉自由 碱的特征吸收为：3 5 0 4 5 0n m 之间的强吸收带( s o r e t 带) 及5 0 0 6 5 0n l t l 之间的弱吸 收带( q 带) 。s o r e t 带可归属为电子r - r 跃迁产生的第二电子激发态s 2 ，q 带可归属为 r - r 跃迁产生的第一电子激发态s l 【1 2 2 1 。表2 2 为所合成的阳离子卟啉在不同溶剂中的 吸收光谱数据。可以看出，不同卟啉的特征吸收峰有明显的不同，这是由于外围官能 团及数目的不同使卟啉大环上的电子跃迁能级发生改变。而同一种卟啉在不同溶剂中 的吸收光谱差别更大，除溶剂化作用外，卟啉的聚集作用是主要的原因。 1 9 水溶性阳离子卟啉的合成及其聚集行为的研究 2 5 4 荧光光谱 图2 9 为t m a p 在不同溶剂中的荧光光谱。卟啉化合物的荧光光谱对应于吸收光 谱的q 带，有两个荧光发射峰，分别位于6 5 0a m 及7 1 0a m 附近，其中6 5 0a m 处发 射峰为主要发射峰。所合成的阳离子卟啉化合物在不同溶剂中的荧光峰位置列于表 2 2 。 表2 2 不同溶剂中卟啉化合物的吸收及荧光光谱数据 t a b l e2 2 a b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c ed a t ao fp o r p h y r i n si nd i f f e r e n ts o l v e n t s 蚤 昌 。 菪 - _ - o j 皿 w a v e l e n g t h ，n i n 图2 9 t m a p 的荧光光谱 f i g 2 9 t h eu vs p e c t r u mo f t m a p 由于卟啉具有大的共轭体系且分子具有刚性，卟啉化合物具有较高的荧光量子产 率，以t p p 的c h 2 c 1 2 溶液为参比，痧= o 1 1 1 2 3 1 ，计算了阳离子卟啉化合物的荧光量 2 0 济南人学硕士学位论文 子产率，结果如表2 3 所示。计算公式如下： y u = y s ( 凡佩) ( a s a u ) ( 1 ) 式中y u 、凡、胤分别表示待测物质的荧光量子产率、积分荧光强度、吸光度蚝、 风、彳s 分别表示参比物质的荧光量子产率、积分荧光强度、吸光度。 表2 3 卧啉化合物的荧光量子产率 一t a b l e 2 3 f l u o r e s c e n c eq u a n t ap r o d u c er a t eo f p o r p h y r i n s 2 6 小结 本章内容介绍了a d l e r - l o n g o 法合成卟啉的反应机理，合成了双亲型卟啉t m ，p 及三种水溶性阳离子卟啉化合物，讨论了实验过程中的影响因素并进行了光谱表征。 所合成的卟啉化合物具有较高的荧光量子产率。 2 1 济南大学硕士学位论文 3 1 引言 第三章t h p p 在a o t 溶液中聚集行为的研究 卟啉聚集体引起了人们极大的