（化学工艺专业论文）龙虾头的酶解及maillard反应制备海鲜味香精.pdf

摘要 利用废弃的龙虾头为原料，通过酶解得到蛋白水解液，以m a i l l a r d 反应制备海鲜味香 精。主要结论如下： ( 1 ) 五种蛋白酶对龙虾头蛋白酶解能力顺序：动物蛋白酶 a l c a l a s e 酶 木瓜蛋白 酶 风味蛋白酶 中性蛋白酶。 ( 2 ) 木瓜蛋白酶的较佳酶解条件：时间6h ，固液比l ：5 ，酶活1 2 0 0u g ；风味蛋 白酶的较佳酶解条件：时间6h ，固液比1 ：4 ，酶活1 0 0 0u g ；中性蛋白酶的较佳酶解条 件：时间6h ，固液比l ：6 ，酶活1 0 0 0u g 。 ( 3 ) 中性蛋白酶与风味蛋白酶复配，最佳工艺条件为：温度6 0 。c ，时间6 + 6h ，固 液比1 ：3 。结果，氢基氮得率为2 4 4 ，固溶物得率4 6 3 。用氨基酸分析仪共鉴定出1 8 种氨基酸，总氨基酸含量为6 9 6 9 m g m l 。 ( 4 ) 活性炭脱色较佳工艺为：p h 值2 0 ，活性炭用量1 0g 1 0 0 m l ，温度6 0 ，时间 3 5m i n 。结果，氨基酸损失率为1 8 4 ，脱色率为8 2 8 。 ( 5 ) 7 3 2 阳离子交换树脂精制单离半胱氨酸，h p l c 检测产品的纯度为8 6 8 8 。 ( 6 ) m a i l l a r d 反应较佳工艺条件为：固溶物含量4 o ，葡萄糖6 o ，木糖2 o ， 精氨酸4 o ，甘氨酸0 3 ，牛磺酸0 4 ；时间6 0m i n ，温度1 0 0 ，p h 值6 0 。 ( 7 ) g c m s 分析海鲜味香精的挥发性成分，共鉴定出2 6 种化学成分，其中糠醛、 甲基2 甲基3 呋喃基二硫具有肉香味，苯并噻唑、3 甲硫基丙醛为对海鲜风味有重要贡 献的化合物。 关键词：海鲜味香精；龙虾头；酶解；m a i l l a r d 反应；氨基酸；脱色 r e s e r c ho ne n z y m a t i ch y d r o l y s i so fw a s t el o b s t e rh e a d sf o r p r e p a r a t i o no f s e a f o o df l a v o r a b s t r a c t ，n l eo b j e c t i v eo ft h i sr e s e a r c hw a st op r e p a r es e a f o o df l a v o ru s i n gt h ee x t r a c t i o no fw a s t e l o b s t e rh e a d sb ym a i l l a r dr e a c t i o n t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 c o m p a r i e dt h ep r o t e o l y s i sc a p a c i t yo ff i v ep r o t e a s eo nt h el o b s t e rh e a d ：a n i m a lp r o t e a s e a l c a l a s e p a p a i n f l a v o u r z y m e n e u t r a lp r o t e a s e 2 t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rp a p a i nw e r ea sf o l l o w s ：a d d i n ge n z y m e1 2 0 0 u g w i ms o l i d - l i q u i d r a t i o1 ：3f o r6 h ；t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rf l a v o u r z y m ew e r ea sf o l l o w s ：a d d i n ge n z y m el0 0 0 u g w i t hs o l i d 1 i q u i dr a t i o1 ：4f o r6 h ；n l eb e s tc o n d i t i o n sf o rn e u t r a lp r o t e a s ew a sa d d i n ge n z y m e 10 0 0 u g 、析t hs o l i d 1 i q u i dr a t i ol ：6f o r6 h 3 t h eh y d r o l y s i sc a p a c i t yo fn e u t r a lp r o t e a s ec o m p l e xw i t ht h ef l a v o u r z y m ew a ss t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o no ft e m p e r a t u r e r e a c t i o nt i m ea n ds o l i d 1 i q u i dr a t i ow e r e6 0 6 + 6 ha n d l ：3 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h ey i e l do fa m i n on i t r o g e nw a s2 4 4 s o l i ds o l u t i o nw a s 4 6 3 t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s a t ew h i c hw a sm a d eu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o nw a s d e t e r m i n e db y18a m i n oa c i da n a l y s i s a n dt h er e s u l ts h o w e dt h ee o n t e n to ft o t a la m i n oa c i d r e a c h e d6 9 6 9m g m 1 4 t h eb e s td e c o l o r i z a t i o nb ya c t i v a t e dc a r b o nw a sp h 2 0w i t h1 o g 10 0 m la c t i v a t e dc a r b o n o n6 0 f o r3 5 m i nd e c o l o r i z a t i o nt i m e t h ea m i n oa c i dl o s sr a t ew a s18 4 a n dt h e d e c o l o f i z a t i o nr a t ec a na c h i e v e8 2 8 u n d e rt h i sc o n d i t i o n 5 7 3 2a m i n oa c i dc a t i o ne x c h a n g er e s i nw a su s e df o rp r o d u c i n gc y s t e i n e ，p u r ec y s t e i n ew a s o b t a i n e da f t e rr e p e a t e de l u t i o na n dc o n f i r m e dt h a tt h ep u r i t yr e a c h e d8 6 8 8 b yh p l c 6 t h eo p t i m u mc o n t e n to fr e a c t i o np r o d u c t so fm a i l l a r dr e a c t i o nw e r ee v a l u s t e db ys e n s o r y e v a l u a t i o n t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fm a i l l a r dr e a c t i o nw e r eo b t a i n e d t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sa sf o l l o w ：4 o h y d r o l y z a t es o l u t i o nc o n t e n t 6 o g l u c o s e 。2 0 x y l o s ea d d i t i o n , 4 0 a r g i n i n e ，0 3 g l y c i n e a n d 0 4 l - t a u r i n e r e a c t i o n t i m e ：6 0 m i n , r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ：10 0 。c ， i n i t i a lp h ：6 0 u n d e rt h i sc o n d i t i o nf l a v o ra r o m ao fs e a f o o dw a sf u ua n dr i c h 7 1 1 1 ef l a v o rc o m p o n e n t si nt h es e a f o o df l a v o rw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e db yg a sg c m s i d e n t i f i e dat o t a lo f2 6k i n d so fc h e m i c a lc o m p o s i t i o n i nw h i c hf u r f u r a l m e t h y l 2 一m e t h y l 3 f u r y ld i s u l f i d e 谢t hm e a tf l a v o r ，b e n z o t h i a z o l y l ，3 - m e t h y l t h i o p r o p i o n a l d e h y d eh a sag r e a t f l a v o rt ot h er o l eo fs e a f o o d k e yw o r d s ：s e a f o o df l a v o r ；w a s t el o b s th e a d s ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；m a i l l a r dr e a c t i o n ；a m i n o a c i d s ；d e c o l o r i z a t i o n 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作 所取得的成果尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者( 本人签名) ：尹日午取( 7 f r - 6 月o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版( 中国科学技术 信息研究所；国家图书馆等) ，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容 保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。 ( 请在以上方框内打“ 丹) 学位论文作者( 本人签名) ： 指导教师( 本人签名) ： p 7 年石月移日 e 气每易，i c 话 致谢 本论文是在尊敬的朱凯教授的严格要求和悉心指导下完成的，从论文的选题、试验的 开展及论文的撰写，都凝结着朱老师的心血和智慧。在三年的学习期间里，导师渊博的学 术知识、严谨的治学态度、朴实的为人和忘我的工作热情给我留下了深刻的印象，并使我 受益终身! 值此论文完成之际，学生谨向朱老师表示衷心的感谢! 在论文工作期间，林中祥、季永新、朱新宝、毛连山、杨云等老师给予了大量的指导 和帮助，在此，向诸位老师表示感谢! 感谢林产化学工程专业王飞老师和倪老师在试验阶段提供仪器和设备的帮助! 感谢本课题组研究生吴飞、任静、陈科、云亮、昊昊和本科生胡飞、高磊、金玲在论 文期间给予的大力帮助! 最后感谢我的家人，特别是我父母在我的学习和生活中给予我的关心、理解和支持! 尹昕新 2 0 0 9 年6 月 1 文献综述 1 1 论文选题的背景及意义 民以食为天，食以味为先。随着人民生活水平的提高、生活节奏的加快，饮食习惯的 改变以及各国饮食文化相互渗透，人们对食品香味提出了越来越高的要求，这也极大的促 进了食品工业的发展。食用香精是改善食品香味，适应食品生产方式变化所必须的原料， 作为食用香精之一的肉味香精近年来取得了迅速的发展，特别是热反应型肉味香精迎合了 人们对食品肉香味的喜爱，顺应了人们追求健康、营养和回归自然的时代潮流，满足了食 品生产企业在增香调味方面不断求新的需求，因而成为了调味料领域发展极快的新型产 品。目前，肉昧香精已扩展到众多食品加工领域，广泛应用于方便面调料、鸡精、罐头、 熏肉、酱肉、香肠、火腿肠、香辣酱以及动物饲料和宠物食品等方面j 。 天然海鲜调味料因富含氨基酸、多肽、有机酸及核苷酸关联物等风味营养物质，又具 有浓郁的海鲜风味而备受人们青眯；这类海鲜调味料还含有许多功能性物质，如牛磺酸、 生物活性肽等，这些物质又赋予了海鲜调味料特殊的保健功能1 2 】。 近年来，龙虾热风靡长江南北，龙虾的养殖加工规模不断扩大，已经形成了具有区域 特色的大产业。在龙虾仁加工的过程中，占整只虾重量3 0 - - - 4 0 的虾头被剔除，我国每 年未被充分利用的龙虾头约1 5 - 2 0 万吨，其中大部分被用于生产饲料等低附加值产品， 有些甚至作为废弃物，造成了资源的浪费及环境污染。龙虾头含有丰富的蛋白质、脂肪及 其它营养物质，目前，利用虾头加工的产品有虾油、虾粉、碳酸钙虾壳蛋白和甲壳素及其 衍生物等，而利用龙虾头制备海鲜味香精的研究很少。用废弃龙虾头为原料，通过酶解制 备蛋白水解液，并以此作为氨基酸源与还原糖进行m a i l l a r d 反应制备海鲜味香精，这对降 低生产成本、环境保护、资源的综合利用以及促进国内肉味调味品的发展等方面起到积极 的作用，对促进国内肉味调味品的快速健康的发展具有重要的意义。 1 2 肉类香精的研究 肉类香精是最近三十年发展起来的一类新型食用香精，是包括猪肉香精、牛肉香精、 鸡肉香精、火腿香精、各种海鲜香精等在内的一系列具有动物肉香味的食用香精的总称。 国际上许多香精公司如美国的i f f 公司，英国的b b a 公司，瑞士的f i r m e n i c h 公司，日 本的t a k a s a g o 公司等都大量生产肉类香精。目前我国肉味香精的生产厂有1 0 0 多家，年 销售额约2 0 亿元人民币，每年以超过1 0 的速度迅速增长【3 j 。国外肉味香精的发展有三 四十年的历史，我国对肉味香精的研究起步较晚，但近十年来发展迅速。目前国产肉味香 精普遍存在着品种比较单一，质量档次不高，风味不够丰满的问题，远远满足不了日益增 长的市场需要，我国每年都要从国外大量进口。因此，该产品的研究开发对于促进我国食 品工业的发展非常重要。 肉味香精的呈味反应主要是m a i l l a r d ( 非酶褐变) 反应，是发生在还原糖和氨基酸之 间的非酶褐变反应【4 】。氨基酸源的选择对反应物的香气和味道有较大影响。可以直接以各 种氨基酸为主要原料，通过与还原糖进行的热反应，制备出各种的肉味香精，此方法生产 的肉味香精具有明显特征肉香味，但生产成本较高，而且肉香味不够丰满；也可用水解植 物蛋白( h v p ) 、水解动物蛋白( h a p ) 及酵母抽提物( y e a s te x t r a c t ) 作为氨基酸源与 还原糖发生m a i l l a r d 反应制得肉香物质【5 】，水解植物蛋白比较廉价，通常是大豆蛋白、小 麦面筋和玉米面筋的水解物，但是制得的肉味香精，肉香气味比较弱，而且不够丰满逼真， 另外，人们发现水解植物蛋白中含有低浓度的3 - m c p d ( 单氯丙二醇) 和3 - d c p ( 二氯丙 醇) ，它们被怀疑是致癌物质和生育抑制剂；用水解动物蛋白可以制得逼真而强烈的肉香 物质，但需要优质的牛肉、鸡肉、鱼、虾肉为蛋白源来制备肉味香精，成本很高。本实验 利用废弃的龙虾头为蛋白源，制备出的海鲜昧香精既有逼真而强烈的海鲜风味效果，生产 成本也较低，而且还具有绿色环保，综合利用方面的作用，所以具有很好的市场前景。 1 2 1 我国龙虾资源 克氏原螯虾俗称淡水龙虾，简称龙虾，是淡水螯虾的一个种，分类上隶属节肢动物门、 甲壳纲、螯虾亚目、螯虾科。龙虾原产美国南部和墨西哥北部，2 0 世纪3 0 年代初，人们 将其作为牛蛙饵料由美国移殖到日本的本州，3 0 年代末又由日本引入到中国，在南京和 滁县附近地区生长繁殖，后沿长江流域自然扩散。2 0 世纪8 0 年代至9 0 年代初，人们将 其作为养殖对象引至各地，现已分布于我国十几个省市，在有些地方已成为一些湖泊和沟 渠的优势种群【6 】。江苏省的盱眙仅龙虾养殖面积已超过1 0 万亩，年产龙虾l o 万吨，市场 销售龙虾6 0 万吨，每年产值超过1 0 亿，再加上安徽、上海、江西、湖北、湖南和浙江 等省市龙虾的产量，我国龙虾的年产量至少在1 0 0 万吨以上。如何科学、合理的充分的利 用这部分资源，国内外都作了不同程度的探索，除生产虾酱和甲壳质外，美国利用对虾废 弃物回收蛋白质，提取虾青素等类胡萝b 素，生产虾粉，虾头液体饲料，调味海产品和模 拟虾风味物质。日本把虾粉用作鱼类饲料，作体表润色剂，研究分离虾风味物质，并将其 作为食品添加剂赋予食品虾味特征。近年来，我国虾资源的深加工也取得了一定进展，生 产出了甲壳素、虾青素、虾酱、虾脑油和虾黄粉等产品p j 。 1 2 2 海鲜味香精的研究现状 现在国内对热反应生产牛肉香精和鸡肉香精的生产工艺研究已经比较成熟，许多香精 香料公司生产有这两类肉味香精，而海鲜味作为大众比较喜欢的风味，研究却相对较少。 海鲜味香精的生产，在我国的兴起只是在近几年的时间。根据形态，海鲜味香精可分为液 体、粉末固体和膏状；按其产品性质可分为合成和天然两种海鲜味香精【引。目前市面上所 见的海鲜味香精多采用合成香精人工调配而成，其产品香气比较单一，缺乏天然逼真感， 2 且通常不耐高温。天然的海鲜味香精生产目前国内缺少成熟的研究成果和产业化技术，因 此研究开发天然海鲜味香精的制备技术具有广泛的市场应用前景。 虾是一种具有独特风味的食物，它除具有丰富的营养之外，还具有四十多种生香成份， 因此亦是一种天然的、具有保健作用的调味珍品。虾味的调味料主要有虾油、虾酱、虾香 料、虾调味汁、虾味酱油等【9 】。虾味风味料的研究只是局限在传统的发酵工艺和生物酶解， 而没有把生产肉昧香精的热反应加工技术运用到其中。利用发酵工艺生产虾味调味料，生 产周期太长，盐含量高，而且受到天气和地域的限制；直接使用虾中的抽提物作为虾味风 味料，成本昂贵，而且脂肪含量较高，这与现代所提倡的食品低热量、低脂肪的理念不相 符合；运用单纯生物酶解技术制备出的虾味调味料，虾香味也不够强烈、不够饱满。针对 以上的情况，本课题旨在以龙虾头为原料，运用生物酶解技术，通过m a i l l a r d 反应制备海 鲜味香精。这样可以解决以上香精制备上存在的缺陷，得到的产品原汁原味，香气强烈、 饱满、逼真，并且大大降低了产品成本。 1 2 3m a i l a r d 反应 m a i l l a r d 反应【lo 】是由法国生物化学家l o u i sc a m i l l em a i l l a r d ( 1 8 7 8 1 9 3 6 ) 于1 9 1 2 年发 现的，主要是氨基酸和还原糖之间的反应。1 9 5 3 年h o d g e 对m a i l l a r d 反应的机理提出了 系统解释，认为该反应可以分成三个反应阶段： ( 1 ) 初级阶段：还原糖的羰基与氨基之间进行加成，加成物迅速失去1 分子水转变为 希夫碱( s h i f f b a s e ) ，再经环化形成相应的n 取代的醛基胺，经a m a d o r i 重排转成有反应 活性的1 氨基1 脱氧2 酮糖。初级m a i l l a r d 反应不引起褐色变，也不产生香味，但其产 物是产生极重要的不挥发性香味物质的前驱物。 ( 2 ) m a i l l a r d 反应高级反应阶段：前驱物形成之后，m a i l l a r d 反应变得更为复杂，开 始形成无氮以及含氮褐色可溶性化合物，此反应阶段主要包括3 条反应路线。 第l 条路线还原酮路线：由a m a d o r i 重排反应产物1 氨基1 脱氧2 酮糖在2 3 位置不可逆地烯醇化，从c l 消去胺基生成甲基二羰基中间体，其进一步反应产物如c 甲基醛类、酮醛类、二羰基化合物和还原等酮裂解产物，反应产物包括乙醛：丙酮、丁二 酮和醋酸等风味成分； 第2 条路线卅s u l o s e 和h m f 路线：a m a d o r i 产物在1 、2 位置上烯醇化，并消去 c 3 上的羰基，加水分解并失去其含氮部分而生成3 脱氧o s u l o s e ，进而生成3 、4 二脱氧 o s u l o s e ，最后又脱水生成糠醛类风味成分； 第3 条路线s 仃e c k e r 降解：在s t r e c k e r 降解中，各种不同的特殊醛( 亦称s t r e c k e r 醛类) ，氨基酮经过异构化形成烯醇胺，再经环化形成吡嗪类化合物。 ( 3 ) 最终阶段：高级m a i l l a r d 反应阶段形成的众多活性中间体，如葡萄糖酮醛、3 脱氧o s u l o s e ( 3 - d g ) 、3 , 4 二脱氧o s u l o s e ( 3 , 4 一二d g ) 、h m f 、还原酮类、不饱和醛亚 胺等等，又可继续与氨基酸反应，最终能够都生产类黑精色素褐色含氮色素，此过程 包括醇醛缩合、环化合反应等。 m a i l l a r d 反应十分复杂，影响因素众多，既和参与m a i l l a r d 反应的氨基酸、还原糖的 种类有关，也与p h 值、温度、反应时间、水分活度等因素与关。 1 3m a i l l a r d 反应的氨基酸源 1 3 1 龙虾头的营养成分 现有的水产品的加工多为些低附加值的产品，技术含量不高，并且废弃物所占比重很 大。虾类产品的加工出口以无头冻虾仁为主，而去除虾仁后的虾头等废弃物约占整只虾的 4 0 。龙虾头中除含有大量的蛋白质、脂肪、钙等，还含有磷、铁、维生素、d h a 、e p a 、 虾青素、人体必需的8 种氨基酸，以及具有抗癌、抗炎作用的硒等有益微量元素【1 1 1 。游离 氨基酸是水产物提取呈味的基础物质，也是水产品加工中发生m a i l l a r d 反应不可缺少的原 料【1 3 】。龙虾加工废弃的龙虾头中蛋白质含量在6 5 左右，所含氨基酸达1 8 种以上，其中 8 种人体必需氨基酸的含量约占总氨基酸3 0 。大多数水产品富含不饱和脂肪酸e p a ( 二 十碳五烯酸) 和d h a ( 二十二碳六烯酸) ，能够促进脑细胞生长发育，改善大脑机能，提 高记忆力。近年来研究还发现，水产食品的提取物中还含有牛磺酸、糖蛋白、维生素b 1 2 、 叶酸以及微量元素硒、钙等多种生理活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等多种生物 功能【1 2 j 。n a + ，k + ，m 9 2 + ，c 1 一，p 3 0 4 。，c a 2 + 等无机离子对虾的呈味同样非常重要，它们的存在 使得有机成分的呈味效果得以充分发挥。此外，甲壳类及软体动物中还含有很丰富的甜菜 碱，甜菜碱是一种季胺类化合物，被认为是这些海产品甜味的来源之一【1 4 1 ，龙虾头抽提 液中甜菜碱平均含量是7 3 0 8 9 8r a g 1 0 0 9 。可以认为龙虾头是生产多种美味调昧料的优 质原料。 表1 - 1 龙虾头的主要成分 ! 垒垒! ：! ! 塾i l l l l l l l e a ! j 2 1 2 巴m2 坚竺翌垒2 11 2 坠! ! 曼! 塾竺苎璺 _ _ _ - _ _ - - 一 一_一 成分水分总氮脂肪灰分总糖 含量7 5 7 4 6 7 14 6 23 3 8o 9 4 1 3 2 蛋白水解的方法 以蛋白质为原料生产氨基酸方法主要有酸水解法、碱水解法和酶水解法【l 5 。 酸法水解是水解蛋白质中使用最早的方法，多用于植物蛋白的水解，在动物蛋白的水 解中使用较少。酸法水解通常温度较高，使得水解过程中含硫氨基酸分解出二甲基硫醚、 甲硫醇、硫化氢等含硫化合物，产品容易产生臭味，而且水解程度难以控制，所以活性肽 含量较低，此方法制成的水解植物蛋白含微量一氯丙醇、二氯丙醇等致癌物；碱法水解是 蛋白质在碱溶液中肽键发生断裂的方法【l 6 1 。碱法水解虽然成本较低，但是水解度也低、 4 专一性差，属于一种不规则水解，水解过程中容易产生尿素，会使氨基酸脱氨而造成胱氨 酸、半胱氨酸等氨基酸的损失，还会导致氨基酸消旋，营养成分损失等问题，因此很少采 用此法来制备供人类食用的水解蛋白。 酶水解是通过酶制剂使蛋白质的肽键打断，使蛋白质降解为多肽、寡肽、二肽、游离 氨基酸等的方法。通过蛋白酶对蛋白质的水解作用，动物蛋白在三个方面发生改变：分子 量降低，离子基团数增多，疏水性基团暴露出来。这样可使蛋白质的功能性质发生改变， 从而达到改善乳化、增强保水性、提高热反应能力及摄食时容易被人体消化吸收等目的。 随着生物技术的发展，各种新型的蛋白酶不断被发现，出现了许多商品化的酶制剂。酶在 食品中的应用研究越来越多，尤其是在蛋白酶水解小麦蛋白、大豆蛋白、猪血蛋白、鸡肉 蛋白、鱼蛋白等方面的研究做了大量工作1 1 7 】。王艳掣1 8 】对小麦面筋蛋白酶解特性做了研 究，利用风味蛋白酶水解后没有苦味，酶解液的水解度可达2 8 0 ；杨兰等u9 j 对鸡肉蛋 白酶法水解及水解液脱苦方法进行了研究，分析了脱苦前后水解液中氨基酸组成的变化。 酶法水解克服了酸法、碱法的缺点，工艺条件温和，产品纯度高，而且由于蛋白酶具有水 解专一性，可以有选择地水解某些特定的氨基酸肽键，避免了酸法、碱法对环境产生污染。 本研究采用生物催化剂酶，水解龙虾头蛋白。 1 3 3 蛋白质酶水解的机理 蛋白质酶水解的机制非常复杂，因为底物中包含了大量的不同种类的不溶性蛋白质。 所有的酶解反应至少分为两个阶段【2 0 】。第一步，酶分子与蛋白质颗粒连接，蛋白质中一 些特殊的残基和肽键进入酶的活性中心；第二步，水解反应的发生，释放出大量可溶性的 多肽和氮基酸，越处于核心、结合越紧密的蛋白质水解速度越慢，一般来说，蛋白质的酶 水解反应在最初的1 0 - - - 1 2 0m i n 内保持较高的水解速度，这段时间由于酶解反应的底物和 所用的蛋白酶的不同而有所差异。 1 4 水解动物蛋白制品在食品工业中的应用 水解动物蛋白中含有多种氨基酸和多肽，此外还含有核苷酸、维生素、有机酸和矿物 质等多种有效成分【2 1 1 。其氨基酸平衡良好，味道鲜美浓郁，具有营养、保健和调味三大 功能，在食品领域内具有广阔的应用前景。 ( 1 ) 水解动物蛋白产品在方便面的应用1 2 2 j 随着生活节奏加快，人们对方便食品的需求量日益增大。提高方便面品质的一个重要 方面，就是使用纯天然风味调味品，它能更好地呈现出肉的甜香和浓厚的滋味。 ( 2 ) 水解动物蛋白产品在膨化食品的应用【2 3 】 肉风味是膨化食品中的主导风味，使用由动物水解蛋白产品配制而成的膨化料能赋予 膨化食品天然真实的肉风味。 ( 3 ) 水解动物蛋白产品在运动饮料中的应用【2 4 】 水解动物蛋白的分子量合适，能迅速提供能量，促进新陈代谢。由于肽的易吸收性， 它是运动营养中很好的氮源，在运动中或运动后摄入含肽饮料，负氮问题和肌肉组织合成 问题都得到很好解决。 ( 4 ) 水解动物蛋白产品在调味品的应用【2 5 j 近年来复合调味料有了很大的发展，鸡精是其中较有代表性的一种。鸡精不仅产生鲜 美甘甜、肉浓厚的口感，而且鸡风味真实、细致。现在市场上还出现鲍鱼汁等复合调味品。 据研究【2 6 1 ，不同风味的动物水解蛋自产品能与香辛料、香精等其他不同配料协同作用， 能在其原有肉味浓厚、真实自然的基础上产生不同综合复杂的风味，使口味更富于变化， 满足不同需要，使产品更富有竞争力。动物水解蛋白可广泛地用于食品行业，随着新术的 应用，如微胶囊以及在反应控制上的研究及应用，产品的品质和品种都会得到提高和丰富。 ( 5 ) 水解动物蛋白在减肥食品中的应用1 2 7 j 人在持续饥饿状态下，肌肉中的蛋白质有所损失，使机体受到伤害。因此控制体重的 同时，要补充充足的蛋白质以维持机体的氮平衡，达到脂肪减少而不导致体质下降。因此， 具有高生物价的肽类所形成的低热软饮料是很好的控制体重的蛋白补充。 ( 1 ) 含硫氨基酸对食品褐变的抑制作用 褐变是食品中普遍存在的一种变色现象，其中有些褐变是人们所期望的，如酿造酱油 的棕褐色，红茶和啤酒中的红褐色，面包焙烤后留下的金黄色以及霉菌豆豉的黑色等。但 就一般情况而言，褐变对食品是不利的，因为褐变不仅有损于食品的外观，而且风味会受 到影响，营养价值也会降低。所以，采用适当方法阻止有害的食品褐变是必需的。研究发 现含硫化合物如半胱氨酸、n 乙酰l 半胱氨酸和还原型谷胱甘肽是多酚氧化酶的有效抑 制剂，这说明含硫氨基酸也能抑制食品的酶促褐变【2 8 】。以同样的摩尔数添加，含硫氨基 酸与亚硫酸盐对食品的酶促褐变有近似的效果，但是亚硫酸盐会使哮喘患者过敏，而含硫 氨基酸的安全性极高。由此可见，含硫氨基酸及其衍生物是代替亚硫酸盐且极具发展潜力 的褐变抑制剂。 ( 2 ) 含硫氨基酸与食品的风味 食品中的风味物质种类繁多，不同的食物有不同的风味。含硫化合物是食品风味的一 大主体【2 9 1 。食品中的大多数含硫风味化合物都直接或间接来自于食品中的含硫氨基酸及 其衍生物。蛋氨酸加热可分解成有清香气味的二甲硫醚，它是高级绿茶、甜玉米、番茄汁、 煨蛤及海藻的香气主体。甲硫醚虽然在牛乳中含量很少，但却是牛乳风味的主要来源。半 胱氨酸与邻醌的结合物具有水果香气。在肉中或肉制品中，舍硫氨基酸与糖之间的 m a i l l a r d 反应的中间产物及其降解物是产生香气的主要途径，这些风味化合物包括三噻 啶、二甲基二硫戊烷和噻啶等。芝麻在焙烤中产生的主要香气成分也是含硫化合物p 。 ( 3 ) 硫氨基酸的抗氧化作用 动物机体的氧化还原状态是一个动态平衡过程。含硫氨基酸对动物生理功能的调节作 6 用，很大原因是其维持了机体氧化还原状态平衡，使一系列物质处于具有活性或失活状态， 从而调节包括免疫在内的各种生理活动。m e t 的氧化还原循环是动物体内一个重要的清除 有害物质的途径，研究表明，m e t 对抗毒和预防疾病具有很好的效果，m e t 的氧化还原循 环维持蛋白质的活性和稳定性，而且，蛋白质m e t 残基的氧化与衰老和多种神经元退化 疾病( 如阿尔茨海默氏症和帕金森病) 相关【3 。研究表明摄入的含硫氨基酸的量与体内 的抗氧化保护作用相关。含硫氨基酸的抗氧化保护作用可以通过其自身的抗氧化作用及合 成具有重要抗氧化作用的物质谷胱甘肽二种途径实现【3 2 1 。 1 6 氨基酸常见分离纯化方法 目前，我国工业用来分离与纯化氨基酸的常用方法有：沉淀剂分离法、离子交换法、 膜分离法、吸附法、萃取法等f 3 3 】。 ( 1 ) 沉淀剂分离法 沉淀分离氨基酸主要有特殊试剂沉淀法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法。特殊试剂 沉淀法是最早应用于混合氨基酸分离的方法之一。某些氨基酸可以与一些有机化合物或无 机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，达到与其它氨基酸分离的目的。等电点沉淀法是 根据氨基酸的等电点不同，在等电点时，氨基酸分子的净电荷为零，有利于氨基酸分子的 彼此吸引而形成结晶体沉淀下来。有机溶剂沉淀法是利用某种有机溶剂使需要提取的物质 在溶液中的溶解度降低而形成沉淀。 沉淀法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点，广泛应用于氨基酸工业提取中【3 4 1 。 目前较成熟的工艺有：苯甲醛缩合提取精氨酸；c g - - 甲苯4 磺酸沉淀提取亮氨酸；氯化 汞沉淀提取组氨酸；从生产半胱氨酸的废母液中回收胱氨酸；用等电点沉淀法提取谷氨酸。 ( 2 ) 离子交换法 离子交换法是利用离子交换树脂对不同的氨基酸吸附能力的差异对氨基酸混合物进 行分组或实现单一成分的分离。离子交换法是氨基酸工业中应用最广泛的分离与纯化方法 专一【3 5 】，oo 氨基酸是一种两性电解质，在酸溶液中，氨基酸以阳离子状态存在，因而能被阳离子 交换树脂交换吸附；在碱性溶液中，氨基酸能以阴离子的状态存在，因而能被阴离子交换 树脂吸附。由于氨基酸的性质，如酸碱度、极性和相对分子量的大小彼此不同，离子交换 树脂对各种氨基酸的交换吸附能力也不同。强酸性或强碱性离子交换树脂，对h + 或o h 。 的亲和力比较小，即使在较低或较高的p h 值下，也不抑制其解离【3 6 1 。 强酸性阳离子交换树脂的游离酸型能交换吸附全部的氨基酸，氨基酸的等电点值越 大，亲和力越大，交换吸附能力越强。当氨基酸溶液的p h 值在中性氨基酸的等电点范围 内时，强酸性阳离子交换树脂的游离酸型优先地交换吸附碱性氨基酸；强酸性阴离子交换 树脂的盐型只吸附碱性氨基酸。强碱性阴离子交换树脂的游离碱型对等电点p h 值大于 1 0 0 的精氨酸交换吸附能力弱；对等电点值小于1 0 0 的氨基酸交换吸附能力较强，等电 7 点值越小，交换吸附能力越强。当氨基酸溶液的p h 值在中性氨基酸的等电点范围内时， 强碱性阴离子交换树脂的游离碱型优先地交换吸附酸性氨基酸；强碱性阴离子交换树脂的 盐型只交换吸附酸性氨基酸【3 7 - ”】。弱酸性或弱碱性离子交换树脂，对矿或o h 。的亲和力 大，即使在微酸性或微碱性环境，也会抑制其解离。因此一般用其盐型，但是，在特殊情 况下，例如，酸碱中和时，则需用其游离酸型或碱型。总之，根据氨基酸分子中既有氨 基又有经基的两性电离特性，分子中侧链基团( r ) 的性质和等电点的范围，调节氨基酸 混合液的p h 值，选择恰当的离子交换树脂，配合相应的交换基团，可以从混合氨基酸中 分离出酸性、碱性和中性氨基酸。 ( 3 ) 膜分离法 膜过滤法可以实现混合溶液的分离，因为膜和溶液的界面处由于亲水性等原因所引起 的选择性透过，存在筛分效应和电荷效应。筛分效应为待分离物质分子的直径大于膜孔的 直径，将被截留，反之则透过；电荷效应( d o n n a n 效应) 为若膜表面带与待分离物质同 种电荷，则会产生静电排斥作用，反之则会产生吸引作用【4 0 j 。 ( 4 ) 吸附法 吸附法是利用恰当的吸附剂，在一定的p h 条件下，使混合液中氨基酸被吸附剂吸附， 然后再以适当的沈脱剂将吸附的氨基酸从吸附剂上解吸下来，达到浓缩和提纯的目的。常 用的吸附剂有活性炭、高岭土、氧化铝、酸型白土等无机吸附剂。但是吸附法的选择性差， 收率低，特别是一些无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大，尤其活性炭影 响环境卫生。所以吸附法曾有一段时间很少采用，几乎被其它方法所代替。但随着大孔网 状聚合物吸附剂的合成和不断发展，吸附法又重新被人们重视j 。 ( 5 ) 萃取法 氨基酸的萃取分离方法主要有溶剂萃取法、反向微胶团萃取法、液膜萃取法。溶剂萃 取法是用一种溶剂将某种物质从另一种溶剂中提取出来的方法，这两种溶剂不能互溶或只 部分互溶，能形成便于分裂的两相。溶剂萃取法可分为物理萃取和化学萃取。物理萃取法 的理论是基础是分配定律，而化学萃取服从相律及一般化学反应的平衡规律。近些年来先 后开发了化学萃取法分离提取氨基酸，其中有机胺类和磷酸应用最多【4 2 j 。 反向微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体，表面活性 剂的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触，而极性头则排列在内形成极性核，极性核溶于 水后形成了“水池”。当含有氨基酸的水溶液与反向微胶团的有机溶剂相混合时，氨基酸 以带电离子状态进人反向微胶团的“水池”内或微胶团球粒的界面分子膜内而被分离。 国外关于反胶团萃取氨基酸的研究主要集中在萃取机理方面，而且主要是对于单一氨 基酸。至今尚未有对于混合氨基酸分离的报道。 1 7 本课题的研究内容 本课题结合国内肉味香精的发展现状和趋势，从国内实际出发，利用废弃的龙虾头为 原料，通过酶解得到龙虾头酶解液，并以此作为主要氨基酸源和还原糖及其它添加物进行 以m a i l l a r d 反应为主的热反应，制备出香味纯正、浓郁的海鲜味香精。研究主要内容如下： ( 1 ) 以香气特征、氨基氮得率和固溶物得率为评价指标，比较风味蛋白酶、a l c a l a s e 酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和动物蛋白酶五种蛋白酶对龙虾头蛋白的酶解效果，选择适 宜的蛋白酶。对选定的酶的酶解工艺进行优，得出较佳的工艺条件。 ( 2 ) 选择几种酶分别与风味蛋白酶复配添加，比较它们的复配酶解效果，从而筛选 出一组酶解后氨基氮得率较高、风味较好的复配酶。对选定的酶的酶解工艺进行优化，得 出较佳的工艺条件。 ( 3 ) 使用活性炭对龙虾头蛋白水解液进行脱色处理，考察温度、p h 值、活性炭用量 对脱色的影响，确定脱色的适宜工艺条件；用离子交换树脂对龙虾酶解液中的氨基酸进行 分离精制，确定分离氨基酸较佳的工艺条件。 ( 4 ) 建立h p l c 分析氨基酸的方法，利用高效液相分析样品中氨基酸种类及含量的 变化，动态描述分离过程。 ( 5 ) 用酶解得到的水解液为原料，结合还原糖、氨基酸等辅料通过m a i l l a r d 反应合 成海鲜味香精。以香气为评价指标，考察还原糖的种类、p h 值、反应时间、温度、还原 糖浓度、氨基酸含量等因素对产物的影响，确定合成海鲜味香精的最佳反应条件。 ( 6 ) 用氨基酸分析仪对龙虾头蛋白复配酶水解液进行分析检测，确定氨基酸组成及 含量；采用气质联用( g c m s ) 对挥发性风味成分进行分析，确定其组成及含量。 9 2 蛋白酶解实验 2 1 引言 生物酶酶解蛋白质技术是利用酶的催化分解作用，将大分子的蛋白质在一定程度上切 割成小分子的肽类和氨基酸，用酶解技术获得的蛋白水解液含有大量的游离氨基酸和水溶 性蛋白，并且营养全面，克服了酸法、碱法的水解程度难以控制，氨基酸易分解，产生有 毒有害物质，易导致氨基酸的消旋，造成营养成分损失等问题；而且由于蛋白酶具有水解 专一性，可以有选择地水解某些特定的氨基酸肽键；另外，蛋白酶解还可避免酸法、碱法 对环境产生污染。蛋白酶解得到氨基酸及其它的营养物质绿色环保，可直接用于各种食品、 保健食品及调味品中，也可作热反应型肉味香精优良的氨基酸源。目前已有不少采用蛋白 酶水解海产品、牛肉、鸡胸脯肉、猪肉的报道，制得的动物水解蛋白用于制备肉类风味料。 余杰等【4 3 】对酶法制取龙头鱼水解蛋白及海鲜风味料进行了研究，得到很好的应用效果； 江南大学的谭斌m 】对牛肉蛋白水解物的特性及模式体系的m a i l l a r d 反应进行了研究，对 不同水解度水解产物的游离氨基酸含量与多肽分子量分布进行了分析。目前，对龙虾头的 酶解研究较少，章超桦等【4 5 】对刀额新对虾自溶的影响因素如紫外线、无机离子、p h 值、 温度梯度等的研究，为虾组织自溶技术提供了一个基本模式；林奕封等1 4 6 j 也深入了内源 蛋白酶对近缘新对虾头的水解，确定了最佳水解条件；但是只靠内源酶的水解是不够彻底 的，梁郁强、孙俊华【47 】报道了利用中性蛋白酶水解虾头，水解液游离氨基酸丰富，具有 浓郁虾味，可以生产调味汁。 龙虾头中含有大量的蛋白质、磷脂质、虾青素和多种矿物质，这些成分具有一定的功 能性作用，研究虾头中蛋白质的有效利用显得非常有意义。本章的目的是筛选合适的酶制 剂，并对酶解工艺进行优化，提高蛋白质水解度，得到尽可能多的氨基酸及其它营养物质， 并为m a i l a r d 反应制备海鲜味香精提供优质的的氨基酸源。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 实验材料 新鲜的龙虾头，市场采购，经过清洗、烘干、粉碎备用。 2 2 2 酶制剂 1 0 表2 - 1 实验所用蛋白酶的性质 酶名称生产厂家 测定酶活力u + g 。温度p h 值 作用特性 2 2 3 实验设备 j a 3 0 0 3 n 电子天平 精密p h 计p h s 2 5 型 数显恒温水浴锅h h 2 温控电热磁力搅拌器 7 2 1 分光光度计 恒温烘箱 氨基酸分析仪 2 2 4 实验方法 上海精密科学仪器有限公司 上海精科雷磁 国华电器有限公司 美国莱伯泰科技有限公司 上海航空测控技术研究所 上海实验仪器厂有限公司 a 2 0 0a m i n on o v a 取适量前处理好的虾粉，放入烧杯中，加蒸馏水，用n a o h 和h c i 调p h 值，加入一 定量蛋白酶，在一定温度下水解。酶解结束后升温到9 0 c 灭酶2 0m i n ，中止反应。然后 用真空抽滤，得到龙虾头水解液。酶解工艺流程如下所示： 甲 困一匝卜圈一 圈 2 2 5 分析检测 2 2 5 1 蛋白酶活力测定：福林法【4 8 】 酶活力的定义为：1g 酶粉( 或1m l 液体酶) ，在一定温度和p h 值条