（工业催化专业论文）玉米蛋白水解制取玉米肽的研究.pdf

大连理一亡大学硕士学位论文 摘要 玉米蛋白( c o r ng l u t e nm e a l ) 水溶性差，组成复杂，口感粗糙，严重影响了其在食 品中的应用。玉米肽是玉米蛋白经酶促水解后形成的一定分子量范围的多肽混合物。玉 米肽不仅具有良好的溶解性、流动性、热稳定性，而且其粘度低、浓度高，在体内吸收 快、利用率高等优点。当其变成分子量更小的二肽、三肽时还可以释放出抗氧化性、消 除疲劳、降低血氨浓度、降血压、促进乙醇代谢等独特的生理活性。 本文主要对玉米蛋自在酸性条件进行酶解研究，提出一种特殊的高效乳化剪切预处 理和高活力酸性蛋白酶酶解相结合的方法。应用此方法反应水解度高，水解物平均分子 量低，而且不产生盐类。 通过单因素试验及正交实验的考察，确定了反应一小时玉米蛋白粉水解的最佳条 件，即：底物浓度为8 0 l ，酶与底物比为1 0 ，反应温度6 0 。c 。实验中采用的酸性蛋 白酶在较高温度下，长时间反应会变性失活，最终确定反应温度为5 0 。玉米蛋白粉原 料通过在7 0 0 0 r p m 高速剪切乳化1 h ，其颗粒度从4 2 0 p r o 降到1 0 m 左右。在最佳反应条 件下，高活力酸性蛋白酶在不加碱、p h 变化情况下水解2 4 h ，玉米虽白粉的水解度和降 解率分别达到5 8 6 4 和7 0 1 9 。7 8 的水解产物分子量分布在1 0 0 0 道尔顿以下，极大 改善了玉米蛋白粉的水不溶性。通过高效液相色谱分析水解物的氨基酸组成，发现高速 剪切乳化不影响水解产物中氨基酸的组成，水解物含有8 种人体必需的氨基酸，且随着 水解时间的延长，氨基酸逐渐增加。 关键词：玉米肽；酸性蛋白酶：预处理 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 t h e p r e p a r a t i o no f c o r np e p t i d eb yc o r np r o t e i ne n z y m o l y s i s a b s t r a c t c o m g l u t e nm e a l ( c g m ) i sd i f f i c u l tt od i s s o l v ei nw a t e r b e c a u s eo fi t sc o m p l i c a t e d c o m p o s i t i o na n dc o a r s em o u t h f e e l ，i t sa p p l i c a t i o ni nf o o di s a f f e c t e ds e r i o u s l y t h ec o r n p e p t i d eg e t n o to n l yh a v et h eg o o dd e l i q u e s c e n c e ，l i q u i d i t y ，h o ts t a b i l i t y ，b u th a v el o w v i s c o s i t y ，h i g hd e n s i t y ，a b s o r b i n gi nt h eb o d yq u i c k l ya n dh i g h l yu t i l i z a t i o n w h e ni t b e c o m e st h es m a l l e rm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d el i k ed i p e p t i d ea n dt r i p e p t i d e ，i tc a na l s or e l e a s e s o m ee x c e l l e n tp r o p e r t i e ss u c ha sa n t i o x i d a t i o n ，t h er e m o v i n gt h ef a t i g u e ，t h el o w e rb l o o d a m m o n i ad e n s i t y ，d e c l i n i n gt h eb l o o dp r e s s u r ea n dp r o m o t i n gt h ee l c o h o lm e t a b o l i z a t i o n i nt h i sp a p e rt h ef e a s i b i l i t yo f m a k ec o r r lp e p t i d e sf r o mh y d r o l y s i so f c o r ng l u t e nm e a lb y s p e c i a lh i g h s p e e de m u l s i f i c a t i o np r e t r e a t m e n ta n dh i g he f f i c i e n c ya c i d i cp r o t e a s ei na c i d i c s i t u a t i o nh a sb e e ns t u d i e d t h ep r o d u c tp r e p a r e dw i t ht h i sm e t h o dh a sh i g hd e g e eo f h y d r o l y z i n ga n dm o r eo l i g o p e p t i d e s m o r e o v e rt h i sm e t h o dh a st h ee f f e c to fd e s a l t i n g t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m u mh y d r o l y z i n g c o n d i t i o n si no n eh o u r h a v e b e e nd e t e r m i n e d ：c o n c e n t r a t i o ni s8 0 9 1 ，r a t i oo f p r o t e a s e s u b s t r a t e i s1 0 ，t e m p e r a t u r e i s6 0 c t h ea c i d i cp r o t e a s e w i l l l o s e i t se f f e c t t h r o u g h t h el o n gt i m er e a c t i o ni nh i g ht e m p e r a t u r e ，s ow ec h o o s e5 0 砒l a s t r e s u l t ss h o wt h a t ，u n d e r t h ea c t i o no fe m u l s i f i c a t i o ne q m p m e n ta t7 0 0 0r p mf o ro n eh o u r ，t h ea v e r a g ep a r t i c l es i z eo f c g mc a nb ed e c r e a s e df r o m4 2 0 “mt oa p p r o x i m a t e l y1o p m u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h e d e g r a d a t i o np e r c e n t a g eo f t h ec o r ng l u t e nm e a lc a nr e a c h7 0 1 9 ，w h i l et h eh y d r o l y s i sd e g r e e c a l lr e a c h5 8 6 4 a f t e rh y d r o l y z i n g2 4 h 7 8 o f t h ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h ta r eb e l o w l 0 0 0 d a l t o n ，t h es o l u b i l i t yi nw a t e ri si m p r o v e d t h r o u g ha n a l y z i n ga m i n oa c i d sc o n s t i t u t i o nb y h p l c ，e m u l s i f i c a t i o np r e t r e a t m e n th a v en oe f f e c to nt h ea m i n oa c i d sc o m p o s i t i o no ft h e p r o d u c t ，a m i n oa c i d sa r eg r o w i n gw i t hh y d r o l y s i st i m e ，e i g h tk i n d so fa m i n oa c i d so ft h o s e a r en e c e s s a r yf o rp e o p l e k e yw o r d s ：c o r np e p t i d e a c i d i cp r o t e a s e ；p r o t r e a t m e n t 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均己在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：之选莓日期：2 ：2 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名：壶丝堑 导师签名 耸盟 大连理工大学硕士学位论文 引言 玉米是人类加工利用最多的禾谷类作物。据报道，玉米深加工产品的种类超过3 0 0 0 多种。美国年产玉米达2 亿多吨，有6 - - 7 用于工业加工，其中4 4 用于酒精工业，5 3 用于淀粉工业。9 0 年代以来，我国玉米生产发展迅速，现在年产量超过i 亿吨。玉米加 工业也初具规模，年产淀粉3 8 0 万吨，发酵法生产酒精也占有一定比例。但同发达国家 相比。尤其同美国的差距还相当大。主要表现为：加工工艺落后：加工品种专； 加工深度不够；总产量不高，经济效益低等。因此在我国种植业产业结构调整的今 天，必须加快玉米深加工业的发展。 在美国玉米原材料的利用率可达9 8 - - 9 9 ，但是在我国玉米加工主要是提取淀粉， 只利用了玉米的5 0 一6 0 作为商品淀粉，其余的大部分以粗饲料或者当作“三废”处理 和排放，不仅经济效益低，极大浪费了资源，而且造成了环境污染。对玉米进行深加工 和再次利用是发展食品工业和蛋白工业之急需，也是农业产业化之急需；在以玉米为原 料的工业企业中，实行食品和饲料的联产，可以更好的提高玉米的经济效益，带动玉米 生产的发展。 玉米淀粉生产中提取淀粉后的主要副产物称为玉米面筋粉( c g m ，俗称玉米渣) ， 它是玉米蛋白的一种常见形式。c g m 含有蛋白质约6 0 ，其中玉米醇溶蛋白约占6 8 ，谷 蛋白约占2 8 ，同时含有少量的球蛋白和白蛋白。玉米蛋白粉水解后可得到多种氨基酸， 其中人体必需氨基酸的含量高于大豆和小麦，这些氨基酸通过生物工程加工，可获得具 有多种生理功能的活性肽。玉米肽不仅具有良好的溶解性、流动性、热稳定性，而且其 粘度低、浓度高，在体内吸收快、利用率高等优点。玉米蛋白经过酶水解后，变成分子 量较小的肽还可以释放出抗氧化性、消除疲劳、降低血氨浓度、降血压、促进乙醇代谢 等独特的生理活性。玉米肽的开发成功将会对玉米深加工业产生重大影响，也将为人们 的健康提供一个良好的新食物源，是种比较理想的新型玉米深加工产品。由于该产品 的应用范围很广，市场开发潜力很大，因此，潜藏着巨大的商机和很好的经济效益。 目前，在我国市场上玉米肽在食品工业中的应用还很少，这主要是因为玉米蛋白 中的醇溶蛋白有大区域的a 一螺旋结构，n 末端有很强的疏水性，是高憎水蛋白，它只溶 于异丙酮或乙醇水溶液中：而谷蛋白只溶于碱水溶液中。因此，玉米蛋白与其他的商业化 蛋白资源相比，食品功能特性差。在通常条件下，蛋白质只有处于溶解状态时，才能表 现良好的功能特性，才具有实用性。为了提高玉米蛋白粉的水溶性，就必须通过改变其 结构，达到改善其功能性质的目的。其次，酶解生产工艺中的一些难题也是制约其应用 的一个主要原因。在酶解玉米蛋白的过程中，近年来的研究大都是在水解的过程中外加 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 碱维持一定p h ，在碱性环境下酶解以得到较高的水解度，这样就不可避免的引入了盐类 杂质，而脱盐又是一个高能耗的步骤。 为了解决以上两个问题，我们开展了对玉米蛋白进行酶解的研究，通过高活力酸性 蛋白酶酶解和高速剪切预处理相结合的方法，在不外加碱p h 渐变条件下，对玉米蛋白 进行水解制备玉米活性肽得到一些有价值的试验结果。 大连理工大学硕士学位论文 1 文献综述 传统营养学观点认为蛋白质营养就是氨基酸营养，动物对蛋白质的需要即是对必需 氨基酸的需要。也就是说到达胃肠道的蛋白质必须水解成游离的氨基酸后才能被机体吸 收利用。但是当动物喂以按理想氨基酸模式配制的纯合日粮或低蛋白质氨基酸平衡曰粮 时，并不能获得最佳的生长效果。因此，一些学者提出了动物对完整蛋白质本身或对 肽有着特殊需要的观点，肽在蛋白质营养中的作用也越来越受到重视。近年来的研究表 明蛋白质在动物消化道中，在消化酶作用下的水解终产物大部分是2 或3 个氨基酸残基组 成的小肽，它们以完整形式被吸收进入循环系统从而被组织利用。之后，小肽的i 型 载体和i i 型载体分别被克隆。至此，小肽能被完整吸收的观点才为人们所接受。肽营 养作用的另一新认识是蛋白质在酶解过程中可以产生一些具有特殊生理功能的生物活 性肽( b i o a c t i v ep e t i d e s ，b a p s ) 。这些生物活性肽在调节胃肠道运动、调节免疫系统、抗 高血压、抗菌、抗血栓、抗病毒、抗癌、清除自由基和促进矿物元素吸收等方面发挥着 重要作用。【1 】 1 1 肽的定义 2 0 世纪初，科学家开始关注一类由氨基酸组成、比蛋白质小、结构简单、生理活性 强的物质，它们与蛋白质没有本质的区别，但又不同于蛋白质，于是把这类物质称做肽 或多肽。多肽最早的商业应用是从牛或猪的胰腺中分离提取胰岛素( 5 1 个氨基酸组成的 多肽) ，它的出现拯救或延长了全世界糖尿病人的生命。这是由于多肽这类生物活性物 质是生命活动重要的参与者，它影响和调节着细胞与细胞、组织与组织间的生理活动， 并且反馈着细胞与组织的化学反应信息。功能肽是由氨基酸构成，活性高，在极微量的 使用下，都能发挥作用。它们在人体内被利用后迅速地被代谢，最终变为氨基酸或水， 无残留，无副作用。所以，很早以前科学家就想把它们应用到人们的日常饮食中，作为 营养补充剂和功能因子，用以影响或改善人们的营养代谢、脂肪代谢、糖代谢、调节神 经系统等u j 。 1 2 多肽、低聚肽和小肽 肽为氨基酸的短序列，当氨基酸的残基达到5 0 个以上就可以称作蛋白质。5 0 个以 下，1 0 个以上的氨基酸组成的为多肽，1 0 氨基酸残基以下，特别是3 - 9 个氨基酸聚合 而成的肽通常叫低聚肽，比低聚肽聚合度更小的就是二肽或三肽。目前发现的许多生物 活性肽都属于低聚肽。低聚肽虽然聚合的氨基酸数量少，却能形成高级结构发挥作用， 但关于低聚肽高级结构与生理功能关系的研究很少。很多研究表明，蛋白质在人体内更 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 多的是以小肽( s m a l lp e p t i d e s ，s p ) ，g o - - 肽与三肽的形式进行吸收，在肠道，小肽可直 接与肠内壁的肽载体结合进行主动转运。近年来的研究也表明，蛋白质经过消化道酶水 解后成为小肽，小肽以完整形式被吸收而进入循环系统。肽载体对底物具有广泛的适应 性，几乎能够以所有的二肽、三肽作为底物，肽载体对疏水性、侧链体积大的底物具有 很高的亲和力，而对亲水性、带电荷的小肽亲和力较小。氨基酸由于具有较高的渗透压， 其吸收速度和效率反而不及小肽，而且氨基酸载体易饱和、吸收耗能也较高。 饲料( 食物) 蛋白源生物活性肽的发现，突破了饲料( 食物) 蛋白仅限于提供氨基 酸和能量的旧概念，展示了饲料( 食物) 蛋白潜在的信息功能或者说蛋白质的第三功能。 饲料( 食物) 蛋白生物活性肽的发现改变了过去对蛋白质营养功能的单纯评价。提示人 们在评价蛋白质的生物学价值时必须考虑到蛋白质的结构及其在消化道中可能释放出 生物活性肽的组成和种类【3 7 】。 动物对蛋白质的利用中，小肽吸收机制起着很重要的作用。这种机制使得氨基酸的 吸收比降解为游离氨基酸再吸收更快，从而提高了动物对蛋白质的利用率。不仅如此， 它们可能还以生物活性肽的形式参与机体的生理功能和代谢调节。因此，蛋白质营养价 值的评价不仅要考虑其氨基酸的组成和数量，还要考虑它们在消化过程中肽的释放和其 生物活性作用。小肽是有别于单个氨基酸营养作用的重要蛋白质中间消化产物。川 1 3 玉米蛋白粉的应用现状 1 3 1 概念 玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副产物，它是由玉米籽粒经湿磨法工艺制得的粗淀 粉乳经淀粉分离机分出的蛋白质即麸质水，用浓缩离心机或沉淀池浓缩后，再经脱水干 燥制成，俗称黄粉子。 1 3 。2 应用现状 由于玉米蛋白粉水溶性差，且赖氨酸和色氨酸较缺乏，严重限制了它在食品工业中的 应用。目前，玉米蛋白粉在国内主要将它用于饲料工业或排放掉，这既浪费了宝贵的粮食 资源，又造成了对环境的污染。表l 是对玉米蛋白粉和大豆粉中必须氨基酸含量的比较。 玉米肽中谷氨酸的含量最高，这是谷类蛋白质的共性，但与大豆、小麦、酪蛋白等蛋白 质所含的氨基酸相比，亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸以及丙氨酸含量较高，而人体需氨 基酸中的赖氨酸和色氨酸含量较少。不过，可以通过与大豆蛋白互补利用相互提高营养 价值。 大连理工大学硕士学位论文 表】，】两种原料必需氨基酸含量对照表( 占总蛋白) 【8 】 t a b 1 1c o n t e n t o ft w o k i n d so fr a w m a t e r i a l se s s e n t i a la m i o na c i d s ( o c c u p y t h e t o t a l p r o t e i n ) 1 4 玉米肽的制备 通过水解方法提高蛋白食品的加工性能、营养性以及释放出生理保健功能已经受到 广泛重视。经过水解的蛋白一般都能增加其在水中的溶解度，降低粘度，增加流动性， 热稳定性，易被人体吸收，降低食品的抗原性。一些原来隐藏于蛋白质分子内部的具有 特定氨基酸序列的肽段被释放出来，形成具有各种不同生理活性的小肽分子1 9 l 。例如酶 解玉米蛋白、大豆蛋白及酪蛋白可以释放出抗高血压活性的小肽1 1 0 2 】；用胃蛋白酶等 水解动物乳清蛋白可得到具有抗菌作用的活性肽【b 等等。 制备蛋白水解物的工艺包括预处理、水解、脱苦、脱色、脱盐、浓缩及干燥等步骤。 其中，水解步骤最为重要。 1 4 1 原料的选择 玉米蛋白质中含有高比例的亮氨酸、异亮氨酸、撷氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸和 脯氨酸、谷氨酸等，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸，这种独特的氨基酸组成使玉米蛋白 水溶性差，营养价值不高，而这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白质成为多种生理活性 肽的来源【”l ，降压肽、抗疲劳肽、醒酒肽等。一般，国外均用玉米醇溶蛋白o 51 6 l 做原 料生产活性肽，但考虑到玉米蛋白粉中含有6 8 左右的醇溶蛋白，所以以玉米蛋白粉为 原料制备玉米肽能降低生产成本，同时变废为宝，大大提高玉米蛋白粉的附加值和对玉 米资源的综合利用率。 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 表1 2 玉米蛋白粉与玉米醇溶蛋白的氨基酸含量【7 1 t a b l e1 2a m i n oa c i d ec o m p o s i t i o no f c o r ng l u t e nm e a la n dz e i n 表1 2 对玉米蛋白和玉米醇溶蛋白中的氨基酸含量进行了比较，由表1 2 可以看出， 玉米蛋白中的赖氨酸和色氨酸含量较低，为其限制性氨基酸，但支链氨基酸和中性氨基 酸含量都相当高，是植物蛋白中颇少见的特色组成。 1 4 2 蛋白水解前的预处理方式 天然玉米蛋白分子具有紧密的立体结构，由于氢键、疏水键、二硫键等作用，使肽 链卷曲于蛋白分子内部近似于球状，很难被蛋白酶水解【8 】，如图1 1 ( a ) 所示，因此必须 对其进行预处理，破坏玉米蛋白质的二、三级或四级结构，打开氢键、二硫键及疏水键， 使之变成无秩序的肽链状态( 即完全变性状态) 如图1 1 ( b ) 所示，那些原来在分子内部 包藏而易与酶发生作用的部位，由于分子结构松散而暴露出来，从而使蛋白水解酶的作 用点大大增加，提高了酶解速度，可见预处理对其后水解至关重要。 大连理工大学硕士学位论文 蛋白变性方法有很多，包括添加亚硫酸钠、加热、添加乙醇等方法。其中热处理由 于具有经济、设备投资少，且经热变性的蛋白质不易回复等特点而倍受青睐。在酶解玉 米蛋白时，必须采取适当的加热方式来破坏蛋白紧密结构，从而提高水解速度，但不能 加热过度，否则就会象图1 1 ( c ) 那样，松散的多肽链又会由于s s 键和疏水键的再生而重 新结合得更加紧密，这样反而阻碍了酶对蛋白的水解作用。 彩霭 图1 1 ( a ) 未变性蛋白质图1 1 ( b ) - - 硫键断裂图1 1 ( c ) s s 键组合 高速剪切乳化处理是本文探索的一种新的对玉米蛋白预处理的方法。它利用高速剪 切乳化机在精密配合的转子及定子作用下，产生强力的剪切力、液力冲击、涡流撕裂， 可以使物料瞬间达到无与伦比的均质细化，将固体颗粒均匀分散在液体溶剂的方法。乳 化可以使分子内部高度规则的空间结构被一定程度破坏，部分氢键、范德华力、离子键 等次级键断裂，肽链一定程度松散，物料产生一定的膨化部分蛋白质分子发生了定向的 再结合，形成多孔的蛋白结构【2 0 1 ，这种结构的变化有利于蛋白酶的水解作用。 1 4 3 玉米蛋白的水解方式 水解蛋白质的反应式1 1 如下 2 1 - 2 4 1 ： 一c y ( 1 1 ) 4 o 玉米蛋白水解物的生产方式主要有化学降解法和酶降解法。化学法是利用酸碱水解 蛋白，虽简单价廉，但由于反应条件剧烈，生产过程中氨基酸受损严重，使l 一氨基酸 形成d 一氨基酸，并能形成像l y s a l a 这样的有毒物质，且难以按规定的水解程度控制水 解，故较少采用；而酶法水解能在温和的条件下进行，能在一定条件下进行定位水解分 裂产生特定的肽，且易于控制水解程度，因而能较好的满足肽的生产需要。反应产物较 n小 h o o i j c 一 h i c i r n l h x 生 y c 0 0 ： 一 r l c j h n | h 一 0 i 8 hl卜j耻 一 n i h 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 之原料蛋白与相同组成氨基酸具有特殊的理化性能与生理功能，成为蛋白制品的发展方 向。 在生产蛋白水解物中酶的选择是关键，它不仅影响最后产品的得率、反应速度，而 且直接影响产品的风味和理化特性。蛋白质水解酶来源于植物( 木瓜蛋白酶，菠萝蛋白 酶、无花果蛋白酶等) 、动物( 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等) 和微生物。微 生物蛋白酶与动物蛋白酶和植物蛋白酶相比溶解性好，活力高，专性不强，对蛋白质 作用强烈，非常适合于对蛋白质进行较深程度的水解。另外，微生物蛋白酶已经工业化 生产，如诺和诺德( n o v on o r d i s k ) 公司生产的碱性蛋白酶和中性蛋白酶，无锡星达生 物工程有限公司的酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶等。因此，微生物蛋白酶是今 后应用的主要方向。目前常用的微生物蛋白酶见表i 3 表i 3 蛋白酶解过程中常_ ；i 的j l 种微生物蛋白酶f 2 5 】 t a b l e 13m i c r o b i a lp r o t e i n a s ec o m m o n l yu s e di nt h eh y d r o l y z i n go f p r o t e i n 1 4 4 关于玉米蛋白酶解的研究 国外对肽类的研究较早，早在2 0 世纪4 0 年代就已经开始研究一些肽的应用。前一个 时期蛋白水解物的开发主要以大豆蛋白、乳蛋白、蛋清蛋白为主，尤其是以乳蛋白水解 物和活性肽的研究开发最为深入。近年来有关畜血、水产蛋白和活性肽的研究开发日益 受到重视【2 6 i 。我国的蛋白水解物和活性肽的研究相对滞后，很多方面刚刚起步，一些单位 开始进行有关大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白水解物的研究工作，但是对玉米蛋白水解物 的研究很少，以玉米蛋白水解物为基料的医药品和食品几乎没有。1 2 7 目前只有日本和美 国等少数国家开始利用并开发了一些有关玉米的再次利用。在玉米肽的研究领域，日本 处于世界领先位置，文献报道较多，他们已经将玉米肽开发成低热量早餐饮料，还开发 出了降血压作用的玉米肽混合物、缩氨肽等食品及医药品【2 8 1 。此外，欧洲、美国等国也 早已有玉米肽产品上市，1 9 7 7 年e d l e r n i s s e n 研究了玉米面筋粉的酶水解，并研究了 温度、p h ，酶浓度对水解的影响【z 。】9 8 9 年，j u l i e e 等研究了玉米面筋的酶水解，对酶 大连理工大学硕士学位论文 浓度和粒度对水解的影响进行了研究【3 们。日本的山口孙一和佐野良史通过对玉米蛋白进 行特定的酶水解，除去游离氨基酸后制得的玉米肽分子量较小：粘度不随浓度的增加而 上升，即使在5 0 的高浓度下，流动性也很好：透明性好，对热稳定：具有等电点时不易 沉淀等特点。1 9 9 0 年t s h i n y a 】等采用嗜热菌蛋白酶和肌动蛋白酶降解玉米醇溶蛋白 研制出无苦昧高f 值寡肽，产量达5 6 。1 9 9 1 年日本学者s m i y o s h i i j 引等报道了玉米醇溶 蛋白酶解得到的l p p ，是迄今发现的蛋白水解得到的最好的a c e i 肽。y n a k a m u r a j 等 报道了玉米肽除降血压外还具有抑制乙醇中毒和恢复机体疲劳的作用。同年，s y a n o 口4 3 等报道用嗜热菌蛋白酶水解经尿素变性的玉米醇溶蛋白，酶解率可达1 0 0 。 我国对生物活性肽研究开发起步晚，从事活性肽的研究单位也多从医药角度出发， 研究力量及投人较少，限制了活性肽的药食两用功能的发挥，市场上国产的活性肽药品 和食品寥寥无几。但近几年研究逐步活跃起来，报道渐多，前景看好。1 9 9 7 年翟瑞文等 用地衣芽抱杆菌碱性蛋白酶对玉米面筋粉进行水解，获得制取玉米肽饮料的工艺。1 9 9 8 年翟瑞文盼卯等又报道了玉米肽的制备特性与应用的研究结果。2 0 0 0 年鲁晓翔b 们等报 道了酶法改性玉米蛋白功能特性的研究结果，该研究主要材料为玉米蛋白粉，所用酶为 胰蛋白酶。同年王遂”玎等报道了微生物蛋白酶对玉米皮蛋白水解作用的研究，他们采 用枯草芽抱杆菌蛋白酶对玉米皮蛋白水解，使其转变为可溶性多肽，最终达到分离、提 取蛋白肽的目的。1 9 9 9 年王梅等盼钔报道了酶解玉米黄粉蛋白制备可溶性肽的研究，所 用酶为碱性蛋白酶，讨论了温度、p h 、底物浓度、酶浓度及预处理对水解的影响。2 0 0 2 年何慧等口州报道了大豆和玉米蛋白酶解肽及其活性研究，所制备活性肽具有抗经基自 由基活性。目前的研究总结起来还存在如下问题：一是大多集中在高得率玉米肽所用蛋 白酶筛选的研究，且一般均是采用单一酶对玉米蛋白粉进行水解：二是在水解过程中无 一例外的采用外加碱来维持p h ，这样会造成脱盐操作。 1 4 5 水解度的控制1 4 u j 酶解制肽中通常以水解度d h 来衡量酶解的效果。可采用t c a 法测定，也可根据 水解过程中n a o h 的消耗量来衡量，还可以酶解产物氨基氮与总氮的比值来表示。d h 越大表示水解的程度越高，生成的小分子物质也就越多，当d h 达到1 0 0 时蛋白质完 全部降解为氨基酸，实际上，在酶法制肽中，这种现象几乎不可能出现，主要原因在于 d h 受到很多因素的共同作用，然而，即使各种因素达到最优水平的组合，由于酶解产 物中出现了能够限制酶解继续进行的肽，d h 也会保持在1 0 0 以下的一个极限值。因此， 在以酶解制玉米肽时要考虑蛋白质的种类、酶的种类以及酶解条件对d h 的影响。在p h 值4 o 4 2 时，苦味很强的肽是不溶的，被离心分离除去，因此苦味降低。 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 1 4 6 玉米蛋白水解物脱苦方法的研究 ( 1 ) 酶法水解蛋白产生苦味的原因 蛋白质在酶法水解后经常会产生苦味，产生苦味的物质是一些短肽，称为苦昧肽。 这使酶法水解蛋白在食品工业上的应用受到严重的限制。m u r r a y ( 1 9 5 2 ) j 5 nn e y ( 1 9 7 1 ) 对苦 味肽进行了研究，他们发现乳蛋白乳白蛋白、酪蛋白水解时产生苦味，而明胶、蛋清蛋 白水解不会引起苦味，这是因为蛋白水解物中的苦味是由肽而不是游离氨基酸引起的， 且苦味能吸附在疏水性吸附剂上，表现为疏水性；象明胶这样的亲水蛋白质其水解物就 没有苦味。 ( 2 ) 玉米蛋白水解肽去苦味的方法 蛋白质水解物的去苦味( d i b i t t e r i n g ) 方法有：选择性分离，塑蛋白反应，掩蔽法和应 用外肽酶4 种方法。 选择性分离( s e l e c t i v es e p a r a t i o n ) 由于苦味肽疏水性较强，因而可以用疏水吸附剂有选择地去除苦味肽。活性炭法是最 常用的一种脱苦味方法。除了活性炭外，其他用于脱苦味的吸附剂还有酚甲醛树脂、玻 璃纤维和多糖凝胶等，但活性炭依然是最普遍使用的方法。另外，活性炭对蛋白水解物 可以进行脱色。1 4 i 】 塑蛋白反应( p l a s t e i nr e a c t i o n ) 高浓度的蛋白质水解物( 2 0 左右) 与蛋白酶( 一般为木瓜蛋白酶) 在一定条件下 可以形成凝胶状蛋白质物质，称为塑蛋白( p l a s t e i n ) ，这一过程称为塑蛋白反应。开始 人们认为水解物又重新合成了大分子的蛋白质，但研究发现自由a 一氨基的量并未增 加，水解物的分子量也无变化。现在普遍的看法是塑蛋白反应是一种转肽作用。 塑蛋白反应通过转肽作用形成了一些氨基侧链的肽，这些疏水肽在水中的溶解性很 小，它们相互聚集成小颗粒，并形成了不溶性的塑蛋白。疏水性氨基酸残基的聚集使它 们隐藏起来，不能与味蕾接触，这就是塑蛋白反应去除蛋白质水解物苦昧的原理。 利用塑蛋白反应去除苦味的一个很大缺点是不能获得可溶性蛋白水解物。除了用于去除 蛋白质水解物的苦昧外，塑蛋白反应还可以用于提高某些蛋白质( 如小麦蛋白) 的营养和 功能特性。 掩蔽法( m a s k i n g ) 许多物质对于蛋白水解物的苦昧有去除作用。t o k i t a 等报道，在水解过程中添加聚 磷酸盐、甘氨酸可成功地掩蔽酪蛋白水解物的苦昧，明胶也有类似的效果【蚴，环糊精因 它有包埋疏水肽的能力对苦味具有掩蔽作用，凝胶淀粉也可掩蔽苦昧，苦味可以隐蔽于 淀粉的内部结构中不会和味蕾接触而达到去除苦昧的目的。 大连理工大学硕士学位论文 使用外肽酶 疏水氨基酸不在端基的肽苦味最大，游离氨基酸有较小的苦味。应用外肽酶可去除 苦味，但缺点是蛋白质水解物中游离氨基酸和小分子肽过多食用后易引起腹泻，u m e t s u f 1 9 8 3 ) 利用小麦羧肽酶去除了酪蛋白水解物的苦味。 玉米肽采用活性炭选择分离法和环糊精包埋法去除苦味。【4 3 l 1 5 玉米肽功能特性的研究 蛋白质的主要功能特性是指溶解性、粘性、乳化性、泡沫性、凝胶性和风味特征。 玉米蛋白水解物的功能特性已不同于原蛋白质的特性，通过有控制的水解可以改变和提 高原蛋白质的功能特性。随着肽键的水解，主要发生了3 个变化： ( 1 ) 随着水解度的提高，可离解的基团( n h 4 + ，c o o 。) 数目的增多，导致了亲水性及 净电荷数的增加，使其成为可溶性肽。 ( 2 1 随着抗原性的急剧降低，多肽链的分子数减少。 ( 3 ) 分子结构改变导致埋藏的疏水中心暴露到溶液环境中。体现为玉米蛋白水解物 溶解性即使在蛋白质等电点也大幅度提高【4 4 4 8 1 ，增加了起泡性f 4 9 1 ，降低了粘性4 钔，去 除了不良风味，去掉过敏成分等【5 ”。所以利用玉米肽的低粘度、高溶解性，在大范围的 p h 内，可制作高蛋白食品，如具有酸奶酪风味的早餐饮料等。 1 5 1 蛋白水解物的生理活性和理化性质 玉米肽的理化性质：玉米肽改善了玉米蛋白粉的水不溶性，具有许多良好的理化性 质：( 1 ) 溶解性好、持水性高、高浓度低粘度等特点雎“5 3 1 ( 2 ) 酸性条件下不易凝聚，等电 点不易沉淀6 2 3 ( 3 ) 较强的乳化性和起泡性倍15 4 1 ( 4 ) 稳定性好晤3 1 玉米肽的生理活性：玉米肽除了具有良好的理化性质外，主要还具有以下生理活 性：( 1 ) 易消化吸收性【5 5 1 ( 2 ) 抗氧化性( 3 ) 消除疲劳刚( 4 ) 降低血氨浓度 5 8 1 ( 5 ) 降血压 1 3 1 4 1 5 ( 6 ) 促进乙醇代谢5 卅 可见蛋白水解物除具有独特的理化特性外，还具有许多生理活性。 1 5 2 玉米蛋白水解物在食品中的应用 现在有关蛋白水解物制品的分类基本按下列两原则进行：一、按活性肽的原料来源 分，有酪蛋白肽、乳清肽、血清肽、大豆肽、小麦肽、胶原肽、水产肽、玉米肽、大米 肽、珠蛋白肽、谷胱甘肽等等。二、按活性肽的功能性质、生理作用划分，有蛋白水解 物类医药食品和蛋白水解物类保健食品。其中主要的肽类是一些活性肽，有阿片肽类、 免疫刺激肽、抗高血压肽、抗凝血肽等。 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 由于医药食品是保健食品的一种特殊类型，这里主要以蛋白水解物类保健食品进行 讨论。蛋白水解物因其特殊的营养价值和生理功能为某些人如老年人、运动员、减肥者 提供优质氮源。( c h r i s t o p h e rt ，c o r d i e ，19 9 4 ；m a r yk s c h i d le ta 1 19 9 4 ) 。 ( 1 ) 玉米肽可以制成老年食品 据报道，随着年龄的增长，单位体重对氮和氨基酸的需求量并不减少，只是日能量消 耗减少了。鉴于老年人的生理特点，老年人不能单靠食用过多的食品来增加蛋白摄入量， 而是应食用富含蛋白的老年食品来满足身体的需要，这种食品以液体状态较好，所以可利 用玉米肽制成高蛋白食品以补充老年人所需的蛋白质。在酶法受控条件下降解玉米醇溶蛋 白( z e i n ) ，对酶解产物进行分离纯化，得到一种新的抗氧化肽i 明】一a s p _ 1 邺1 u ，具有恢 复青春、延缓衰老、抗癌等抗氧化机制。玉米蛋白中的半胱氮酸、组氨酸、色氨酸、赖氨 酸、精氨酸、亮氨酸和缬氨酸、5 羟色氨酸有抗氧化能力，现已发现一些含组氨酸、色氨酸 和酪氨酸等功能短肽也具有明显的抗氧化作用 6 0 】。其中t y r 具有酚羟基结构，此酚羟基具有 质子供体的作用1 6 “，可以猝灭自由基，与t y r 邻近的a s p 和g l u 的羧酸根具有吸电子作用， 使t y r 酚羟基上氧电子云密度减弱，更有利于质子的释放，增强了t y r 的质子供体效应。由 于t y r 苯环为共轭体系，使其去掉质子后形成的自由基中间体更趋于稳定。此外，玉米抗氧 化肽的n 端为疏水性氨基酸l e u ，使抗氧化肽与脂肪酸的相互作用增强，提高了其对脂质自 由基的捕捉能力。因此，我们所获得新抗氧化四肽的抗氧化活性是由其分子供氢的能力和 自身结构的稳定性决定的。通过捕捉自由基反应链的过氧化自由基，阻止或减弱自由基链 反应的进行，氢原子给予自由基后，本身成为自由基中间体，而此中间体越稳定越易形成， 其前体就越易清除自由基，则抗氧化能力越强【6 0 】，研究发现单纯的氨基酸也有某些抗氧化 活性，但其活性远远低于由其所组成的抗氧化肽，这也是生物活性肽的一个显著的特点， 即整个肽的活性远大于其组成氨基酸的活性1 6 ”。因此我们认为抗氧化肽的高生物活性在于 肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自 由基的相互作用。 ( 2 ) 制成运动食品 z a w o d z k i ( 1 9 9 2 ) 通过肌肉糖原再合成的试验表明，在膳食或饮料中强化碳水化合物 和蛋白质，比只强化碳水化合物对增加肌肉中的糖尿贮存更为有效。由于玉米肽含有多 种氨基酸并且具有良好的吸收性，可作为运动营养中的很好氮源，使运动员在运动中或 运动后摄入含肽饮料，恢复运动后的疲劳。 ( 3 ) 制成控制体重食品 通过脂肪消耗来减轻体重是身体控制膳食的基本思想。在长期饥饿过程中，蛋白将 从骨骼肌肉中损失不可避免的给身体带来损害，故对新型控制体重膳食的要求是具有最 大连理 j 火学硕士学位论文 少能量但含有足量的蛋白作为控制体重膳食的标准，这样就可以在保持身体氮平衡的前 提下主要通过脂肪损失来减少体重。用具有高生物价的肽配制的低卡软饮料是一种颇具 吸引力的减轻体重的膳食，它基本能保持氮的摄入平衡，且可通过消耗脂肪减少体重， 蛋白水解物强化的膳食，另一好处是有助于减少食欲。 ( 4 ) 制成低过敏性食品 食物过敏是严重的健康问题，食品过敏者轻则引起皮疹，重则会危及生命。以高度水 解蛋白为基料的食品，在预防食品过敏性方面是有效的。玉米蛋白水解物在预防和治疗 过敏性方面的作用无疑是开发研究的一个重要方向。 ( 5 ) 患消化道疾病病人的食品 膳食中的蛋白质，其消化吸收要经过一个复杂的过程，蛋白质的消化首先在胃中由 酸和胃蛋白酶开始，继续被胰蛋白酶、凝乳蛋白酶和粘膜肽酶水解，产生游离氨基酸和小 肽，然后消化吸收。对于一些患有特殊消化器官疾病的病人，最好能食用可直接吸收的 肽类食品，而且这种食品还可通过肠道喂养。玉米肽可以为此类病人提供一个很好的食 品来源。 ( 6 ) 各种氨基酸的利用 玉米肽中高含量的亮氨酸( 2 2 左右) ，能及时补充氨基酸，降低血中氮浓度，消除 疲劳等。玉米肽中丙氨酸的含量，是大豆肽的3 倍，小麦肽的5 倍，酪蛋白的4 倍， 而丙氨酸对减轻麻醉，防止酒醉有良好的效果。 ( 7 ) 保鲜作用 玉米醇溶蛋白膜具有溶解速度快、韧性强、热封好、透明度高，对空气有较好的阻 隔作用；能防止食品成分氧化、失水及风味散失的作用；它在肠道中可溶解并缓慢释放 其包被物；成本低于塑料包装物；安全无污染。可广泛应用于食品r e , i t , ( 果蔬保鲜) 、医 药工业( 糖衣及缓释壁材) 以及饲料业( 颗粒饲料粘结剂) 等。他的研制成功，为玉米深加 工产品开发探索了一条新路，原料可增值6 7 倍。玉米醇溶蛋1 1 1 ( z e i n ) 浸涂硬糖，可延 缓硬糖吸水溶化，防止硬糖发烊、返砂，以便长久保持硬糖质量；用玉米醇溶蛋f ! t ( z e i n ) 液浸涂杏仁及核桃能延缓其氧化腐败速度；玉米醇溶蛋白添加不同的增塑剂可用于青 椒、番茄、腊肉、香肠的涂膜保鲜还可用于香蕉的保鲜等。由于玉米醇溶蛋白膜具有独 特的溶解性，且能形成透明、柔软、均匀的保鲜薄膜和具有较强的保水性和保油性， 是一种理想的天然保鲜剂。 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 1 6 主要研究内容 根据目前研究存在问题，本论文的研究内容主要包括以下几个方面： ( 1 ) 研究高活力酸性蛋白酶在p h 变化条件下对玉米蛋白的酶水解作用，确定酶水解 玉米蛋白的最佳条件。 ( 2 ) 研究乳化对酸性蛋白酶水解玉米蛋白的影响。 ( 3 ) 研究p h 值变化条件下经过高速剪切乳化处理后酸性蛋白酶水解玉米蛋白的酶解 作用，以水解度和降解率为主要指标，以不外加碱调p h 避免盐生成制取玉米肽 为目的，进行正交试验找出酶水解玉米蛋白的最佳条件。 ( 4 ) 研究玉米蛋白水解物的分子量分布。 ( 5 ) 采用高效液相色谱法测定水解产物的氨基酸组成。 大连理工大学硕士学位论文 2 实验部分 2 1 实验原料及化学试剂 玉米蛋白 黑曲霉酸性蛋白酶 盐酸 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 碳酸氢钠 柠檬酸 无水醋酸钠 甲醇 氢氧化钠 甲醛 乙醚 2 ，4 一二硝基氟苯 乙腈 牛血清蛋白 浓硫酸 氯化钠 硫酸钾 硫酸铜 硼酸 甲基红 次甲基蓝 葡萄糖 2 2 实验仪器 凯氏定氮蒸馏装置 不锈钢釜 电热恒温干燥箱 水夹套式三口玻璃发酵罐 精密酸度计 饲料级 食品级 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 色谱纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生物纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 2 5 0 m l p h s - 2 型 长春大成玉米有限公司 北京房山酶制剂厂 大连海运试剂厂 潮卅l 化学试剂厂 天津市天河化学试剂厂 中美合资天津天福精细化工有限公司 天津市天河化学试剂厂 沈阳市试剂三厂 中国上海陆忠试剂厂 沈阳市试剂三厂 丹东市胜利化工厂 大连海运试剂厂 瑞典p h a r m a c i a l 公司 沈阳试剂三厂 美国生物华美研究所 哈尔滨化工化学试剂厂 沈阳市试剂三厂 沈阳市试剂三厂 沈阳市试剂三厂 沈阳市试剂三厂 沈阳市试剂三厂 沈阳市试剂三厂 天津大茂化学试剂厂 自组装 自加工 上海机械厂 自加工 上海雷磁仪器厂 玉米蛋白水解制取玉米肽的研究 台式离心机 超级恒温水浴 磁力搅拌器 电子天平 红外线快速干燥器