（动物学专业论文）一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响.pdf

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o r g a n i s m sw e r ei n j e c t e di nv i v oa n d p a t h o g e n sw e r ec o i n c u b a t e dw i t hh e m o c y t e si nv i t r o ，w ed e t e c t e dt h en o sa c t i v i t yo f c h i n e s em i t t e nc r a b ( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) a n dc h a n g e so fn oc o n c e n t r a t i o n r e s u l t s s h o w e dt h a tt h ei n d u c i b l en o se x i s t e di nc h i n e s em i t t e nc r a bh e m o c y t e sa n di t s p r o d u c to fn o w a sr e l a t e dw i t hi m m u n i t y n o si n h i b i t i o nt e s t se x h i b i t e dt h a te d t a a n dl - n a m e s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h en o sa c t i v i t yi n d u c e db yp a t h o g e n i cb a c t e r i a , b u tt h es m th a dn os i g n i f i c a n ti n h i b i t i o n t h u s ，w e s p e c u l a t e dt h a tt h es t r u c t u r eo f i n d u c i b l en o si nc h i n e s em i t t e nc r a bm a yb em o r es i m i l a rt om a m m a l i a nc o n s t i t u t i v e n o s u n d e rt h es a m ec o n c e n t r a t i o no fe x o g e n o u sn o ，i th a dn os i g n i f i c a n ti n h i b i t o r y e f f e c to nb a c t e r i a lg r o w t hw h e ni tw a su s e da l o n e ，b u tt h eg r o w t ho fb a c t e r i aw a s s u p p r e s s e dr e m a r k a b l yw h e ne x o g e n o u sn o w a sc o - e x i s t e d 晰t hh e m o c ”e s ，t h e r e f o r e ， w ec o n c l u d e dt h a tn oc a ns i g n i f i c a n t l yi m p r o v eh e m o c y t e st oi n h i b i tt h e b a c t e r i a g r o w t h i no r d e rt of u r t h e re x p l o r et h ee f f e c to fn oo ni m m u n ea c t i v i t yo fc h i n e s e m i t t e nc r a b ，f i r s t l yw ei n j e c t e ds n pi n t ot h ec r a bb o d ya tac e r t a i nc o n c e n t r a t i o n ，a n d t e s t e dt h ec h a n g e si nt h ei m m u n e r e l a t e di n d i c a t o r sa f t e rs a m p l i n ga td i f f e r e n tt i m e t h e n e x t ，w ec o i n c u b a t e dh e m o c y t e sw i t hs n pf o r2h o u r si nv i t r o ，t h e nd e t e c t e dh a g o c y t i c a c t i v i t yo fh e m o c y t e sa n dt h eb a c t e r i a la d h e s i o nt oh e m o c y t e s f i n a l l y , w ei n j e c t e ds n p i n t ot h ec r a bb o d y , a n dt h e nd e t e c t e de f f e c t so fs n po nt h ee x p r e s s i o no fa n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s c r u s t i n sm r n ab ys e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c rm e t h o d r e s e a r c hd a t a d e m o n s t r a t e dt h a te x o g e n o u sn os i g n i f i c a n t l ya f f e c t e dt h eh e m o c y t e sc o u n t ( d h c ) o f d i f f e r e n tt y p e s f o re x a m p l e ，g r a n u l o s ac e l l sr e d u c e da n ds m a l lg r a n u l ec e l l sa n d n o n g r a n u l ec e l l si n c r e a s e di nac e r t a i np e r i o d e x o g e n o u sn oc o u l d i n d u c es o m e i m m u n e r e l a t e de n z y m ea c t i v i t i e s f o re x a m p l e ，t h ep h e n o lo x i d a s ea n da l k a l i n e p h o s p h a t a s ea c t i v i t y w e r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yb ys n pa tlo o b m o l l ，a n da c i d l j 一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响 英文摘要 p h o s p h a t a s ea n dl y s o z y m ea c t i v i t yw e r ee n h a n c e db ys n pa t lo o p m o l la n d 5 0 0 1 a m o l l ，h o w e v e r , m a n ye n z y m ea c t i v i t yw a si n h i b i t e db ys n p a t 10 0 0 1 a m o l l b a c t e r i a la d h e s i o nt oh e m o c y t e sw a ss t r e n g t h e n e db ys n pa tm o r et h a n5 0 0 i t m o l l p h a g o c y t o s i sa c t i v i t i e sw e r ei n c r e a s e db ys n pa t2 0 i - t m o l l ，b u tt h i se f f e c tw a sn o t o b s e r v e dw h e ns n pc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dm o r et h a n5 0 0 1 a m o l l as h o r t t e r m e x p r e s s i o no fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sc r u s t i n l i iw a si n d u c e db ys n pa tlo o p m o l l c m s t i n l i ie x p r e s s i o no fc r a bb o d yi n c r e a s e da f t e r12 h ，b u ti tr e t u r n e dt ot h en o r m a l l e v e l ( c o n t r o lg r o u p ) a f t e r2 4 h i nt h em e a n w h i l e ，t h ee x p r e s s i o no fc r u s t i nih a dn o s i g n i f i c a n tc h a n g e i no u rr e s e a r c h ，w e e x p l o r e dt h e c h a r a c t e r i s t i c so fh e m o c y t e sn o sa n d s y s t e m a t i c a l l y s t u d i e dt h ee f f e c to fn 0o nt h ei m m u n ea c t i v i t yo fc r u s t a c e a n r e p r e s e n t e db yc h i n e s em i t t e nc r a b i ng e n e r a l ，n 0h a v ep o s i t i v ea n dn e g a t i v ee f f e c t s o nc r u s t a c e a ni m m u n e ，d e p e n d i n go nt h ec o n c e n t r a t i o no fn o e x o g e n o u sn oa t a p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o nc o u l ds t r e n g t h e ni m m u n ed e f e n s eo fc h i n e s em i t t e nc r a bt o m i c r o b l e k e y w o r d s ：n i t r i co x i d e ；n i t r i co x i d es y n t h a s e ；e r i o c h e i rs i n e n s i s ；i m m u n e i i i w r i t t e nb y ：s o n gx i u m e i s u p e r v i s e db y ：x uw e i - a n 目录 前言1日日菁l 文献综述2 1 一氧化氮对生物体免疫活性的影响研究进展2 2 甲壳动物免疫研究进展8 第一章外源微生物诱导对中华绒螫蟹血清和血细胞一氧化氮生成量的影响1 2 1 材料与方法1 2 2 结果1 4 3 讨j 沦17 第二章一氧化氮对中华绒螯蟹血细胞免疫活性的影响1 9 l 材料与方法1 9 2 结果2 1 3 讨论2 8 第三章一氧化氮对中华绒螯蟹免疫相关酶活性的影响3 0 1 材料与方法3 0 2 结果与分析3 2 3 讨论3 6 第四章一氧化氮对中华绒螫蟹抗菌肽c r u s t i n s 表达的诱导3 9 l 材料与方法3 9 2 结果4 3 3 讨1 沧4 7 全文总结4 9 附录一英汉双解缩略词表5 0 附录二脊椎动物和无脊椎动物n o s 比较51 参考文献5 2 攻读学位期间公开发表的论文6 4 致 谢_ ：6 5 一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响前言 上- j 一 刖舌 一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 是生物体内一种作用广泛且性质独特的小分子 物质，由一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e ，n o s ) 催化合成。它除了作为神经 系统信号传递分子，心血管系统舒血管因子外，还在生物体免疫防御中发挥重要 作用。 在脊椎动物中，n o 与机体免疫关系的研究较为深入。已有数据表明细胞因子 或内毒素诱导诱导激活的i n o s 是c a 2 + 非依赖性的，其催化产物n o 在细胞活性的 调节、炎症反应和自身免疫性疾病等方面发挥着或利或害的双重作用。近年来， 在无脊椎动物中，n o 在宿主抗寄生虫感染、杀菌以及抗逆境等免疫防御过程中的 作用也日益引起人们的重视。 针对n o 影响机体免疫活性的方式，多数研究集中在n o 以及衍生物的直接作 用。但在多种软体动物和甲壳类的克氏原螯虾( p r o c a m b a r u sc l a r k i i ) 中还发现，因 微生物感染诱导而产生的n o 能够增强血细胞聚集菌体的能力，从而增强血细胞 的杀菌作用，提示n o 还可能通过其他方式影响机体免疫活性。 中华绒鳌蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) ，俗称河蟹，属甲壳纲十足目，是我国的特产。 在养殖过程中由于病害问题日益突出，通过改善和提高中华绒螯蟹的免疫力已逐 渐成为其疾病防控的发展方向。 因此，本试验以研究n o 影响机体免疫活性的方式为核心，并结合生产、生 活的需要，以我国特有水产品中华绒螯蟹为研究对象，首先通过采用不同类型微 生物注射感染和致病菌孵育离体血细胞，以确定中华绒螯蟹体内可诱导n o s 的存 在，同时在n o s 抑制性试验基础上，探讨中华绒螯蟹血细胞中n o s 的性质。较 为系统地研究外源n o 对中华绒螯蟹免疫相关指标的可能影响，以期深入了解n o 在以中华绒螯蟹为代表的甲壳动物免疫防御中的作用方式，并为今后中华绒螯蟹 的疾病防治提供基础理论数据。 文献综述一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响 文献综述 l 一氧化氮对生物体免疫活性的影响研究进展 生物体内，由诱导型一氧化氮合酶催化生成的一氧化氮，具有活跃而广泛的 生化性质，介导一系列病理过程，因而越来越多的学者对一氧化氮与免疫系统的 关系产生兴趣，以下就近年来有关资料加以综述。 1 1 一氧化氮概述 一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 是真核生物细胞内的一种重要活性物质。自1 9 8 0 年f u r c h g o t t 1 】第一次提出n o 是一种内皮细胞舒血管因子以来，因其广泛的生物学 效应而受到人们高度重视。1 9 9 2 年美国s c i e n c e 杂志将n o 评为年度分子，1 9 9 8 年f u r c h g o t ，i g n a r r o 和m u r a d 因在n o 作为信号分子研究中的突出贡献获得诺贝 尔奖。n o 是迄今发现的生物体内最小、最轻、最简单的信息分子。与以前所知 的生物信息分子( 通常为蛋白及多肽等大分子或结构复杂的单胺类物质) 所不同的 是：传统的生物信息分子都是与细胞膜或细胞内的特异受体结合，经细胞内特定 信号转导途径进而引发细胞功能的变化，而n o 不需要任何中间机制可以快速直 接通过生物膜，将一个细胞产生的信号传递给周围细胞，在神经、免疫、消化、 呼吸、内分泌等多种系统中发挥重要的调节作用【2 ，3 1 。 n o 是一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e ，n o s ) 催化l 精氨酸生成l 胍氨酸 的过程中释放的，其反应式如下： l ，氟妒一艇誓一l 一氯 i - 瓜u o 脊椎动物一氧化氮合酶有三种亚型，分别由不同的基因编码，根据n o s 基因 序列和细胞定位不同分为3 种亚型：神经元型n o s ( n n o s ) 主要存在于中枢神经、 外周神经系统；内皮型n o s ( e n o s ) n 内皮细胞所特有；诱导型n o s ( i n o s ) 主要存 在于巨噬细胞中。e n o s 和n n o s 在细胞处于生理状态下即有表达，合称为组成型 2 一氧化氦对中华绒螯蟹免疫活性的影响文献综述 n o s ( c o n s t i t u t i v en o s ，c n o s ) 。c n o s 需要钙离子或钙调蛋白激活、n a d p h 的参与才能将l 一精氨酸转变成胍氨酸，释放n o ，由于催化发应迅速而短暂，生成 的n o 少，人们认为它主要作为传递介质和调节介质而存在。 i n o s 不依赖于钙离子或钙调蛋白，常存在于炎症细胞的胞质中，也发现于其 他许多器官组织，正常情况下不表达活性，在内毒素或某些细胞因子，如肿瘤坏 死因子( t n f ) 、丫干扰素( i n f - t ) 等刺激连同四氢生物喋呤和n a d p h 共同作用下可 被激活，单体i n o s 无活性分子量为1 3 0 k d ，只有在形成分子量为2 5 0 k d 的二聚 体时才具有生物活性。催化生成的n o 量大且存在时间长，能持续几小时到几天 不等。相关研究显示n o 主要在病理情况下发挥作用，可以抑制或杀死病原体， 非特异性地参与炎症的发生和发展过程【4 ，5 1 。 1 2 一氧化氮对脊椎动物免疫活性的影响 近年来，人们对由i n o s 催化生成的n o 在脊椎动物中的作用已经有了较为广 泛而深入的了解，包括对细胞活性的调节、炎症反应，心血管疾病与自身免疫性 疾病等诸多方面。 1 2 1n o 对细胞活性的调节 长期以来，n o 都被作为快速调节细胞凋亡与细胞活性的重要分子【6 ，7 1 。它通 过影响线粒体的功能来调节细胞的存活或死亡。其作用方式表现在多个方面：例 如，n o 连同0 2 既能为呼吸链上的多种酶提供底物结合位点，还能与线粒体蛋白 上血红素铁硫醇簇形成复合物从而影响酶的催化活性。除此之外，n o 还能直接 降低离体线粒体内膜电位( ) ，导致线粒体“肿胀”。这些现象都是线粒体依赖的 凋亡过程的早期阶段【8 d 1 1 。在离体线粒体、n o 供体处理的未损伤细胞、大量表达 i n o s 的细胞中都观察到细胞色素c 和凋亡诱导因子( a i f ) 的存在。 然而，n o 对细胞活力的影响十分多变。事实上，n o 往往表现出双重作用， 既能增强细胞活力又能根据细胞类型和n o 的浓度诱导细胞凋亡【1 2 - 16 1 。例如，适 当的n o 浓度可以抑制b 淋巴细胞基部凋亡f 1 7 】，而在由细胞因子t g f d 诱导的肝 细胞和f a s 依赖的多种炎症细胞模型中n o 则会诱导细胞凋亡。已有多种作用模型 对n o 的这种保护性作用做出了解释。其中包括启动凋亡前信号通路的脱敏反应 ( 尽管对该机制的研究还很少) ，它能够抑制p r o c a s p a s e 和c a s p a s e 的活性，表达 抗凋亡基因【1 8 】。c a s p a s e 是通过半胱氨酸组氨酸催化机制裂解专一蛋白的蛋白酶家 文献综述一氧化氮对中华绒整蟹免疫活性的影响 族，其激活位点含有半胱氨酸残基，对n o 参与的巯基亚硝基化作用敏感，这是 n o 调节细胞凋亡的一个可能生理机铝l j 1 9 , 2 0 。 1 2 2n o 与与炎症反应 局部炎症反应是在病原体存在、组织发生化学或机械损伤、器官移植或胞外 基质重建时机体做出响应的表现形式【2 1 , 2 2 】。对肿瘤细胞的免疫监视过程也是一种 炎症反应【2 3 1 。大多数局部炎症反应( 病原体存在或组织损伤) ，具有表现炎症特征 性标记( 如红肿、发热、疼痛) 功能的募集细胞来执行。通过结构和功能重建的 决定过程严格限制炎症反应时间，以避免持续不断的病态炎症反应。 先天免疫涉及机体整体自我平衡的控制，需要精确调节使每一个反应完全适 应炎症区域的具体要求 2 4 2 5 1 。炎症细胞( 单核细胞和巨噬细胞) 的激活，在先天 免疫中扮演者重要角色。因炎症细胞表面存在大量多功能受体( t o l l 样受体，t l r s ) 而表现出多功能性，这类受体能够识别数量相当庞大的病原模式分子【2 6 】。 炎症细胞还有其他功能，如巨噬细胞通过吞噬作用，毒杀病原体和炎症反应 等方式参与宿主抗病原体感染的防御反应。病原体和促炎症细胞因子激活巨噬细 胞，进而诱导一系列参与宿主免疫防御的基因表达，这些基因的表达导致促炎症 调节因子如生物活性脂、花生四烯酸代谢物、活性氧、活性氮和其他蛋白酶所需 的基质的释放【2 1 1 。其中激活的巨噬细胞诱导i n o s 的表达是参与哺乳动物先天免疫 反应( 如细胞生长，细胞毒性，促凋亡机制) 的重要一员。 n o 根据浓度的不同，一方面具有促细胞凋亡活性，另一方面又能维持细胞的 完整性，保证吞噬性细胞发挥正常功能。用短半衰期n o 供体g n s o ( 半衰期约为 4 0 m i n ) 处理的巨噬细胞，很快会出现凋亡特征；而持续稳定的n o 或脂多糖( l p s ) 、 丫干扰素( i f n 吖) 诱导i n o s 表达进而催化生成的n o 都不会引发细胞凋亡【2 7 2 8 1 。巨 噬细胞表现出了比其它细胞( 如神经元细胞、t 淋巴细胞和b 淋巴细胞) 更强的 n o 耐受性。通过不同半衰期n o 供体和n o s 抑制剂作用靶细胞，发现持续高浓 度的n o 还会延迟巨噬细胞触发执行凋亡的反应，增强细胞活性有利于维持细胞 完整性【2 9 。3 1 】。持续低浓度的n o 可以通过促进肿瘤细胞的生长、参与肿瘤血管形 成或者抑制瘤细胞凋亡等效应起到促瘤作用。人结肠癌中i n o s 浓度约为2 0 p m o l ( m i n m g ) 表现为促癌作用与人乳腺癌中研究报道的结果相似，此时i n o s 的表达活 性比引起细胞毒性和凋亡等抗瘤作用时至少低1 2 个数量级，因而持续产生低浓 4 一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响文献综述 度的n o 表现为对肿瘤的生长促进性【3 2 】。由活化的巨噬细胞产生或由硝酸甘油、 硝普钠等n o 供体药物释放的高浓度n o 可能介导肿瘤细胞的编程性细胞死亡、抑 制肿瘤生长，表现为抗肿瘤活性【3 3 1 。此后在慢性淋巴细胞性白血病等其他研究中 的类似结果都证明了n o 双重作用的浓度依赖性【3 4 】。 除了研究对细胞活性的影响外，在炎症反应中n o 还具有广泛且普遍的调节 作用。当感染持续不断时，伴随着单层细胞被募集到感染位点，引起激活免疫过 程的分子释放进一步增强，导致炎症调节因子富集，对机体有害。近年来，人们 发现n o 参与阻止炎症调节因子过量释放的负性调节，该调节通过终止活化细胞 基因表达产物来实现。相关研究发现n o 可使自然杀伤细胞的n f 1 ( b 蛋白酶和p 5 0 、 p 6 5 亚基d n a 结合结构域亚硝基化从而抑制其转录活性【3 5 】。 1 2 3n o 与心血管疾病 n o 对心肌收缩功能的影响因其浓度和来源不同呈不同性质的作用，一般认为 生理浓度的n o 可以促进和维持心肌的收缩功能，而过高浓度的n o 则使收缩功 能减弱，白细胞来源的i n o s 对心肌细胞有害，而心肌细胞来源的i n o s 具有保护 作用【3 6 1 。 对于i n o s 源的n o 在动脉粥样硬化、高血压等疾病中所起的作用，不同研究 者所得出的研究结论不尽相同。通过对基因敲除小鼠的研究发现，同单纯载脂蛋 白e ( a p o e ) 敲除小鼠相比，a p o e 和i n o s 基因双敲除小鼠动脉粥样硬化面积显著减 少，表明i n o s 可能直接促进动脉粥样硬化病变的发展【3 7 1 。 另外，有些研究者发现n o 的长期增加，可抑制新生内膜增生、炎症细胞浸 润和新生内膜平滑肌细胞聚集。同野生型小鼠相比，i n o s 基因缺陷小鼠血清胆固 醇水平以及动脉粥样硬化斑块的发生率增加【3 8 】。 1 2 4 n o 与自身免疫性疾病 自体免疫疾病已成为肿瘤和心血管疾病后又一个高发和致死病。人们发现自 发性自身免疫病小鼠体内产生的n o 明显增加。当在饮水中加入n o s 的抑制剂时， 可明显减轻此种小鼠的自发性肾脏病变，降低使尿中蛋白质含量，减轻自发性关 节炎炎症程度以及滑膜组织增生程度【3 9 1 。 1 3 一氧化氮对无脊椎动物免疫活性的影响 2 0 世纪9 0 年代初，人们从几种昆虫脑中分离到n o s 。发现这类n o s 与脊椎 文献综述一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响 动物组成型n o s 有相似的特征，主要表现在通过改变c a 2 + 浓度水平可以激活n o s ， 而且该酶在几分钟内就能催化产生具有信号作用的n o ，并能广泛参与化学感应、 视觉信息加工和长期记忆的形成【4 0 】。此后研究还发现n o 在昆虫细胞免疫和体液 免疫反应中起作用。鳞翅目昆虫盐泽枝灯蛾( e s t i g m e n ea c r a e a ) 的巨噬细胞样血细胞 具有n a d p h 黄递酶活性。用细菌脂多糖刺激血细胞3 0 m i n 后其细胞悬液中l 瓜 氨酸，亚硝酸盐硝酸盐含量明显增加。这是首次报道经免疫激活后昆虫血细胞中 存在n o s 活性【4 1 1 。按蚊似n o p h e l e ss t e p h e n s o 被疟原虫感染后，n o s 的转录活性 增强。按蚊进食含n o s 的底物l 精氨酸时可减少疟原虫的感染，而进食含n o s 抑 制剂l - n a m e 时能明显增加疟原虫发育的卵囊数 4 2 , 4 3 】。进一步研究还发现在不同 组织中n o s 的表达存在差异，而且不同类型刺激物对n o s 的诱导效果也有所不 同。用锥虫( t r y p a n o s o m ar a n g e l i ) 和l p s 对长红猎蝽( r h o d n i u s p r o l i x u s ) j ：挂行活体内 免疫，q r t - p c r 检测不同组织中n o s 的表达，发现l p s 能显著诱导脂肪体和血 细胞中n o s 的表达，而锥虫对消化管中n o s 的表达诱导效果明显m 】。 近年来，在无脊椎动物中除昆虫以外其它类群物种中也发现了i n o s 的存在， 其催化生成的n o 广泛参与机体免疫防御反应。 例如，在软体动物中，用昆布多糖和脂多糖分别刺激紫贻贝( m y t i l u s g a l l o p r o v i n c i a l i s ) 离体血细胞可升高亚硝基水平【4 习；用2 a g ( 2 a r a c h i d o n o y g l y c e r 0 1 ) 束u 激紫贻贝免疫细胞可使n o 释放量显著增加【4 6 】；以副溶血 弧菌( v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s ) 和脂多糖为刺激因子，采用硝酸盐还原酶法测定杂色 鲍( h a l i o t i sd i v e r s i c o l o r ) r f l 细胞中n o 的水平，证实杂色鲍血细胞中存在n o s 活性 m ；用n o 供体s n a p 作用于感染帕金虫( p e r k i n s u sm a r i n u s ) 的牡蛎( c r a s s o s t r e a v i r g i n i c a ) ，发现s n a p 能显著抑制帕金虫的增殖【4 引。 在甲壳动物中，采用细胞形态法和n b t 还原法间接鉴定了日本对虾( p e n a e u s j a p o n i c u s ) 和中国明对虾( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) n m 细胞中存在n o s 活性。采用 亚硝酸盐法和l 瓜氨酸法研究中国明对虾在感染白斑综合症病毒( w s s v ) 过程中 血细胞n o s 活性的变化情况。结果表明，w s s v 感染能够显著诱导中国明对虾血 细胞i n o s 的表达。然而随着w s s v 的大量增殖，由于血细胞被破坏而使i n o s 活 性显著降低，最终导致死亡【4 9 】。将副溶血弧菌和l p s 离体孵育凡纳滨对虾 ( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 血细胞发现一氧化氮( n o ) 浓度显著高于对照组，而且这一反 6 一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响文献综述 应能被n o s 抑制剂亚硝基l 精氨酸甲酯( l n a m e ) 所阻断，因而证实了其血细胞 中存在n o s 活性【5 0 l 。通过注射不同浓度溶藻弧菌悬液发现，凡纳滨对虾y a n n a m e 0 血清中n o 含量及n o s 活力显著高于对照组，说明一氧化氮系统对凡纳滨对虾感 染的溶藻弧茵有清除作用【5 i 】。将金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 与克氏原螯 虾( p r o c a m b a r u sc l a r k i o 血细胞共同孵育，可见菌在血细胞周围的聚集，n o 供体硝 普纳( s n p ) 能显著增加聚集菌的数量，n o s 抑制剂l - n m m a 则能阻滞这种趋势。 在菌血细胞共育液中添加l p s ，n o 生成量增加，菌落形成数则显著减少，而 l n m m a 却能缓解l p s 诱导的n o 对菌落形成数的抑制，从而间接证明了n o 对 葡萄球菌有抑制作用【5 2 】。 1 4 一氧化氮在生物体内作用机理 当局部n o 浓度小于1 “m o l l 时，它可直接与许多分子反应或结合发挥应有 的生理作用【5 3 】。但在病理条件下，局部n o 浓度剧升可达若干个p m o l l 级水平。 此时n o 可与周围超氧离子反应，或结合到生物体重要蛋白的活性部位，或作为 信号分子结合到某些免疫相关基因的相关元件上，从而发挥其免疫活性。 1 4 1 一氧化氮与超氧离子( s u p e r o x i d ea n i o n ，0 2 3 作用 n o 与0 2 。作用生成过氧化亚硝基阴离子( o n 0 0 。) ( 强氧化剂) ，具有较大的 细胞毒性。主要表现在：o n o o 。在酸性条件下，如脑缺血缺氧或组织处于酸中 毒性状态时，与h + 反应形成o n o o h ，o n o o h 易分解为n 0 2 + 和o h 。，o h 能通 过链式反应导致含硫基蛋白破坏和脂质过氧化。同时还能与核酸反应引起d n a 链 断裂引起细胞毒性反应 5 4 , 5 5 】。o n o o 与过渡金属元素反应，生成硝基化因子。 其毒性可使内皮细胞受损、水肿、血小板和白细胞聚集、以及血管调节失常等【5 6 1 。 1 4 2 一氧化氮与金属离子结合 n o 结合在某些酶的金属配基( 常为铁、铜、锰) 上，生成的配位化合物可导致 正反两方面的生物学效应。 一方面，n o 通过激发某种酶而活化蛋白，起着保护或调节作用。如n o 可 结合到可溶性鸟苷酸环化酶( s g c ) 上的f e “上活化s g c ，进一步诱导c g m p 合成， c g m p 是最重要的信号分子之一【5 7 】。 另一方面，n o 结合到蛋白活性部位的金属上，阻止细胞行使正常功能而产生 毒害作用。如n o 可以使细胞色素氧化酶，过氧化氢酶，细胞色素p 4 5 0 ，腈水合 7 文献综述一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响 酶和蛋白酶失去活性。还可与体内的金属蛋白如铁硫蛋白结合，生成的络合物有 致癌作用【5 引。许多酶的活性部位为4 f e 4 s 基团，n o 与之结合形成形成铁二亚硝 酰基二硫醇复合物，引起代谢酶中的铁丢失，抑制含铁酶( 核糖基还原酶、乌头酸 酶及辅酶q 还原酶) 活性，一些对铁相当敏感的微生物，就会被抑制或杀灭【5 9 1 。 1 4 3 一氧化氮与硫醇的反应 n o 能与蛋白质或肽里的硫醇反应生成s 亚硝基硫醇( t h i o n i t r i t e s 或 s - n i t r o s o t h i o l s ) 。s 亚硝基硫醇参与的转亚硝化过程，属于极其重要的细胞信号通 道。许多转录因子如n f r , b 、缺氧诱导因子( h i f ) 、锌指转录因子、金属蛋白等通 过半胱氨酸残基的s 硫代亚硝化而被活化。它们控制许多重要的生命活性过程如 血管生成，创伤治愈，d n a 修补与合成以及细胞呼吸作用【删。作为具有生物活性 的气体小分子，n o 可以与许多胞内外的目标分子发生反应，这些反应的结果可 能对细胞是致命的，也有可能对细胞起保护作用。例如，n o 可以作为抗氧化剂 和抗凋亡物质抑制细胞的程序性死亡【6 l 】，但是n o 对细胞是处于保护作用还是处 于毒害作用很可能依赖于n o 在细胞内的有效浓度和细胞本身的生理状态【6 2 , 6 3 】。 1 4 4 一氧化氮调节免疫基因表达 除上述途径外，还有研究者认为n o 可能作为信号分子作用于细胞，使细胞 释放杀菌物质从而达到增强机体免疫的目的。例如n o 可诱导生物体内某些抗菌 肽基因的表达，而抗菌肽是所有生物体发挥先天免疫作用的重要肽类分子。将一 氧化氮供体注射到家蚕o m b y xm o r o 脂肪体内能诱导抗菌肽c e c r o p i n b 基因的表 达，认为n o 作为细胞内信号分子。当病原相关分子( 如l p s ) 被血细胞识别后， 通过一种活性信号传给与血细胞直接相连的脂肪体细胞，使其产生n o s 和其它免 疫蛋白，n o s 催化产生的n o 扩散到其它没有收到病原入侵信号的脂肪体细胞， 并且活化这些细胞的抗菌肽基因 6 4 】。转d i p t e r i c i n l a c z 基因的果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 在血细胞包囊作用中伴随着n o 的大量生成，能诱导编码抗菌肽 d e p t e r i c i n 基因的表达【6 5 】。 2 甲壳动物免疫研究进展 甲壳动物不具有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，属非特异免疫系统。 其免疫反应具有不同于脊椎动物的一些独特的性质。主要包括血细胞的吞噬、包 囊以及血淋巴中的一些酶或因子的杀菌作用，这些反应机制传统上被分为细胞免 疫和体液免疫。实际上在甲壳动物免疫中这两种反应很难严格区分开来，如一部 8 一氧化氮对中华绒螯蟹免疫活性的影响文献综述 分体液因子是在细胞内产生并储藏在细胞内发挥作用的，细胞反应又受体液因子 的介导和影响等。然而，为了方便叙述，本文中仍将细胞免疫和体液免疫分开介绍。 2 1 细胞免疫 2 1 1 吞噬作用 当入侵微生物较小时，血细胞通过吞噬作用吞入病原体，在细胞内部将其杀 灭。血细胞的吞噬杀菌过程一般分为吸附、吞入和消化杀菌三个阶段。完成对异 物的有效吸附后，血细胞伸出伪足，或直接形成凹陷将异物颗粒吞入，接着将吞 噬物分解。甲壳动物不同物种具有吞噬活性的细胞类型有所不同，即使同一种动 物不同类型细胞间吞噬活性也存在差异。 通常根据血细胞有无颗粒和颗粒大小，将甲壳动物血细胞分为3 种类型：透 明细胞( h y a l i n ec e l l s ，h c ) 、小颗粒细胞( s m a l l g r a n u l a rc e l l s ，s g c ) 和大颗粒细 胞( g r a n u l a rc e l l s ，g c ) 【6 6 。有研究发现，淡水螯虾( p a c i f a t a c u sl e n i u s o u l u s ) h c 具有较强的吞噬能力，s g c 极少参与吞噬活动，而g c 则完全没有吞噬活性【6 7 】。 还有学者认为，淡水螯虾的h c 具有吞噬作用，s g c 对外源物质具有