（化学工程专业论文）聚乙烯醇修饰脂质体的制备研究.pdf

摘要 摘要 脂质体是磷腊分散在水中形成的具有双分子层，内部为水相的闭合囊泡，由 于其可以包封水溶和脂溶性物质，目前主要被用作缓释性靶向给药的载体。 脂质体在应用中还存在这许多亟待解决的问题，如天然磷脂的制备、脂质体 的不稳定性等。因此本研究的目的就是解决上述问题，制备聚乙烯醇修饰的脂质 体。 本文首先用溶剂萃取法联合超临界c 0 2 萃取法从市售的大豆磷脂中提耿脂质 体用高纯度的大豆卵磷脂。通过h p l c 的分离检测证明，产品中p c 含量为9 4 9 8 。 过氧化性的研究表明大豆卵磷脂是不稳定的。通过详细的讨论抗氧化剂v e 的抗 氧化效果以及b h t 和v c 的协同抗氧化作用，确定了v f 和b h t 为脂质体用的抗 氧化剂。 本文用复乳法制备了一种新的聚乙烯醇修饰脂质体。此制备方法首先是将大 豆卵磷脂溶于有机溶剂中，与待包封物的水溶液形成o w 乳液，然后再与聚乙烯 醇溶液混合形成w o w 乳液，最后去除有机溶剂。实验结果表明第二步乳化过 程以及溶剂去除温度直接影响到脂质体的性质。脂质体的包封率随着第二步乳化 温度的升高而降低，第二步超声时间的增加会增加脂质体的包封率，减小脂质体 的粒径，增加p v a 的吸附量，但是时间太长会使脂质体破裂。去除有机溶剂时， 温度越低，所得到的脂质体的粒径就越小。 用不同醇解度的聚乙烯醇制备脂质体，结果显示吸附量随着聚乙烯醇醇解度 的增加而减少，脂质体的粒径随着聚乙烯醇浓度的增加先增加后降低，凶此在聚 乙烯醇修饰的脂质体中是其分子中的乙酸酯基团与脂质体帽互作用。 对脂质体进干亍了质量评价，电镜照片表明所制得的脂质体为圆球状，粒径分 布比较均匀。3 1 p n m r 谱图显示聚乙烯醇修饰脂质体在微观上是片层六角相，立 方六角相和六角形h i i 相3 种结构的混合，当聚乙烯醇浓度为4 时，脂质体中有 层状相存在。粒径和z e t a 的测定结果表明聚乙烯醇修饰脂质体粒径都随着聚乙烯 醇的加入而大于大豆卵磷脂脂质体，同时z e t a 电势减小。这说明聚乙烯醇存在于 脂质体的外测。聚乙烯醇的加入使得脂质体的包封率增大。脂质体混悬液的p h 值随着放置时间的增加而下降。泄漏率的实验结果表明聚乙烯醇修饰脂质体在血 液中的泄漏率要大于在p b s 缓冲溶液的，并且其泄漏率随温度的升高和储存时间 的增加而增加。 将聚乙烯醇修饰脂质体与大豆卵磷脂脂质体、聚乙烯醇包覆的脂质体进行比 华南理工大学博士学位论文 较，结果显示相比较于大豆卵磷脂脂质体，聚乙烯醇的掺入使得脂质体的包封率 增加，粒径增加，z e t a 电势降低，泄漏率降低，这说明聚乙烯醇起到了稳定脂质 体的作用。在两种聚乙烯醇脂质体中，聚乙烯醇修饰脂质体的泄漏率小于聚乙烯 醇包覆的脂质体。在三种脂质体中，用复乳法制备的脂质体时最稳定的。 探讨了聚乙烯醇稳定脂质体的机理。我们认为聚乙烯醇的掺入之所以可以稳 定脂质体是因为聚乙烯醇存在于脂质体的外测，它可以提高空间稳定的作用。但 是当p v a 浓度过高时，会因为出现空缺层而稳定性降低，泄漏率有所增加。 探讨了脂质体泄漏的机理，研究表明，由于不同脂质体的通透系数不同，随 意导致了泄漏率的不同。聚乙烯醇脂质体由于有聚合物保护，所以通透系数小， 泄漏率小。两种聚乙烯醇脂质体的制备方式不同，所以聚乙烯醇在脂质体中的作 用方式可能不同，使得脂质体膜的通透系数不同，泄漏率不同。 关键词：脂质体；聚乙烯醇；复乳法；大豆卵磷脂 a b s t r a c t a b s t r a c t l i p o s o m e sa r el i p i d ss u s p e n d e di nw a t e rw i t hs p h e r i c a ls e l f - e n c l o s e ds y s t e m w h i c hh a v eb i l a y e rs t r u c t u r e sa n da ni n n e ra q u e o u sp h a s e b e c a u s el i p o s o m e sp o s s e sa l o to f a d v a n t a g e s ，s u c h a s b i o c o m p a t i b i l i t y ，t h ea b i l i t y t o e n c a p s u l a t e b o t h w a t e r s o l u b l ea n dl i p i d s o l u b l em o l e c u l e s ，b i o d e g r a d a b i l i t ya n dt h ea b i l i t yt od e l i v e r y d r u g st os p e c i f i ct a r g e ts i t e s ，s ot h e ma r ec u r r e n t l yb e i n gu s e da sad r u gd e l i v e r y c a r r i e rf o rt h es u s t a i n e dr e l e a s eo fad r u gc o m p o u n dt oas p e c i f i cs i t ei nt h eb o d y t h e r ea r em a n yp r o b l e m sn e e dt ob er e s o l v e du r g e n t l yf o rt h ea p p l i c a t i o no f l i p o s o m e s ，f o re x a m p l e ，t h ep r e p a r a t i o no ft h er a wm a t e r i a l sa n dt h es t a b i l i t yo f l i p o s o m e s t h e r e f o r e ，t h ep u r p o s eo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st os o l v et h ea b o v ep r o b l e m s ， a n dm a k et h el i p o s o m e sm o d i f i e db yp o l y v i n y la c o h 0 1 i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，am e t h o d ，c o m b i n e ds u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ee x t r a c t i o n a n ds o l v e n t e x t r a c t i o n ， i sc h o s e nt o p r e p a r eh i g h p u r l t ys o y b e a n p h o s p h a t i d y i c h 0 1 i n e s ( s p c ) w h i c h i s l i p o s o m a l m e m b r a n em a t e r i a lf r o ms o y b e a n p h o s p h o l i p i d s t h ep r o d u c tc o n t a i n i n g9 3 9 8w t p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s ( p c ) i s a n a l y z e db yh p l c s p cc a nb ed e g r a d e db e c a u s eo fi t sp e r o x i d a t i o n t h ee f f e c to f s o m ea n t i o x i d a n t ss u c ha sv e ，b h ta n dv co nt h ep r e v e n t i o no fs p cp e r o x i d a t i o na r e s t u d i e d v ea n db h ta r ec h o s e na sa n t i o x i d a n t si nl i p o s o m e s an o v e ll i p o s o m em o d i f i e dw i t hp o l y v i n y la l c o h o l ( p v a ) w a sp r e p a r e db yt h e m e t h o di nw h i c hl i p s o m e sw e r ef o r m e dt h r o u g ht w os t e p so fe m u l s i f i c a t i o na n d d i s p e r s i o n f i r s t ，s p cw a sd i s s o l v e di no r g a n i cs o l v e n t ，t h e na d d e dt h ea q u e o u s s o l u t i o no fe n t r a p p e dm a t e r i a l ，a n dt h i sm i x t u r ew a se m u l s i f i e d b yu l t r a s o n i c e m u l s i o nt of o r mw ot y p ee m u l s i o n t h ep r o d u c tw a st h e ni m m e d i a t e l ya d d e dt op v a s o l u t i o nt of o r maw o wt y p ee m u l s i o n f i n a l l yr e m o v e dt h eo r g a n i cs o l v e n tf r o m g e n e r a t el i p o s o m e s t h es e c o n de m u l s i f i c a t i o na n dt h ep r o c e s so fr e m o v i n gt h e o r g a n i cs o l v e n tw i l li n f l u e n c et h ep r o p e r t i e so fl i p o s o m e s t h el i p o s o m ee n t r a p m e n t e f f i c i e n c yd e c r e a s e da st h ei n c r e a s e dt e m p e r a t u r ed u r i n gt h es e c o n de m u l s i f i c a t i o n h i g he n t r a p m e n te f f i c i e n c y ，l a r g e ra m o u n to fa d s o r p t i o no fp v aa n ds m a l l e rs i z e w e r eo b t a i n e dw h e nt h es e c o n de m u l s i f i c a t i o nw a sp e r f o r m e da tl o n gu l t r a s o n i c e m u l s i o nt i m e ，b u tt h el i p o s o m e sw o u l db r o k e na tl o n g e rt i m eo fu l t r a s o n i c a n d s m a l l e rl i p o s o m ep a r t i c l e sw e r eo b t a i n e dw h e nt h eo r g a n i cs o l v e n te v a p o r a t i o na ta l o w e r t e m p e r a t u r e t h r e ek i n d so fp v aw i t hd i f f e r e n td e g r e eo fh y d r o l y s i sw e r ec h o s e nt op r e p a r e d l i p o s o m e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta d s o r p t i o na m o u n to fl i p o s o m e sd e c r e a s ea st h e i i i 华南理工大学博十学位论文 h y d r o l y s i sd e g r e eo fp v a i n c r e a s e t h i si n d i c a t e dt h a tt h ea c e t a t eg r o u p si nt h ep v a m o l e c u l a ri n t e r a c t e dw i t hl i p o s o m e s t h ep r o p e r t i e so ft h el i o p o s o m e sw e r es t u d i e db ye l e c t r o nm i c r o g r a p h sw h i c h s h o w e dt h ep a r t i c l e sw e r es p h e r ew i t hh o m o g e n e o u sd i s t r i b u t i o no fp a r t i c l e ss i z e t h e “p n m r a n a l y s i s s h o w e dt h a tt h e l i p o s o m e sp o s s e sm i x p h a s e o f h e x a g o n a l p h a s e ，l a m e l l a r h e x a g o n a lp h a s ea n dc u b i c h e x a g o n a lp h a s e w h e nt h ec o n c e n t r a t i o n o fp v ai n c r e a s e dt o4 ( w w ) t h eb i a l y e rp h a s ee x i s t e di nt h el i p o s o m e t h ep o l y m e r l a y e re x i s t e n c eo nt h el i p o s o m a ls u r f a c ei sc o n f i r m e db yt h ei n c r e a s ep a r t i c l e sa n dt h e r e d u c t i o nv a l u eo f t h el a r g e re n t r a p m e n te f f i c i e n c yw a so b t a i n e dw h e np v aw a s i n c o r p o r a t e d t h ep hv a l u eo fl i p o s o m e ss o l u t i o nw i l lh a v ed e c r e a s ed u r i n gi tw a s s t o r a g e t h er e s u l t so fl e a k a g ee x p e r i m e n t s h o w e dt h a tt h el i p o s o m ee n t r a p p e d m a t e r i a li nb l o o dl e a k a g em o r et h a ni nt h a to fp b s a n dt h el e a k a g er a t ei n c r e a s e d w i t ht h ep r o l o n g a t i o no fs t o r a g et i m ea n dt e m p e r a t u r e c o m p a r i n gt h el i p o s o m e s ( e - l i p ) w i t hl i p o s o m e ( c l i p ) c o a t e dp v a a n ds - l i p ，i t c a nb es h o w e dt h a tt h ep v am o d i f i e d l i p o s o m e s h a v e l a r g e re n t r a p m e n t e f f i e n c y ，l a r g e rp a r t i c l es i z e ，r e d u c t i o no ft h ev a l u eo f a n dt h es m a l ll e a k a g e r a t e a m o n gt h et h r e ek i n d so fl i p o s o m e s ，t h ee l i pi st h em o s ts t a b l eo n e t h es t a b l em e c h a n i s mo fp o l y m e rm o d i f i e dl i p o s o m e sw a ss t u d i e d b e c a u s eo ft h e e x i s t e n c eo fp o l y m e rl a y e ro nt h el i p o s o m a ls u r f a c e ，i th a v es t e r i cs t a b i l i z a t i o ne f f e c t o nt h es y s t e m w h e nt n ec o n c e n t r a t i o no fp v aw a st o ol a r g e ，t h es t a b i l i t yo ft h e l i p o s o m ew a si m p a r e db yd e p l e t i o nl a y e r t h em e c h a n i s mo fl e a k a g ew a sa l s os t u d i e d w eb e l i e v et h a tt h ed i f f e r e n c eo ft h e l e a k a g ei s b e c a u s eo fad i f f e r e n c ei np e r m e a b i l i t yc o f f i c i e n t f o rt h ee x i s t e n c e p o l y m e rl a y e ro nt h ec l i pa n de l i p ，t h ep e r m e a b i l i t yc o e f f i c i e n ti ss m a l l t h et w o l i p o s o m e sw e r em a d eb yd i f f e r e n tm e t h o d s ，s op v ai n t e r a c t w i t h l i p o s o m e s i n d i f f e r e n tw a y sa n dt h e r ew e r ed i f f e r e n tc o e f f i c i e n t s k e yw o r d s ：l i p o s o m e ，p o l y v i n y la l c o h o l ，m u l t i e m u l s i f i c a t i o n ，s o y b e a n p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s i v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：确矮物 日期：年硐7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 保密回，在五年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 昶觳枷 j 锨钦 日期：y l l 年s 月吁日 日期2 h 年月? 日 第一章绪论 第一章绪论帚一早三百t 匕 1 1 概述脂质体 脂质体( 1i p o s o m e ) 最早是1 9 6 5 年由b a n g h a m 等作为生物膜的模型提出 的。b a n g h a m 等发现将磷脂分散在水中会形成多层囊泡，每一层均为脂质双分子 层，囊泡中央和各层之间被水相隔开，后来就将这种由磷脂双分子层组成，内部 为水相的闭合囊泡称为脂质体。 图1 一l 脂质体的结构示意图 f i g 1 1s c h e m a t i cr a p r e s e n t a t i o l lo ft y p i c a ll i p o s o m e s 脂质体一经发现，就引起了生物学家、药学家的兴趣。在很长一段时间内， 脂质体一直被作为生物膜的模型来研究膜的性质”。1 。在这些研究的基础上，在 7 0 年代初，g r e g o r i a d i s 等根据脂质体特点，提出可以用脂质体作为药物载体的 可能性，并用脂质体作为b 一半乳糖苷酶载体治疗糖累积疾病“，研究中发现药 物经脂质体包封后，药物动力学发生了很大的变化，药物在体内的分布发生了变 化，药物在体内的半衰期大大延长了，药物的毒副作用得到了明显的改善。在此 之后，人们开始应用脂质体作为药物载体，包封不同的物质来进行了研究一”。 当前脂质体的研究主要集中在四个领域：膜模拟研究：药物的可控释放和体 内的靶向给药；皮肤化妆品等同用工业品基质：基因及其它活性物质向细胞内的 转运。近十年来，用脂质体包裹的药物、疫苗等新产品的不断问世，极大的推动 了脂质体的研究与发展。 1 2 脂质体的组成 细胞膜的化学成分主要是类脂和蛋白质。类脂是脂的衍生物，细胞膜中的类 脂主要是磷脂和胆固醇。 华南理工大学博十学位论文 1 2 1 磷脂 磷脂对生物膜的生理活性和机体的正常代谢有重要的调节功能，研究发现几 乎所有的生物细胞均含有磷脂”。目前最有实用价值的磷脂原料是大豆和蛋黄。 磷脂是一种极性脂，根据其主链结构，可分为两大类：磷酸甘油酯 ( p h o s p h 0 9 1 y c o r i d e ，p l ) 和鞘磷脂( s p h i n g o m y e l i n ，s m ) 。通常人们所说的磷 脂是磷酸甘油酯，其分子结构示意图如下所示： 图卜2 磷酸甘油酯的结构示意图 f i 9 1 2m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fp h o s p h o g l y c o r i d e 磷脂分子由一个头部和两个尾部组成，头部是可以溶于水；向下延伸的两条 平行的尾部是脂肪酸链，每条链有1 0 至2 4 个碳原予。一般r 。往往是饱和的，而 r 。是不饱和的，它多数含有1 个顺式双键，但也会含有2 ，3 或是4 个顺式双键。 磷酸甘油酯中的磷酸基团可以被各种结构的小分子化合物酯化，形成不同的磷酸 甘油酯。 磷脂酸( p h o s p h a t i d i ca c i dp a ) 2 第一章绪论 磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i h ep c ) 磷脂酰乙醇胺( p h o s p h a t i d y l e t h a n 0 1 a m i n e p e ) 磷脂酰丝胺酸( p h o s p h a t i d y l s e r i n e p s ) 磷脂酰甘油( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o p g ) 磷脂酰肌醇( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o lp 1 ) 图i 一3 常见磷脂的化学结构式 f i g 1 3 m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fr e p r e s e n t a t i v el i p i d s 图卜3 是几种常见的磷脂的化学结构式。不同的磷脂的差别在于其极性头部 的大小、形状和电荷的差异。在常见的磷脂中，磷脂酰胆碱( p c ，卵磷脂) 、磷脂酰 乙醇胺( p e ，脑磷脂) 是中性的，脂质磷脂酸( p a ) 、磷脂酰甘油( p g ) 、磷脂酰 肌醇( p i ) 是负电荷磷脂，脂质硬脂酰胺( s a ) 是正电荷磷脂。 1 2 2 胆固醇 胆固醇是一种中性脂质，也属于双亲分子，但是亲油性大于亲水性，它在各 类动物细胞膜中含量较高，在植物细胞膜中含量较少。胆固醇的加入会使脂质体 的膜固化，减少自由基的生成，降低磷脂的的氧化水平，使稳定性显著增加。 华南理工大学博士学位论文 3 图1 - 4 胆固醇分子结构 f i g 1 4m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc h o l e s t e r o l 1 3 脂质体的结构 1 3 1 磷脂分子在脂质体中的结构 1 3 1 1 磷脂分子的堆积结构 磷脂分子所形成的结构，主要是由磷脂分子和水含量决定的，对于类脂分子 的各种结构，可由堆积参数( p ) 来表示： p ：j l( 1 1 ) a o ，。 式中：v 为分子的体积，a 。为磷脂分子极性头部的横截面积，l 。为碳氢链的长度。 p 不同磷脂分子堆积的形式有所不同，图卜5 显示的是各种磷脂分子的堆积形状。 对于具有两条疏水尾部的磷脂分子如p s ，p c 等而言，它们的极性头部基团的 横截面积与两条尾部的横截面积大致相等，分子呈圆柱形，在水中自发排列呈片 层( 或称液晶) 形式。片层具有双分子层结构，磷脂分子的亲水头部伸向双分子 层两侧表面，疏水尾部则伸向内侧，双分子结构还可以进一步闭合形成球形的脂 质体，以减少疏水尾部与水相接触的机会。当脂质体在某些因素作用下出现缺口 时，缺口处能自行闭合。磷脂分子的这种能够形成双层结构，同时又可以自我闭 合的特性以及其流动性在生物膜的结构中起着重要的作用。 4 第章绪论 培血磺艚 硪痛陡胆喊 威庸睫吐韫醚 螭磺庸 磺庸酰乙衅胺 硗俺畦 晟凸 1 3 ( d ( 1 z 内岛型穗腔耋 图卜5 各种磷脂分子的堆积形状 f i g 1 5m o d e lo fg e o m e t r i c a lp a c k i n go fv a r i o u s1i p i d s 当磷脂分予的亲水头部横截面积大于疏水尾部的截面积时，脂类分子呈倒圆 锥形，如溶血磷脂等，这类分子在水环境中形成小球状的分子团或微囊，非极性 的疏水尾部朝向微囊的内面。 若磷脂分子的两条疏水尾部均由不饱和烃所组成，如磷脂酸，p e 等，它们的 亲水头部的截面积就会小于疏水尾部的截面积，整个分子呈圆锥形，在水相中形 成内翻型的微囊，即亲水头部朝向微囊内面。微囊和内翻型微囊都是非双分予层 膜结构，可能在膜的融合，内外层脂质分子的翻转运动等生物学过程起着重要的 作用。 1 3 1 2 磷脂分子在水溶液中的结构 磷脂分子溶于水时，会随着磷脂分子浓度的不同而产生不同的结构，参照 图卜6 ，在稀溶液中，磷脂分子可能会以单体，二聚体或低聚物的形式将憎水基 靠拢而分散在水中，随着磷脂浓度的增加，当达到临界胶束浓度( c m c ) 时，磷脂 分子开始聚集，形成球状胶束( a ) ，其亲水的极性基朝外，与水分子接触，而非 极性基朝里，被藏在胶束内部，随着磷脂浓度的进一步增加，胶束的大小或数量 也增加，磷脂会形成棒状胶束( b ) 或是盘状胶束( c ) ，或是堆积成六方i ( e ) ， 浓度进一步增加，磷脂膨胀形成更稳定的形态即层状相，这种层状相( f ) 随着双 分子层中磷脂分子和水分子层的改变而改变。随着两种分子的增加，水膜的厚度 减小，此时脂质体的相态变成了极性头朝里，而非极性的碳氢链向外的反六方相 h i i ( g ) 。 同 口 2|圈溉瘴ll蹦0t目 n耳8 华南理工大学博士学位论文 图卜6 磷脂在水溶液中的几何形状 f i g 卜6g e o m e t r yo fl i p i d sa g g r e g a t i o ni nm i x t u r ew i t hw a t e r 1 。3 1 3 磷脂分子的交叉双层排列 在生物膜中存在着酰基链长度不同的磷脂分子，而膜的厚度是均一的。由于 生物膜脂双层结构在水中的排列方式必需采用能量最低的形式，而且磷脂分子的 极性头部的表面积要和其酰基链横截面相匹配，同时酰基链在范德华力的作用下 取最大的排列方式，在双层疏水区也不能形成空隙，因而在一定条件下，这些脂 质分子的酰基链很容易排列形成交叉双层结构。根据交叉结构的不同，可以分为 全交叉，部分交叉和混合交叉。 交叉双层结构使脂质体头部的表面积增加，降低了单位面积的电荷密度。在脂 质双层结构间，水化作用的排斥力是主要的相互作用，它可以防止水化的脂质分 子双层与双层之间相互接触并进一步避免脂质融合。交叉结构的形成使水化作用 排斥压降低，并促使脂质融合。 a 图卜7 磷脂分子的排列示意图( a 无交叉，b 全交叉，c 混交叉，d 部分交叉) f i g 1 7s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fl i p i d sc h a i na r r a n g e m e n t s p o s s i b l ei nb i l a y e r s 氟m氟吡 玎0 e 叫 ；。“u 几u册删 第一章绪论 1 3 1 4 磷脂双键对脂质体膜的影响 磷脂脂肪链的饱和程度影响着脂质膜排列的紧密程度，因而影响着脂质体的 稳定性。由图1 - 8 可以看出全饱和磷脂可以紧密排列，而含有不饱和键的磷脂排 列不紧密，前者要比后者稳定。 a b 图1 - 8 磷脂的脂肪链对脂质体膜的排列的影响( a 饱和，b 不饱和) f i g 1 8 t h ee f f e c to fa c y lc h a i no nm e m b r a n e 1 3 2 胆固醇在脂质体中的结构 在细胞膜中胆固醇一般不与蛋白质结合，而主要与磷脂结合。胆固醇本身不 形成脂质双层结构，但是它以高浓度的方式掺入磷脂膜中，其羟基与磷脂分子中 羧基以氢键的形成复合物，使得磷脂脂肪链自由移动减少，引起膜的压缩，结合 紧密，胆固醇在细胞膜中，本身它在膜中主要起着改变磷脂层性质的作用，趋向 于减弱膜中的类脂与蛋白质之问的连接，它像“缓冲剂”一样起着调节膜结构“流 动性”的作用。磷脂与胆圆醇在脂质体中的排列方式如图卜9 所示： 水 图卜9 胆固醇与磷脂的排列示意图 f i g 1 9s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f1i p i d sa n dc h o l e s t e r o la r r a n g e m e n t s 1 3 3 脂质体的形成机理 有一些学者认为当磷脂与水混合时，在无外力的作用下会自发的形成脂质体， 但是实际上这是不可能的。因为研究发现脂质体是热力学不稳定体系，因此是不 华南理t 大学博士学位论文 可能自发形成的。为了能够形成脂质体，首先必需施加外力，例如搅拌、超声、 挤压和均质，但是脂质体形成之后，体系不稳定容易聚集、融合成大的、多层 脂质体，最终沉降。 磷脂分子分散在水中，聚集成各种结构以使其整个体系的吉布斯自有能g 最低，这个过程通过最大化亲水作用和最小化疏水作用来完成，双亲分子聚集， 把两条疏水链结合在一起，避开水相，而亲水的头部基团结合在一起暴露于水相， 导致磷脂分子能自身排列成一个个封闭小室，内部含有一定体积的水溶液。这种 现象称为自组装。自组装是一种普遍存在于生命体系中的现象，是生命的最本质 的内容之一。大量复杂的具有生物学功能的大分子系统( 如蛋白质，核酸，生物膜) 正是通过分子自组装形成的“”。 当分子从水相到非极性相时，每个一c h 。和一c h 3 分别可获得7 0 0 c a l m o l 和 2 1 0 0 c a l m o l 的能量，另外极性头部的水合也会使体系a g 的降低，因此制备好的 脂质体应该放置一段时间以使其充分的水合。 用不同的方法制备的脂质体是不同的类型，这表明在腊质体的形成过程中由 不同的机制。脂质体的形成目前认为主要由“芽殖”机理和磷脂分子自组装形成 小的“类脂碎片”，如下图所示： 图卜l o 脂质体形成的机理( a 芽殖，b 类脂碎片) f i g 1 1 0 e c h a n i s mo fl i p o s o m ef o r m a t i o n 在“芽殖”机理中，双分子层的连续性和完整性一直保持到最后，在后一种 机理中，在脂质体形成的早期阶段双分子层就已经破裂了。脂质体的形成主要 有两种途径，对于大脂质体，通过芽殖的发生生成脂质体容易，对于小的脂质体， 形成磷脂双层碎片，使其边缘暴露在外面，因此不稳定，通过自身闭合形成泡囊。 目前普遍认为有两种力在脂质体的形成过程中发挥着重要的作用：一种是双 分子层的弹性弯曲力，另一种是边缘能量，它能在膜内产生开口，小孔或是缺陷。 第一章绪论 两种力可以导致原来双分子层对称性的破坏，并使体系的能量降到新的最小值， 这就产生泡囊化作用。 1 4 脂质体的性质”“”， 1 4 1 相变温度 脂质体膜的物理性质与温度有密切的关系，当温度升高时，脂质双分子层中 的酰基侧链从有序变为无序排列，这种变化引起脂膜的物理性质发生变化，由“胶 晶”态变为“液晶”态。此时膜的流动性增加。这种转变时的温度称为相转变温 度( t 。) 。所有的磷脂都具有特定的t 。，这依赖于极性基团的性质、酰基链的长度 和不饱和程度。一般而言，增加链的长度或增加链的饱和度将增加t 。在相变温 度以下时，由于磷脂分子的脂肪酰链为全反式构相，排列紧密，膜刚性和膜厚度 都增加，膜的结构处于晶态；当在相变温度以上时，由于脂肪酰链的伸缩、弯曲 及歪扭现象和侧向移动，膜结构处于流动态和液晶态：当磷脂发生相变时，可有 液态、液晶和晶态共存，出现相分离，易导致包封物的泄漏。由于脂质体的相变 行为决定其通透、融合、聚集和蛋白质结合，所有的这些都明显影响脂质体的稳 定性和它在生物体内的行为。 1 4 2 膜的通透- 洼 脂质体膜是半透性膜，不同离子穿膜和分子扩散过膜的速率有极大的不同。 对于在水溶液和有机溶液中溶解度都很高的分子，脂质膜是一种非常弱的屏障。 极性溶液如葡萄糖和高分子化合物通过膜非常慢。中性电荷的小分了如水和尿素 都能很快的扩散，而带电的离子的行为有很大的差异，质子和羟基离子穿膜非常 快，可能是由于水分子间的氢键结合的结果，钠和钾离子跨膜则非常慢。随着磷 脂链不饱和程度的增加，钠离子的通透性下降，而葡萄糖分子的通透性稍有增加， 若增加磷脂脂肪酸链的长度，由于膜的厚度的增加，所有物质的通透性都有所降 低。 1 5 脂质体的制备方法及分类 1 5 1 脂质体的分类 1 5 1 1 根据脂质体的结构和粒径分类 ( 1 ) 单室脂质体：脂质体中只有一层双分子层，根据其大小分为： 小单室脂质体( s m a l lu n i l a m e l l a rv e s i c l e s ，s u v s ) ，粒径最小为2 0n m ， 但都小于2 0 0 n m ；大单室脂质体( l a r g eu n i l a m e l l a rv e s i c l e s ，l u v s ) 粒径在 华南理t 大学博士学位论文 2 0 0 1 0 0 0 n m 之i 司 二者相比较而言，小单室脂质体粒度分布均匀，在循环系统中的停留较长， 靶向性较强，但包封率较低，脂质膜内外层问的脂质分布不均匀；大单室脂质体 包封率高，为生物膜的良好模型，但膜不够稳定。 ( 2 ) 多室脂质体：又称多层脂质体( m u l t i l a m e l l a rv e s i c l e s ，m l v s ) ，粒径 小于5l im ，是药物溶液被几层脂质双分子层所隔开形成不均匀的聚积体，其包封 率较低，稳定性较好，容易制备在循环系统停留时间不如s u v s 长。 ( 3 ) 多囊泡脂质体( m u l t i v e s i c u l a ry e s i c l e s ，m v v s ) ：在一个大的脂质体中 有一些独立的脂质体。其直径比微胶囊小，一般大于ium ，最大不超过5 “m ，目 前国外多用作抗癌，酶制剂和抗生素的药物载体。 1 5 1 2 根据脂质体的性能分类 ( i ) 一般脂质体，包括单室脂质体、多室脂质体和多囊泡脂质体。 ( 2 ) 特殊性能的脂质体，包括热敏性脂质体、p h 敏感脂质体、免疫脂质体、 光敏性脂质体等。 1 5 1 3 根据脂质体的表电面荷分类 磷脂的头部带有不同的电荷，带正电荷的脂质形成的脂质体为正电荷脂质体 或阳离子脂质体，带负电荷的脂质形成的是负电荷脂质体。不带电荷的脂质形成 的是中性脂质体。 1 5 2 脂质体的制备 脂质体的制备强调的是粒径大小适中和高包封率。脂质体的制备的所有方法 都包括以下几个步骤： ( 1 ) 磷脂、胆固醇等脂质与所要包封的脂溶物溶于有机溶剂，在一定条件下去 除有机溶剂形成脂质薄膜。 ( 2 ) 使脂质分散在含有需要包裹的水溶性物质水溶液中形成脂质体 ( 3 ) 纯化形成脂质体 ( 4 ) 对脂质体进行质量分析 各种制备方法的主要差别是脂质薄膜分散在水溶液中的方式。脂质体的制备 方法可分为三大类：( i ) 物理分散法：( 2 ) 两相分散法；( 3 ) 去污剂增溶法。 1 5 2 1 物理分散法 物理分散法的基本原理是将类脂材料干燥成薄膜，然后加入水溶性介质分散、 膨胀、水合，然后再进一步处理。工艺简单，但是这种方法制备得到的脂质体的 包封率都较低。这种制备方法有：手摇法( 也称薄膜法) 、超声波法、挤压制备法、 干燥重组囊泡法、高压乳化法、f r e n c h 压力制备法。 在这些方法中，手摇法是脂质体制备方法中最原始，但也是至今为止最基 0 第一章绪论 本和应用最广泛的方法，超声波法“”可分为两种：水浴超声波和探针超声波，这 种方法可将m l v 变成s u v ，是制备小脂质体的常用方法。f r e n c h 压力制备法“7 是 在1 3 7 8 2 4 k p a 下进行制备，用这种方法制得的脂质体比超声法形成的脂质体粒径 稍大些，包封率上升。挤压制备法“”的优点是可选择膜的孔径来决定脂质体的大 小，而且经过几次之后比较均匀。干燥重组囊泡法将制备好的脂质体冷冻干燥， 再加入水溶液使其水化，融合再闭合形成高包封率的脂质体。 1 5 2 2 两相分散法 这个方法的基本原理是将类脂溶解在有机溶剂中，然后此油相与水相接触， 再将溶剂蒸发，以变成脂质体。这种方法有3 种类型：溶剂和水互溶( 如乙醇注 入法) ，溶剂和水不互溶，但水相过量( 如乙醚注入法1 ) ，溶剂和水不互溶， 但溶剂过量( 如反相蒸发法m 。2 ”) 。 乙醇注入法缺点是包封率低，且乙醇很难除去。乙醚注入法的优点是方法较 温和，包封率高，但速度慢不适合大量生产。而反相蒸发法适用于包封水溶性物 质，大分子生物活性物质如各种抗生素，胰岛素免疫球蛋白，碱性磷酸酶，核酸 等。用反相蒸发法制得的脂质也称为r e v s 。 1 523 表面活性剂增溶法2 “ 表面活性剂与磷脂分子相连，掩蔽了磷脂分子中的疏水部分，磷脂通过表面 活性剂介导与水密切接触形成混合微团，此方法的特点是从含有磷脂的混合微团 中去除表面活性剂，从而自发形成单层脂质体，但是在制备的过程中有药物的漏 出和稀释，并且在脂质体形成之后，难以去除微量的表面活性剂，因此此法不是 制备脂质体的主要方法。它一般是用于制备脂溶性蛋白类药物的脂质体。 1 5 2 4 脂质体常用制备的比较 从下表可以看出，超声法室是制备s u v s 的主要方法。此外高压乳化法，挤压 制备法，f r e n c h 压力制各法，乙醇注入法都可以制得s u v s 。反相蒸发法是制各 l u v s 的主要方法，表面活性剂增溶法也可以制得l v u s 。相比较与s u v s ，l u v s 的 包封率较高。手摇法制得的是m l v s ，但是包封率很低，近年来有一种反复干燥一 水合法可以制备包封率较高的m l v s “” 所有的方法所制得的脂质体的粒径分布都比较宽。由于粒径对于脂质体而言 是一个重要的衡量稳定性的常数，也是影响其在组织中分布的重要常数，所以一 般在制备脂质体后都要经过聚碳酸酯膜的挤压来使其粒径分布均匀m ，。 华南理t 大学博十学位论文 表卜1 脂质体的粒径与制备方法的关系 t a b l e1 一l r e l a t i o n s h i pb e t w e e np r e p a r a t i o nm e