（应用化学专业论文）2（2羟基苯基）苯并咪唑类荧光探针的合成.pdf

摘要 2 ( 2 羟基苯基) 苯并咪唑( h p b i ) 及其衍生物是一类重要的荧光化合物，它们可以通过 激发态分子内质子转移过程( e s i p t ) 发射具有大的s t o k e s 位移的特征荧光，这类化合物 对开发新型荧光探针、高能辐射探测器、塑料发光体以及聚合物紫外稳定剂有着重要意 义。因此，研究此类化合物的合成及其荧光特性具有重要的理论意义和应用价值。 一氧化氮( n 0 ) 是一种参与多种生理和病理过程的功能分子。目前已有的n o 荧光探 针多为通过测定n o 的氧化产物，间接地测定n o 的存在及浓度变化，存在着应用的局限 性。本研究室研究表明，h p b i 及其衍生物能够和二价铜离子形成稳定的配合物，此配合 物作为荧光探针能够用于n o 的直接测定，本论文对这类新型n o 荧光探针的合成及性能 进行了研究。 巯基( s h ) 是细胞中化学活性最高的基团。但传统的检测方法灵敏度低，不能适应有 些生物样品中巯基化合物的测定，而s h 荧光探针具有灵敏度高等优点，得到了广泛应 用。本文也对具有大的s t o k e s 位移的2 ( 2 羟基苯基) 苯并咪唑类的巯基荧光探针开展了 合成与性能研究。 主要内容如下： 1 以取代水杨醛和邻苯二胺为原料，合成了h p b i 衍生物2 a 一2 9 ，其中化合物2 d 和2 9 采用多种路线合成，以找到最佳合成方法。对2 a 2 9 的荧光特性进行了测定，分 析了不同取代基对荧光特性的影响，三种互变异构体的产生以及它们所导致的两种发射 荧光的产生原理。讨论了磺酸基的引入对水溶性的影响及2 9 在酸、碱溶液中光谱性质 变化。 2 采用席夫碱三价锰配合物分解法合成了h p b i 和2 ( 2 羟基苯基) 萘并咪唑( h p n i ) 及其衍生物3 a 3 h ，测定了它们和二价铜离子形成的配合物以及铜配合物与n o 反应后紫 外和荧光光谱特性。这种新的合成方法只需在室温下进行且产率高。合成的化合物中有 六种h p b i 和h p n i 铜配合物和n o 的反应具有迅速性和直接性，反应前后化合物的荧光 强度变化非常明显，具有作为n o 荧光探针的先决条件。 3 合成了n 3 ( 2 苯并咪唑基) 4 羟基苯基 马来酰亚胺酸( b i h p m a ) 和n 3 ( 2 苯 并咪唑基) 4 羟基苯基) 马来酰亚胺( b i h p m ) ，测定了b i h p m a 和b i h p m 与b 筑基乙 醇反应前后荧光光谱变化，并将它们应用于h e p g 2 ( 人源肝癌细胞) 细胞和l - c y s ( l - 谷胱 甘肽) 中巯基的测定，结果证明了该类化合物作为细胞内巯基荧光探针的可行性。 关键词：苯并咪唑荧光探针一氧化氮巯基合成 a b s t r a c t 2 ( 2 一h y d r o x y p h e n y l ) b e n z i m i d a z o l e ( h p b i ) a n di t sd e r i v a t i v e sa r eas e r i e so fi m p o r t a n t f l u o r e s c e n tc o m p o u n d si nt h ec a s eo ft h e i ri n t e n s ee m i s s i o np r o p e r t i e sv i ae x c i t e d s t a t e i n t r a m o l e c u l a rp r o t o nt r a n s f e r ( e s i p t ) m e a n w h i l e ，t h eh p b id e r i v a t i v e sa r eu s e f u l 弱an e w s e r i e so ff l u o r e s c e n tp r o b e s ，h i g h - e n e r g yr a d i a t i o nd e t e c t o r , p l a s t i cs c i n t i l l a t o r sa n dp o l y m e r u l t r a v i o l e ts t a b i l i z e r s s oi ti so fg r e a ti m p o r t a n c et os t u d yt h es y n t h e s i sa n df l u o r e s c e n t c h a r a c t e r i s t i c so ft h e s ec o m p o u n d s n i t r i co x i d e ( n o ) i sam u l t i f u n c t i o n a lm o l e c u l ei nb i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a lp r o c e s s h o w e v e r , m o s to fc u r r e n tf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rn om e a s u r e m e n tt h eo x y d a t e dp r o d u c t so f n oi n s t e a do fn oi t s e l f , d u et ot h el i m i t e dm e a s u r e m e n to ft h ee x i s t e n c ea n dc o n c e n t r a t i o no f n oi n d i r e c t l ya n dm a k et h e i ra p p l i c a t i o n sl o c a l i z e d o u rs t u d i e ss h o w e dt h a th p b i d e r i v a t i v e sc a nc o o r d i n a t ew i t hc u 2 t of o r ms t a b l ec o o r d i n a t i o nc o m p o u n d sw h i c hc a nb e u s e da sf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rd e t e c t i n gn od i r e c t l y t h i sa r t i c l ed i s c u s s e dt h es y n t h e s i sa n d p r o p e r t i e so ft h e s en e wn o f l u o r e s c e n tp r o b e s s u l f h y d r y l ( 一s h ) i so n e o ft h em o s ta c t i v eg r o u pi nc e l l s u n l i k et h et r a d i t i o n a ld e t e c t i o n m e t h o d sw i t hr a t h e rl o ws e n s i t i v e t yt ob eu s e l e s si ns o m ec a s e s b u t - s hf l u o r e s c e n tp r o b e s w e r ea p p l i e dw i d e l yb e c a u s eo ft h e i rh i g hs e n s i b i l i t y t h ec o r r e s p o n d i n gs y n t h e s i sa n d p r o p e r t i e so f _ s h f l u o r e s c e n tp r o b e sw i t hh p b i sa st h ef l u o r o p h o r ew h i c hh a v eb i gs t o k e s s h i f tw e r ea l s od i c u s s e d t h i sa r t i c a li n c l u d e st h r e ep a r t sa sf o l l o w s ： 1 h p b id e r i v a t i v e s ( 2 a - 2 9 ) w e r e s y n t h e s i z e d w i t h s u b - s a l i c y l a l d e h y d e a n d 1 ，2 - p h e n y l e n e d i a m i n ea st h el a wm a t e r i a l s 2 da n d2 9w e r es y n t h e s i z e dw i t hs e v e r a lm e t h o d s t of i n dt h eo p t i u ma p p r o a c h f l u o r e s c e n tp r o p e r t i e so f2 a - 2 9w e r em e a s u r e d ，t h ei n f l u e n c eo f s u b s t i t u t i n gg r o u p so nf l u o r e s c e n tp r o p e r t i e s ，t h ec r e a t i o no ft h r e et a u t o m e r sa n dt h et w o t y p e so ff l u o r e s c e n c ec r e a t e db yt h e m w e r ea n a l y s e d t h ei n f l u e n c eo fs u l f o - g r o u po n s o l u b i l i t ya n dt h es p e c t r u mc h a r a c t e r i s t i c so f2 9 i na c i da n da l k a l is o l u t i o n sw e r ea l s od i s c u s s e d 2 h p b ia n dh p n i d e r i v a t i v e s ( 3 a - 3 h ) w e r es y n t h e s i z e dt h r o u g h s c h i f f b a s e s m a n g a n e s e ( 1 1 1 ) c o m p l e x e sd e c o m p o s i t i o np r o c e s sa tr o o mt e m p e r a t u r ew i t hh i g hy i e l d 1 n h eu va n df l u o r e s c e n ts p e c t r u m so fh p b i c u 2 + ，h p n i c u 2 + a n dt h e s ec o m p l e x e sr e a c t e dw i t hn o w e r em e a s u r e d s i xo ft h e s ec o m p l e x e sc a nb en of l u o r e s c e n tp r o b e sb e c a u s et h e yc a nr e a c tw i t hn o i m m e d i a t e l ya n dd i r e c t l y ，a n dt h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t yc h a n g eo b v i o u s l y 3 b i h p m aa n db i h p mw e r es y n t h e s i z e da n dt h e i rf l u o r e s c e n ts p e c t r u m sr e a c t e dw i t h b m e r c a p t o e t h a n o lw e r em e a s u r e d t h e ya l s ob eu s e df o r hi nh e p g 2a n dl - c y s ，a n dt h e c e l l u l a re x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tb i h p m aa n db i h p mc a nb eu s e da sf l u o r e s c e n t p r o b e sf o r s hi nc e l l s k e yw o r d s ：b e n z i m i d a z o l e ，f l u o r e s c e n tp r o b e s ，n i t r i co x i d e ，s u l f h y d r y l ，s y n t h e s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 叁盗墨墨盘堂 或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：f 亿弓听 签字日期：洲莎年月口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 墨盗墨墨盘堂有关保留、使用学位论文 的规定。特授权墨洼墨兰盘望可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 由于部分资料需要保密，解密后适用本授权说明 学位论文作者签名：i 杉狮 签字日期：瑚年月1 0 日 导师签名： 欢瑚杰 签字日期：z 彬年月口日 第一章文献综述 1 1 荧光概述 1 1 1 荧光的产生 第一章文献综述 荧光是处在激发态的分子和原子返回基态过程中伴随着放射出来的一种光能。一般 说来，有色化合物分子通常处于能量最低的状态，称为基态。吸收紫外或可见光的能量 后，电子跃迁至高能量轨道激发态。处于激发态的分子通过振动驰豫、内部转换等过 程跃迁到分子的最低激发态的最低振动能级，再发生辐射跃迁回到基态，放出光子，产 生荧光【1 。2 1 。 有机染料分子的第一激发态与基态的能差是一定的，因而荧光波长不随激发光波长 的改变而发生变化。分子激发过程中吸收的能量一般高于荧光辐射释放的能量，二者之 差以热的形式损耗，因此荧光波长比激发光波长要长，其差通常为5 0h i l l 7 0n l l l ，当有 机化合物分子内可以形成氢键时，则增至1 5 0h i l l 一2 5 0n m ，这一规律称为s t o k e s 位移。 荧光的强度受许多因素的制约，如激发光源能量、吸收强度、量子效率等。 1 1 2 影响荧光性质的环境因素 荧光分析信号的产生涉及对光子的吸收和再发射两个过程，这两个过程都是瞬间 的，而在两个过程之间存在一相当短的时间间隔，一般为1 0 8s ，在这一时间内处于激 发态的分子发射荧光而回到基态的去活过程与各种无辐射( 非发光) 过程是相互竞争的。 因此荧光的强度取决于分子结构及其所处的环境因素1 3 j 。 1 温度 荧光试剂的荧光量子产率和荧光强度通常随溶液温度的降低而增加；反之，则减弱。 一般在2 0 时，温度引起的荧光淬灭作用就有表现，随着温度的升高，淬灭作用加剧。 在2 0 以下荧光量子产率随温度变化稍不明显，因此进行荧光染色过程中，为取得良 好的荧光效果，应注意温度的控制。 2 溶剂效应 溶剂的性质对荧光物质的荧光强度有明显的影响，通常荧光强度随着溶剂极性的增 大而增强。如8 羟基喹啉在氯仿、丙酮、乙腈中的荧光强度随着溶剂极性的增强而依次 增加。 3 p h 值对荧光的影响 如果荧光物质带有酸性或碱性取代基时，溶液p h 值的改变对其荧光强度将有很大 影响，荧光物质的酸式或碱式的光谱也会有明显差别。值得注意的是，一些荧光物质在 第一章文献综述 酸性或碱性溶液中发生水解，发生环的破裂或键的断开，使荧光强度改变。因此，必须 区分是p h 值对荧光强度的影响还是不可逆的化学变化引起的荧光强度的变化。 4 荧光探针浓度的影响 浓度对荧光强度的影响很明显。在稀溶液中的荧光强度与荧光探针的浓度呈线性关 系；浓度增加到一定程度时，荧光强度保持恒定，即使再增加浓度，荧光强度也不发生 变化，若浓度再增加，超过一定限度，荧光强度将随着浓度的增加而减弱。荧光探针液 的浓度一般为1 矿一1 0 5m o l l 。 5 荧光淬灭 各种原因使荧光探针的荧光强度降低，以致荧光探针的荧光强度与浓度不呈线性关 系，这种现象称为荧光淬灭? 荧光淬灭导致荧光物质的荧光效率降低或激发态寿命缩短， 导致荧光强度的降低。荧光淬灭主要有碰撞淬灭、能量转移、氧的熄灭作用、荧光物质 的自淬灭等。 1 2 有机荧光探针 1 2 1 概述 在生物染色剂中有一类可被紫外线或蓝紫光( 短波长光) 激发而发射荧光的染料，称 为荧光染料( 荧光色素) ，现在应用的一些染料也可被长波长光线激发，这些荧光色素常 统称为荧光探针。 作为探针的试剂必须具备： ( 1 ) 探针与被研究分子的某一微区必须有异性结合，且结合比较牢固； ( 2 ) 结合的探针必须对环境条件灵敏； ( 3 ) 结合的探针不影响被研究的大分子的结构和特性。 有机荧光探针对环境变化非常敏感，已广泛应用于生物物质的物化性质和结构的测 定，特别是近十年来，有机荧光探针染料同时也被用于电子学、聚合物化学、医药、法 医和其他各种领域。 1 2 2 分子结构与荧光特性 荧光的发射与强度主要与染料的分子结构有关。事实证明，荧光物质分子一般都含 有发射荧光的基团( 称为荧光团) 以及能使吸收波长改变并伴随荧光增强的助色副l 。 1 共轭体系对荧光的影响 通常增加分子p 电子共轭体系长度可提高荧光效率并使荧光红移。空间位阻效应的 存在能破坏分子的共平面性及共轭程度，从而使荧光减弱。立体异构对荧光强度也有影 响，如反式二苯乙烯是强荧光型的，顺式二苯乙烯由于位阻效应的存在则无荧光特性。 2 取代基对荧光的影响1 6 j 大部分有机荧光物质分子中带有芳环，芳环上引入取代基的种类和所处位置对荧光 化合物的荧光性能均有影响。 第一章文献综述 通常给电子基团可使荧光增强，如n r l r 2 ，o r ( r l ，r 2 = h ，c h 3 ，c 2 h 5 ) 等。吸电 子基团使荧光减弱，如 c - - o ，n 0 2 ，c o o h ，c h o ，c o r ( r - - c h 3 ，c 2 h 5 等) ，n = n ， 卤素( c i ，b r ，d 等。还有一些影响不明显的取代基，如：r ，s 0 3 h 等。分子两端分别 引入给电子和吸电子基团可使染料发生红移并伴随荧光的增强。氨基的引入可使荧光增 强。有些取代基能改变染料的性质，例如环状多烯化合物是致癌的，但其吸电取代基衍 生物却具有实际应用价值。 3 分子环构化对荧光的影响 染料分子的闭环对荧光的产生非常有利，可以增加分子共平面性和刚性而使荧光增 强。许多本身无荧光或荧光很弱的化合物与金属螯合产生的具有环状结构的螯合物显示 较强的荧光。分子内含有羟基并可形成分子内氢键多数情况下能使荧光强度提高。 1 2 3 有机荧光探针分类 目前最常用的有机类荧光探针有以下几种： 1 香豆素类 大多数香豆素荧光染料为黄色，带有绿色荧光。但香豆素的母体结构是无色的，且 在常温下没有荧光。取代后的香豆素衍生物，特别是给电子基团的取代，将增加其荧光 量子产率。如4 甲基7 羟基香豆素、7 二甲氨基香豆素，在它们的分子结构中不但含有 六元环，而且含有羰基，在一定条件下也可与被标记物发生反应，用于细胞内p h 的测 定、牛血清蛋白检测。 2 萘酰亚胺荧光染料【7 州 萘酰亚胺类有机荧光染料是一类非常重要的功能染料，近年来在国际和国内研究非 常活跃。本类荧光染料的分子结构具有共平面性、较大的共轭体系，分子结构中一端具 有强的给电子基团，另一端具有强的吸电子基团，这种“吸一供电子共轭体系 中电子 很容易受到光的照射跃迁产生荧光。 3 菁类 菁染料近年来应用在红外激光染料、非线性光学材料和生物大分子荧光标记等方 面，主要是以吲哚环和苯丙噻唑、苯丙嗯唑活苯丙吲哚等含氮杂环为骨架【1 0 l 。 4 酞菁类 在酞菁的基本结构中，周边取代的官能团可以是烷基、苯并基团、杂环等，中心可 容纳n i 、z n 、p t 、s i 、g e 等原子1 1 1 】，但酞菁染料的缺点是溶解度小、体积大，会影响 生物分子其他性能【1 2 j 。 5 罗丹明、荧光素及其它荧光染料 罗丹明类染料的荧光量子产率较低，而其最大吸收波长一般在6 0 0n m 左右，受样 品背景干扰相对较少，是常用的荧光探针。荧光素类染料具有较好的荧光量子产率以及 良好的水溶性，最大激发波长在5 0 0n m 左右，但s t o k e s 位移小，容易光致变色，光淬 灭率高，对p h 敏感性强m 。 吖啶类染料可与r n a 及d n a 结合，其阳离子形式还可以与蛋白质、多糖和粘多糖 等大分子静电结合，对活细胞具有渗透性，在高浓度下与蛋白质结合后荧光量子产率降 第一章文献综述 低，是较常用的碱基对嵌入荧光分析染料。 嗯嗪类染料由于n 原子的吸电子作用，能使波长红移8 0n n l ，但同时造成了量子产 率和摩尔消光系数的下降。该类荧光染料已被用作生物探针【堋。 在众多有机荧光探针中，2 ( 2 羟基苯基) 苯并咪唑( h p b l ) 及其衍生物是一类重要的荧 光化合物，它们可以通过激发态分子内质子转移过程( e s i p t ) 发射具有大的s t o k e s 位移 的特征荧光，以其特有的性能在越来越多的领域内有着广泛的应用前景。 1 3 苯并咪唑类荧光化合物 1 3 1 概述 咪唑类衍生物是一类重要的生物配体，它在碱性磷酸酯酶，碳酸酐水解酶和超氧化 物歧化酶，参与金属离子的配位，对于它们的生物功能起着至关重要的作用1 1 5 , 1 6 j ，在医 药、卫生和保健等领域有着广泛应用【1 7 硎。其中苯并咪唑类衍生物是一种含有两个氮原 子的杂环化合物，可作为药物中间体，制备人、畜的驱虫药物和柑橘属果类的杀真菌剂， 以及果品保鲜剂，具有杀菌、抗癌等活性。由于其结构的优越性和生理活性、反应活性 以及其它优良特性，故它的应用十分广泛1 1 9 j 。因此，几十年来苯并咪唑及其衍生物的合 成及应用研究从未间断，至今仍十分活跃闭j 。 羟基苯基苯并咪唑类化合物是一类具有大的s t o k e s 位移值和较大的荧光量子收率 的荧光化合物，具有特征的荧光特性，可作为探针用于细胞生物学和生物医学的特种试 剂和诊断药物。 1 3 2 国内外对苯并咪唑类化合物研究动态 国外关于苯并咪唑类化合物及其衍生物的研究很多，如德国b o e h r i n g e ri n g e l h e i m 公司研制的降压药，瑞典a s t r a 公司研制的新型胃质子泵抑制剂奥咪拉畔等药物均为苯 并咪唑类化合物及其衍生物。日本茨城大学的藤井合成了系列羟基苯基苯并咪i 唑( h p b i ) 衍生物作为锌离子荧光探针【2 l j 。国内苯并咪唑类化合物及其衍生物研究也很多，主要用 于医药、农药等方面。 1 3 3 苯并咪唑类化合物的生物活性 苯并咪唑类化合物的生物活性是多种多样的，既有与d n a 的相互作用，也有对多 种受体和酶的抑制作用，如作为d n a 拓扑异构酶的抑制剂、h i v 逆转录酶的抑制剂等。 这一特点使得它成为多种新药设计合成的目标。它们还是类重要的生物配体，它在碱 性磷酸酯酶，碳酸酐水解酶和超氧化物歧化酶，参与金属离子的配位，对于它们的生物 功能起着至关重要的作用【2 2 , 2 3 1 ，在医药、卫生和保健等领域有着广泛的应用。其中苯并 咪哗类衍生物具有杀菌、抗癌等活性。由于其结构的优越性和生理活性、反应活性以及 其它优良特性，故它们的应用十分广泛。 第一章文献综述 1 3 4 苯并咪唑类化合物的应用 苯并咪唑衍生物及其金属配合物一直都是研究热点，之所以引起人们极大的研究兴 趣，主要是由于这类化合物具有良好的生物活性。 早在2 0 世纪6 0 年代，苯并咪唑及其甲基、苯基衍生物就用于生物制药，显示出很好 的商业价值。随着人们对其性质的深入了解，发现苯并咪唑衍生物在有机溶剂及水溶 液中能发射出较强的荧光，因此人们利用其荧光量子产率较高的特性，将其应用于鉴别 和分析有机化合物、药物，以及用于生物大分子的荧光标记【2 4 1 。 苯并咪唑是一个有趣的杂环化合物，许多药物是苯并咪唑衍生物或其配合物。其中 最重要的两类是抗寄生虫药和质子泵抑制剂。1 9 6 1 年人们发现了苯并咪唑具有抗肠道线 虫作用，由此导致苯并咪唑类驱虫药的发展。2 0 世纪8 0 年代末出现的质子泵抑制剂主要 都是苯并咪唑类衍生物，具有抑制胃酸分泌作用，对溃疡的治愈率很高。苯并咪唑衍生 物作为配体与过渡金属离子形成的配合物，可用于生物分子的模拟，例如维生素b ，2 就 是苯并咪唑核苷酸与可啉环系的内络盐。近几年来，苯并咪唑衍生物作为配体应用于放 射性药物及抗炎药物的研究异常活跃。苯并咪唑衍生物还可用作铜铝等金属防腐剂、光 敏剂、无银照相、表面活性剂、荧光增白剂及光敏染料等。苯并咪唑可用作抗辐射剂， 效果达9 0 。聚苯并眯唑由于高热稳定性、化学稳定性、低温稳定性及粘结性好，又具 不燃性及抗吸潮性，已广泛用于太空服装等空间用材料。 1 4 一氧化氮荧光探针的研究进展 1 4 1 一氧化氮简介 一氧化氮( n o ) 是一种分子小、结构简单的气体，难溶于水，由于其分子中有一未配 对电子，具自由基结构，容易与氧、超氧化物自由基、过渡金属离子起反应。在宇宙空 间中，n o 作为一种星际污染物存在【辱2 7 1 ，并且存在于金星和火星的大气层d 尸 2 8 , 2 9 。在 地球上，n o 被认为是一种大气污染源，并且是一种潜在的健康有害物。 对于n o 的研究很早就有人开始了。1 9 7 7 年，休斯顿的一位硕士及药理学家f e t i d m u r a d 在分析硝酸甘油及相关的血管舒张化合物的作用过程中，发现它们都释放可舒张 平滑肌细胞的n o 。他们推断内源性因子( 如激素) 可能也是通过n 0 而起作用的，但是当 时没有实验数据支持他的观点。一直到1 9 8 0 年，纽约药理学家f u r c h g o t t 在进行药物对血 管作用的研究中发现，内皮细胞可产生一种信息分子，这种分子可引起血管平滑肌细胞 的舒张，从而使血管舒张 3 0 , 3 ，他称这种信号分子为内皮衍生的舒张分子。这一发现引 起了人们对该因子进行鉴定的兴趣。至1 j 1 9 8 6 年，洛杉矶药理学家i g n a r r o 与f u r c h g o t t 同时 并且相对独立的推断出：n o f l o 为e d r f 3 2 】，它们的观点引发了世界上许多实验室进行相 关研究的热潮。这是人类首次发现一种气体在机体中具有信号分子的作用。1 9 8 7 年 p a l m e r 等和i g n a r r o 等又证实了这一理论1 3 3 l 。目前的公认是n o 在心血管，神经系统和免 疫系统中是一种广泛存在的信使分子1 3 4 - 3 7 。 第一章文献综述 1 4 2 一氧化氮的作用 1 n o 的生理功能 近年来的研究表明，n o 作为一种新型的细胞内信使分子，广泛参与机体心血管、 神经和免疫系统的生理和病理调节。它能舒张血管、降低血压、抑制血管平滑肌细胞的 增值和血小板粘附，并作为一种神经递质，在神经元的信息传递中起重要作用。n o 的 主要生理功能有调节血压【3 引、作为神经递质1 3 9 1 、抗血小板活性【加】以及其他生理功能【删 如免疫调节功能、抗溃疡作用和调节性功能。 2 n o 在炎症中的作用 n o 在炎症中的作用是双面性的，它既能促进炎症反应- ，也有抗炎作用。 n o 具有细胞毒作用，大量的动物实验研究显示，n o 的过量产生在炎症反应和组织 损伤中发挥了重要作用。在败血症【4 1 1 ，呼吸衰竭【4 2 l ，慢性病贫血【4 3 1 ，关节炎【4 4 j 等中已 观察到n 0 过量产生。 同时，n o 是一种内皮来源的防御分子，在生理和病理状态下保持血管内皮的协调 性发挥了重要作用。在炎症反应中宿主产生的大量n o 可能为防御细菌、病毒、寄生虫 入侵的一道防线1 4 5 1 。n o 是血小板功能强大的抑制剂。另外，n o 通过调整血小板血管 壁间相互作用维持血管内皮完整性，抑制血小板聚集，并使已聚集的血小板重新解聚【蚓， 故在抗血栓形成及抑制炎症的早期过程有重要作用。研究证实【4 7 1 ，n o 既抑制淋巴细胞 的增殖，又促进包括类风湿性关节炎在内的许多免疫反应及免疫病理过程。 3 n o 在癌症中的作用 肿瘤转变是癌症中最关键的起始步骤。一系列研究均显示n o 可以起始或者促进肿 瘤生成【4 8 , 4 9 j 。但相应的，另外一些研究显示了n o 对肿瘤生成具有抑制效果。从肿瘤细 胞产生的n o 既可以促进也可以抑制肿瘤的进一步发展，取决于所处的环境。然而，一 些研究提供了相矛盾的发现。这些矛盾之处可能在于肿瘤类型的差异，组织的差异以及 肿瘤模型的差异。血管生成对肿瘤的生长和转移是至关重要的1 5 0 j 。n o 通过直接或者间 接的机理调控血管生成。在血管成熟中，n o 的作用主要是依靠招募旁血管细胞1 5 1 1 。 因此，调节n o 信号途径可以用来治疗肿瘤。文献报导了提高或者降低n 0 水平均可 以作为潜在的合适策略。 1 4 3 一氧化氮的检测方法 生物产生的n o 可以通过两种方式检测：直接测定和间接测定，而间接测定法则是 测定n o 比较稳定的产物，如硝酸盐，亚硝酸盐。具体的测定方法分为如下几种： 1 g r i e s s 分析( g r i e s sa s s a y ) ： g r i e s s 分析是一种在1 8 9 7 年由j o h a n np e t e rg r i e s s 发明的检测亚硝酸盐的方法【5 2 邡】， 由于它的简单性，它目前被用来分析大量生物样品，如血浆( 血清) ，尿液，c s f ，唾液 和细胞培养液等p j 。这种方法的实际灵敏度大约在o 5 3 m 亚硝酸盐。 它的缺点在于非直接测定，误差较大；干扰较多；测定n o 不够敏感。g r i e s s 分析 测定n o 的最小浓度为, u m 级，而在诸如血管生成，神经传导中的n o 的生成浓度为n m 级， 第一章文献综述 难以用这种方法测定；需要把硝酸盐还原成亚硝酸盐，操作上比较复杂。 2 氧化血红蛋白法( o x y h e m o g l o b i n ) n o 可以结合含有血红素( h e i n e ) 的蛋白，包括血红蛋白，并且改变它的吸收光谱。 n o 和氧化血红蛋i 白( o x y h b ) 的结合能够通过光谱变化进行即时( r e a l t i m e ) 的光学测定。生 物系统中n o 的早期探索应用的主要是这种方法，但是后期的发现该方法有很多缺陷： 专一性比较差；可能错过实际的n o 产生量【5 5 5 6 ；需要纯化商业可获得的o x y h b 试剂。 3 电子自旋共振法( e l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e ，e s r ) 虽然n o 本身是一个e s r 活性分子，并且在化学系统中用e s r 是可以测定的，但生物 系统中的n o 信号用直接的e s r 方法几乎不可测定，主要原因是n o 的半衰期太短，浓度 太低。为了克服这些困难，e s r 自旋捕获技术被应用于生物系统体外或体内n o 的测定。 几种自旋捕获化合物能够选择性和n o 反应，被应用于生物n o e l 定，例如铁和硫代氨基 甲酸酯衍生物形成的复合物( f c d t c 复合物) ，n o 螯键捕获化合物( n o 等1 5 7 捌。 e s r 被广泛应用于体内n o 检测，因为它能够在常温下进行检测。然而，e s r 方法有 着两个明显的缺点：高昂的设备费用；敏感性较低。 4 电化学感应器( e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s ) 电化学方法对于测定生物样品中的n o 是最实际的方法之一，因为它的优点很明显： 电极体积小，可用于体内测定，没有破坏性，很少需要或者不需要试剂的参与，测定敏 感，简单，花费低廉。即使电化学知识有限的研究者也可以操作电分析方法进行测定。 目前的电化学n o 感应器能够检测从1n m 到2 5 m 范围内的n o ，但电化学感应器的 缺点也是明显的：线性和重复性不理想，一般测定的误差范围在5 1 0 是很普遍的；电 化学测定受温度波动的影响很大；空间上的局限性：电极对n o 的空间分布的信息受电 极放置的位置影响极大，难以给出生物体系中总体n o 分布的时间空间信息。 5 化学发光法( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 化学发光检测被应用于测定呼吸呼出气体中的n o 5 9 , 6 0 l 。气相化学发光法检测对n o 的敏感性和选择性都很好，但是有如下缺点：仪器笨重；测定费时，价格昂贵；需要许 多试剂进行辅助操作。 用液相测定法测定溶解的n o ，是基于n o 在过氧化氢的存在下，可以和碱性发光氨 ( 1 u m i n 0 1 ) 发生反应，这种方法由k i k u c h i 等人开发【6 1 - 6 3 1 。这种测定方法的主要贡献在于 它曾被用来进行细胞内生成n o 的可视化“i s u a l i z a t i o n ) l 叫。 6 荧光检测法( f l u o r e s c e n c em e t h o d s ) 荧光检测方法作为一种非介入性检测方法，在n o 生物成像中是非常有用的。为了 开发有用的n o 荧光探针，以下标准必须满足1 6 5 j ： ( 1 ) 荧光探针应该能够和n o 或者其衍生物在室温，大气压下，生理p h ，水溶液条件下 发生反应产生对应的荧光产物，并且不产生副产物； ( 2 ) 反应应该对n o 或其衍生物是专一性的； ( 3 ) 这些探针和它们的产物应该是稳定的，尤其是对光稳定，因为进行生物成像需要进 行激光显微镜测定； ( 4 ) 这些探针的荧光特性应该在有或无n o 时差别很大； 第一章文献综述 ( 5 ) 激发光最好是可见光，以避免自体荧光的产生以及对生物系统造成光损伤； ( 6 ) 这些探针应该能够透过生物膜，从而能够进入活细胞中，进行生物成像。 使用n o 反应的荧光探针，结合激光共聚焦显微镜，能够提供一种合适的细胞内即 时分析n o 变化的方法，这种方法是非介入性的，给生物系统几乎不造成损伤。此外， 它们能够用于测定体内的n o 变化和分布，虽然需要进行一些简单的手术操作把含有染 料的组织区域暴露在光线下进行观测。 1 4 4 用于一氧化氮检测的荧光探针 1 二氨基萘( d i a m i n o n a p h t h a l e n e ，d a n ) d a n f l 了m i s c o 等开发吲，相比g r i e s s 分析而言，它有着提高了的n o 二敏感性，是一 种快速定量n o 玉的荧光测定方法。它的反应机理在于d a n 和n 0 2 在酸性条件下可以生成 荧光产物1 ( h ) 萘基三唑( n a t ) 。 这种方法的检测下限是1 0n m ，比g r i e s s 分析敏感5 0 - 1 0 0 倍。该方法有着更好的专一 性和适用性，有利于大规模样品的测定。这种荧光方法测定生物系统中的n o 厶是非常有 效的，但这种n o 荧光探针化合物的缺陷也是明显的：反应要在酸性条件下进行，会造 成细胞和组织的损伤；激发光在紫外区，会造成一定的活细胞损伤；非直接反应，不能 反映生物系统中n o 的实时生成量。 2 二氨基荧光素( d i a m i n o f l u o r e s c e i n s ，d a f s ) 荧光素被广泛应用于生物学中的荧光团，由于它具有很便于检测激发和发射波长， 高的消光系数，以及在水中有很高的量子产率。因此，n a g a n o 等设计了一系列二氨基荧 光素化合物 6 7 - 6 9 1 ，作为一系列新的n o 探针。其中，d a f - 2 是目前应用的最广泛最成功的 n o 荧光探针之一。图1 1 是d a f 2 和n o 在氧气存在条件下的反应机理。 n n h o私盘daf-2t 图1 1d a f - 2 和n o 在氧气存在条件下的反应机理 f i g 1 - 1 r e a c t i o nm e c h a n i s mo fd a f - 2w i t hn oi nt h ep r e s e n c eo f0 2 d a f - 2 的n o 检测下限是5n m 。荧光素的苯环上的羟基在质子化后，荧光几乎完全 消失，而d a f 系列化合物也有类似的性质，d a f 2 t 的荧光在p h 小于7 时衰减程度极大， 这也就意味着d a f - 2 只有在p h 大于7 的介质中才能发挥作用。为了改善这种问题，在荧 光素上取代吸电子基团如氯可以降低p k a 值，期望能够让化合物的荧光在生理条件下更 加稳定，化合物称作d a f 4 和d a f - 5 。d a f 4 和d a f - 5 的激发和发射波长相对于d a f 2 而言，转移到了长波区。虽然氯原子的吸电子效应确实降低了d a f t 的p k a 值，但在p h 为7 9 的时候，它们的荧光强度表现降低，可能是由于三唑基团的脱质子化造成。苯环 第一章文献综述 羟基的脱质子化之所以能够降低荧光强度，是因为电子移位造成困难从而导致了吸收波 长的蓝移，而三唑环的脱质子化造成荧光降低是因为共轭双键的小电子给予作用。因此， 氯取代降低了苯环羟基的p k a 值，诱导了在生理p h 附近的荧光不稳定。 为了克服这种三唑质子造成的荧光不稳定，甲基被引入了这系列化合物，如d a f 4 m 1 ，4m 2 ，5m 1 和5m 2 ，这些化合物，尤其是d a f - 4 m 2 对n o 是极其敏感的，并且它在 p h 在5 8 以上都是稳定的。同时，氟代的荧光素衍生物对于光漂白的抵抗性非常好，激 发波长在4 8 8i l m ，并且仍然是p h5 8 以上荧光稳定，称为d a f f m ，它的敏感性是d a f - 2 的1 4 倍。这些化合物的结构可参见图1 2 。 厂 1 厂 - 淞一蟠心 _ ocm9 r k d罾旷丈眦喂 第一章文献综述 2 嗯吨类 主要有荧光素、罗丹明及曙红马来酰亚胺。它们都具有较长的荧光发射波长和与s h 反应后高的量子产率( f ) 。但这类化合物具有较小的斯托克斯位移，且其量子产率对生 理p h 敏感。尽管如此，由于长的发射波长及大的消光系数的优点和缺少合适的替代试剂， 它们仍然被广泛用于研究蛋白质的结构特性及内部的相互作用、标记抗体等1 8 2 删。 3 苯并杂环类 这一类中的b i p m ( n 【p ( 2 苯并咪唑基) 苯基】马来酰亚胺) 是第一个已实际应用的 马来酰亚胺类巯基荧光探针，它对g s h 的检测限为1 0 m o l l 8 4 1 ，但它的缺点是发射 波长较短( 3 5 0n m - 4 0 0n m ) ，s t o k e s 位移小，水溶性不好。 4 其它 其它的苯并五元杂环化合物如苯并嗯唑、苯并吡咯酮、苯并呋喃等的马来酰亚胺衍 生物也具有好的荧光特性，改变其杂环母体或环上的取代基还可改变试剂的检测灵敏 度。这类探针的最大缺点是发射波长较短。l i t a k 等【髂l 报道的含有水溶性阳离子吡啶锚盐 的苯并嗯唑类马来酰亚胺类荧光探针具有长的发射波长，其大的斯托克斯位移、好的水 溶性、光稳定性及p h 稳定性诸方面都优于荧光素。 除了上述几种化合物外，还有一些如以芘、荧葸、吖啶、萘胺衍生物、水杨酸等为 荧光团的马来酰亚胺类荧光探针，它们有的具有一些特殊的性质。如n a m ( 9 吖啶马来 酰亚胺) 的荧光强度随溶剂极性的增大而增强，a n m ( n f 4 苯氨基1 萘基】马来酰亚胺) 与s h 的加成物仅在疏水环境中才出现荧光增强，它们都是有用的环境检测探针【8 6 , 8 7 1 。 第二章羟基苯基苯并咪唑类化合物的合成和光谱性质测定 第二章羟基苯基苯并咪唑类化合物的合成和光谱性质测定 近年来，荧光探针技术已成为生命科学和生物医学研究领域的重要手段和微观可视 化技术，新型荧光探针作为生理学和病理学研究的新型试剂广泛应用于多种重大疾病的 临床诊断和影象学研究【8 8 , 8 9 l ，开发新型高灵敏度的荧光探针已成为药物合成领域的研究 热点之一。2 ( 2 羟基苯基) 苯并咪唑( h p b i ) 及其衍生物是一类重要的荧光化合物，它们可 以通过激发态分子内质子转移过程( e s i v r ) 发射具有大的s t o k e s 位移的特征荧光，因此， 这类化合物对开发新型荧光探针、高能辐射探测器、塑料发光体以及聚合物紫外稳定剂 有着重要意义。在生物领域，它们还被用来制作分子开关凹l 。因此，研究此类化合物的 合成及其荧光特性具有重要的理论意义和应用价值。 而大部分有机荧光物质分子中带有芳环，芳环上引入