（生理学专业论文）galanin在嗅成鞘细胞中的表达及其作用研究.pdf

摘要 甘丙肽( g a l a n i n ，g a l ) 是一个2 9 - - 3 0 个氨基酸的酰攀化神经肚。它广泛分布 于中枢神经系统，参与学习记忆、神经内分泌和神经元活动等功能的调节。本文旨 在通过一种特殊的胶质细胞嗅成鞘细胞( o l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l s o e c s ) 来 研究g a l 及其受体( g a l r l 、g a l r 2 和g a i r 3 ) 的表达。并进一步探讨g a l 对o e c s 的作用。 为此，实验分为四部分进行。第一部分，选取出生后1 3 天的s d 大鼠摘取 大脑嗅球，垮其最外层嗅穆经层剽离下来，获得o e c s 培养物。运用阿糖胞营 ( a r a - c ) 处理这些细胞培养物从而纯化出o e c s ，再用含牛垂体提取物( b p e ) 的 培养液对细胞进行扩大培养。然后运用免疫组化a b c 法与免疫荧光细胞化学两种 方法进行鉴定。第二部分，为了检测体外培养的o e c s 是否表达g a l 及其二种受体 g a l r l 、g a l r 2 和g a l r 3 ，安验中采用免疫荧光化学舒j 方法来捡测g a l 蛋白的 表达。爵运用r t - p c r 方法来检测g a l 及其三种受体m r n a 的表达。第三部分， 为了初步了解g a l 对新牛大鼠o e c s 的影响，首先，实验中运用m t t 法来裣测不 同浓度的g a l 及其受体激动剂( g a l l 1 1 和g a l 2 1 1 ) 利拮抗剂( m 3 5 ) 对o e c s 增殖的影响。然后采用t u n e l 法避一步检测g a l 是否0 i 越了细胞的凋亡。笫圆部 分，为了进一步探讨g a l 对o e c s 增殖影响的作用机理，我们将1 0 0 n m g a l 作甩 于o e c s ，采用! 睁定量逆转录聚含酶链反应( s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c r ) 检测o e c s 中几种与神经细胞生长和存活楣关的营养因t ( l i f 、c n t f 、g d n f 、n t n 和b d n f ) 表达的变化。旨在通过这几种营养因子表达的变化，来探究g a l 的栩关作用机珲。 实验域人的甘油醛- 3 一磷酸脱氢酶( g l y c e r a l d e h y d e - 3 一p h o s 曲a t ed e h y d r o g e n 撤 g 3 p d h ) 作为内参照。 实验结粟： 1 ) 经过上述分离与纯化细胞的方法，我们成功地获得o e c s ，细胞纯度达到一 9 3 ，并且o e c s 在体外能够稳定的生长。 2 ) 体外培养的o e c s 表达g a l 的m r n a 。但未检测到g a l 蛋白。并且o e c s 只 表达g a l 受体g a l r 2 的m r n a ，而不表达其他两种受体g a l r l 和g a l r 3 的 m r n a 。 3 ) 除了l n m 的g a l 2 1 1 之外，各种浓度的g a l 及两种受体激动剂g a l l 1 1 和 g a l 2 ，1 1 都能够明显地抑制体外培养的o e c s 的增殖，丽且g a l l t l 和g a l 2 1 1 的效应可能比g a l 更强烈。但是他们的这种抑制效应均可被非特异性g a l 受 体拮抗荆m 3 5 所阻断。而且t u n e l 法捡测显示g a l 未引起细胞产生凋亡现象。 4 ) 当g a l 作用于细胞三天后o e c s 中l i f 和g d n f 表达量明显降低，i f i _ c n t f 的表达量没有发生明显变化。值得一提的是，o e c s 表达l i f ，这在以前未曾报 道过。 综上所述，我们从新生s d 大鼠嗅球的嗅神经层分离纯化得到了纯度较高的 o e c s 。利用这种细胞来研究g a l 的作用，结果说明g a l 抑制这种细胞的增殖。f l l 这种抑制效应不是通过亏f 起细胞的凋亡丽实现的。此外，o e c s 中只表达受体g a l r 2 ， 则提示g a l 是通过受体g a l r 2 进而引发了细胞内相应的生物学效应，其中包括下 调l i f 和g d n f 的表达量。同时，我们推测这两种神经营养因予表选量的降低可能 导致是细胞增殖受抑的原因之一。 关键词：嗅成鞘细胞： g a l a n i n ；分离；纯化：受体；激动剂； 拮抗剂；增殖；神经营养因予； 表达；r t - p c r a b s t r a c t g a l a n i n ( g a l ) i sa2 9 3 0a m i n o a c i dn e u r o p e p t i d e i ti ss p r e a dt h r o u g h o u tt h e c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m g a l a n i nh a sb e e ni n v o l v e di nm u l t i p l ef u n c t i o n a lr e g u l a t i o n s ，f o r e x a m p l e ，i ti si n v o l v e di n t h er e g u l a t i o no fl e a r n i n ga n dm e m o r y ，n e u r o e n d o c r i n ea n d n e u r o n a la c t i v i t yf u n c t i o n s t h i se x p e r i m e n ti n v e s t i g a t e st h ee x p r e s s i o n so fg a la n di t s r e c e p t o r si no l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l s ( o e c s ) ，as p e c i a lg l i a lc e l l ，a n df u r t h e rs t u d i e s t h ee f f e c t so fg a lo nt h e s ec e l l s t od ot h i s ，f o u re x p r 6 s s i o n sw e r ec a r r i e do u t f i r s t ，w es e l e c t e dn e o n a t a l ( o n e - t o t h r e e d a y o l d ) s dr a t sa n dg o to l f a c t o r yb u l b so ft h e i rb r a i n t h eo l f a c t o r yn e r v el a y e r w a sp e e l e da w a yf r o mt h er e s to fb u l ba n dt h eo e c sc u l t u r e sw e r eo b t a i n e d t h e n ，t h e c u l t u r ew a st r e a t e dw i t h c y t o s i n ea r a b i n o s i d e ( a r a c 1a n dt h ep u r i f i e d o e c sw e r e r e c e i v e d t h e s ec e l l sw e r ee n r i c h e db ya d d i t i o no fb o v i n ep i t u i t a r ye x t r a c t ( b p e ) t ot h e c u l t u r e m e d i u m w h e r e a f l e r , t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a la b cm e t h o da n dt h e i m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n gw e r eu s e dt oi d e n t i f yo e c s s e c o n d ，t od e t e r m i n ei fo e c si n v i t r oe x p r e s s e dg a la n di t sr e c e p t o r si n c l u d i n gg a l r l ，g a l r 2a n dg a i r 3 ，w ed e t e c t e d t h ee x p r e s s i o no fg a l p r o t e i nu s i n gi m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n gi nt h i ss t u d y , a n dt h e n ， t h er t - p c ra n a l y s i sw a su s e dt od e t e c tm r n a sf o rg a la n di t st h r e er e c e p t o r s t h i r d ， t od e t e r m i n ee f f e c t so fg a lo nn e o n a t a lo e c s ，m t f a n a l y s i sw a su s e dt od e t e c t t h e e f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fg a la n d a g o n i s t ( g a l l 一1 1 a n d g a l 2 - 1 1 ) ， a n t a g o n i s t ( m 3 5 ) o fg a lr e c e p t o r so nt h ep r o l i f e r a t i o no fo e c s t h e n ，t h et u n e l m e t h o dw a sf u r t h e ru s e dt od e t e c ti fg a lc o u l dr e s u l ti nc e l la p o p t o s i s f i n a l l y , t of u r t h e r s t u d y t h em e c h a n i s mo fg a lo nt h ep r o l i f e r a t i o no fo e c s ，t h e s e m i q u a n t i l a t i v er t - p c r a n a l y s i sw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o n so fs e v e r a ln e u r o t r o p h i cf a c t o r st h a ta s s o c i a t e d 坤i c ht h eg r o w t ha n ds u r v i v a lo fn e r v ec e l l s ，f o re x a m p l e ，l i f ，c n t f , g d n f ，n t na n d b d n f b y t h e s e c h a n g e s o ft h e i r e x p r e s s i o n s ，w e c o n c l u d e ds o m ef u n c t i o n a l m e c h a n i s m so fg a l i nt h e e x p e r i m e n t ，t h e h u m a n g l y c e r a i d e h y d e 一3 一p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( g 3 p d h ) w a s c a r r i e do u tt ob et h ei n t e m a ls t a n d a r d t h e f o l l o w i n g sa r et h er e s u l t so f t h i ss t u d y ： 1 ) b yt h ea b o v em e t h o d so fi s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，w es u c c e s s f u l l yo b t a i n e do e c s a n dt h ec e l lp u r i t yw a s9 0 9 3 w h a t sm o r e ，o e c sc o u l d g r o ws t a b l yi nv i t r o 2 ) i nv i t r o ，o e c se x p r e s sm r n a sf o rg a l ，b u tt h eg a lp r o t e i n i sn o td e t e c t e d f u r t h e r m o r e ，o e c se x p r e s sm r n a f o rg a l r 2b u tn o tf o rt w oa n o t h e rr e c e p t o r s ，g a l r1 a n dg a j r 3 3 ) e x c e p t 1 r i m g a l l 一1 1 ，e v e r yc o n c e n t r a t i o n s o fg a la n dt w o r e c e p t o ra g o n i s t s ， g a l l - 1 1a n dg a l 2 1 1 ，c a ns i g n i f i c a n t l yi n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fo e c s m o r e o v e r , t h ee f f e c t so fg a l l 一1 1a n dg a l 2 1 1m a yb es t r o n g e rt h a ng a l b u tt h ei n f l u e n c e c a nb eb l o c k e db ym 3 5 ，an o n s p e c i f i ca n t a g o n i s to fg a l r e c e p t o r s i na d d i t i o n ，t h e r e s u l to ft u n e l a n a l y s i ss h o w e dt h a tg a l d i d n tl e a do e c st oa p o p t o s i s 4 ) a f t e ro e c s w e r ei n c u b a t e dw i t hg a lf o r3d a y s ，t h ee x p r e s s i o n so fl i fa n dg d n f d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nt h e s ec e l l s ，b u tt h e r ew a sn oa n y c h a n g e o ut h ee x p r e s s i o no f c n t ei tw a sw o r t ht o s a y i n gt h a t o e c se x p r e s s e duf w h i c hw a sn o tr e p o r t e d p r e v i o u s l y i naw o r d ，u s i n gt h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d ，w eo b t a i n e dm o r ep u r eo e c s f r o mt h eo l f a c t o r yn e r v el a y e ro fn e w b o r nr a to l f a c t o r yb u l b ，a n ds t u d i e dt h ee f f e c to f g a lo nt h e s ec e l l s t h er e s u l ts h o w e dt h a tg a li n h i b i t e dt h e s ec e l l sp r o l i f e r a t i o n ，b u t t h ee f f e c tw a sr e a l i z e dn o t b yl e a d i n gc e l l s t o a p o p t o s i s i na d d i t i o n ，o e c so n l y e x p r e s s e dt h er e c e p t o rg a l r 2 ，w h i c hs u g g e s t e dt h a t ，t h r o u g ht h er e c e p t o rg a l r 2 ，g a l a r o u s e dt h e c o r r e s p o n d i n gb i o l o g i c a le f f i c a c y , i n c l u d i n gd e c r e a s eo fl i fa n dg d n f e x p r e s s i o n s m e a n w h i l e ，w ec o n c l u d e dt h ed e c r e a s eo ft h e s et w on e u r o t r o p h i cf a c t m e x p r e s s i o n sm a y b eo n eo ft h er e a s o n s w h y t h ec e l lp r o l i f e r a t i o nw a si n h i b i t e d k e yw o r d s ：o l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l s ，g a l a n i n ，i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，r e c e p l w f ， a g o n i s t ，a n t a g o n i s t ，p r o l i f e r a t i o n ，n e u r o t r o p h i cf a c t o r , e x p r e s s i o n ， r t - p c r 星趁童硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 孙心德教授华东师范大学主席 张季平教授华东师范大学 周晓明教授华东师范大学 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的 个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入 学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权冉学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在解密后适用 本规定 日期：型：! ：! 圭 学傍论文作者签名丐匿。圭全意= 导师 日期：理丛：皇：三圣 0 国 彩 橼 g a | a n i n 在嗅成鞘细胞中的表选及其作用研究 前言 哺乳动物的嗅觉系统被普遍地用于研究神经发生和轴突再生的分子和细胞基 础。不管是在受损情况下还是正常的更新，哺乳动物的嗅觉系统具有独特的能力， 它终生可以支持嗅上皮中的外周神经细胞体的轴突生长并进入c n s 的嗅球。这与多 数c n s 组织相反，c n s 中多数组织仅仅在发育时期支持轴突的生长。在嗅觉系统 中，这种特性被认为是部分源于嗅成鞘细胞( o l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l s ，o e c s ) ，它 可以为处于受损c n s 的不良环境中的再生轴突创造一种许可环境。这样就使o e c s 成为移植介导c n s 损伤修复的一种强而有力的细胞源。来自动物模型的研究已经证 实o e c s 可以使脱髓鞘轴突重新髓鞘化1 1 , 2 】，还可促进受损脊髓的修复【3 ，”。 o e c s 分布于嗅粘膜的固有层、嗅神经和嗅球的最外两层( 神经层和小球层) 1 5 ， “。它是一种特殊胶质细胞，具有某些与周围神经系统( p n s ) 的s c h w a n n 细胞和 中枢神经系统( c n s ) 的星形胶质细胞相似的表形特征。现在，几种o e c s 形态学 已被证实，但是其中只有两种与抗原表型相关联的形态被插述。一种是s c h w a n n 细 胞样o e c s ，这是由于它具有梭状形态，表达低亲和性神经营养因了受体( p 7 5 r r r ) 和弥散性胶质纤维酸性蛋白( g f a p ) 。另一种是星形胶质样o e c s ，这是由于它具 有扁平的形态，表达丝状g f a p 和神经细胞粘附分子( p s a n c a m ) ，而缺乏p 7 5 。 来自新牛嗅神经、成年大鼠嗅神经、新生和成年大鼠的嗅球外层的胶质细胞和从固 有层分离出的o e c s 也已被证实具有相类似的细胞类型。形状扁平的星形胶质样细 嘲研能是具突起细胞的一种未成熟形式，类似于扁平的不其突起的s c h w a n n 细胞前 体细胞，这种前体细胞随后分化为成熟的具突起的s c h w a n n 细胞。这两种细胞类型 可曲拽囊成熟o e c s 的两种表型的变体。 体内的o e c s 以几种标志为特征，这些标志包括：p 7 5 、g f a p 、o 。抗体、 s 1 0 0 和神经肽y 【7 1 。运用这些标志进行免疫组织化学并结合超微组织分析，检测 到整个o n l 都存在o e c s 。而且o e c s 形成了一种亚层组织，这种组织根据所处的 位置携带不同的抗原。用于定义体外培养的o e c s 的标志( p 7 5 。r r r 和g f a p ) 只能 前言 标记一定比例的在体o e c s ，另一部分亚型可以用$ 1 0 0 和神经肽y ( n p y ) 。在体外， o e c s 所表现出来的免疫标记特征要依赖于组织供体的年龄、培养条件和培养时问。 尽锊存在这种变异，但是许多标记特性会在一定程度上得到维持。运用一些抗体七 检测体外培养的胚胎的、新生的和成年动物的o e c s 的抗原表型。所有培养的细胞 都具有$ 1 0 0 免疫反应性r 离体培养和在体实验研究表明o e c s 可分泌多种神经营养因了，如n g f 、b d n f 、 n t - 3 、n t - 4 、c n t f 、g d n f 等，此外，o e c s 还表达有利于神经突起生长的胶质源 性连接素( g l i a l d e r i v e d n e x i n ) 和s - 1 0 0 1 5 9 1 引。这些因了都是神经细胞存活和生k 所 必需的。人们认为神经损伤阻断了神经营养因予的逆行转运，神经元胞体得不到靶 源性的神经生长因子的供给从而导致促凋亡基因的表达，这是导致神经元死亡和再 生失败一个重要因素。而上述神经营养因子的表达可能就是o e c s 促进再生轴突生 长的机制之一。 所以，利用这种神经系统中特殊的胶质细胞来研究一种广泛分布于中枢神经系 统中的酰基化神经肽g a l a n i n ( g a l ) 是非常有意义的。而这方面的研究至今还未 曾见报道。 g a l a n i n ( g a l ) 是一个由2 9 3 0 个氨基酸组成的神经肽，最初是从猪的小肠 f j 分离出来的 ”1 。在哺乳动物中，g a l 广泛地分布于中枢和外周神经系统。在哺乳 动物的中枢神经系统中，前脑腹侧、杏仁核、海马、脑干和脊髓中都出现g a l 的 高表达i ”。2 “。与其广泛分布的特点相一致的是，g a l 具有非常广的作用，包括参与 神经调制、生殖和内分泌等功能2 3 i 。最新的一项研究发现在正常成年动物的大脑 中，位于室下带( s u b v e n t r i c u l a r z o n e ，s v z ) 和头向迁移通道( r o s t r a l m i g r a t o r ys t r e a m r m s ) 的未成熟的神经祖细胞也表达g a l m r n a 且具有g a l 的免疫反应性l 。在 受损的神经区域，g a l ，的表达则明显州高陋7 i 。提示g a l 可能参与了神经发生和 樽牛过程中的调控。研究发现，在中枢神经系统中，当前脑瞬时缺f l 后，海马中 1 _ 现g a l 表达的升高。而在外周神经系统中，当坐骨神经和脊髓神经横断之后脊 髓背根神经节中也出现g a l 表达的升高。另外，在阿尔茨海默病患者中也存在g a l 的高表达。上述g a l 高表达的出现都是在神经系统受损的情况下m 现的，似是， 这种g a l 高表达的具体作用是什么至今还不是很清楚。已有研究说明g a l 是种 神经抑制调质。而且近来的研究还发现，g a l 参与细胞增殖和凋亡的调节。 g a l 的这些作用是通过与至少三个特异性受体亚型g a l r i 、g a l r 2 和g a l r 3 的 相互作用而介导的，三种受体亚型都属于g 蛋白偶联受体超家族成员。 尽管已经有许多针对g a l 的研究，但是它作用于细胞后，通过哪一受体介导 细胞内的第二信号，进而激发什么样的分子事件以及产生的效应仍然需要更多的研 究去揭示。 g a l a n i n 在嗅成鞘细胞巾的表达及其作用研究 第一部分嗅成鞘细胞的体外培养与鉴定 摘要：选取出牛1 3 天的s d 大鼠，摘取大脑嗅球。将其最外层嗅神经层分 离下来，分离出含有嗅成鞘细胞的细胞培养物，经过阿糖胞苷的处理而纯化，再用 含牛垂体提取物的培养液培养得到纯度较高的嗅成鞘细胞。运用免疫组化a b c 法 与免疫荧光细胞化学两种方法进行鉴定。结果显示：经过这种方法处理得到了纯度 达到9 0 9 3 的嗅成鞘细胞。 关键词：嗅成鞘细胞s d 大鼠分离纯化鉴定 嗅成鞘细胞( o l f a c t o r yc n s h c a t h i n gc e l l s ，o e c s ) 是一种特殊胶质细胞，它具有 某些与周围神经系统( p n s ) 的s c h w a n n 细胞和中枢神经系统( c n s ) 的星形胶质 细胞相似的表形特征1 2 8 3 0 i 。近年来发现，嗅神经终生可以由基底细胞再生，再生细 胞的轴突可穿越c n s 与p i n s 的过渡区重新长入嗅球与小球层的细胞建立突触联系 1 5 1 。这些轴突的独特能力被认为与成鞘细胞所创造的许可环境密切相关i ”，”i 。由此 提示，成鞘细胞可能比s c h w a n n 细胞更有利于c n s 和p n s 的修复。鉴于o e c s 的 这些特性，近年来已有研究将o e c s 植入脊髓作为促进受损轴突再牛的一项实验策 略。结果显示，植入的o e c s 能够明显地促进受损轴突的再生和功能的修复”。5 i ， 包括脱髓鞘轴突的重新髓鞘化1 2 3 6 1 。因此，o e c s 就成为研究神经再牛和治疗疾病的 一种较好的移植细胞源。另外，由于o e c s 具有一定的增殖能力，所以可以作为研 究c n s 中神经细胞的良好模型。本实验从新生大鼠的嗅球中分离并培养出o e c s ， 以其为研究这类细胞提供更多的实验基础，并为接下来的实验提供一种稳定且单一 的细胞源。 第一部分嚷成鞘细胞的体外培养与箍定 材料与方法 1 材料 细胞培养的主要试剂及材料：d m e m 培养液为g i b c o 公司产品；胎牛血清 ( f c s ) 为杭州四季清产品；牛垂体提取物( b o v i n ep i t u i t a r ye x t r a c t ，b p e ) 为s i g m a 产 品；阿糖胞苷( c y t o s i n ea r a b i n o s i d e ，a r a c ) 为上海华联制药有限公司产品；六孔细 胞培养板属美国c o m i n g 公司产品。多聚赖氨酸为华美生物工程公司产品。 抗体及荧光试剂：兔抗s 一1 0 0 抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品：a b c 免疫组化检测试剂盒( 浓缩型) 、d a b 浓缩显色液、结合异硫氰酸荧光素的山羊抗 兔抗体( a n t i m o u s ei g gf i t cc o n j u g a t e ) 购自华美生物工程公司；d a p j 为上海生 工公司产品。 2 方法 2 1 取材 2 1 1 嗅成鞘细胞的分离 嗅成鞘细胞的分离培养参考c h u a h 和t e a g u e 3 7 i 的方法。将出生后1 - - 3 天s d 大鼠断头，用酒精进行表面消毒后剥离出整个大脑，放迸冰冷的d h a n k s 液体中， 然后在解剖镜下仔细地将位于嗅球( o l f a c t o r yb u l b ，o b ) 的最外层即嗅神经层 ( o l f a c t o r yn e r v el a y e r , o n l ) 分离下来，将组织块剪碎后浸入3 m l0 1 2 5 胰酶中， 3 7 c 孵育1 5 m i u ，然后加入等量的含有i o f c s 的d m e m 培养液中止消化。用移 液器吹打1 0 - - 1 5 次形成单细胞悬液，移入离心管中，室温1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃 上清，用l m l 含1 0 f c s 的d m e m 培养液重悬细胞，重新离心一次。最后用含1 0 f c s 的d m e m 新鲜培养液重悬细胞，按照从3 只大鼠得到的细胞悬液接种于6 孔板r 1 的1 孔的原则进行接种，然后于3 t c ，5 c 0 2 培养箱中培养。 2 1 2 纯化培养 培养2 4 h 后，加入2 1 0 _ 5 m o f l 阿糖胞苷( a r a c ) 4 8 - - 7 2 h 以太除杂细胞( i 要是成纤维细胞) 。然后，每隔1 5 m i u 更换一次培养液，连续更换三次以去除a r a _ c 。 第一部分嗅成鞘细胞的体外培养与黪定 最后加入含1 0 f c s 、1 2 9 9 m lb p e 的d m e m 条件培养液于3 7 。c ，5 c 0 2 培养箱 中继续培养。咀后每隔3 天换半量培养液。 2 1 - 3 传代培养 弃细胞培养上清，经d h a n k s 液洗涤后，加入o 1 2 5 胰酶和0 2 e d t a ( 1 ：1v v ) 的混合液进行消化3 m i n ，再加入等体积的含1 0 f c s 的d m e m 培养液终止消化。 然后将细胞悬液移入离心管中，1 0 0 0 t p m 离心5 m i n ，弃上清，加入l m l 含1 0 f c s 的d m e m 培养液重悬细胞，重新离心一次。最后用含1 0 f c s 、1 跏g m lb p e 的 d m e m 条件培养液重悬细胞，调整细胞密度到3 x 1 0 5 m ! ，接种于6 孔板于3 7 5 c 0 2 培养箱中继续培养。 2 2 嗅成鞘细胞的鉴定 用兔抗s - 1 0 0 ( 1 ：1 0 0 ) 旧3 7 j 免疫组化a b c 法和免疫荧光细胞化学两种方法鉴 定o e c s 并检测其纯度。按照上述的方法将传代细胞经消化、离心和重悬从而形成 细胞悬液，调整细胞密度为5 x 1 0 4 m l ，将其均匀地接种到预先放霹有经多聚赖氨酸 ( 1 0 ”g m 1 ) 处理过的盖玻片的2 4 孔培养板中，每孔0 跏i 细胞悬液。将2 4 孔培养 板放入3 7 。c 、5 c 0 2 培养箱中培养，2 4 h 后4 多聚甲醛固定，然后进行免疫组化 a b c 法和免疫荧光化学检测( 这两种方法的具体步骤如下) 。o l y m p u sb x 5 1 显微成 像系统下对结果进行观察与拍照。随后再进行细胞纯度的统计，从检测结果的玻片 中随机抽取5 张，选取1 0 个视野进行s 一1 0 0 阳性细胞的统计。 2 2 1 免疫组化a b c 法检测步骤 1 细胞在盖玻片匕贴好后，以4 多聚甲醛固定3 0 m i n 。 2 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n 3 次。 3 0 7 5 过氧化氢孵育，室温1 0 m i n 。 4 0 0 1 mf ) b s 漂洗5 m i n 3 次。 5 0 3 t r it o n x 一1 0 0 室温下作用1 5 m i n 。 6 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n 3 次。 第一部分嗅成鞘细胞的体外培养与鉴定 7 加入1 0 山羊血清封闭剂，3 7 ，2 0 m i n 。 8 倾去多余封闭剂，不洗，直接加入一抗( s - 1 0 0 ，1 ：1 0 0 ) ，4 c 过夜。 9 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n 3 次。 1 0 滴加生物素标记的二抗，3 7 。c 孵育1 h 。 1 1 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n 3 次。 1 2 在1 0 。1 1 步的过程中，进行a b c 混合液的制作。用稀释液按照1 ：5 0 分别稀 释亲和素和生物素一辣根过氧化物酶，再将两者混合，湿盒中3 76 c 温育 3 0 m i n ，即成a b c 。 1 3 滴加混合好的a b c ，湿盒中3 7 温育1 h 。 1 4 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n 3 次。 1 5 d b 显色：临用前以d a b 溶解液将d a b 溶解成0 5 m g m 1 浓度，另加3 1 t 。0 ： 至0 0 3 浓度后混匀，加到玻片上。镜下见显色适宜，即用水充分冲洗， 终止显色。 1 6 显微镜下观察扪照。 2 2 2 免疫荧光细胞化学检测步骤 1 细胞在盖玻片上生长良好时，弃培养上清以4 多聚甲醛固定3 0 m i n 。 2 0 0 1 m p b s 漂洗5 m i n 3 次。 3 0 3 t r i t o n x 1 0 0 室温下作用1 5 m i n 。 4 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n x 3 次。 5 加入1 0 山羊血清封闭剂，3 7 ，2 0 m i n 。 6 倾太多余封闭剂，不洗，直接加入一抗( s 1 0 0 ，1 ：1 0 0 ) ，4 c 过夜。 7 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n x 3 次。 8 滴加f i t c 标记的山羊抗兔抗体，湿盒中3 7 。c 温育1 h 。 9 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n x 3 次。 1 0 滴加d a p i ，室温1 5 m i n 。 1 1 0 0 1 mp b s 漂洗5 m i n x 3 次。 1 2 荧光显微镜下观察拍照。 第一部分嗅成鞘鲺咆的体外培养与鉴定 结果 1 嗅成鞘细目良体外生长的形态学观察 o e c s 在体外接种2 4 h 后已基本贴壁。经过a m c 处理纯化之后，o e c s 占绝对 多数。在倒置显微镜下观察，o e c s 立体感强，胞体呈长梭形，突起细长，多数o e c s 是双极细胞，也有少数是三极细胞( 图卜lb ) 。在细胞密集的地方，o e c s 的突起 伸展具有平行性( 图1 1c ) 。有时o e c s 之间连接起来容易形成网状结构( 图l l d ) 。但仍有少量非成鞘细胞( 主要是成纤维细胞) 存在，这类细胞折光性和立体感 较差，胞体扁平且边界不规则。还有少量吞噬样细胞。这类细胞颜色黯淡。成纤维 细胞和吞噬样细胞在外形上都与o e c s 明显不同。而未经a r a - c 处理的细胞中，成 纤维细胞比例明显偏高( 图1 1a ) 。他们铺于o e c s 下面形成膜样连接，而极少量 的吞噬样细胞则分散于最上面。 图1 - 1 体外培养的嗅成鞘细胞。( a ) 体外经含1 0 f c s 的d m e m 条件培养液培养三天且未经 第一部分嗅成鞘细胞的体外培养与鉴定 a r a - c 纯化过的含o e c s 的细胞群( 酚红染色，x 2 0 0 ) 。( b ) 体外经a r a - c 处理过的o e c s ( 苏 木精染色，2 0 0 ) 。根据细胞形态可以看出杂细胞明显减少。( c ) 在细胞密集的地方，细胞的 突起与突起之间容易平行生长( 苏木精染色+ 1 0 0 ) 。( d ) 有时细胞之阊连接起来会形成网状 结构( d a b 染色，x 1 0 0 ) 。 f i g 1 1 t h e o e c s w 目e t r e a t e d b y a r b - c o r n o t i n v i t r o ( a ) t h e c e l l s i n c l u d i n g o e c s w h i c h c u l t u r e d f o r3d a y sb yd m e mc o n d i l i o n c dm e d i u mo n l yc o n t a i n i n g1 0 f c s ( 2 0 0 ) ( b ) t h eo e c sw b r c 口e a c e db ya r a - c ( h e m a t o x y l i ns t a i n i n g ，x 2 0 0 ) t h em a r k e dd e c r e a s eo f c o n t a m i n a t i n gc e l l sw o b s e r v e db yc e l lm o r p h o l o g y ( c ) p r o c e s s e so fc e l l sw h i c hw e 忙i nc l o s ep r o x i m i t yw i t he a c ho t h e r , o ! i e = ng r e wi np a r a l l e ld i r e c t i o n s ( h c m a t o x y l i l is t a i n i n g ，1 0 0 ) ) s o m e t i m e st h er 曲c u l a t e d s l r u c b l r c sw e l co b s e r v e d a bs t a i n i n g ，xt o o ) 2 免疫组化a b c 法和免疫荧光检测 免疫组化a b c 法显示大部分细胞均呈现s - 1 0 0 免疫阳性( 图1 - 2a ) 。免疫荧 光检测显示，s - 1 0 0 和d a p i 双标记的细胞是o e c s ，这类细胞占绝大多数。其中只 带有d a p i 标记的细胞是杂细胞( 图1 2b - c ) 。统计结果显示s - 1 0 0 阳性细胞百分 率为9 0 - - 9 3 ，即o e c s 的纯度为9 0 - - 9 3 。这些阳性细胞绝大多数是双极和三极 细胞，且细胞突起细长。 9 第部分嗅成鞘细胞的体外培养与鉴定 图1 2 o e c s 的免疫组化a b c f 法鉴定和s 1 0 0 ( 绿色) 和d a p i ( 蓝色) 双染免疫荧光鉴定。 ( a ) d a b 染色的组化a b c 法鉴定图。几乎所有的细胞都具有s - 1 0 0 免疫原性，且这类细胞呈 现双极和三级形态( 1 0 0 ) 。( b d ) s 1 0 0 ( b ，绿色) 和d a p i ( c 蓝色) 的双染免疫荧光图。 d 为b 和c 的合成图，显示仅仅有极少量的细胞为s - 1 0 0 免疫阴性( 红色箭头所指) ，这些细 胞即为杂细胞( 4 0 0 ) 。 f i g1 - 2 t h ei m m u n o h i s t o c h e m i c a la b cs t a i n i n ga n di m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n gw i t ha n t i s 1 0 0 ( g r e e n ) a n dd a p i ( b l u e ) ( a ) t h e d a b s t a i n i n gi m a g e m o s tc e l l sp r e s e n ti m m u n o r e a c t i v i t yt os - 1 0 0 t h e s ec e l l sd i s p l a yb i p o l a ra n dt r i p o l a rs h a p e ( 1 0 0 ) ( b - d ) f l u o r e s c e n ti m a g e so fs - 1 0 0 一p o s i t i v e c e l l s ( b ，g r e e n ) d o u b l e s