（生物化学与分子生物学专业论文）生麦芽糖α淀粉酶基因的克隆与鉴定.pdf

摘要 摘要 生麦芽糖i x 淀粉酶指a 淀粉酶家族中水解利用淀粉及相关多聚糖主要产物为麦芽 糖的一类酶，包括麦芽糖淀粉酶、新普鲁兰酶和环状麦芽糊精淀粉酶。生麦芽糖a 淀粉 酶具有多底物特性和底物优先选择性，可水解值1 ，4 、仅1 ，6 葡萄糖苷键，作用于淀粉及 环状糊精、普鲁兰多糖等相关多聚糖、寡糖，主要产物为q 麦芽糖，属于淀粉分解酶类 亚族g h l 3 。生麦芽糖a 淀粉酶主要应用于淀粉及食品工业。 本研究中，根据地衣芽孢杆菌基因组序列中的麦芽糖淀粉酶基因序列和糖苷水解酶 家族g h l 3 中生麦芽糖洳淀粉酶基因的两端保守序列设计合成两对引物，分别以b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s a t c c l 4 5 8 0 和b a c i l l u s c e r e u s c i c i m b 0 6 2 7 染色体d n a 为模板，p c r 扩增 得到两段不同来源的生麦芽糖淀粉酶基因a m y m b 1 和a m y m b e 。经核苷酸序列测定， a m y m b i 序列大小为1 7 6 4b p ，编码5 8 7 个氨基酸，预计蛋白分子量为6 7 4k d a ，等电 点为4 9 3 ；a m y m b c 序列大小为1 6 8 5 b p ，编码5 6 1 个氨基酸，预计蛋白分子量为6 5 4 k d a ， 等电点为5 1 8 。经氨基酸序列比对和蛋白质序列比对，两者都具有0 【淀粉酶家族特有的 高度保守的催化活性区域，其中a m y m b 1 与最l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 麦芽糖淀粉酶 相一致；a m y m b e 与丑c e r e u sa t c c l 4 5 7 9 来源的新普鲁兰酶基因具有9 9 2 9 的同源性。 将a m y m b 1 和a m y m b e 分别克隆入表达载体p e t 2 8 “+ ) 中，经i p t g 诱导，在 e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中成功实现了初步异源表达，s d s p a g e 电泳结果分别显示 出分子量约为6 7 k d a 和6 5 k d a 的特异性蛋白质条带。发酵制备粗酶液，测定生麦芽糖q 淀粉酶活性。结果表明，a m y m b 1 获得了活性表达，酶活力为3 7 9 7 u m l ；而a m y m b e 可能不适用于大肠杆菌，最终没有获得活性表达。 对重组生麦芽糖a 淀粉酶a m y m b i 的酶学性质和水解特性进行了系统分析。重组 酶a m y m b 1 的最适反应温度为4 5 ，最适反应p h 为6 5 ，重组酶具有良好的稳定性， 能在4 5 以下的中低温环境和比较宽泛的p h 范围内( p h4 5 8 5 ) 保持稳定，且酶活 受金属离子影响不显著。重组酶能够水解环状糊精、可溶性淀粉和普鲁兰，最适底物为 环状糊精。 关键词：生麦芽糖a 淀粉酶，基因克隆，异源表达，鉴定，酶学性质 a b s t r a c t a b s t r a c t m a l t o s e - f o r m i n ga - a m y l a s e i st h ea m y l a s ew h i c hh y d r o l y z e ss t a r c ha n dr e l a t e d p o l y s a c c h a r i d et op r o d u c em a l t o s ea st h em a i np r o d u c t s m a l t o s e f o r m i n g0 【一a m y l a s eb e l o n g s t og l y c o s i d eh y d r o l a s e sf a m i l y13 ( g h13 ) ，m a i n l yu s e di ns t a r c ha n df o o di n d u s t r y i th a s d i f f e r e n tn a m e s ，i n c l u d i n gm a l t o g e n i ca m y l a s e ，n e o p u l l u l a n a s ea sw e l la sc y c l o m a l t o d e x t r i n a s e b u ts h a r e sas i m i l a rs t r u c t u r e m a l t o s e - f o r m i n ga - a m y l a s ee x h i b i t sd i s t i n c ts u b s t r a t es p e c i f i c i t y a n ds u b s t r a t ep r e f e r e n t i a ls e l e c t i v i t y i tc a t a l y z e st h eh y d r o l y s i so f a - 1 ，4 - a n da - 1 ，6 一g l u e o s i d i c l i n k a g e sa p p e a r e di nm a n yo l i g o s a c c h a r i d e sa n dp o l y s a c c h a r i d e s ，s u c ha ss t a r c h ，c y c l o d e x t r i n e a n dp u l l u l a n t h em a i np r o d u c ti sa - m a l t o s e i nt h i ss t u d y , t w os e t so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h em a i t o g e n i ca m y l a s eg e n e o fb a c i l l u sl i c h e n r m i sa n dm a l t o s e f o r m i n ga - a m y l a s eg e n ec o n s e r v a t i v es e q u e n c e t w o d i f f e r e n ts o u r c e sm a l t o s e f o r m i n ga - a m y l a s es e q u e n c eh a v eb e e ns u c c e s s f u l l ya m p l i f i e db y u s i n gt h ec h r o m o s o m ed n ao fb 疗c h e n i f o r m i s a t c c14 5 8 0a n db a c i l l u sc e r e u s c i c i m b 0 6 2 7a st e m p l a t e s s e q u e n c i n go fp c rp r o d u c ts h o w e dt h a tt h en u c l e o t i d es e q u e n c e o f a m y m b 1w a s1 7 6 4b p ，t h ed e d u c e dp r o t e i nw a s5 8 7a m i n oa c i d sa n dt h ei s o e l e c t r i cp o i n to f t h ep r o t e i nw a s4 9 3 ；t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo fa m y m - b cw a s1 6 8 5b p ，t h ed e d u c e dp r o t e i n w a s5 6 1a m i n oa c i d sa n dt h ei s o e l e c t r i cp o i n to f t h ep r o t e i nw a s5 1 8 s e q u e n c eb l a s t i n go f t w o p r o t e i n sr e v e a l e dt h a tt h e yb o t hc o n t a i n e dah i 曲l yc o n s e r v a t i v ec a t a l y t i ca r e aw h i c hs p e c i a l l y e x i s t e di n0 【一a m y l a s ef a m i l y a m y m b 1s e q u e n c ew a st h es a m ea sm a l t o g e n i ca m y l a s ei n 丑 l i c h e n r m i sa t c c l 4 5 8 0b u td i f f e r e n tf r o mt h o s eo fo t h e rs t r a i n so f 丑l i c h e n r m i s ； a m y m b es h a r e da9 9 2 9 s i m i l a r i t i e sw i t l ln e o p u l l u l a n a s ef r o ma c e r e u sa t c c1 4 5 7 9 t h ea m y m b 1g e n ea n da m y m b eg e n ew e r es u b c l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 “+ ) a n de x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 、s u c c e s s f u l l ya f t e ri n d u c e d 、析t h0 5m m o l l i p t g t h er e c o m b i n a n ta m y m - b ih a dam o l e c u l a rm a s so f 6 7k d ao ns d s p a g e ，w h i l et h e r e c o m b i n a n ta m y m b ch a dam o l e c u l a rm a s so f6 5k d a t h er e c o m b i n a n ta m y m b 1s h o w e d t h ee n z y m ea c t i v i t yo f3 7 9 7 u m l ，b u tt h er e c o m b i n a n tf o r mo f a m y m - b ci nec o l is h o w e d n od e t e c t a b l ea c t i v i t y t h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e sa n dh y d r o l y t i cc h a r a c t e r so ft h er e c o m b i n a n ta m y m - b 1w e r e a n a l y z e ds y s t e m i c a l l yi nt h es t u d y t h em a x i m u ma c t i v i t yo ft h er e c o m b i n a n te n z y m ew e r ea t 4 5 。c a n dp h6 5 i tw a ss t a b l ei nal o w t e m p e r a t u r ee n v i r o n m e n t ( n om o r et h a n4 50 c ) a sw e l la s a ta 谢d ep hr a n g e ( p h4 5 - 8 5 ) ，a n dt h ee n z y m ew a sn o ts e n s i t i v et om e t a li o n s t h e r e c o m b i n a n te n z y m ec a nc a t a l y z et h eh y d r o l y s i so fc y c l o d e x t r i n s ，s o l u b l es t a r c ha n dp u l l u l a n , t h ec y c l o d e x t r i nw a st h eo p t i m a ls u b s t r a t e k e y w o r d s ：m a l t o s e - f o r m i n ga - a m y l a s e ，g e n ec l o n i n ga n de x p r e s s i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n ， e n z y m a t i cp r o p e r t i e s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 望掬 日期： 燮年篁旦! 仝旦 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 r 签名： 璺煎 导师签名： 日 期： 7 何1 ， 浙3 年s 月所 i 前言 1 前言 1 1 生麦芽糖a 淀粉酶的涵义及性质 生麦芽糖仅淀粉酶是0 t 淀粉酶家族中水解利用淀粉及相关多聚糖主要产物为麦芽 糖的一类酶的总称，主要有麦芽糖淀粉酶( e c3 2 1 1 3 3 ，m a l t o g e n i ca m y l a s e ) 、新普鲁 兰酶( e c3 2 1 1 3 5 ，n e o p u l l u l a n a s e ) 和环状麦芽糊精淀粉酶( c y e l o m a l t o d e x t r i n a s e ，e c 3 2 1 5 4 ) 。这三种酶同属于淀粉分解酶类亚族g h l 3 t 1 一。 1 1 1 淀粉水解酶的分类及a 淀粉醇家族成员 淀粉是一类由多个葡萄糖分子通过a 1 ，4 和a 1 ，6 葡萄糖苷键连接而成的高分子量 碳水化合物，广泛存在于自然界中，是动物、植物、微生物的能量主要来源之一。淀粉 酶就是通过作用于糖苷键来水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物 中。 目前发现的常见淀粉酶类根据其作用方式又可概括为以下几类：内切淀粉酶如洳 淀粉酶、q 麦芽糖淀粉酶等；外切淀粉酶如b 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、a 葡萄糖苷酶等； 脱支淀粉酶如异淀粉酶、普鲁兰酶、新普鲁兰酶等；转移酶如环状糊精葡萄糖转移酶、 寡糖基转移酶等【5 j 。依据酶分子一级结构的相似与不同，淀粉水解酶类可被分为糖苷水 解酶( g h ) 三大家族：以m 淀粉酶为代表的g h l 3 家族；以p 淀粉酶为代表的g h l 4 家族；以葡糖糖化酶为代表的g h l 5 家族。 尽管不同的淀粉酶作用效果相同，它们都能催化水解相同底物中0 【糖苷键的断裂， 但其结构和作用方式是截然不h 的t 6 1 。a 淀粉酶和p 淀粉酶都具有一个t i m 卷桶折叠区 p j ，它们的活性区域都包括个( 肌) 3 卷桶结构，这一结构由8 个仅螺旋环绕8 个相同的 d 折叠组成【舯】。但不同酶的该结构存在一定差别【1 0 1 。葡糖糖化酶则具有另一种结构一 ( o a ) 6 卷桶，这一结构中6 个a 螺旋被另外6 个环绕l l l 】。 随着当今知识信息的不断更新，小淀粉酶家族成员有了很大扩充，包括了将近3 0 种不同种类的酶和蛋白质f l 引。它们与典型的a 。淀粉酶之间都存在一定的序列相关性【6 】。 目前，所有这些酶都被归于g h l 3 、g h 7 0 和g h 7 7 家族，统称为糖苷水解酶g h h 系。 如表1 1 所示，g h h 系包含有水解酶、转移酶、异构酶等种类【1 3 】。 表1 - 1 舡淀粉酶家族( g h h 系) t a b 1 - 1a - a m y l a s ef a m i l y ( c l a ng h - h ) 江南大学硕士学位论文 所有的糖苷水解酶g h h 系成员都具有以下3 个共同结构特征：( 1 ) 催化反应区域呈 ( 1 3 a ) 8 卷桶结构；( 2 ) 活性位点为3 个氨基酸残基，f 1 4 内的a s p 残基作为亲核试剂，p 5 内 的g l u 残基作为质子供体，d 7 内的a s p 作为底物结合位点；( 3 ) 采用保留机制催化水解a 糖苷键。g h h 系中各种酶之间的序列同源性非常低( 1 0 左右) ，这与酶的来源不同有 关u 引。图1 1 为根据保守序列区域绘制的g h h 系的进化树。 g h l 3 家族是g h h 系中最大的分支，包括仅淀粉酶( a a m y l a s e ，e c3 2 1 1 ) 、环状 糊精葡聚糖转移酶( c y c l o d e x t r i n g l u c a n o t r a n s f e r a s e ，c g t a s e ，e c2 4 1 1 9 ) 、麦芽糖淀粉 2 1 前言 酶( m a l t o g e n i ca m y l a s e ，e c3 2 1 1 3 3 ) 、洳葡萄糖苷酶( a - g l u c o s i d a s e ，e c3 2 1 2 ) 、 淀粉蔗糖酶( a m y l o s u c r a s e ，e c2 4 1 4 ) 、淀粉普鲁兰酶( a m y l o p u l l u l a n a s e ，e c3 2 1 4 1 ) 、 环状麦芽糊精淀粉酶( e y e l o m a l t o d e x t r i n a s e ，e c3 2 1 5 4 ) 、新普鲁兰酶( n e o p u l l u l a n a s e ， e c3 2 1 1 3 5 ) 等【1 3 】。 图1 - 11 7 - 淀粉酶家族( g h - h 系) 的进化树 f i g 1 1e v o l u t i o n a r yt r e eo f t h ea - a m y l a s ef a m i l y ( c l a ng h - h ) 1 1 2 生麦芽糖a 淀粉酶的基本特性 麦芽糖淀粉酶、新普鲁兰酶和环状麦芽糊精淀粉酶非常独特，不同于典型的o 【淀粉 酶，可以水解利用麦芽三糖，具有多底物特性，可作用于淀粉、环状糊精和普鲁兰多糖 等；还具有底物优先选择性，优先快速水解利用直链淀粉或环状糊精，少量利用支链淀 粉( 普鲁兰) ：最适作用底物为环状糊精【悼硒】；同属于环状糊精水解酶类。水解直链淀 粉或环状糊精的主要产物为麦芽糖，另有少量葡萄糖生成；水解普鲁兰的产物为潘糖 ( p a n o s e ) 、麦芽糖、葡萄糖，三者的摩尔数比例为3 ：l ：1 【1 7 1 。有一些来源的生麦芽糖 a 淀粉酶还具有转糖基作用，通过形成q 1 ，3 、a 1 ，4 、a 1 ，5 和舡1 ，6 糖苷键来转移水解 形成的糖基到另一个糖分子上【l 引。图1 2 为生麦芽糖洳淀粉酶的水解和转糖基作用模式 图【3 l 。另外，麦芽糖淀粉酶还能水解阿卡波糖( a c a r b o s e ，一种a 淀粉酶的有效抑制剂) ， 但这种酶活性与菌种相关i 。 江南大学硕士学位论文 图1 - 2 生麦芽糖叶淀粉酶的水解和转糖基作用模式 3 1 f i g 1 - 2am o d e lo fc o u p l e dh y d r o l y s i sa n dt r a n s g l y c o s y l a t i o nc a t a l y z e db ym a l t o s e p r o d u c e ra - a m y l a s e 3 】 长期以来，在a 淀粉酶研究领域，关于麦芽糖淀粉酶、新普鲁兰酶、环状麦芽糊精 淀粉酶这三种酶在特性方面如何区别，一直存在相当大一部分的定义混淆，尽管这三种 酶具有不同的编码基因和酶学编号，但三者在性质方面的差别未见任何报道。在已知的 数据中，有超过2 0 种酶的信息显示证明，麦芽糖淀粉酶、环状麦芽糊精酶和新普鲁兰酶 三者非常相似，很难区分，序列之间有4 0 0 o - , 一8 6 的一致性。与典型的q 淀粉酶不同，三 者都具有一个新型的高度保守的含有1 3 0 个氨基酸残基的n 末端区域，该区域与分子结 构中心的( d 旭) 8 卷桶区域相互作用，形成窄而深的催化活性中心，这种结构不同于其它a 淀粉酶的宽而浅的催化活性中心，这种特殊结构也决定了这三种酶的环状糊精优先底物 选择性。为了澄清相关的定义混淆，l e e 等对麦芽糖淀粉酶、新普鲁兰酶、环状麦芽糊 精淀粉酶的分子结构和保守序列等方面进行了研究，结果充分证明了麦芽糖淀粉酶、新 普鲁兰酶、环状麦芽糊精淀粉酶属于同一种酶，三者没有本质区别【1 9 j 。 1 1 3 生麦芽糖伍淀粉酶基因的细菌来源 细菌来源的生麦芽糖。【淀粉酶基因主要有：枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 、地衣 芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 、蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、嗜热脂肪芽孢杆菌 ( g e o b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、栖热菌属( t h e r m u ss p ) 、嗜热放线菌( t h e r m u s v u l g a r i s ) 等 2 0 2 1 1 。 1 2 生麦芽糖a 淀粉酶的应用 生麦芽糖泓淀粉酶由于其独特的酶学性质，生麦芽糖a 淀粉酶主要应用于淀粉及食 品工业，如淀粉糖化工业、面粉工业、食品烘焙工业等方面【2 2 】。 4 1 前言 1 2 1 生麦芽糖m 淀粉酶在淀粉糖化工业方面的应用 麦芽糖浆是一种麦芽糖含量高、葡萄糖含量低、热量低的新型糖制品1 2 3 1 。它具有 甜味适口、温和、营养价值高、清亮透明、耐高温、吸湿性低、保温性好、热稳定性好、 抗结晶等显著特点 2 4 - 2 5 j 。 麦芽糖浆用途广泛，主要包括：( 1 ) 在食品工业中，麦芽糖浆由于具有耐热性好、 甜度低、发酵性能和抗结晶性好、渗透压低等特点，可作为一种很好的工业水分调节剂 和食品填充剂；( 2 ) 在医药工业中，麦芽糖浆是一种补充机体所需碳源的理想能源，可 精制成麦芽糖注射液和特殊病人所需的理想甜味剂麦芽糖醇，还可作为营养剂以及 特殊疫苗、抗菌素的载体进行新产品开发；( 3 ) 在化妆品行业中，麦芽糖浆由于具有良 好的保湿性能，添加到化妆产品中能使肌肤保持水分和药物缓慢释放，实现化妆品的美 肤和治疗效果【2 6 。2 7 1 ；( 4 ) 麦芽糖还可作为酶制剂，广泛应用于工业生产。 自然界中不存在游离的麦芽糖，一般采用p 淀粉酶作用于淀粉分子，由尾端开始， 间隔的水解洳l ，4 糖苷键产生麦芽糖。但在工业应用中，用d 淀粉酶单独糖化时，麦芽 糖的得率不高，往往还会产生许多寡糖，很难满足高麦芽糖浆的生产要求。随着酶工业 的不断发展以及人们对麦芽糖的质量( 色泽、麦芽糖含量、还原糖质) 更高要求，麦芽 糖浆的生产已经成为提高我国糖果质量和产品档次的保证，同时也是进入国际市场，参 与国际竞争的保证。应用酶制剂生产麦芽糖新产品以及改良生产工艺已成为深入研究的 热点f 2 8 】。 生麦芽糖a 淀粉酶由于其具有多底物特性并能利用麦芽三糖，甚至一些酶学性质可 能还比d 一淀粉酶优越，因此在淀粉糖化方面可与p 一淀粉酶相补充。生麦芽糖洳淀粉酶具 有很强的淀粉糖化能力，可单独或与一种支链淀粉脱支酶一起用于生产高麦芽糖浆。 1 2 2 生麦芽糖舭淀粉酶在面粉工业方面的应用 在我国传统饮食中，面粉是一日三餐主食原料之一，同时也是现代食品工业最主要 的原辅料之一。就目前市场来看，以小麦粉为原料制成品在工业食品中占据着数量绝对 优势。但由于小麦种植和品种原因，我国小麦产出面粉品质不高、口感较差；另一方面， 随着人们生活水平日益提高和食品工业的不断发展，对面粉及面制食品品质提出了更高 要求，因此不得不通过添加面粉改良剂来改善面粉品质，以生产出相应专用粉1 2 9 1 。 应用于面粉改良的主要酶制剂有淀粉酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、脂肪酶、脂 肪氧化酶、谷氨酰胺转氨酶、蛋白酶、植酸酶、乳糖酶等。淀粉酶中常用的是q 淀粉酶 和麦芽糖淀粉酶。 烘焙类面制品作为消费品，有其一定的货架期( 保鲜期) ，过期之后容易因老化( 淀 粉回生) 造成品质下降，引起不必要的经济损失。为此，需要不断研究各种添加剂以延 长面包货架寿命，在最大程度上降低经济损失。而麦芽糖淀粉酶则具有这种独特的抗老 化作用，它能水解淀粉生成q 麦芽糖和一小部分糊精，从而保持面包的弹性、松软和新 鲜。 面粉工业中应用的麦芽糖淀粉酶是经基因工程改良枯草芽孢杆菌深层发酵，并经纯 5 江南大学硕士学位论文 化而得到的一种新型酶制剂，它能延缓面包老化过程，延长烘焙食品的货架期，同时又 不会导致面团发黏而影响其加工性能。在烘焙过程中，它作用于面粉中的淀粉部分，使 其产生小分子量糊精，防止淀粉与面筋之间相互作用而引起老化。 麦芽糖淀粉酶的耐热性处于真菌g t 淀粉酶和热稳定的细菌a 淀粉酶之间，只有在淀 粉糊化温度条件下才表现出高度活性，而在低于3 5 时活性很低，因此，麦芽糖淀粉酶 不会改变面团的布拉班德特性，在烘焙过程中仍能起作用，并在烘焙最后阶段被灭活， 所以也不会导致淀粉过度分解。真菌a 淀粉酶或热稳定的细菌q 淀粉酶过量会导致面团 发黏，面包在烘焙过程中就会出现塌陷，且在贮存过程中也会出现面包心发黏现象。应 用麦芽糖淀粉酶则会减少这种现象的发生。另外，麦芽糖淀粉酶对于面包柔软度和弹性 也有一定影响i 删剖j 。 1 3 国内外研究进展 k i m 等【3 4 】将一株丑s u b t i l i ss u h 4 2 的麦芽糖淀粉酶基因在as u b t i l i s1 6 8 中表达并 对其启动子功能进行了研究。研究中发现，丑s u b t i l i ss u h 4 2 中编码麦芽糖淀粉酶的基 因b b m a 与丑s u b t i l i s1 6 8 中一段功能未知的y v d f 基因在序列上几乎完全相同，以此为 基础，用b b m a 基因作为探针进行s o u t h e r n 杂交分析显示，这段基因在不同的丑s u b t i l i s 菌株中普遍存在。将b b m a 基因整合到as u b t i l i s1 6 8 染色体上并研究了其启动子功能， 结果表明，当培养基中含有b 环状糊精、麦芽糖或淀粉时，该启动子可以完全表达，而 当有葡萄糖、果糖、蔗糖或甘油存在时，该启动子表达受到抑制，表明b b m a 基因表达 可能受代谢产物反馈抑制。 p a r k 等【3 5 】研究t g e o b s t e a r o t h e r m o p h i l u s 来源的麦芽糖淀粉酶与阿卡波糖和多种糖 原分子受体之间的转糖基作用方式与机理。研究发现，嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖 淀粉酶可以切开阿卡波糖的第一个糖苷键，形成葡萄糖和一种假三糖 ( p s e u d o t r i s a c c h a r i d e ，p t s ) ，然后转移p t s 单位到葡萄糖的c 一6 位，以q 1 ，6 糖苷键相 连，生成异阿卡波糖( i s o a c a r b o s e ) 。研究还证实，嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀 粉酶还可以通过形成0 【1 ，3 、a 1 ，4 、a 1 ，5 或伐1 ，6 一糖苷键来转移p t s 单位到多种糖原分 子受体上，如d 葡萄糖、d 甘露糖、d 半乳糖、甲基a d 吡哺葡萄糖、d 吡喃果糖、 d 一吡喃木糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽三糖、 麦芽糖醇、木糖醇、d 葡萄糖醇等。p a r k 等在研究中也对转糖基产物进行了结构分析， 分析方法包括薄层层析色谱、高效离子色谱、酶解、甲基化分析和1 3 c 核磁共振波谱。 另外，还将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶与不同糖原受体之间的转糖基作用做 了比较，结果显示，最佳受体分子为龙胆二糖，其次为麦芽糖和纤维二糖，最差为d 葡萄糖醇。 l i u 等【4 l 对来源于深海嗜热芽孢杆菌b a c i l l u ss p w p d 6 1 6 的麦芽糖淀粉酶基因进行克 隆并在ec o l i 中与谷胱苷肽s 转移酶( g s t ) 实现融合表达，并对重组酶的性质进行了 研究。重组麦芽糖淀粉酶最适温度为5 0 。c ，最适p h 为6 0 ，稳定范围为3 0 - 7 0 、 p h 6 o 8 0 。重组酶受化学试剂影响较大，可被表面活性剂( c h a p s ) 、二硫苏糖醇( d t t ) 6 1 前言 和t w e e n 2 0 ( o 1 1 ) 激活，酶活受1m a n o l l 的e d t a 、苯甲基磺酸氟( p m s f ) 、s d s 、 0 1 t r i t o n x 1 0 0 、2 m e 和金属离子b a 2 + 、c a 2 + 、m 9 2 + m n 2 + 、f e 2 + 的部分抑制，受1 0m m o l l p m s f 、s d s 和z n 2 + 、c u + 、v e 3 + 的完全抑制。 j o n e s 等【3 6 】对b a c i l l u ss p t s 2 5 来源的麦芽糖淀粉酶进行了分子定向进化方面的研 究。目前在食品烘焙行业中用于抗面包老化的麦芽糖淀粉酶主要是n o v o z y m e s 公司生产 的来源于b a c i l l u ss p t s 2 5 的麦芽糖淀粉酶n o v a m y l 。野生型n o v a m y l 虽然抗老化作用显 著，但其只在中性条件下稳定，在低p h 环境下易失活，这就限制了它在面包烘焙方面一 些特定过程中的应用。基于此，对野生型n o v a m y l 进行了分子定向进化，以期得到低p h 条件下能稳定存在的n o v a m y l 。研究中构建了两个易错p c r 库，将其在屋s u b t i l i s 表达， 筛选在低p h 环境下热稳定性和活力都有所改善的有益突变，然后通过d n a 改组的方法 对这些有益突变进行反复重组，得到两代突变库。结果筛选到了一些能在p h 4 5 条件下 稳定且热稳定性提高了1 0 的有益突变，其中一株已成功应用于低p h 面包生产过程。 h i r o k i 等u7 j 对最s t e a r o t h e r m o p h i l u st r s 4 0 来源的新普鲁兰酶的催化作用方式进行了 研究，结果表明，新普鲁兰酶可以通过水解g 1 ，4 、伍1 ，6 葡萄糖苷键利用普鲁兰多糖， 生成潘糖；也可以通过形成0 【1 ，4 和0 【1 ，6 糖苷键来进行转糖基作用。这四种催化反应采 用同一种反应机制。 h i r o s h i 等【1 7 j 研究发现，丑s t e a r o t h e r m o p h i l u st r s 4 0 来源的新普鲁兰酶具有底物优先 选择性。当直链淀粉和支链淀粉同时存在时，可优先高效水解直链淀粉，主要产物为麦 芽糖，而几乎不作用于支链淀粉。来源于嗜碱芽孢杆菌a 2 5 a 的环状麦芽糊精淀粉酶和 b i i c h e n i f o r m i sa t c c 2 7 8 11 来源的麦芽糖淀粉酶也被发现具有相同的底物优先选择特 性。这三种酶都能高效利用环状糊精和直链淀粉，而水解普鲁兰的效率则相对较低。研 究中将这三种酶与其它淀粉水解酶( 细菌糖化a 淀粉酶、细菌液化g t 淀粉酶、b 淀粉酶、 丑m e g a t e r i u m 来源的新普鲁兰酶) 做了比较，结果显示，只有这三种酶具有底物优先选 择性。 z h o u 等【3 8 1 对麦芽糖淀粉酶和p 淀粉酶的协同作用进行了研究，比较了两种麦芽糖 生成酶对同一底物的水解差异，通过优化这两种麦芽糖生成酶和脱支酶的组合，可以高 速地制造麦芽糖含量高的高麦芽糖浆。 周建芹等1 3 9 1 分别研究了液化程度对麦芽糖淀粉酶和p 淀粉酶这两种酶糖化作用的 影响以及酶的用量对麦芽糖含量的影响，研究了制取超高浓度麦芽糖浆时麦芽糖淀粉酶 和b 淀粉酶并用与脱支酶的协同作用。结果表明：液化程度对麦芽糖淀粉酶和p 淀粉酶 的糖化作用有显著影响；与麦芽糖淀粉酶或p 淀粉酶单独与脱支酶的糖化相比，麦芽糖 淀粉酶和p 淀粉酶共同与脱支酶协同作用时可得到更高纯度的超高麦芽糖浆。 我国的淀粉酶工业应用主要还是以传统的a 淀粉酶和糖化酶为主，而生麦芽糖舡 淀粉酶在国内还没有得到广泛关注，相关研究更是鲜见。关于生麦芽糖q 淀粉酶分子生 物学方面的研究未见任何报道。 总之，生麦芽糖甜淀粉酶是一类能够水解淀粉底物生成主要产物为麦芽糖的一类水 解酶，在淀粉及食品工业中具有重要的工业应用价值，但国内外对于生麦芽糖a 淀粉酶 7 江南大学硕士学位论文 的生化特性描述相对较少，且进行过实验鉴别的种类也不多。因此，有必要对未知功能 的生麦芽糖0 【淀粉酶进行一定的功能鉴定，研究和评价细菌来源的新的生麦芽糖0 【- 淀粉 酶将有助于对此类酶进行本质和性质的深入研究；同时，也将有助于探索并开发其可能 的应用价值，为今后可能的应用提供基本理论和依据。 另外，为寻求一种各方面性质都比较优良的基因来源，我们有必要对不同细菌来源 的生麦芽糖洳淀粉酶的性质和功能进行初步探索。丑l i c h e n i f o r m i s 和丑c e r e u s 作为生麦 芽糖a 淀粉酶基因的主要细菌来源，相关研究报道很少，有关最c e r e u s 来源的生麦芽糖 a 淀粉酶基因的功能鉴别更无从查询。 1 4 本文的主要研究内容 基于以上描述，本论文选择了b 1 i c h e n i f o r m i s 和盈c e r e u s 来源的两个基因组序列中 标示为生麦芽糖a 淀粉酶的可能开放阅读框为研究对象，对这两个功能未知的生麦芽糖 弘淀粉酶基因进行了有效的分子克隆及异源表达，并对其中一种进行了较全面的酶学、 生化等方面的性质鉴别。论文的主要研究内容包括以下三方面： 1 丑l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 、丑c e r e u sc i c i m b 0 6 2 7 生麦芽糖a 淀粉酶基因 a m y m b 1 和a m y m b c 的克隆及序列测定； 2 丑l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 生麦芽糖i f , 淀粉酶基因a m y m b 1 在ec o l i 中的表达 及重组酶酶学性质和水解特性研究： 3 丑c e r e u sc i c i m b 0 6 2 7 生麦芽糖a 淀粉酶基因a m y m b c 在ec o l i 中的异源表达。 8 2 材料和方法 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 菌株- 和质粒 晟l i c h e n i f o r m i sa t c c l 4 5 8 0 由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 ( h t t p ：e i c i m c u j i a n g n a n e d u c a ) 提供；最c e r e u sc i c i m b 0 6 2 7 由云南德宏火山1 2 土样筛 得，保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心。 克隆宿主菌ec o l i x l 1 和表达宿主菌ec o l i j m l 0 9 、ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) 为本研究室 保藏。 克隆载体p b l u e s c f i p t l is k ( 一) 为本研究室保藏，克隆载体p m d l 9 一ts i m p l e 购自 t a k a r a ( 大连) 公司。表达载体p e t 2 8 “+ ) 购自i n v i t r o g e n 公司。 重组质粒p s k a m y m - b 1 、p m d l 9 t - a m y m b c 、p e t - 2 8 a - a m y m b 1 、p e t 一2 8 a - a m y m b e 及重组菌五c o l ix l 一1 ( p s k a m y m - b 1 ) 、ec o l ix l - 1 ( p m d l 9 一t - a m y m - b c ) 、ee o l ij m l 0 9 ( p e t 2 8 a - a m y m - b i ) 、 ec o l ij m10 9 ( p e t - 2 8 a - a m y m - b c ) 和ec o l id e 3 ( p e t - 2 8 a - a m y m - b 1 ) 、ec o l id e 3 ( p e t - 2 8 a a m y m - b c ) 为本研究中构建。 2 1 2 主要分子生物学试荆和化学试剂 实验用d n a 限制性内切酶e c o r i 、b a m h i 、s m a i 及t 4d n a 连接酶；核酸分子量 标准、蛋白分子量标准均为b b i 公司产品。 e f ud n a 聚合酶、卡那霉素、氨苄青霉素购于上海生工生物工程公司。 p c r 产物( 小量) 纯化试剂盒、胶回收试剂盒均为q i a g e n 产品。 测序用试剂盒为美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的b i g d y et e r m i n a t o rv 3 1 试剂盒。 丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺为f l u k a 公司产品。 x - g a l 和i p t g 购自t a k a r a ( 大连) 公司。蛋白胨和酵母粉产地为o x o i d 公司。普 鲁兰多糖为s i g m a 公司产品。s d s ( 十二烷基磺酸钠) 、可溶性淀粉、环状糊精、葡 萄糖、麦芽糖、考马斯亮蓝r - 2 5 0 、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、脲、盐酸胍等 其余试剂均为进口或国产分析纯。 2 1 3 常用溶液殁培养基的配制 ( 1 ) 染色体、质粒提取常用试剂 r n a s e 溶液：r n a s e5m g ，于lm l 生理盐水中充分溶解，沸水浴1 0r a i n ，缓慢冷 却后分装，- 2 0 保藏。 溶液i ：5 0m m o l l 葡萄糖，2 5m m o l lh s h c i ( p h8 o ) ，1 0m m o l le d t a 。 溶液i i ：0 2m o l l n a o h ，l s d s 。 溶液i ：5m o l l 乙酸钾6 0m l ，冰乙酸1 1 5m l ，水2 8 5m l ，混匀。 c 1 = 柚n a c i 溶液：10 c t a b 一0 7m o l ln a c l 。 9 江南大学硕士学位论文 t e 溶液：2m m o l lt r i s h c i ，1m m o l le d t a ，p h8 0 。 p e g 溶液：2 5 p e g 8 0 0 0 ，5 0m m o l lt r i s h c i ( p h 8 0 ) ，5 0m m o l lc a c l 2 。 ( 2 ) 感受态细胞制备常用试剂 o 1m o l lc a c l 2 ( 含3 0 甘油) ：取o 0 2m o l lc a c l 2 溶于8 0m l 水中，用m o p s 调 p h 至7 2 ，且定容至1 0 0m l ，另配制6 0 的甘油溶液，将0 0 2 m o l lc a c l 2 和6 0 甘油 等体积混合，高压灭菌，4 保存。 ( 3 ) 诱导培养及蓝白筛选用试剂 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) ( 1 0 0m g m l ) ：o 5ga m p i c i l l i n 溶于5m l 无菌水中，o 2 2 岬滤膜过滤除菌，分装成1m l 小份，2 0 保存。 x - g a l ( 5 0m g m l ) ：5 溴4 氯- 3 - 吲哚p d 半乳糖苷5 0m g 溶于lm