（生物化学与分子生物学专业论文）纳他霉素高产菌株的构建及其发酵工艺优化.pdf

浙江大学硕上学位论文 摘要 纳他霉素是一种对酵母菌、霉菌等真菌具广谱抗性的多烯大环内酯类抗生 素，作为新型生物防腐剂广泛应用于食品、医疗等领域。由于纳他霉素的发酵 水平较低，生产成本较高，广泛应用受到限制。因此利用基因工程技术提高纳 他霉素发酵水平，具有重要意义。 论文通过s o u t h e r n 杂交、引物步移测序等方法在恰塔努加链霉菌基因组文 库的柯斯质粒p m r d 4 6 上克隆到了纳他霉素生物合成基因簇附近的一个基因 s c n r l ，f r a m e p l o t 分析及序列同源性比较表明s c n r l 是纳他霉素潜在的途径特异 性正调控基因。s c n r i i 是本实验室已克隆到的另一纳他霉素途径特异性正调控 基因，分别将含途径特异性正调控基因的d n a 片段s c n e d + n p ( 自身启动子) 、 s c n r l i + e r m e * p 、s c n r i + s c n r i i + n p ( 自身启动子) 与链霉菌整合表达载体p l j 8 6 3 0 连接，成功构建了重组质粒p l y 2 、p l y 4 、p l y 5 。通过大肠杆菌链霉菌结合转 移方法，将重组质粒p l y 2 、p l y 4 、p l y 5 转至出发菌株恰塔努加链霉菌l 1 0 中， 构建了多拷贝基因工程菌株恰塔努加链霉菌z j u c l 、z j u c 2 、z j u c 3 。 基因工程菌株和出发菌株分别在y e m e ( 不加蔗糖) 和y s g 发酵培养基 中进行摇瓶发酵和正交优化，结果表明：z j u c l 、z j u c 2 、z j u c 3 在y e m e 培 养基中的纳他霉素发酵单位分别为1 9 6 9 l 、1 9 1 9 l 、2 1 2 9 l ，分别比出发菌 株提高了1 7 、1 4 、2 7 ；y s g 培养基中，z j u c 3 的纳他霉素发酵单位为 3 7 6 9 l ，比出发菌株提高了3 3 ；y s g 培养基的正交优化结果表明，葡萄糖和 黄豆饼粉对纳他霉素产量有显著影响，其较优组成为葡萄糖6 0 9 l 、黄豆饼粉 2 7g l 、酵母粉6 5g l 、p h 8 ，优化后z j u c 3 的纳他霉素发酵单位达到4 。1 4g l ， 比出发菌株提高4 6 。 关键词：纳他霉素；恰塔努加链霉菌；途径特异性调控；s c n r l ；基因工程 一一 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t n a t a m y c i n , 部o n ek i n do fp o l y e n em a c r o l i d ea n t i b i o t i c s ，i sab r o a d s p e c t r u m a n t i f u n g a la g e n t i t i s w i d e l yu s e di nf o o di n d u s t r i e sa n dm e d i c a lt r e a t m e n t h o w e v e r , t h ea p p l i c a t i o no fn a t a m y c i ni sl i m i t e db e c a u s eo ft h el o wy i e l do f n a t a m y c i na n dt h eh i 曲c o s to fp r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，i t so fg r e a ts i g n i f i c a n c et o i m p r o v e t h en a t a m y c i n p r o d u c t i o nb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g b ys o u t h e r nb l o t t i n ga n dp r i m e rw a l k i n g ，t h es e q u e n c eo fs c n r lg e n ew a s o b t a i n e df r o mt h ec o s m i dp m r d 4 6 ，a sao r t h o l o g u eo f n a t a m y c i np a t h w a y - s p e c i f i c p o s i t i v er e g u l a t o rg e n ei ns t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s s c n r i ii sa n o t h e rp a t h w a y - s p e c i f i cp o s i t i v er e g u l a t o rg e n eo b t a i n e db yo u r l a b o r a t o r yp r e v i o u s l y t h ed n af r a g m e n t so f s c n r i + n p ( w i t hi t so w np r o m o t e r ) 、 s c n r i i + e r m e * p 、s c n r i + s c n r i i + n p ( w i t ht h e f to w np r o m o t e r s ) w e r el i g a t e dw i t h p l j 8 6 3 0 ，r e s p e c t i v e l y , r e s u l t i n gi np l a s m i dp l y 2 、p l y 4 、p l y 5 ，w h i c hw e r et h e n t r a n s f e r r e di n t ot h e o r i g i n a ln a t a m y c i n - p r o d u c i n gs t r a i n c h a t t a n o o g e n s i sb y c o n j u g a t i o nr e s p e c t i v e l y , g e n e r a t i n gg e n e t i ce n g i n e e r e ds t r a i n ssc h a t t a n o o g e n s i s z j u c l 、z j u c 2 、z j u c 3 i ny e m em e d i u mw i t h o u ts u c r o s e z j u c l 、z j u c 2 、z 几7 c 3r e a c h e dt h e n a t a m y c i ny i e l do f1 9 6 9 l 、1 9 1 9 l 、2 1 2 9 lr e s p e c t i v e l y , a b o u t1 1 7 、1 1 4 、1 2 7 f o l dt h a nt h a to ft h es t a r t i n gs t r a i n z j u c 3r e a c h e dan a t a m y c i ny i e l do f3 7 6g li n y s gm e d i u m ，w h i c hw a s1 3 3f o l do ft h es t a r t i n gs t r a i n t h eo r t h o g o n a ld e s i g n o p t i m i z e dt h e y s gm e d i u ma n dt h e o p t i m i z e dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea s f o l l o w s ：g l u c o s e6 0 e g l ，s o y b e a r lm e a l2 7g l 、y e a s tm e a l6 5g l ，p h 8 t h e o p t i m i z e dy s gm e d i u mr e n d e r e dt h en a t a m y c i np r o d u c t i o no fz j u c 3t ob ei n c r e a s d f r o m3 7 6e g lt o4 1 4 e g l k e y w o r d s ：n a t a m y c i n ，s t r e p t o m y c e s c h a t t a n o o g e n s i s , p a t h w a y s p e c i f i c r e g u l a t i o n ，s c n r i , g e n e t i ce n g i n e e r i n g v n 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘鲎或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：躯蓖囊 签字日期： 冽。年 月7 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：。年即日 签字日期：印碑多肌加 专 浙江大学硕士学位论文 1 1 纳他霉素概述 第1 章绪论 1 1 1 纳他霉素的特性 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 是一种多烯大环内酯类抗生素，也称匹马菌素或 游霉素( p i m a r i c i n ) ，分子式为c 3 3 h 4 7 0 1 3 ，分子结构式见图1 - 1 。它可由三种链 霉菌产生：纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) ，恰塔努加链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s ) 及褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) 。 n 憋 图1 - 1纳他霉素的分子结构 f i g u r el - 1t h ec h e m i c a ls t u r c t u r eo fn a t a m y c i n 纳他霉素微溶解于水，可溶于甲醇、冰醋酸和稀盐酸等，在中性水溶液中 时的活性几乎不受温度影响。纳他霉素在室温条件下活性稳定，5 0 放置几天 或经1 0 0 * c 短时处理，其活性几乎没有损失。1 2 0 。c ：加热不超过1 h 纳他霉素仍 能保持部分活性。 纳他霉素是多烯大环内酯类抗真菌剂，对几乎所有的酵母和霉菌等真菌都 具有抗性。抗菌机理是通过与真菌细胞膜成分中的麦角固醇结合，结合的程度 与麦角固醇的含量成正比，结合后形成抗生素固醇复合物，引起真菌细胞膜结 构的改变，破坏细胞膜的渗透性，造成细胞内一些重要物质的泄漏而使菌体死 亡。纳他霉素对于细胞膜中无固醇成分的细菌则无抗性。 浙江大学硕士学位论文 1 1 2 纳他霉素的应用 由于纳他霉素对酵母菌、霉菌等真菌的广谱抗性及无毒、高效、不致畸、 不致敏、对人体无害无残留等特性，它已被全球三十多个国家作为食品防腐剂 批准使用，我国卫生部于1 9 9 7 年正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂。纳他霉 素成为我国批准使用的仅有的2 种食品生物防腐剂之一( 另一个是乳酸链球菌 素，n i s i n ) 。而纳他霉素的抑真菌作用与乳酸链球菌素的革兰氏阳性细菌的抗 性刚好互补。 如今，作为食品防腐剂的纳他霉素广泛的应用于食品行业，如：奶酪、烘 培食品、肉制品、果蔬汁、饮料和易发霉食品等。 除食品行业外，纳他霉素还可应用于临床医疗，用于真菌引起的皮肤和粘 膜感染、真菌性角膜炎、阴道和肺部的真菌感染等。 它还作为兽药，应用于牛和马的皮肤及黏膜的真菌感染治疗等。 随着人们对纳他霉素的深入研究，它定将在更多的领域发挥作用。 1 2 纳他霉素国内外的生产水平及研究现状 纳他霉素作为安全高效的新型生物防腐剂，应用领域广泛，显示了良好的 前景，但其较高的成本成为限制它应用的一个主要因素。因此，提高纳他霉素 产量，降低其成本和售价，将为纳他霉素开辟更为广阔的市场和应用前景。 目前，国内外对于纳他霉素的生产研究主要集中在诱变育种、发酵工艺、 提取工艺、分析检测等方面。关于纳他霉素基因工程水平的研究才刚刚起步， 相关的文献和报道很少。 1 9 6 0 年，c y a n a m i d 最早报道了发酵生产纳他霉素的传统方法。但接下来直 到9 0 年代，人们才开始重新关注纳他霉素的生产研究。 1 2 1 纳他霉素的发酵生产研究状况 纳他霉素主要是国外的公司生产，生产厂家主要有丹麦的丹尼斯克、荷兰的 帝斯曼公司、西班牙的v g pp h a r m a c h e m z , 以及美国的c y a i l 锄i d 公司( 2 0 0 0 年7 月被b a s f 收购) 等。国内对纳他霉素的研究比国外要相对滞后，且目前只有少数 几所科研院校进行纳他霉素的研究。北京市东方瑞德生物技术有限公司是国内第 一家纳他霉素的生产厂，此外，主要还有上海的奇泓生物科技有限公司、浙江的 一2 一 浙江大学硕上学位论文 银象生物工程有限公司，国内纳他霉素的生产出1 2 也逐渐开始成为热点。 目前国外纳他霉素的工业发酵产量已经稳定在7 9 l 以上，最高可达到1 0 9 l 。 国内公开报道纳他霉素的资料很少，且大多是关于菌种选育、发酵工艺和发酵罐 放大、分离提取工艺等方面的研究，但这些研究还不够深入和系统，纳他霉素的 发酵水平还处于较低的水平，工业化生产进展比较缓慢，与国外专利报道的产量 相差较远。 国内对纳他霉素的最早报道见于2 0 0 2 年，北京市营养源研究所的李东等人 探索了碳源、氮源和磷酸盐对纳他霉素发酵生产的影响。 何艳玲等对间歇补料分批发酵提高纳他霉素产量的工艺进行研究，在5 l 自动发酵罐条件下，还原糖降至2 以下时进行间歇补料添加葡萄糖使其浓度 维持在2 ，纳他霉素产量最高提高到2 3 9 l ，比起始提高3 5 。 杨东靖等根据分子育种中链霉素的抗性基因与链霉菌产抗生素能力之间的 对应关系，利用链霉素的抗性突变作为筛选标记，选育到了纳他霉素高产菌株， 纳他霉素产量比出发菌种提高到1 4 6 。再经过碳源、氮源、培养基初始p h 值、 溶氧、种龄和接种量的发酵工艺优化后，纳他霉素最终产量达到2 8 1 9 l ，比出 发菌株提高到1 7 0 。 骆健美等对影响纳那霉素液体发酵的重要因素采用中心旋转组合设计，进 行发酵优化实验。最后，纳他霉素产量比原始培养条件下提高了2 0 0 ，达到 4 5 9 l 。 李荷迪等研究了纳他霉素产生菌原生质体的最佳制备和再生条件，并在此 基础上对原生质体进行紫外诱变育种。筛选到的菌株纳他霉素的最高产量为 2 5 1 5 0 7 m g l ，增产1 0 7 0 9 。 国外关于纳他霉素发酵方面的研究比较深入和成熟，相关专利报道较多。 艾森申克的专利( c n l 0 7 1 4 6 0 a ) 报道了发酵法生产纳他霉素的菌种培养 与繁殖方法。要用一种适宜生孢子的培养基，菌种繁殖所用的饱子悬浮液浓度 要为1 0 5 - - 1 0 1 0 c f u m l 。菌种细胞干重为1 5 9 l 比较适宜，且菌体细胞密度 是纳他霉素生产培养基体积的o 1 一l o 。 奥尔森的专利( c n l 0 7 0 6 8 8 a ) 报道了连续发酵法生产纳他霉素，产量可 达6 1 2 9 l 。 一3 一 浙江大学硕士学位论文 e i s e n s e h i k n 等人的专利报道了添加碳源、氮源进行纳他霉素的发酵。碳源 浓度保持在5 _ 3 0 9 l ，纳他霉素的产量至少可达5 9 l 。 e s l l h a y s h a 等人探究了接种物类型和培养条件对纳塔尔尔链霉菌发酵产生 纳他霉素的影响。提出用孢子悬浮液进行菌种繁殖，且孢子悬浮液的浓度应为 1 0 8 个m l 。 1 2 2 纳他霉素产生菌的基因工程研究 目前已报道并公认的纳他霉素产生菌有三种：纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ) ，褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) 以及恰塔努加链霉 ( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s ) 。 国内外关于纳他霉素产生菌的基因工程方面的研究目前还处于初步阶段。 相关文献和报道很少。 2 0 0 0 年，西班牙学者a p r i c i oj f 等人对纳塔尔链霉菌a t c c2 7 4 4 8 通过基 因组步移的方法，克隆并鉴定到了纳他霉素的生物合成基因簇，连续的 8 5 k b d n a 序列片段被测定。该基因簇包含1 6 个可读阅读框( 见表1 1 ) ：5 个 大的聚酮合成酶( p k s ) 系统基因：p i m s 0 、p i m s l 、p i m s 2 、p i m s 3 、p i m s 4 ( 见图1 2 ) 和11 个p k s 的后修饰基因。 2 0 0 1 年，m a r t a v m e n d e s 等人从纳塔尔链霉菌中克隆到纳他霉素的合成修饰 基因p h n d ，它编码细胞色素p 4 5 0 环氧酶p i m d ，负责将4 ，5 去环氧匹马霉素( 4 ， 5 d e e p o x y p i m a r i e i n ) 转变成匹马霉素( 纳他霉素) 。而后，m a r t a v m e n d e s 等又通 过中断基区i p i m d ，获得了新型环氧纳他霉素。 d a n f e r b e r 牙i j 用基因工程方法使聚酮化合物在大肠杆菌中得以合成。 2 0 0 5 年，m a r t av m e n d e s 将p i m d 在大肠杆菌中成功表达，首次对多烯大环内 酯类化合物p 4 5 0 单氧化酶进行异源表达和研究 基因工程方法是目前生物技术研究中最接近产业化的领域之一。相比传统的 诱变育种和发酵优化等方法，基因工程方法更为准确有效，且能节省大量的工作 时间和实验材料。由于链霉菌的次级代谢途径与调控庞大而复杂，目前对抗生素 生物合成基因途径和代谢调控机制的研究还不够深入，限制了基因工程在抗生素 生产中的应用。但随着基因组学的普及和分子生物学与分子遗传学的发展及对链 霉菌抗生素生物合成调控机制的深入研究，基因工程方法将成为改造抗生素生产 - 一4 - 一 浙大学硬士学位论文 菌提高抗生素产量的主流方法。 表1 - i 纳他霉亲生物台成基目蔟o r f s 及其功能( 郫建国，王敏2 0 0 3 ) t a b l e i - id e d u c e d f u n c t i o n s o f o r f s 抽t h e p i m a r i c i n b l o s y a t h e d c g e n ec l u s t e r 鲤g塑丝 d h 1 8 岫a 组件o盛ao mmm 组件l硌舶鼹 a c p m # 2b自mnm 组件，珏抽隔风 口 组忭4gmmnm p $ 目# 5b a 1 am日 组件6bmn m # 7 mnm 目* 8bmnm 组粹9自 m m # ”mmm 目m 组件umwm dn d拢m 组件u 硌抽d hn册正 “m# 女c 施b自毋鼬转运曲c m c3 2 氟# 龋 柚咖那绷包色重p - 4 5 d 单氯化酶 脚啦弼胆瑶醉，【化舜 删，柚，铁氧还蛋自 咖6柚粥绷目色素嗍革氧化舜 m浇i 豳，酾 咖，mm* 强 区j “f h 一 t 。 一一，- 7o 一 圈1 - 2 纳他霉素生物台成基因簇 f i g u r e i - 2 0 r 口i s 砒i o f m 。g e n ec l u s t e r f o r p i m a r i c i n b i o s y n t h e s i s ( a p , i c i o3 f , e ta l , 2 0 0 5 浙江大学硕士学位论文 1 3 链霉菌次级代谢调控途径 链霉菌的次级代谢产物丰富而多样，且具有重要的医药与工业价值，如各 种抗生素、酶抑制剂、免疫抑制剂等。链霉菌体的次级代谢受到复杂且多层次 多水平的调控。这些调控体系呈网络状，并不是简单的一对一的线性关系，许 多抗生素的合成受到多个调控基因多种调控途径的作用，且调控基因之间通常 会有相互调控作用。在遗传水平，链霉菌的次级代谢调控可分为三个层次：途 径特异性调控( p a t h w a y - s p e c i f i cr e g u l a t i o n ) 、全局调控( g l o b a lr e g u l a t i o n ) 和多效 性调控( p l e i o t r o p i cr e g u l a t i o n ) 。 1 3 1 途径特异性调控 途径特异性调控为最低层次的调控，它只对某种抗生素或几种具有某些共 同生物合成途径的抗生素的生物合成进行特异性调控。这些途径特异性调控基 因通常位于相应的抗生素生物合成基因簇内部。 链霉菌抗生素调控蛋白家族( s t r e p t o m y c e sa n t i b i o t i cr e g u l a t o r yp r o t e i n s ， s a r p ) 都是链霉菌次级代谢产物的途径特异性正调控因子。该家族成员的n 端 含有一个保守的螺旋转角螺旋( h e l i x t u r n h e l i x ) d n a 结合蛋白域， a c t l i o r f 4 、r e d d 、d n r j 等都属于这个家族。 天蓝色链霉菌( sc o e l i c o l o r ) 中的a c t l i - o r f 4 和r e d d 分别调控放线紫红素 ( a c t i n o r h o d i n ) 与十一烷基灵菌红素( u n d e c y l p r o d i g i o s i n ) 的生物合成。 波赛链霉菌( s t r e p t o m y c e sp e u c e t i u s ) a t c c2 9 0 5 0 中，d n r i 、d n r j 及d n r r 2 是柔红素( d a u n o r u b i c i n ) 生物合成的激活因子。在波赛链霉菌中增加砌与 砌的拷贝数，柔红霉素合成的重要前体物产量提高1 0 倍；增加d n r r 2 的拷 贝数后，柔红霉素前体物和柔红霉素产量分别提高1 0 倍和2 倍。敲除d n r i 后， 柔红霉素的合成停止，且波赛链霉菌对柔红霉素抗性降低。 吸水链霉菌1 7 9 9 7 ( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ) 中格尔德霉素( g e l d a n a m y c i n ) 的生物合成基因簇中发现有两个调控基因：g d m r l 和g d m r l i ，二者都属于l u x r 转录调控蛋白家族。将基因g d m r l 和g d m r h 阻断后，格尔德霉素完全消失， 基因回补后，格尔德霉素产量恢复，表明g d m r l 和g d m r i i 为格尔德霉素生物 合成的正调控基因。半定量r t p c r 实验表明g d m r i 和g d m r l l 是对负责合成 一6 一 浙江大学硕士学位论文 格尔德霉素的一些p k s 基因的转录进行调控，而对p k s 基因的后修饰基因没 有调控作用。 此外，还有很多途径特异性调控因子已被发现和鉴定，如费氏链霉菌( f r a d i a e ) 中泰乐菌素( t y l o s i n ) 的生物合成基因簇的调控基因t y l r 、t y l p 、q 、 t y l s 、丁( 见图1 3 ) ；纳塔尔链霉菌( n a t a l e n s i s ) 中调控纳塔霉素合成 的p i m m 、p i m r 等。 里苫蛋吕臼。尽。移 i 兰型卜 图1 - 3 泰乐菌素生物合成基因簇的途径特异性调控基因调控示意图 ( + ) ：激活( ) ：抑制 f i g 1 - 3t h em o d e lf o r t h er e g u l a t i o no ft h ep a t h w a y s p e c i f i cr e g u l a t o r yg e n e so ft y l o s i n b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r ( 张艳娟，洪斌2 0 0 4 ) ( + ) ：a c t i v a t e ( - ) ：r e p r e s s 1 3 2 多效性调控 多效调控为链霉菌次级代谢的最高调控水平，它可对链霉菌抗生素的产生、 形态分化等进行调控。 a 因子是一类属于丫丁酮内酯类小分子化合物。1 9 6 7 年，k h o k h l o v 等人 首次发现a 因子能对灰色链霉菌的形态分化起调控作用，而后发现它还能多效 性的调控抗生素、黄色素等次级代谢物的合成。在链霉菌的许多种中也发现了 a 因子及其类似物的存在( 见图1 - 4 ) 目前研究得比较清楚和深入的是灰色链霉菌的a 因子。在茵体生长初期， a 因子浓度很低，a 因子受体蛋白( a f a c t o rr e c e p t o rp r o t e i n ，a r p a ) - 与调控灰 色链霉菌形态分化和次级代谢的基因a d p a ( a - f a c t o rd e p e n d e n tp r o t e i n ) 的启动 子区域结合，抑制a d p a 的转录。当进入生长期的稳定期，a 因子经积累，浓 度达到一定的阈值，与a r p a 结合，使a r p a 的构象发生变化，而从a d p a 的启 动子区脱离，a d p a 开始转录。翻译合成的a d p a 接着调控下游一系列的基因， 如孵4 、a m f r 、s g m a 、s t r r 等，而调控灰色链霉菌的形态分化和抗生素等次 淅扛大学硕学位论文 级代谢的合成( 见囤1 - 5 ) 。a 因子也因此被认为是链霉菌体内的“激素” 5 丫_0 y 一，n 、? ，7 鲁“”4 乎。j j 1 静一，? ? 一如一静一 图i - 4 链霉菌中的几种舍7 - 丁酎内醋结构的化台物 f i g u r ei - 4s o m e 廿b u t y r o l a c t o n e s f r o ms t 陀p t o m y c e sr e k o t a k a n o2 0 0 6 ) 上l 之 勰一i 黜粼 四j 图l 灰色链霉菌中a 因子对次壤代谢和形态分化的信号级联调控 f i g u r ei - 5 t h e a - f a c t o rs i 驴a l i n gc a s c a d e 廿i g g e r s m o r p h o l o g i c a ld i f f e m , n t i a t i o n a n d c o 岫m e t a b o l i s m i n & 廊w ( k l a s f i b n i h ，m a r kjb u r n e r 2 0 0 9 ) 一8 一 浙江大学硕士学位论文 d a s r 是天蓝色链霉菌中的全局调控蛋白，调控色素放线菌紫素( a c t ) 和 十一烷基灵红菌素( r e d ) 的产生，并且它的调控作用与菌体生长的营养条件 相关。 n s d a 是链霉菌的全局性负调控基因，广泛存在于链霉菌中。其基因序列高 度保守，含有t p r 结构域，功能也保守，对链霉菌抗生素的合成和产孢形态分化 具有负调节作用。中断变铅青链霉菌n s d 4 ，可以激活沉默的放线紫红素生物合 成基因簇的表达；天蓝色链霉菌中中断n s d a 基因，则放线紫红素、钙依赖抗生 素和次甲基霉素等3 种抗生素都超量产生；中断肉桂地链霉菌n s d a ，所得到的 船幽一突变株的莫能菌素产量在摇瓶水平上为出发菌株的2 7 倍。 1 3 3 全局调控 链霉菌中存在着原核型和真核型两种双组分全局调节系统，它们对链霉菌 的次级代谢和形态分化进行全局调控。全局调控基因一般位于抗生素生物合成 基因簇外面。 a f s r a f s s 是灰色链霉菌和天蓝色链霉菌中的丝氨酸苏氨酸双组分调控系 统。a f s r 是一种特殊的转录因子，可结合到a f s s 的启动子区域，启动其转录。 a f s r 还具有a t p a s e 活性，该活性与d n a 结合活性都是由丝氨酸苏氨酸残基 的磷酸化来调节。磷酸化的a f s r 蛋白结合到a f s s 的启动子区，通过a f s s 的表 达来激活下游其他调控基因( 包括途径特异性调控基因等) 而调控次生代谢产 物的合成。 p h o r - p h o p 是链霉菌中的磷酸双组分多效全局调控系统。在c o e l i c o l o r 、 sl i v i d a n s 、a v e r m i t i l i s 、sg r i s e u s 及n a t a l e n s i s 中，p h o r - p h o p 基因序列都 已被鉴定及报道，且在bs u b t i l i s 、ec o l i 、m b o r i s 中广泛存在，其序列及功 能均保守。p h o r 蛋白是结合在膜上的感受蛋白，而p h o p 蛋白可与d n a 结合， n 端有与磷酸化相关的保守区，c 端有保守的d n a 结合域。 p h o r - p h o p 对链霉菌抗生素及次级代谢产物的合成起间接的负调控作用。 中断sl i v i d a n s 的p h o r p h o p 基因，十一烷基灵菌红素的产量显著提高，由野 生菌的1 2 n m o l m g 干重提高到1 4 n m o l m g 干重；放线紫红素基因簇被激活且产 量达到2 5 n m o l m g 干重。中断sn a t a l e n s i s 的p h o r - p h o p 基因，那他霉素的产 量提高了8 0 。 一9 一 浙大学硬学位论文 环境中的磷酸浓度降低到一定值时，p h o r 发生自我磷酸化，形成p h o r p ， 然后将磷酸基团传给处于去磷酸化状态的p h o p ，形成p h o p p ，磷酸化的p h o p 作为转录因子，结合到p h o r - p h o p 调控的基因的上游p h ob o x e s 区，澈活这些 基因的转录。这些基因一般是初级代谢产物合成基因，p h o r - p h o p 对其进行直 接的正调控，如碱性磷酸酶基因的表达必须有p h o r - p h o p 的存在。 最近研究发现，震组分调控系统p h o r p h o p 与a f s r a f s s 具有相互调控左 右。在调控e 商品p s t s ，p h o r p 的转录时，p h o p 与a f s r 竞争性的结合到这三 者的启动子区( 见圈1 - 6 ) o 田l 石p h o r p h o p 与a f s r a f s s 震组分系统坷的相互调控作用示意圉 f i g u r e l - 6m o d e lo f c r o s s - t a l kr e g u h t i o n i n p h o r p h o p a n d a f s p d a f s s 日咖m s ( f e m a n d o s a n t o s - b e n e i t na l2 0 0 9 ) 1 0 一 一 一 专 浙江大学硕上学位论文 2 1 引言 第2 章基因工程菌株的构建 目前报道的纳他霉素的产生菌主要有三种：纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ) ，褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) 以及恰塔努加链霉 ( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s ) 。 纳他霉素作为一种安全、高效的新型生物防腐剂，广泛应用于食品行业及 医疗、兽药等领域，显示出良好的应用前景和深厚的市场潜力，但其较高的成 本在一定程度上限制了它的应用。因此，提高纳他霉素产量，降低其成本和售 价，将为纳他霉素开辟更为广阔的市场。 工业菌种的改良多采用传统的紫外诱变、化学诱变等方法，这些方法具有 较大的盲目性和随机性，工作量大，要耗费大量的人力物力。且经过多轮的诱 变和筛选后，工业菌株的抗生素产量已处于较高的水平，很难筛选到发酵水平 更高的菌株。 目前，天蓝色链霉菌( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r ) 和阿维链霉菌( s t r e p t o m y c e s a v e r m i t i l i s ) 基因组测序已完成，且随着基因组学和分子生物学技术的日益发 展，链霉菌中部分次级代谢产物的生物合成基因簇及其调控机制已逐步地被阐 明。随着对链霉菌次级代谢调控研究的深入和集中，基因工程方法将逐步应用 于工业菌株的改造，成为改造抗生素生产菌株、提高抗生素产量的有效及主流 方法。 本论文的实验工作基于实验室前期的工作基础( y i l i n gd u ，s h i f e ic h e n ， l i a n g y i n gc h e n g ，2 0 0 9 ) ：以恰塔努加链霉菌s 册彤的18 8 4 b p 月f 段作探针，在其 基因文库中筛选到3 个c o s m i d ：p m r d 4 5 、p m r d 4 6 、p m r d 4 7 。在p m r d 4 7 上已 克隆出恰塔努加链霉菌的s c 玎尺倦因的部分序列以及那他霉素正调控基因s c ，z 尺 全序列。 在本章中，我们从p m r d 4 6 上克隆到纳他霉素途径特异性正调控基因s c n r i 的 完整d n a 序列，并对其进行引物步移测序和同源性分析，用基因工程方法构建 恰塔努加链霉菌的基因工程菌株z j u c l 、z j u c 2 、z j u c 3 ，分别包含多拷贝基因： s c n r i + n p 、s c n r i i + e r m e 叩、s c n r i + s c n r i i + n p 。 浙江大学硕士学位论文 2 2 材料与方法 2 2 1 菌株和质粒 实验中使用到的菌株和质粒分别列于表2 1 和表2 2 中。 表2 - 1 本实验所用的菌株 t a b l e2 1t h es t r a i n su s e di nt h i se x p e r i m e n t 表2 - 2 本实验所用的质粒 t a b l e2 12t h ep l a s m i d su s e di nt h i se x p e r i m e n t 一1 2 浙江大学硕士学位论文 2 2 2 实验仪器和设备 实验用到的仪器和设备如下表2 3 ： 表2 - 3 实验仪器 t a b l e 2 3l i s to fi r l s t u m e n t s 一1 3 浙江大学硕士学位论文 2 2 3 培养基 实验中用到的培养基如下： l b 培养基( w ) ： t r y p t o n e y e a s te x t r a c t n a c l 1 o 5 1 ( 固体培养基添加1 5 2 的琼脂) 2 x y t 培养基( w ) ： t r y p t o n e y e a s te x t r a c t n a c l m s 培养基( w ) ： 黄豆粉 甘露醇 琼脂 y m g c 固体培养基( w v ) ： 1 6 1 o 5 2 2 2 一1 4 一 浙江大学硕士学位论文 2 2 4 抗生素 麦芽抽提物 葡萄糖 酵母抽提物 碳酸钙 琼脂 1 0 4 0 4 0 4 2 本实验中用到的各抗生素使用浓度和配制如下： 链霉素( s t r e p t o m y c i n )5 0 m g m l ( 无菌水配制) 卡那霉素( k a n a m y c i n )5 0 m g m l ( 无菌水配制) 壮观霉素( s p e c t i n o m y c i n )5 0 m g m l ( 无菌水配制) 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n )1 0 0 m g m l ( 无菌水配制) 阿泊拉霉素( a p r a m y c i n )5 0 m g m l ( 无菌水配制) 硫链丝菌素( t h i o s t r e p t o n )5 0 m g m l ( d m s o 配制) 2 2 5 酶和生化试剂 p c r 引物由上海生工合成，d n a 测序由上海生工、i n v i t r o g e n 完成。工具 酶购自t a k a r a 、f e r m e n t a s 等公司，凝胶回收试剂盒为北京天根生物公司产品。 2 2 6p c r 扩增的引物序列 s c n r l l 基因引物序列： s c n r i i - f ：5 c c g t 筮幽g c g a g c c t t g a t a aa a 3 ( n d e i 酶切位点) ， s c n r i i - r ：5 a t ac 工i qc t g t g c c c g c t c a c t t c a c a 3 ( n d e i 酶切位点) 。 p c r 反应体系总体积为5 0 u l ：无菌水3 0 u l ，1 0 x b u f f e r5 u l ，d n t p ( 2 m m ) 2 u l ， d m s o ( 5 0 ) 5 u l ，m g s 0 4 ( 2 5 m m ) 2 u l ，s c n r i i - f ( 2 0 u m ) i 5 ，s c n r i i - r ( 2 0 u m ) 1 5 u l ， k o d p l u s ( 5u u 1 ) l u l ，d n a 模板2 u l 。扩增程序为9 5 ( 2 变性5 m i n ；9 5 cl m i n ， 5 6 c l m i n ，7 2 * ( 2 1 r a i n 进行3 0 个循环；最后于7 2 c 延伸1 0 m i n 。 扩增s c n r l 启动子加上s c n r l i 启动子的引物序列： 一15 浙江大学硕士学位论文 s c n r i + i i - n p f ：5 t t g c g g t c g g a g g t g c g g g c a t g a 3 s c n r l + i i - n p r ：5 c c t t t g c a t g g c g a g c c t t g a t a 3 p c r 反应体系总体积为2 0 u l ：无菌水1 2u l ，1 0 x b u f f e r2 u l ，d n t p ( 2 r a m ) 0 8 u l ，m g s 0 4 ( 2 5 r a m ) 0 8 u l ，d m s o ( 5 0 ) 2 u l ，s c n r i + i i - n p f ( 2 0 u m ) o 5 u l ， s c n r i + i i - n p r ( 2 0 u m ) o 5 u l ，k o dp l u s ( 5u u 1 ) 0 5 u l ，d n a 模板0 9 u l 。扩增 程序为9 5 c 变性5 m i n ；9 5 ( 2 1 m i n ，5 6 c l m i n ，7 2 c 4 5 s e c 进行3 0 个循环；最 后于7 2 延伸l o m i n 。 s c n r i 基因的1 8 8 4 b p 片段引物序列： s c n r i - f ：5 c t g c t g c t c a t c c g c c t t g g c 3 ， s c n r i - r ：5 a t t c c c a c c g g c g t g c g c 3 。 p c r 反应体系总体积为2 0 u l ：无菌水1 2 u l ，1 0 x b u f f e r2 u l ，d n t p ( 2 r a m ) 0 8 u l ，m g s 0 4 ( 2 5 m m ) 0 8 u l ，d m s o ( 5 0 )