（化学工艺专业论文）从发酵液中提取生物防腐剂ε聚赖氨酸的初步研究.pdf

摘要 e 一聚赖氨酸( - p o l y - l l y s i n e ) 是由微生物发酵合成的一种由赖氨酸单体 通过e 酰胺键形成的多肽。e p l 具有优良的抑菌作用，对革兰氏阳性菌和阴 性菌、酵母和一些病毒都有抑制作用，而且兼有水溶性好、热稳定性高等特点。 目前，e - p l 已广泛用于食品加工和贮藏的防腐保鲜、可降解生物材料、药物 包被物、靶向药物载体以及医学研究中。 本文采用d 1 5 2 弱酸性阳离子交换树脂( h 型) 对发酵法生产的e 聚赖氨 酸进行了分离提取的研究。参考外文文献设计了合理的工艺流程。离心分离发 酵液( p h 3 2 ) ，调节滤液的p h 值到8 5 ，过滤除去沉淀。滤液通过d 1 5 2 离子 交换柱( h 型) ，用水和0 2 n 的醋酸洗涤，用0 1 n 的盐酸洗脱。用1 n 的n a o n 调节洗脱液的p h 值到6 5 ，加入活性炭脱色后浓缩到小体积。加入乙醇和乙醚 的混合物( 体积比2 ：1 ) 后，析出白色晶体。产品可进一步使用葡聚糖凝胶柱 精制。 通过静态交换实验，研究了d 1 5 2 树脂对e 聚赖氨酸的静态交换的一些参 数，通过动态交换实验，研究了以盐酸为洗脱剂，以盐酸为再生剂的工艺流程， 确定了主要工艺参数。 关键词：e 一聚赖氨酸，提取，离子交换，交换树脂 a b s t r a c t e p o l y l - l y s i n e i s c o m p r i s e d o f l y s i n e l i n k e d b y a m i d eb o n d t h r o u g h m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n i th a se x c e l l e n ta n t i b a c t e r i a ia c t i v i t ya g a i n s tg r a m p o s i t i v e a n d g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ，y e a s t a n ds o m ek i n d so fv i r u s e s i na d d i t i o n a l 一p o l y l - l y s i n e i ss o l u b l ea n da t t r a c t i v eh e a ts t a b l e a t p r e s e n t p o l y l - l y s i n e h a v eb e e nu s e da sn a t u r a lf o o dp r e s e r v a t i v em a i n l y , d e g r a d a b l e b i o l o g i c a lm a t r e r i a ， c o a to f d r u g ，c a r r i e ro fg a r g e td r u ga n dm e d i c a lr e s e a r c h t h es e p a r a t i o na n de x t r a c t i o no f 一p o l y l i s i n ef r o mf e r m e n t a t i o nl i q u i db y u s i n gw e a k a c i da n i o n e x c h a n g er e s i nd 1 5 2w a ss t u d i e d t h ec u l t u r eb r o t h f p h 3 2 ) w a sf i l t e r e da n dt h ef i l t r a t ew a sa d j u s t e dt op h 8 5 t h e n ，t h ep r e c i r l i t a t ef o r m e dw a s r e m o v e d b y f i l t r a t i o n t h ef i l t r a t ew a s a p p l i e d o nac o l u m no fa m b e r l i t e i r c 一5 0 ( h t l f r o m la n dw a s h e dw i t h0 2 na c e t i ca c i da n dw a t e r , s u c c e s s i v e l y t h e s u b s t a n c ew a se l u t e dw i t h0 1 nh y d r o c h l o r i ca c i d t h ee l u a t ew a sn e u t r a l i z e dw i t h i ns o d i u mh y d r o x i d ea n dd e c o l o r i z e dw i t ha c t i v ec h a r c o a l a n dt h e r le v a p o r a t e dt oa s m a l lv o l u m e t h ed p s u b s t a n c ew a sp r e c i p i t a t e da saw h i t e p o w d e rb ya d d i t i o no f a ne t h a n o la n de t h e rf 2 ：1 ) m i x t u r e t h es u b s t a n c ew a sf u r t h e rp u r i f i e db yc o l u m n c h r o m a t o g r a p h yo ns e o h a d e x g 一2 5 t h r o u 【g h s t a t i c e x c h a n g ee x p e r i m e n t s ，s t a t i ce x c h a n g ep a r a m e t e r s o f 8 一p o l y l - l y s i n eo nd 1 5 2 r e s i ni sd i s c u s s e d t h r o u g hd y n a m i c e x c h a n g ee x p e r i m e n t ， t h et e c h n i c a lp r o c e s su s i n gh c la se l u e n ta n dh c la sr e g e n e r a t i v ea g e n ti ss t u d i e d ， a n dm a i nt e c h n i c a lp a r a m e t e r sa r ed e t e r m i n e d k e y w o r d s ：- p o l y l - l y s i n e ，e x t r a c t i o n ，i o ne x c h a n g e ，i o ne x c h a n g er e s i n s 天津科技大学硕士学位论文 l 前言 e 一聚赖氨酸是一种具有广谱抑菌能力和许多优良特性的新型生物防腐 剂，它的开发始于2 0 世纪8 0 年代，目前在日本已实现工业化生产，而国内 迄今为止还没有这方面的相关报道。 生物防腐剂是指从生物体内，通过生物培养、提取和分离技术获得的具 有抑制和杀灭微生物的生物活性物质。目前生物食品防腐剂有三种类型： 天然动植物的直接提取物；生物工程产品如乳酸链球菌素、海松素和溶菌 酶等；天然存在于各种生物体且可以通过人工修饰、分解、蒸馏等方法制 得的产品如丙酸、维生素k 和e 一聚赖氨酸等。 国外对天然食品防腐剂的合成、筛选、抗菌性能和抗菌机理进行大量研 究的同时，对有关食品防腐剂的法规也不断补充、完善。到目前为止，国外 食品防腐剂行业已相当成熟，开发出了数十种天然食品防腐剂，建立了完备 的法规。国内对天然食品防腐剂的研究起步较晚，目前尚属初级阶段，为适 应市场需求，国内学者也做了大量的工作。 2 l 世纪是“绿色”的世纪，是追求食品安全与可持续发展的世纪。因此， 开发绿色食品、有机食品成为提高经济效益，增加市场竞争力，提高人民生 活质量的重要举措，随着人民生活水平的进一步提高，天然食品防腐剂在食 品加工保藏过程中将被广泛使用。生物技术的飞速发展，为开发、应用天然 食品防腐剂开辟了一条崭新的途径。 1 1e 一聚赖氨酸的简介 1 9 7 7 年日本学者s s h i m a 和h s a k a i 从放线菌培养过滤液中提取出一种含 有2 5 - 3 0 个赖氨酸残基的同型单体聚合物，这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基 通过n 羧基和e 一氨基形成的酰胺键连接而成，故称为e 一聚合赖氨酸( e p l ) 。由于微生物合成e p l 独特的分子结构，使之具有广泛的生理功能和实 用特性。1 9 8 4 年s s h i m ae t a l 对p l 的抑菌作用和机理进行了研究，发现 p l 对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、真菌的生长繁殖有显著的抑制作用。 1 前音 1 1 1 聚赖氨酸的结构 化学法合成的聚赖氨酸为n 型，其赖氨酸残基之问的酰胺键是由a 一氨基 和a 一羧基缩合而成( 图1 1 ) 。研究证明e p l 比a p l 有更强的抑菌活性， 由于a 一多聚赖氨酸有毒性，目前在国际市场上e 一多聚赖氨酸作为食品防腐 剂已经取代了a 一多聚赖氨酸i 鲋。 7 - i 一陋一c 屿一c h 2 一呱一吗一掣一c o l o h 甘陋一c h c o l o h w 2 c h 2 一c h2 一c t t2 一c h2 一n h2 一p la p l 图t - 1e p l 和q p l 的分子结构式 l 1 2 物化性质 具有高抑菌活性e 一聚赖氨酸的分子量在3 6 0 0 - 4 3 0 0 之间，当分子量低于 1 3 0 0 时，e 一聚赖氨酸失去抑菌活性。其没有固定的熔点，2 5 0 。c 以上开始软 化分解；s 一聚赖氨酸易溶于水、乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂： 热稳定性高，1 2 0 。c 女h 热l o m i n 仍具有抑菌活性。对其表征进行红外光谱分析 表明：在1 6 8 0 1 6 4 0 c m l 和1 5 8 0 1 5 2 0 c m 一1 有强吸收峰【3 1 。 卜11 l 1f 。科举拇j 一：j 甄甍呈蕞燕磊墨蓦星塑萎基基塞室里重复蕊曼 aoo 一口 w ”r 一1 a e 聚赖氨酸标准品红外谱图b 一文献中e 一聚赖氨酸的红外。普 幽1 - 2e 一聚赖氨酸红外谱图 1 1 3 生物学性质 e 一聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肤，这种生物防腐剂是8 0 年代初由 = ；= 1 本学者腾井正弘、平木纯等人研制成功的吼e 聚赖氨酸能在人体内分 解为赖氨酸，而赖氨酸是入体必需的八种氨基酸之一，也是世界范围内各国 允许在食品中强化的一种氨基酸。因此e 一聚赖氨酸是一种营养型抑菌和，安 全性高于其他化学抑菌剂，其急性口服毒性为5 9 k g 。e 一聚赖氨酸抑菌谱广， 在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有 一定的抑菌效果，而且其对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用，但在 酸性和碱性条件下抑菌效果不佳阢 。“1i； v 。 、11l v ，f 8 一 $ 8 2 8 p $ e 女a 奎登型塾查兰堡! 竺篁堡奎 表1 - 1 一p l 利n p l 对微生物抑制效果【7 】 1 1 4e 聚赖氨酸的抑菌机理 研究发现，防腐剂主要是抑制微生物的呼吸作用，导致能量物质a t p 和 还原物质n a d h 亏缺，所有合成代谢受阻，活性的动态膜结构不能维持，代 谢方向趋于水解，最后产生细胞自溶。实验表明，天然防腐剂e 一聚赖氨酸对 大肠杆菌的呼吸有一定抑制作用，并与典型的呼吸途径抑制剂存在显著区别。 同时e 聚赖氨酸还作用于生物膜系统和蛋白合成系统，其与核糖体结合抑制 蛋白和酶生物大分子的合成 8 】a 因为生物膜系统是微生物进行能量转化、物 质代谢等生命活动的主要场所，所以e 聚赖氨酸踞留生物膜后，可直接而迅 速地破坏依赖于膜结构完整的能量代谢和细胞及细胞器赖以生存的对物质的 选择性，导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微，土物产生自溶作用，最终导致细胞 死亡。 1 前言 1 2e 一聚赖氨酸的应用 1 2 1s - 聚赖氨酸在食品中的应用 1 2 1 1e 聚赖氨酸在奶制品中的防腐保鲜作用 徐红华等人通过饱和试验设计研究了e 聚赖氨酸和甘氨酸对牛奶的保 鲜作用，结果表明单独使用s 一聚赖氨酸和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者 混合使用的效果。混合使用时其增效随二者用量的增加而增加，但当e 一聚赖 氨酸用量过高时，这种增效作用会有所减弱，其中添加4 2 0 m g ls 。聚赖氨酸 和2 的甘氨酸抑菌效果最佳1 9 。 1 2 。1 。2e - 聚赖氨酸在含淀粉类食品中的防腐保鲜作用 日本学者腾井正弘在米饭中添加0 4 0 6 e 聚赖氨酸醋酸制剂研究 对米饭的防腐作用，结果显示；3 0 * c 培养4 8 h r 后，添加一聚赖氨酸防腐剂 的样品中细菌总数为6 0 x 1 0 3 个鹰，而空白样中细菌总数为3 6 1 0 8 个儋，表 明e 聚赖氨酸的醋酸制剂有明显的抑菌作用 1 0 l 。 1 2 1 3e - 聚赖氨酸在动物性食品中的防腐保鲜作用 将鸡肉、肉类浸渍在溶有0 1 2 e 一聚赖氨酸甘氨酸制剂调味液中，再涂 上面粉用油炸。这种炸鸡在3 0 。c 放置7 2 h r ，经细菌总数检测发现：浸渍过炸 鸡中细菌总数为1 。0 x1 0 4 个g ，而空白样中为1 0 8 个g 以上1 1 0 】。 1 2 2e 一聚赖氨酸在其它领域的应用 e 聚赖氨酸富含阳离子，与带有阴离子的物质有强的静电作用力并且对 生物膜有良好的穿透力，基于这一特性多聚赖氨酸可用于某些药物的载体， 因此在医疗和制药方面得到广泛应用【12 】【埘。将e 一聚赖氨酸与海藻酸盐复合 体做成缓释胶囊的包被膜，通过聚赖氨酸改变海藻酸盐膜的通透性，从而实 现逐步释放内容物的目的。n u s s i n o v i t c h ae t a l 将分子量2 5 0 0 以0 5 0 0 0 d a 的 蛋白质包被于聚赖氨酸海藻酸盐膜内，测定了蛋白质的释放曲线，并与海藻 酸盐膜作了对比，结果证明添加聚赖氨酸实现了膜的缓释功能【1 4 1 。 解放军总医院基础所的科研人员用海藻酸钠一聚赖氨酸一海藻酸钠 ( a p a ) 微囊化牛嗜铬细胞后( b c c ) 注入脊髓蛛网膜下，其对慢性疼痛有 镇痛作用，而且这种a p a 膜具有良好的免疫隔离作用i l ”。h u g u e se t a l 发现 将氨甲嘌呤( 治疗白血病、肿瘤的药物) 与e p l 聚合，能提高药物的疗效1 1 。 聚赖氨酸用于可生物降解的高吸水性材料( s a p ) ，主要用作妇女卫生巾、 婴儿尿片等卫生用品的吸液材料。日本物质工学工业技术研究所用v 射线使 聚赖氢酸交联可得到吸水倍数约2 0 0 倍的s a p l l 7 o 目前基因治疗中目的基因转移的耙向性是研究的难点，这一过程需要基 因转移载体如病毒载体介导和以多聚赖氨酸、月旨质体或阳离子脂质等作为复 天津科技大学硕士学位论文 合载体的一部分来介导基因转移 1 8 3 。s o s p e d r a pe t a l l l 9 佣聚赖氨酸为主链的分 支聚合蛋白搭载生物大分子来治疗肝炎病毒( h a v ) ，取得了良好的疗效。日 本科学家斯波真理子和东京大学教授片冈一则合作研究出了一种高分子材料 载体，它是由化妆品原料聚乙二醇和天然食品保鲜剂聚赖氨酸构成的链条， 长度为2 0 至3 0 纳米，与无毒性病毒大体相当。动物实验结果表明，使用这 种载体提高了药物的安全性。由于聚赖氨酸带正电，容易被带负电的脱氧核 糖核酸所吸附，而且不容易被分解，因而较适合于治疗肝脏疾病1 2 0 1 。 在生物科学研究领域，聚赖氨酸是电融合技术中的有效促融剂。 d i e d e r i c h a n k ee t a l 研究了电脉冲对不同分子量聚赖氨酸修饰的细胞膜的破坏 程度，发现细胞膜吸附高分子量聚赖氨酸会降低其破损临界电压1 2 ”。 g r o e b n e r ue t a l 的研究也发现平均分子量为3 9 7 0 1 3 2 3 0 0 的纳摩尔级浓度的 聚赖氨酸能促进大麦原生质体的电融合率，与葡聚糖相比，是其融合率的2 倍【2 2 1 。 刘德伍、李国辉等人采用多聚赖氨酸为基质的无血清培养基培养人表皮 细胞。结果表明能显著提高表皮细胞的贴壁、集落和膜片形成的速率，同时 对培养表皮细饱的生长无不利影响。这种培养方法明显优于胶原和纤维联接 蛋自的表皮细胞固着，为表皮细胞体外培养技术又提供了一条无血清培养的 途径f 2 3 】。 1 2 3e 聚赖氨酸的商品剂型 1 2 3 1 酒精制剂 以含5 0 一聚赖氨酸的糊精粉末为基础原料，添加3 0 - 7 0 的酒精，主要 用于各种蛋制品。f u j i ia t a l 研究发现，将3 0 无水乙醇或含水乙醇与 聚赖氨酸盐混合能明显抑制酵母生长【2 4 l 。 1 2 3 2 有机酸制剂 添加有机酸如：醋酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸等，添加量为 0 5 。5 。0 。其中e 一聚赖氨酸与醋酸对枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用。主 要用于米饭、饮料、色拉、酱类等食品刚。 1 2 3 3 甘油酯制剂 甘油酯为低级脂肪酸酯，添加量为0 0 1 5 。主要用于含有动物性蛋白、 乳蛋白较多的食品i z 5 1 。 1 2 3 4 甘氨酸制剂 甘氨酸本身就是种抑菌剂，其和e 一聚赖氨酸复合使用，协同抑菌效果 更佳。甘氨酸添加量为0 0 1 1 0 l z ”。 1 前言 1 3e 一聚赖氨酸的生产 1 3 1e 一聚赖氨酸的生物合成途径 葡萄蒋 磷酸妊芾醇式丙酮醯 j ， 丙日醛 革酰乙醚乙酰c o a 山 聂冬氨醚 天冬氨酰磷酸 i 天冬氨醯半醛 二氨基康二醅 j ， 赖氨酸寸 。一泉赖氨醒 e 一聚赖氨醚合成酶 图1 - 3s 一聚赖氨酸司能的生物台成途径 1 3 2e 聚赖氨酸的发酵生产 e 一聚赖氨酸的发酵生产通常采用合成培养基，发酵的p h 值偏酸性，培 养温度为3 0 ，e 聚赖氨酸的产量高低与生物量有正相关性。 s h o is h i m a 和h e c h is a k a i 对一聚赖氨酸产生菌进行了鉴定和发酵研究， 采用不同碳源和氮源做了对比研究，发现以葡萄糖为碳源：无机氨盐和有机 氮为氮源，e 聚赖氨酸的发酵产量最高，为o 4 9 l 。同时对发酵温度、发酵 周期和发酵过程进行了研究1 2 6 。迄今为止e 一聚赖氨酸的微生物发酵在日本已 实现工业化，年销售量为1 0 0 0 吨。但在我国还处于实验室阶段，小试和中试 采用易操作的分批发酵。 目前，e 。聚赖氨酸合成菌株的最高产率为5 0 l 左右，但若要取得更大 的经济效益，还必须对菌株作进一步改良。传统的方法是对出发菌株采用常 规的诱变方法；随着对e p l 合成机理研究的深入和合成酶基因的定位、克 隆和表达，科研人员将采用基因工程手段，构建基因工程菌应用于e p l 的 | 产。 天津科技大学硕 学位论文 1 3 ，3e 一聚赖氨酸的提取精制 e 一聚赖氨酸是一种胞外多肽类物质，提取工艺与胞外酶或蛋白质的提取 基本相似。主要方法有盐析法、有机溶剂萃取法和离子交换法。通常情况下 根据被提取物质的理化和生物学特性选择两种方法结合使用，e 聚赖氨酸采 用离子交换和有机溶剂摹取的方法。 1 , 4 其它均聚赖氨酸简单介绍 聚氨基酸( h o m o g e n e o u sp o l y a m i n oa c i d ) 是指同一种氨基酸单体幽化学 法或微生物法合成的类高分子聚合物。例如e 一聚赖氨酸、y 聚谷氨酸、 聚天冬氨酸、聚鸟氨酸等。目前在美国、同本等发达国家，在食品、化工、 医药、环保等领域均聚氨基酸都得到广泛的应用。 均聚氨基酸有许多优越的特性：抗有机溶剂腐蚀、瞅热、抗逆行性好。 例如日本科学家首先利用聚。l 谷氨酸甲酯合成具有高防水性和透湿性的纤 维布料。聚合氨基酸衍生物有明显的压电效应，天然型聚l 氨基酸和聚 d 一氨基酸的立体结构分别为右旋螺旋体和左旋螺旋体，它们对于相同的剪切 力来i 兑电极化方向相反。因此利用聚合氨基酸这一特性可制造出能改变电流 方向的电予材料。聚氨基酸呈多价念离子，与组织和细胞有良好的相容性， 可出代替非致病性病毒作为基因治疗的载体。聚合氨基酸作为一种生物大 分子具有良好的组织亲和性、消化吸收性，能促进组织修复和细胞生长。例 如聚谷氨酸和聚赖氨酸为水溶性聚氨基酸，抗原性小，可以在聚氨基酸膜上 进行纤维芽细胞粘接和增嫱p “。 1 4 i 聚天冬氨酸( p a s p ) 高分子材料中，可生物降解聚合物的丌发与应用已成为发达国家研究的 热点。聚天冬氨酸( p a s p ) 是近年受海洋动物代谢启发而研制成功的种无 毒、无污染、可降解的化学产品，具有优异的阻垢分散性能和良好的可生物 降解性，优于同类产品聚丙烯酸，是公认的可生物黔解聚合物和水处理剂的 更新换代产品j 。 l o wkc e ta 1 1 2 9 1 对聚天冬氮酸的生物降解性进行了研究，发现将p a s p 调节到p h 9 0 8 0 ，在2 5 的活性污泥中，2 8 天后降解8 3 ，显示了优良的 生物降解性。熊蓉眷等人【3 0 】对生物高分子聚天冬氨酸的合成和阻垢性能进行 了研究。当p a s p 的聚台度在2 0 0 0 3 0 0 0 时，有很强的阻垢性能。在普通馒 水中，p a s p 在2 m 1 用量时，阻垢率已达9 9 8 ，在高钙、高碱、赢p h 值 条件下，对碳酸钙仍具有良好的阻垢效果。 p a s p 的化学合成方法有直接法和削接法。直接法是首先用酶法或发酵法 1 前言 合成出天冬氨酸，然后以天冬氨酸为单体合成p a s p ： 反丁烯= 酸一l 厂天冬氨酸一聚琥珀酰亚胺聚天冬氨酸 问接法是以马来酰胺加热聚合形成中间体，然后中脚体碱解可形成聚天 冬氨酸。目前还未见生物合成聚天冬氨酸的文献报道。 1 4 2y 聚谷氨酸( y p g a ) y 聚谷氨酸( v p g a ) 是由多种杆菌( b a c i l l u ss p e c i e s ) 产生的一种胞 外多肽，其是某些微生物荚膜的主要成分。y ，p g a 具有水溶性和可生物降解 性，由微生物发酵法利用胞内y p g a 合成酶系催化d 。和l _ 谷氨酸通过v 一 谷氨酰胺键连接而成。这种由杆菌产生的胞外多肽一y 一聚谷氨酸与化学合成 的聚谷氨酸在分子结构上有本质的差异，前者的结合键是y 酰基，其可以被 士壤中的微生物分泌的水解酶所分解。经研究表明，y 一聚谷氨酸是一种阴离 子异形肽，分子量约为2 7 1 0 5 d a 。分予中的氢键对y 。聚谷氨酸的高水溶 性起着关键作用。 日本科学家以谷氨酸v 甲基酯为原料，生产合成新型聚合物一兀t c 。这 种聚合物广泛用于皮革制造、纤维产品、食品包装膜等；聚合d 谷氨酸和聚 合l 天冬氨酸，用苯乙烯处理改性可得到高抗碱性的纤维树脂。通过改性再 聚合，可得到比一般天然纤维和化学纤维性能更佳的材料；日本学者通过发 酵法合成并提取v p g a ，经电子束轰击可制成v p g a 树脂，这种新型树脂 为白色粉末，具有极强的吸水性，是纸和尿不湿的五倍。它经吸水饱和后变 成果冻状，可作为粮食种子的理想包衣材料。 此外y p g a 还可作为增稠剂、保湿剂等应用于食品和化妆品行业；作为 蔬菜、水果的防冻剂等应用于农业领域p ”。 1 4 3 多聚鸟氨酸( p l o ) 以多聚鸟氨酸为介导物质的植物遗传转化法是一种全新曹勺基因转化方 法，简称p l o 法。这种方法是利用多聚鸟氨酸这个多价阳离子来改变原生质 体或外源d n a 表面负电荷，使其中之一改变成带f 电荷，从而达到原生质 体和外源d n a 丁e 负相吸，以促进外源d n a 进入到原生质体中。这种方法具 有较高的转化效率，只要是原生质体再生系统已确立的作物都可以利用这种 方法介导外源基因。南相同 3 2 1 等人以大豆幼子叶原生质体为材料，利用多聚 鸟氨姨俾l ，0 ：p o l y l - o m i t h i n e ) 对基因转化进行了研究，大大提高了转化效率。 1 5 生物工业下游技术m 1 1 5 1 生物工业下游技术的工作领域 剥于山生物界自然产生的或由微生物苗体发酵的、动植物细胞组织培养 天津科技大学母h 。学位论文 的、酶反应等各种工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制 目的成分，最终使其成为产品的技术，通常称为下游技术( d o w n s t r e a m p r o c e s s i n g ) ，也称为下游工程或下游加工过程。 由于下游技术是生物技术产品产业化的必经之路，故而越来越受到人们 的重视。很多工业生物技术产品，包括现代发酵工业产品，其质量的优劣、 成本的高低、竞争力的大小，往往与下游技术直接有关。某些基因工程产品， 其提取精制成本甚至占总成本的7 0 9 0 。近2 0 年来，下游技术得到了长 足发展，出现了许多新概念和新技术，有些已经在工业上得到应用，有的虽 然还在研究中，但已经显示出良好的应用前景。8 0 年代以来，生物工业下游 技术进步很快，出现了许多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可将它 们分为以下几类： ( 1 ) 固液分离技术发酵液菌体特别是细菌的分离一直是生物工业上的难 题，近2 0 年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术 引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵 液的分离性能，加之纤维素助滤剂的丌发，大大提高了发酵掖的固液分离效 率。 ( 2 ) 细胞破碎技术细胞破碎是工业化生产胞内物质所必需的技术，已经 丌发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。 ( 3 ) 初步分离纯化技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。 ( 4 ) 高度分离纯化技术7 0 年代猷来，逐步开发出各种色谱( 层析) 技术， 如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交欹色谱和凝胶色谱等，后两种技 术已丌始用于批量生产。 ( 5 ) 其他新型分离技术超临界c 0 2 萃取技术在获驭天然生物物质方面有 着独特的优势，介于反渗透和超滤之| 1 ；i j 的纳米滤( n a n o f i l t r a t i o n ) 技术在生 物工业和水处理中有着广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技本及反胶团 技术的研究和应用开发也相继取得了很大进展。 1 5 2 生物工业下游技术的一般工艺过程 出于工业生物技术产品众多，原料广泛，产品性质多样，用途各异，因 而分离、提取、精制的技术，生产工艺及相关装备也是多种多样的。根掘不 同的对象，可采用在生物工业中行之有效的化工单元操作技术，电可采用生 物工业中特商的下游新技术。 按生产过程划分，生物工业下游技术大致可分为4 个阶段，即预处理、 提取( 初步分离) 、精制( 高度纯化) 、产品制作。 ( 1 ) 预处理的固液分离主要技术有过滤和离心。固液分离以除去发酵液 1 前言 中的不溶性固形物杂质和菌体细胞。过滤和离心相比，无论是投资费用还是 运转费用，荫者都要小的多，因而首选方法应是过滤。 ( 2 ) 提取( 初步分离) 目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道 精制工序创造有利条件。提取操作中，通常是目的产物要求有较大浓缩比的 过程，可选技术也比较大。 ( 3 ) 精制( 高度纯化) 目的是除去与产物的物理化学性质比较接近的杂 质。通常采用对产物有高度选择性的技术，如色谱分离技术常被使用。结晶 特别是重结晶通常也能获得纯度高的产物。 ( 4 ) 成品制作成品形式与产品的最终用途有关，有液态产品也有固态产 品，美观的产品形态也是产品档次的一个标志。 生物反应的产物一般是由细胞、游离的细胞外代谢产物、细胞内代谢产 物、残存底物及惰性组分组成的混合液，生物下游加工过程所应用的分离纯 化技术取决于产物所存在的位蚤( 细胞内或细胞外) 及产物分子的大小、电 荷形式和溶解度等。 下游加工过程的一般流程 注：( ) 内为主要的分离纯化方法 幽1 4 下游加i ：过群的一般流挥 勰粉 附、离子交换) 上图是通过细胞培养生产生物物质的下游加工过程的一般流程。首先， 将绌胞与培养液分离丌来。当目的产物存在于细胞内( 胞内产物) 时，需首 先利用细胞破碎等方法将目的产物释放到液相中，除去细胞碎片后进行一系 列粗分离和纯化操作( 路线l a ) ；如果胞内目的产物以包含体( i n c l u s i o nb o d i e s ， i b s ) 形式存在的蛋白质，则需利用变形剂溶解包含体后通过除去变形剂等方 法使蛋白质复性( r e f o d i n g ) ( 路线l b ) 。当1 7 1 的产物为胞外产物，即在细胞培 1 0 奎堡型丝查竺竺圭竺篁堕兰 养液中已分泌到培养液中，则除去细胞后直接对培养上清液进行一系列浓缩、 分离和纯化，得到定纯度的目的产物溶液( 路线2 ) 。最后经过脱盐、浓缩、 结晶和干燥处理，得到最终产品。 可以看出，为了得到一定纯度的生物产品，下游, d h i 过程需要采用多种 方法，实行多步分离操作。 由于处理对象的广泛性，下游技术正向多样性方向扩展，r 6 深度和广度 延伸。这就要求从事生物工业下游技术的科技人员具有相当的化学、物理、 物理化学和生物学基础和较宽的工程技术知识面。科学技术具有丌放性和包 容性，需要不断吸收各行各业的新技术、新概念、新知识来发展生物工业下 游技术。 1 5 3 生物工业下游技术的发展 下游技术的进步，推动了生物技术产业化的进程。社会需要催生着新的 生物技术产品的登场，许多新的生物技术产品的出现与新分离方法的丌发有 关，新分离方法的丌发又导致新原理的发现，新原理的发现又促进了新材料 的开发。社会发展过程中，总是追求以最小的代价( 入力、财力、物力) 获 得最大的产出，生物工业电不例外。生物技术产品在国内或国际市场上的竞 争优势最终还是体现在低成本、高质量和无( 少) 污染上。成本、质量、环 境保护将是生物工业下游技术永久性的发展方向和推动力。 1 s 3 1 传统分离技术的提高和完善 蒸馏、蒸发、过滤、离心、结晶和离子交换等传统技术由于应用面，“相 对成熟，对他们的提高和完善将会推动大范围的技术进步。如8 0 年代酒精差 压( 多效) 蒸馏技术工业应用的成功，大幅度降低了成品酒精的能耗，为进 一步提高酒精质量扣一f 了技术基础；结合蒸汽喷射热泵的四效甚至七效蒸发 技术大幅度节能并为废水处理技术作出贡献，也促进了计算机控制技术和生 物工业的结合；各种新型高效的过滤和离心机械的问世，也从一个侧面推动 生物工业向更大规模方向发展。结晶理沧和离子交换技术的新发展，提高了 产品的收率、质量和生产效率。可见，适合于规模化工业化生产的传统技术 经过改造提高后，适应面会更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。 1 5 3 2 新技术的研究和开发 ( j ) 新型分离介质的研究丌发 膜、树脂和凝胶是目前主要的新型分离介质。 从半渗透膜丌始，膜技术已经逐步发展为一个庞大的膜家族。其中膜材 料和膜制造i ，艺是技术关键。离子交换树脂和大网格吸附树脂是一大类重要 的分离介质，在工业分离上已占有重要地位，在生物j l2 业下游技术领域的应 用也日趋广泛，并不断出现新型树脂和新技术。 色谱分离是有机化学和生物化学中大分子分离的一项十分重要的分离技 术，属精细分离。d n a 重组技术和其它生物技术产品的产业化促进了色谱分 离技术的大发展，逐渐从实验室走向工业规模，目前已成为生物分离技术研 究前沿。 ( 2 ) 子代分离技术 各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技 术和萃取、蒸馏、蒸发技术想结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏技术和渗透蒸 发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成离子交换色谱、等电聚焦色谱 等。它们具有高度的选择性和分离效率。 ( 3 ) 其他新兴下游技术 由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临 界c 0 2 萃取、反胶团萃取。它们在细胞碎片的去除，细胞胞内物质、酶及蛋 白质天然生物物质的提取分离方面有独特的优势，在生物工业上具有广阔的 应用前景。菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌 体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。 1 5 3 3 清洁生产 清洁生产( c l e a n e rp r o d u c t i o n ) 是指将综合预防的环境保护策略持续应 用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。它包括三方面内容， 即清洁生产工艺( 技术) 、清洁产品、清洁能源。清洁生产工艺是生产全过程 控制工艺，包括节约原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全部排放物 和废物离开生产过程以前，尽最大可能减少它们的排放量和毒性，对必须排 放的污染物实行综合利用，使废物资源化。 尽管清洁生产研究尚属起步阶段，在技术和理论上尚未完善，但它的重 要性已日显突出。 1 9 8 0 年前后，世界主要发达国家先后实旌生物技术发展计划，8 0 年代以 后，生物技术产业以日新月异的步伐迅速发展，特别是在与医药、食品、食 品添加剂以及化妆品等有关的生物产物生产方面，不仅产品种类繁多，而且 数量也不断增长。毫无疑问，导致生物技术产业迅速发展的主要原因是：基 因工程和细胞融合等现代生物技术的惊人进步，使天然存在的极微量有用生 物物质得以通过大量细胞( 微生物、动物及植物细胞) 培养进行商业规模生 产。此外，生物产物从原料( 培养液或细胞) 生产到产品的后处理技术( 分 离纯化技术) 的发展，使低成本、高收率、纯化目的产物成为现实。由于生 物技术产品大多数是与人类生活密切相关的物质，对有害物质有严格的控制， 天津科技大学硕：i 一学位论文 生产过程也要求有严格的管理，在最终产品中往往不允许极微量的有害杂质 存在，这使生物产物的分离纯化过程在整个生产过程中显得极为重要。 2 原理、材料和方法 2 原理、材料和方法 2 1 离子交换原理j 离子交换技术长期以来用于水的处理、食品、生物制品的提取精制及金 属的回收。在生物工业中，离子交换广泛用于氨基酸、有机酸、抗生素等工 业，尤其是在抗生素工业中，将发酵液中的抗生素通过离子交换的方法结合 在离子交换树脂上，然后在适当的条件下洗脱下来，这样可以使目的分子从 大量的溶液中浓缩到一个小的体积内，体积缩减到原液的几十分之一，同时 杂质分子液大量的被除去，得到纯度较高的抗生素。用离子交换法分离提纯 各种生物活性代谢物质具有成本低，工艺操作方便，提炼效率较高，设备结 构简单，以及节约大量的有机溶液等优点【”】。离子交换法也有缺点，首先是 不定能找到合适的树脂，其次是生产周期长，生产过程中p h 值变化较大。 离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子材料。它的 化学稳定性良好，且有一定孔隙度。其巨大的分子可以分成两部分：一部分 是不能移动的，多价的高分子基团，构成树脂的骨架，使树脂具有上述的溶 解度和化学稳定的性质；另一部分是可移动的离子，称为活性离子，它在树 脂的骨架中进进出出，就发生离子交换反应现象。或者说，离子交换树脂是 一类带有官能团的网状结构的高分子化合物，其结构由三部分组成：不溶性 的三维空间网状骨架，连接在骨架上的官能团和官能团所带的相反电荷的可 交换离子。当树脂浸在水溶液中时，活性离子因热运动，可在树脂周围的一 定距离内运动。树脂内部有许多空隙，由于内部和外部溶液的浓度不相等( 通 常是内部浓度较高) ，存在渗透压，外部水分可渗入内部，这样就促使树脂体 积膨胀。把树脂骨架看作是一个有弹性的物质，当树脂体积增大时，骨架的 弹性也随着增加，当弹力大到和渗透压达到平衡时，树脂体积就不再增大。 骨架上的活性离子在水溶液中发生离解，可在较大范围内自由移动，扩散到 溶液中。同时，在溶液中的同类型离子，也能从溶液中扩散到骨架的网格或 孔内。当这两种离子浓度差较大时，就产生一种交换的推动力，使它们之间 产生交换作用，浓度差越大，交换速度越快。利用这种浓度差的推动力使树 脂上的可交换离子发生可逆交换反应。离子树脂的交换反应与溶液中的置换 反应相似。离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与交换剂之间的结合力的 差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与交换剂的结合力是可逆的，在一 定的条件下能够结合，条件改变之后又可以被释放出来。 天津科技大学硕士学位论文 2 2 离子交换过程的理论基础 2 2 1 离子交换平衡 离子交换反应是可逆反应，但是，这种可逆反应并不是在均相溶液中进 行的，而是在固态的树脂和水溶液接触的界面间发生的f 3 6 。 雕i i - j 冀爷i 降 “m 。卜m ： ”：i 。“2 蠢 8 卜”i p s o ： n 8 u “：巴 图2 - i 离子交换反应的界面过程 在水溶液中，离子交换是由于树脂上的官能团b + 与溶液中的同类型离子 a + 之间的浓度差推动着他们之间的交换，当这种交换反应进行到一定程度时， 就建立了离子交换平衡状态，使树腊和溶液中都同时含有a + 和b + 两种离子。 一般公认离子交换过程是按照化学物质的量关系进行。例如阳离子交换 过程可表示为： a 叶+ 1 i ( r s 0 3 一) b +营n b + + ( r s 0 3 一) n a 叶 如果把离子交换反应看作是简单的化学反应，则可以按照质量作用定律， 用反应平衡关系来描述上式的反应： k b 8 = ( ob ) “( or n a ) ( oa ) ( or b ) “ aa 和a b 一表示溶液中离子a 和b 的活度 。r n a 。r b 一表示离子a 和b 在树脂内的相应活度 k b a _ 选择系数，它的大小取决于实验条件 k b “不是一个常数，为了计算方便，实际中通常将其看作平衡常数。 对于稀溶液，离子的活度系数可以看作为1 ，因此，式中的an 和ab 可 用相应的摩尔浓度 a n + 】和【b + 1 来表示。而树脂内的离子浓度较高，活度可用 相应的离子摩尔分数x i 与活度系数f i 的乘积来代替。则： k b 8 = b 十 ( x r n a ) f a 。a a ” ( x r b ) “( f r b ) “ 令 b + ( x r 。) = k 0 a ” i ( x r b ) “ 则：k o = k b a ( f r b ) ” f r n a a 吖 a a d “ 坩 吲 旧- 主 o 2 原理、材料和方法 式中k 0 为表观平衡常数，可由实验确定。k 0 也不是一个严格的常数，但 它可用于确定各个离子可以交换到何种程度，估计从溶液中除去某一数量的 离子所需要的树脂量。 2 2 2 离子交换选择性 3 7 1 在实际应用中，溶液中常常存在很多离子，离子交换树脂能否将所需离 子从溶液中吸附出或将杂质离子全部( 或大部分) 吸附住，具有更大的实际 意义。这就要研究离子交换树脂的选择吸附性，即选择性。离子交换树脂和 离子间的亲和力越大，就越容易吸附，树脂的选择性集中在交换常数k 的数 值上。l i a b 越大，离子交换树脂对b 离子的选择性越大( 相对于a 离子而言) ； 反之，k | a 8 a 1 3 + c a 2 + m 9 2 + n + 常见的阴离子的被吸附顺序为： 柠檬酸根 硫酸根 硝酸根 ( 2 ) 溶液浓度的影响 树脂对离子交换吸附的选择性，在稀溶液中比较大，而在浓溶液中选择 性较小，因此可将溶液稀释，树脂选择性吸附高价离子。 ( 3 ) 离子的水化半径 树脂在水溶液中要发生水化，所以原子量的大小并不能反映离子在水溶 液中的体积。离子在水溶液中的大小应用水化半径来表征。水化半径较小的 离子优先吸附。依水化半径的次序，可将各种离子对树脂的亲和力大小排成 下列顺序。 一价阳离子l i + n a + n h 4 + r b + c s + a g + t i + 二价阳离子m 9 2 + z n 2 + c u 2 + n i 2 + c a 2 + s r 2 + p b 2 + b a 2 + 一价阴离子f 一 h c 0 3 。 c 1 一 h s 0 3 一 b r 一 n 0 3 9 的溶液中操作) 。 选择合适的操作条件：交换时的p h 。合适的p h 值应具备3 个条件：p h 值应在产物的稳定范围内；使产物离子化：使树脂能解离。树脂的型式。 对酸性树脂可以用氢型或钠型，对碱性树脂可以用羟型或氯型。般蜕来， 对弱酸性和弱碱性树脂，为使树脂能离子化，应采用钠型或氯型，而对强酸性 和强碱性树脂，可以采用任何形式；但如产物在酸性、碱性条件下易破坏， 则不宜采用氢型或羟型树脂。溶液中产物浓度。低价离子增加浓度有利于 交换上树脂，高价离子在稀释时溶液被吸附。洗脱条件。沈脱条件应尽量 使溶液中被洗脱离子的浓度降低。洗脱条件一般应和吸附条件相反。如吸附 在酸性下进行，解吸应该碱性下进行；如吸附在碱性下进行，解吸应在酸性 下进行。为馒在解吸过程中，p h 变化不致过大，有时宜选用缓冲液做洗脱剂， 如果单凭p h 变化洗不下来时，可以试用有机溶剂，选择有机溶剂的原则是： 能和水混合，且对产物溶解度较大。 2 4 生化用离子交换刺的特点 生化分离体系复杂，大分子受微环境影响较大，构象易变，因此分离活性 大