（药理学专业论文）angⅡ及ne对过表达gαq乳鼠心室肌细胞钙信号的影响.pdf

目录 l f l j i | i f i | l l l f l 川l i f i l l l l l l f f i | j m l y 19 0 0 5 5 9 中文摘要l 英文摘要5 研究论文a n gi i 及n e 对过表达g q q 乳鼠心室肌细胞钙信号的影响 引言l o 第一部分携带小鼠野生型g 伐q 基因的重组腺病毒p a d g o 【q g f p 的构建 前言：1 l刖舌1 l 材料与方法1 2 结果2 3 附图2 6 讨论3 1 小结3 2 参考文献3 2 第二部分a n gi i 及n e 对过表达g 明乳鼠心室肌细胞钙信号的影响 前言3 4日i j 舌3 4 材料与方法3 5 结果、：4 l 附图4 3 讨论5 1 小结5 4 参考文献5 4 结论5 6 综述g q 通路和c a 2 + 信号与心肌肥厚关系的研究进展5 7 致谢6 6 个人简历6 7 _ _ _ 。一。一 中文摘要 a n g 及n e 对过表达g 仅q 乳鼠心室肌细胞钙信号的影响 摘要 心肌肥厚是心脏对多种疾病的适应性反应，如高血压、瓣膜病、心肌 缺血等，持续的病理性刺激会引起心肌细胞在结构和电生理学上的重构， 这将大大增加了心律失常和心力衰竭的风险。所以研究心肌肥厚的发生机 制、有效控制心肌肥厚的发展进程对预防和治疗心肌肥厚引发的心力衰竭 具有重要的价值。 众多研究表明g q 通路的激活在心肌细胞肥大的过程中起到了至关重 要的作用。g q 偶联受体激动剂包括血管紧张素i i ( a i l 西o t e n s i i li i ，a n gi i ) 、 去甲肾上腺素( n o r q ) i n e p h r i n e ，n e ) 、内皮素( e n d o m e l i n ，e t ) 可诱发 新生鼠左室心肌细胞( n r v m s ) 肥大。在n 】w m s 中过表达野生型g 仅q 蛋 白可使心肌细胞肥大，而过表达持续激活的g q q 突变体蛋白，最初引起心 肌细胞肥大进而发展为心肌坏死。通过转基因方法在小鼠心脏中特异性表 达g 0 【q 蛋白，可使心脏的重量以及心肌细胞的大小都明显的增加，a n p 、 q a c t i o n 和b m h c 等胎儿基因的表达也明显增加。 迄今为止g q 通路激活引起心肌细胞肥大发生的机制尚不清楚。而c a 2 + 在心肌肥厚发生过程中的作用近年来越来越受到人们的关注。研究发现细 胞内c a 2 + 浓度升高可激活细胞内的钙调磷酸酶( c a n ) ，进而激活活化t 细 胞核因子( n u c l e a rf a c t o ro fa c t i v a t e dtc e l l s ，卜吼盯) ，从而引起肥厚相 关基因的转录增加，这一通路可能在心肌肥厚的发生过程中具有重要的作 用。但g q 通路激活以及过表达g 蛔引发的心肌肥厚是否通过对细胞内钙信 号产生影响而实现的目前还不是很清楚。本实验首先利用a d e a s y 腺病毒 载体系统构建含小鼠野生型g 叫基因的重组腺病毒载体，再使其转染乳鼠 心肌细胞，观察过表达g 叫的乳鼠心肌细胞在a n gi i 、n e 作用下细胞内钙 信号的变化，以研究g q 通路激活引起心肌肥厚与细胞内钙信号的关系。 中文摘要 第一部分携带小鼠野生型g n q 基因的重组腺病毒载体的构建 目的：利用a d e a s y 腺病毒载体系统构建含小鼠野生型g o 【q 基因的 重组腺病毒，并在h e k 2 9 3 a 细胞中进行重组腺病毒p a d g 0 【q g f p 的扩 增制备。 方法：( 1 ) 目的基因p g e m h e g 叫经p c r 加入s p ei 和p v ui 两个 酶切位点并大量扩增，凝胶电泳鉴定，正确p c r 产物胶回收提纯。( 2 ) p c r 产物与穿梭载体p s h u t t l e i r e s h 硒f p 1 经s p ei 和p i 充分消化， 将其产物经t 4 连接酶连接，构建成功的质粒p s h u t t l e g 仅q 经凝胶电泳鉴 定，同时送测序公司测序。( 3 ) 经测序证实后的p s h 眦l e g 仅q 依次进行 p m ei 线性化、纯化、去磷酸化、胶回收等处理。通过b i o r a d 电转化仪 将线性化后的p s h 似l e g a q 转化入b j 5 l8 3 a d e 弱y 感受态细胞，进行同 源重组。经凝胶电泳鉴定成功的重组质粒转化入d h 5q 感受态细胞中扩 增。( 4 ) 重组腺病毒质粒p a d g 0 【q g f p 经p a ci 线性化后，用酚氯仿提 纯质粒。纯化后的线性重组腺病毒质粒p a d g 叫g f p 经l i p o f e c t 锄i n e t m 2 0 0 0 转染h e k 2 9 3 a 细胞，包装制备腺病毒颗粒。( 5 ) 将原代病毒液反 复冻融3 次后，继续感染h e k 2 9 3 a 细胞进行病毒颗粒的扩增。包装成 功的病毒颗粒感染h e k 2 9 3 a 细胞后提取全细胞蛋白经w e s t e m b l o t 方法 鉴定是否达到过表达g q 蛋白的目的。 结果： ( 1 ) p c r 扩增方法将s p ei 和p i 两个酶切位点加入g 0 【qc d n a 两端，经1 琼脂糖凝胶电泳鉴定，p c r 产物片段长度约l k b ，与预期大 小1 0 9 8 b p 相符。 ( 2 ) 以上p c r 产物与穿梭载体p s h 此l e i r e s h r g f p 1 分别经s p e i 和p i 酶切消化，酶切产物经t 4 连接酶连接构成质粒p s h u t t l e g u q 。 质粒p s h u t t l e g o q 中插入片段序列正确性经酶切鉴定和d n a 测序证实。 ( 3 ) 测序证实后的质粒p s h u 仕l e g q q 经p i n ei 线性化后，经电转化 转入携带腺病毒骨架p a d e 硒y 的b j 5 1 8 3 感受态细胞进行同源重组。同源 重组后挑选出的阳性克隆质粒转化d h 5q 感受态细胞，扩增后抽提质粒 经p a ci 酶切鉴定，可得一条约3 0k b 大小的片段和3l 曲或者4 5k b 大 中文摘要 小的片段。由此可知重组p a d e a s y s h u t t l e g 0 【q 质粒构建成功。 ( 4 ) 经p a ci 线性化的p a d e a s y s h u t t l e g a q 质粒转染h e k 2 9 3 a 细 胞，可观察到细胞病理变化( c 舛o p a “ce 虢c t ，c p e ) ，即展开的细胞经病 毒颗粒感染后出现细胞慢慢变圆、飘起的现象。c p e 现象可以说明已包装 出病毒颗粒。 ( 5 ) 经w | e s t e m - b l o t 检测感染腺病毒p a d g 0 【q g f p 的h e k 2 9 3 a 细 胞中g 仅q 蛋白的表达量明显增加，表明该病毒可成功实现在体外培养的 细胞中过表达g 0 【q 蛋白的目的，能满足下一步的实验研究。 结论：利用a d e a s y 腺病毒载体成功构建了含有小鼠g a q 基因的腺 病毒颗粒，为下一步的实验研究奠定了基础。 第二部分腺病毒p a d g a q g f p 转染乳鼠心室肌细胞及对细胞内钙信号 的影响 目的：通过腺病毒p a d g a q g f p 转染在离体培养的乳鼠左心室肌细 胞( n r v m s ) 中过表达g q q ，通过激光共聚焦显微镜观察给予心肌肥厚 激动剂a n gi i 和n e 后心肌细胞内钙信号的变化，从而探讨g q 通路激活 引起心肌肥厚与细胞内钙信号的关系。 方法：( 1 ) 熙m s 的分离及培养：在无菌条件下，应用终浓度为o 0 4 胰酶、o 0 6 胶原酶i i 的混合液反复消化出生2 3 天的乳鼠心肌组织6 7 次，用含1 0 f b s 的d m e m 培养基中和收集到的细胞悬液，用差速贴壁 法和溴脱氧尿嘧啶( b r d u ) 相结合的方法纯化细胞，置c 0 2 培养箱孵育。 ( 2 ) 腺病毒p a d g 仪q g f p 转染n r v m s ：用稀释好的病毒液替换n r v m s 的培养液，c 0 2 培养箱孵育4 8h ，观察转染效率并经w b s t 肌b l o t 检测目 的蛋白表达情况。( 3 ) 激光共聚焦显微镜下观察刚r m s 内钙的变化： 砌1 0 d 2 a m 负载心肌细胞1 5m i n 后，灌流给予5 州a n g i i 和n e ，观察 心肌细胞内钙的变化。 结果： ( 1 ) 分离的n 】m s 培养4 8 h 后心肌细胞展开并伸出的伪足，相互 交织在一起形成多个细胞簇，每个细胞簇中的细胞呈放射状排列，并可同 中文摘要 步化搏动，说明细胞状态良好。 ( 2 ) 将第一部分构建的重组腺病毒p a d g 仅q g f p 感染m m s 细胞 4 8 h 后，在激光共聚焦显微镜下观察可见大多数细胞具有绿色荧光的表 达，说明腺病毒的转染效率较高，w r e s t e n - b l o t 结果显示感染腺病毒 p a d g a q g f p 的n i w m s 细胞中g a q 蛋白的表达为对照组细胞的3 5 倍， 提示腺病毒p a d g a q g f p 感染成功在文蹦s 细胞内过表达g 0 【q 蛋白。 ( 3 ) 腺病毒转染4 8 h 后在激光共聚焦显微镜下观察给予5 州的a n g i i 或n e 前后过表达g 0 【q 蛋白的w m s 细胞内钙的变化，结果显示与对 照组相比5 州a n gi i 和n e 可明显增加过表达g q q 的m w m s 细胞钙振 荡的频率，而且过表达g q q 的m s 在a n gi i 作用下基础的钙升高幅 度也明显增加。 结论：g a q 蛋白在心肌细胞中过表达可显著影响心肌肥厚刺激因子引 起的钙信号，进一步提示钙信号增强可能是g q 通路激活引起心肌肥厚的 关键因素。 关键词：腺病毒；m q ；n r v m s ；心肌肥厚；钙信号 英文摘要 一一一 e f ! | f e c t so fa n gi ia n dn e o nc a 2 + s i g n a li ng 0 【qo v e r e x p r e s s i n g n e o n a t er a tv e t r i c u l em y o c y t e s a b s t r a c t c a r d i a ch y p 嘶r o p h yo c c u r s 舔观a d a p t i v er e s p o n s et od i 疏r e n tc a r d i a c d i s e a s e ss u c ha sh y p 叭e n s i o n ，v a l v u l a rh e 矾d i s e a s e ，a i l dm y o c a r d i a li s c h e i l l i a s t m c t u r a la n de l e c 仃0 p h y s i 0 1 0 9 i c a lr e m o d e l i n gi n d u c e db ys u s t a i n e ds t i i n u l u s w i l li 1 1 c r e a s et h er i s ko fa 玎h 舛l i 试aa n dh e 叭f a i l u r e t ou n d e r s t a n d 戗l e m e c h a n i s mo fh y p 舐r o p h yd e v e l o p m e n t 觚dt 0p r e v e n tt h ep r o c e s s o 士 h y p 叭r o p h yh a p p e n i n g a r ei m p o r t a n tf o rr e d u c i n gn l er i s ko f h e a nf a i l u r e a c c u i n u l a t i v es t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a tt h ea c t i v a t i o no fg qp a t 1 w a y 瓶g h tb ea 嘶t i c a lf a c t o ri na l ed e v e l o p m e n to fm y o c a r d i a lh y p e m o p h y t h e a g o n i s t so fg qp r o t e i n c o u p l e dr e c 印t o r s ，i n c l u d i n ga n g i i ，n e ，a n de t - lc a n i n d u c et h eh y p 嘶r o p h yo fn e o n a t e m tv e t r i c u l em y o 哪e s( n r v m s ) o v e r e x p r e s s i o n o ft h ew i l ( 1 - t y p eg o 【q i nn r v m sc a u s e sm y o c a r d l a l h y p e r t r o p h y w h i l eo v e r e x p r e s s i o no fc o n s t i t u t i v e l y a c t i v a t e dg 0 【qi n u t a n t p r o d u c e sh y p e n r o p h yi n i t i a l l y ，a n de v e n t u a l l yr e s u l t si nc a r d i o m y o c y t e s d e a t h c a r d i a cs p e c i f i cg c l qt r a n s g e i l i c m i c el e a d st 0 h e a r t o v e r w e i g h t ， c 枷i o i n y o c y t ee n l a r g e m e n t ，a sw e u 邪i n c r e a s 删o f 朋屺 q a c t i o na n db m h ce x p r e s s i o n s of 乱t h em e c h a l l i s mo fg 伍q s t i i n u la t | 耐i n y o c a r d i a lh y p 锄r o p h y i s u n c l e a r f o rt h ep a s tf e wy e a r s ，a c c u 埘【u l a t i v ee 、r i d e n c es u g g e s t e dt h a tc 一十 p l a yac r i t i c a lr o l ei n t h ed e v e l o p m e n to fn l y o c 砌i a lh y p e r t r o p h y i ti s s u g g e s t e dt h a ti n c r e a s e d 【c a 2 + 】iw i na c t i v a t ec a ：n ，a i l di 1 1 i t i a t eas e r i e so f c v e i l t s w h i c ha c t i v a t et h e 撇觚di n c 燃m et 豫r l s c 却t i o no fh y p e m o p h y r e l a t e dg e n e s t m sp a t h w a y 觚g h tb ee s s e n t i a l f o rm ed e v e l o p m e n to f h y p e n r o p h y h o w e v t h el i l l l ( b e 柳e e l lc a 2 + s i g n a la i l dh y p 晡o p h y i n d u c e d b yt h eg p c r s ( i n c l u d i n ga n g ，n e ) a i l do v 蹦i x p r e s s i o no fg 明i ss t i u i i l i s s i n g i nt h i s 咖d y ，w ei n v e s t i g 砌m ee 跚s o fo v e r e x p r e s s i o no fg 0 【qo n 英文摘要 n ea i l da n gi ii n d u c e dc a 2 + s i g n a li nm tc 砌i o m y o c y t e s ar e c o m b i n a n t a d e n o v i m sc a r 巧i n gm i c ew i l d t y p eg a qw 弱f i r s tc o n s t m c t e da n dw a st h e n u s e dt oi n f e c tt h e 删s t h ei n t r a c e l l u l a rc a 2 + s i g n a li n d u c e db ya n gi ia n d n ei nn r v m sw i t l la n dw i h o u to v e r e x p r e s s e dg a qw a sc o m p a r e di no r d e rt o u n d e r s t a n dt h er o l eo fc a 2 + s i 弘a li nl 呻e r t r o p h yi n d u c e db yt l l eg p c r s p a r t lc o n s t i u c t i o no ft h er e c o m b i n a n ta d e n o 、，i r u s c a r r y i n g m i c e w n d 一够p eg a qg e n e o b j e c t i v e ：t oc o n s 咖c tr e c o m b i n a ma d e n o v i m sa d e n o v i m sc a n 蜘n g m i c ew i l d - t y p eg o l q ( p a d g q q g f p ) ，锄dt o 锄p l i 矽t h ep a d g a q - g f pi nt h e h e k 2 9 3 ac e l l s m e t h o d s ：( 1 ) g 0 【qc d n aw 弱锄叩1 i f i e db yp c rf 酌mv e c t o r p g e m h e g 0 【qa 1 1 dt h er e s t r i c t i o n 铋dn u c l e 嬲es i t eo fp v uia n ds p e1w e r e a d d e dt ot h ee n d so fg 仅qc d n a t h ep c r p r o d u c t sw e r ea 1 1 a l y z e db ya g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i s ，a n dp u d f i e db yd n ag e lc x t m c t i o n 酗t ( 2 ) t h ep c r 触g m e n t s w e r ec u t t e dw i t h s p ei 锄dp v ui ，锄dw e r e1 i g a t e d i n t o p s h u t t l e - i r e s - l 蜩f p 一1 ，w h i c hw a sa l s oc u t t e db ym es 锄ee n z y l l l e s t h e r e c o m b i n a mp l a s m i dw 硒 锄a l y z e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d c o n f i n l l e db ys e q u e n c i n g ( 3 ) p s l m t t l e - g 0 c q 、v 缌l i n e r i z e db yp m ei ，f o l l o w e d b yp u r i f i c a t i o na n dd 印h o s p h o r y l a t i o n s u b s e q u e n t l y ，l i n e 血e dp s h u 仕l e - g 叫 w 弱e l e c t r o 栅1 s f o n i l a t e di n t 0b j 一5l8 3e l e c 仃o p o r a t e d c o m p e t e i l tc e l l sc a r r y i n g a d e n o v i m sb a c k b o n e p l a s m i dp a d l 三a s y - 1 t o g e n 所a t e r e c o m b i n a n t p a d g a q - g f p ( 4 ) p o s i t i v er e c o m b i n a n ta d e n o v i m sp l a s m i d si d e m 砺e db y r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o nw e r eu s e dt ot r a n s f o n nd h 5 qc o m p e t e n t c e l l ss ot h a tm er e c o m b i n a n ta d e i l 0 、，i m sp l 硒l i l i dd n ac o u l db e 锄p l i f i e d t h e nt h el l e w l yc o l l s t n l c t e dp a d - ( h q g f pw 弱l i n e a r i z e db yp a ci ，a i l d t r a n s 佗c t e di n t oh e k 2 9 3 ac e l l st h r o u g hl i p o 矗娥锄i n e1 m2 0 0 0 ( 5 ) t h e v i m s e sw e r e 锄叩1 i f i e da n dp a c k a g e di i lh e k 2 9 3 ac e l l s ，m e nt h ev i m s e s p a n i c l e sw e r el i b e r a t e db yt i m 行饯纪e t h a wc y c l e s 6 英文摘要 r e s u i t s ： ( 1 ) p c rp r o d u c t so fg 明c d n aw e r ea n a l y z e dt h r o u 曲a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s t h es i z eo ff j r a g m e n t sw a sa sl 鹕ea se x p e c t e d ( 10 8 9 b p ) ( 2 ) p s h u t t l e - 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b l o tr e s u l t ss h o w e dt h ee x p r e s s i o no fg 伐qp r o t e i i li ni n f e c t e d h e k 2 9 3 ac e l l sw a ss i g l l i f i c a n t l yi n c r e 懿e dc o m p a r e dw i t hc o l l 仃o lh e k 2 9 3 a c e l l s c o n c l u s i o n ：t h er e c o m b i n a n ta d e n o v i m sc a r r ) ，i n gr n i c ew i l d t y p eg o 【q g e n ew a se s t a b l i s h e ds u c c e s s m l l y t i l i sw o u l db et h e 如n d 锄e n tf o rt h e 如r t h e r s t u d y p a r t 2e f f e c to fo v e x p s s i o no fg 0 【q n r si n d u c e db ya n g a n dn e o nt h ei n t r a c e u u l a rc a 2 + s i g n a io f o b j e c 晰e ： t o o v e r e x p r e s sg a qi nn 】州m s t h r o u g ha d e n o v i m s i n f e 嘶o na n dt oo b s e r v ee 船c to fo v e r e x p r e s s i o no fg a q o nm ei n t i a c e l l u l a r 7 英文摘要 c a ，2 十s i 印a lo fn 】艾州si n d u c e db ya n g i ia 1 1 dn e m e t h o d s ：( 1 ) c e l ld i s s o c i a t i o na n dc u l t u r e ：c a r d i a ci n u s c l eo f2o r3d a y s n e o n a t er a l = t u sw 嬲d i g e s t e dr 印e a t e d l y6 - 7t i i n e sb y0 0 4 t d ，p s i na 1 1 do 0 6 c o l l a g e n a s ei i t h ec e l ls u s p e n s i o nw e r ec o l l e c t e di nd m e mm e d i u m ，w h i c h c o n t a i n s1 0 f b s m y o c a r d i a lc e l l sw e r ep u r i f i e db yt h et e c l l i l i q u eo f d i 丘e 删a la n c h o r i n gv e l o c i 锣w i t h i nat i m eo f8 0m i na n db r d u ，a n dw e r e m e np l a c e di n t oc 0 2i i l c u b a t o r ( 2 ) 套源v m sw e r ei n 氨t e db ya d e n o v i m s c a r r y i n gm i c ew i l d t = 憎eg q q f o rt h i s ，t l l ei n e d i u mi n c u b a t i n gn r 、厂m sw a s r 印1 a c e dw i t ha d e n o v i r u s e sw h i c hh a db e e nd i l u t e db yt h em e d i u m ，a i l dt h e n t 1 1 e c a r d i o i n y o c 舛e s w e r ep l a c e di n t oc 0 2i n c u b a t o rf o r4 8 ha i l dt l l e o v e r e ) 【p r e s s i o no fg 仅qw a sc o n f i n n e db yw e s t e m - b l o ta n a l y s i s ( 3 ) t h e c h a n g e o fi n t r a c e l l u l a rc 扩w 嬲咖d i e d u o u 曲c o n f o c a lm i c r o s c o p e n r v m s ，i n f t e dw i lp a d - g 0 【q g f po rc o n t r o lg f p ，w e r el o a d e dw i m r h o d 2 - a m 锄d t r e a t e d b ya n g i io rn e r e s u l t s ： ( 1 ) n r v m sp r o g r e s s i v l ys t r e t c ho u tw i t hp a r a p o d i u ma n dc o n g r e g a t e t o g e t h e r a n df o mt h ec e nc l u m p s4 8 ha r e rd i s s o c i a t i o n c e l lc l u m p s r h y t h m i c a l l yb e a ti 1 1as y n c h r o n i z e da n ds p o n t a n e o u sf a s h i o n ，i n d i c a t i o no f h e a l t l l yn r m m s ( 2 ) m sw i 淝i i l f 托t e db yp a d g a q - g f pw i mh i g he 伍c i e n c y ，a n dt h e e x p r e s s i o no fg a qp r o t 血证n r v m s i n 舭t e dw 池p a d - g 仅q g f pw a sa b o u t 3 5t i m e sa s 曲to f t h e 删si n 妣伽w i t hc o 咖lv i r i l sp a d g f p ( 3 ) o v e r e x p r e s s i o no fg 凹i n 卜删m sm a r k e d l yi n c r e a s e dt h e 能q u e n c y o fc a l c i u mo s c i l l a t i o ni n d u c e db y5 州a n gi io rn e ，w l l i c hw 弱n o to b s e r v e d i nn r v m sw i 廿l o u tg a qo v e r e x p r e s s i o n m e a 删m i l e ，t h ed i 硒t o l i cc 矿十 i n c r e 弱锄e n tc 肌s e db y5 州a n g1 1w 蠲a l s om o r ep r o f o 吼dmn r v m s o v e 叩s s i n gg a q m 趾i i lc o 曲0 l m s c o n c l u s i o n ：o v 唧r e s s i o no fg a q i i lm y o c a r d i a lc e l l sm a r k e d l ya 髓c t t h ec a z + s i g n a lc a u s e db ys t i m u l a t i n gf i a c t o ro fh y p e r t l o p h ma n dm ee r l l l a n c e d c a 2 + s i 印a lm a y b et l l e 耐t i c a l 舭t o rf o rh y p e m p h yi n d u c e db yg qp a t h w a y 8 英文摘要 k e y w o r d s ：a d e n o v i r u s ；g 0 【q ；n r v m s ；c a r d i a c l 卵o t r o p h y ；c a 2 + s i g n a l 研究论文 a n g 及n e 对过表达g 仅q 乳鼠心室肌细胞钙信号的影响 引言 心肌肥厚( c a r d i a ch y p e m o p h y ) 是心脏对多种疾病的适应性反应， 如高血压、瓣膜病、心肌缺血等，持续的心肌肥大刺激会引起心肌细胞在 结构和电生理学上的重构，这将大大增加了心律失常和心力衰竭的风险 【1 1 。因此研究心肌肥厚的发生机制、有效控制心肌肥厚的发展进程对预防 和治疗心肌肥厚引发的心力衰竭具有重要的价值。 众多研究表明g q 通路的激活在心肌细胞肥大的过程中起到了至关重 要的作用。g q 偶联受体激动剂包括血管紧张素i i ( a n gi i ) 、去甲肾上腺 素( n e ) 、内皮素( e t ) 可诱发新生鼠心肌细胞( n 删s ) 肥大【2 】。在 n i m s 中过表达野生型g o 【q 蛋白可使心肌肥大，而过表达持续激活的g q q 突变体蛋白，最初引起心肌肥大进而发展为心肌坏死【3 】。这种现象在过表 达g 0 【q 的转基因动物中进一步得到证实，通过转基因方法在小鼠心脏中特 异性表达g 叩蛋白，可使心脏的重量以及心肌细胞的大小都明显的增加， a n p 、q a c t i o n 和b m h c 等胎儿基因的表达也明显增加【4 1 。 g q 通路激活引起心肌细胞肥大发生的机制目前尚不十分清楚。而近 年来，c a 2 + 在心肌肥厚发生过程中的作用越来越受到人们的关注。特别是 c a 2 + 升高可使钙调磷酸酶( c a n ) 激活，进而激活核转录因子脚而引起 肥厚相关基因的转录增加，这一通路可能在心肌肥厚的发生过程中具有重 要的作用。然而关于g q 通路激活引起心肌肥厚与其对细胞内钙信号调节 关系的研究并不多。本实验以乳鼠心肌细胞为研究对象，研究g q 蛋白偶 联受体激动剂a n g i i 、n e 对正常和过表达g a q 乳鼠心肌细胞内钙信号的影 响。本实验分为两部分，第一部分是携带小鼠野生型g 仅q 基因的腺病毒载 体的构建。第二部分通过腺病毒转染方法在乳鼠心肌细胞中过表达g 叩， 观察给予a n gi i 、n e 等g q 偶联受体激动剂对过表达g 仅q 细胞内钙信号变化 的影响。通过上述两部分的实验研究进一步证明g q 通路激活引起心肌肥 厚与细胞内钙信号的关系，有助阐明a n gi i 、n e 等心肌肥厚刺激因子引发 的心肌肥厚的发生机制。 研究论文 第一部分 携带小鼠野生型g 0 【q 基因的重组腺病毒a d - g 0 c q g f p 的构建 上一 刖 菁 腺病毒是目前较常用的转染载体，与传统的脂质体转染方法比较具有 转染效率高、病毒滴度高、插入基因容量大、外源基因表达水平高、宿主 范围广泛( 包括分裂期和非分裂期细胞) 等优点【5 8 】。本部分实验的意义 是建立重组腺病毒载体转染的方法以提高心肌细胞、神经元等非分裂细胞 的转染效率。 腺病毒( 批v i r a lv e c t o r ，a d ) 是由蛋白外壳包裹线状的双链d n a 构成的无包膜病毒，呈二十面体对称。在病毒2 0 面体的1 2 个项角均有一 个顶角颗粒，每个项角颗粒又可分为基底部、纤维突起、顶球部。顶球部 是腺病毒颗粒与细胞表面c a r 受体( 柯克萨基腺病毒受体，c o x s a c k i e a d e n o v i m sr e c 研o r ) 结合的主要部位。目前广泛应用的腺病毒载体多是以 人类腺病毒c 亚群的2 型和5 型为基础构建而成，大多缺失e l 区和e 3 区，自身不能表达病毒包装蛋白，只有在具有e l 和e 3 区的2 9 3 细胞或 h e l a 细胞帮助下才会形成病毒颗粒，从而具有感染细胞的能力【5 一。 在腺病毒感染细胞的过程中有两个极其重要的介质：柯克萨基 腺病毒受体( c o x s a c i 【i ea d e n o v i r u sr c c 印t o r ，c a r ) 和整合素( i n t e g 血) 。c a r 是一种跨膜糖蛋白，其胞外区可与腺病毒项角颗粒的项球部结合，形成复 合物，从而参与腺病毒对细胞的粘附。整合素对于腺病毒在细胞膜上的定 位是必需的，而且其表达水平的高低将直接影响腺病毒的感染效率。腺病 毒感染细胞